JPS609520B2 - Ｎーアシルオルゴテイン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はオルゴティンの誘導体に関する。

オルゴティンは、実質上純粋な注射し得る形の、すなわ
ちそのソース中にそれと混和し、もしくは付随する他の
タンパクを実質上含まない水溶性タンパク同族の集団の
メンバーに合衆国アドブテッドネーム委員会が与えた一
般名である。

アメリカ特許第８７５８６８２号はオルゴティンを含有
する医薬組成物を特許請求している。このオルゴテイン
金属タンパクは、物理的、化学的、生物学的および薬力
学的性質の特徴ある組み合わせを持ったタンパク同族集
団のメンバーである。

これら同族のそれぞれは、物理的には高度に密集した本
来の形態を持つ、単離された、球形の緩衝液および水に
溶けるタンパクの実質的に純粋の形であって、それは熱
不安定性ではあるが、イオン半径０．６０乃至１．００
Ａを持つ二価の金属の塩を含有する緩衝液に熔解すると
きは、６５００で数分間の加熱に安定であり、そしてそ
れはゲル電気泳動において特徴的な複数バンド像を与え
ることが特徴である。化学的には、それぞれ０乃至２を
除いてはすべてのタンパクアミノ酸と、少ないパーセン
トの炭水化物と、皆無の脂質と、１モル当りイオン半径
０．６０乃至１．００Ａの一種またはそれ以上の二価の
金属の１乃至５グラム原子によって提供される０．１乃
至１．０％の金属舎量と、そして実質的に皆無のキレー
ト化した一価金属または皆無の分子内において細胞奏で
ある金属を含有していることによって特徴づけられる。
オルゴティン同族のアミノ酸組成は、それを単離するソ
ースにかかわりなく一定している。

第１表に分子量８２５００の数種のオルゴティン同族の
アミノ酸残基の分布を掲げる。船 船 注（１｝ 比色定量。

注｛２｝ アミノ酸分析の平均および分光定量上記第１
表から、オルゴティン同族は２０乃至２６の、および通
常は２０乃至２３のリジン基を有し、そのうち１乃至３
を除いてはすべて滴定し得るご−アミノ基（トリニトロ
ベンゼンスルホン酸）を持っている。

本発明はこのオルゴティンのリジン基の少なくともその
一部がアシル化されたオルゴティン誘導体の製法に関す
る。従って本発明はＮ−アシルオルゴティンに関し、本
発明によって得られる新規なアシル化オルゴティンは医
薬として有用であり、Ｎ−アシルオルゴティンを含む医
薬は炎症の治療に有効である。

天然のオルゴテインタンパクは特異的に高いスーパーオ
キシドジスムターゼ活性を持っている（マツコードおよ
びフリドビツチ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４４ ６
０４４（１９６９）：キール、マツコードおよびフリド
ビッチ、同誌２４５、６１７６（１９７０）：同誌２４
０２８７５（１９７１）参照）。

この活性は、前記リジン基をアシル化するとき例えば天
然タンパクの２０乃至５０％にきわ立って低下する。

驚くべきことに、天然タンパクの抗炎活性はアシル化に
よって影響を受けない。従ってこのアシル化タンパクは
、天然タンパクと同じように０甫乳類その他の動物の炎
症状態の治療に有用である。抗炎作用とＳＯＤアーゼ活
性との分離は、ＳＯＤアーゼ活性によって生ずる副次作
用の減少をもって抗炎療法を可能にする。

上述のように、オルゴティン同族は２０乃至２針固のＩ
Ｊジン基を持っている。

オルゴテイン分子は二つの同じべプチッド鎖（サブュニ
ット）より形成せられているので、これらのリジン基の
半分は、緩和な温度およびｐＨ条件下にあっては強く、
しかし非共有結合で結合している各鎖に存在している。
このオルゴティン分子の立体構造のために、通常各鎖中
のいくつかのりジンのどーアミノ基は、トリニトロペン
ゼンスルホン酸（ＴＮ斑）で滴定されず、そして容易に
はアシル化できない。しかしながら、滴定できないリジ
ンのご−アミノ基のァシル化も、例えば無水酢酸のよう
な適当なァシル化剤を使用して達成し得る。アシル化の
程度は、天然オルゴティンタンパクのリジン基の１乃至
３個はＴＮＢＳは滴定されないことを考慮に入れて、Ｔ
ＮＢＳ反応性アミノ基の減少によって測定できる。例え
ばウシオルゴテインは、その２０乃至２２個のＩＪジン
のうち、１８個だけが定量される。緩和なアミノ基のア
シル化は、霞気泳動に示される電荷変化を計数すること
によって定量化できる。しかしながら、普通の電気泳動
条件下（ｐＨ８．４トリスーグリシン緩衝液）では、広
範囲にアシル化したタンパクはそのバンドを識別するた
めにはあまりにも速く移動する。この問題は、後述する
ように天然オルゴティンでアシル化オルゴティンを混成
し、分子中のアシル基の数の半分に減らし、そして混成
した分子を露気泳動にかけることによって回避すること
ができる。一般的にいうと、ＩＪジンの約半分までは、
もっとも緩和なアシル化剤、例えばアセチルサルチル酸
でさえも容易にァシル化される。

それぞれのオルゴテインベプチツドのサブユニット中の
利用できる（ＴＮＢＳで滴定可能な）リジンの１個を除
いて全部は、強いアシル化条件、例えば氷冷Ｉｍｐ日７
．５のリン酸緩衝溶液中過剰の無水酢酸を用いてアシル
化することができる。予期されるように、滴定できるリ
ジンアミノ基の全部禾満をアシル化するときは、滴定し
得るリジンアミノ基のいずれかが特別にアシル化され易
い訳ではないので、オルゴティン分子上のアシル基の分
布は見掛け上不規則である。

オルゴティン分子は二つの同じべプチッド鎖で出来てい
るので、部分的にアシル化したオルゴティンのァシル基
は、それぞれのべプチッド鎖サブュニット上で多かれ少
なかれ不規則に分布し、二つの鎖の間では多かれ少なか
れ同等に分布する。通常単一のアシル化剤が使用される
ので、アシル基はすべて同じものである。しかしながら
二種もしくはそれ以上のアシル基を分子内、およびその
各鎖中にさえも有しているアシル化オルゴティンを製造
することが可能である。混合アシルオルゴティンを製造
する一方法は、違ったアシル化剤で段階的にァシル化す
ることである。

例えば、滴定し得るリジンご−アミノ基の一部分はァシ
ル化剤の一種の低濃度、例えば１×１０‐３Ｍ無水酢酸
でアシル化し、アミノ基の他の部分を他のァシル化剤の
中程度の濃度、例えば５×１０‐３Ｍコハク酸無水物で
アシル化し、反応性アミ／基の残りをさらに別のアシル
化剤の高濃度でアシル化することができる。何がアシル
化剤の低、もしくは高濃度であるかはタンパクアミ／基
との相対的反応速度と溶媒とに依存し、従ってこれは反
応ｐＨとァシル化剤の種類、そして少し‘ま緩衝液と温
度とに依存する。混合アシルオルゴテインを製造するも
う一つの方法は混成化によるものである。

オルゴティンの「混成化」とは、違ったオルゴティン２
分子のべプチッド鎖から混合オルゴティンを生成させる
こと、例えばＡ２と＆、ＡとＢがそれぞれをべプチッド
鎖であるとすると、ん十Ｂ２こ２ＡＢとなる。亀気泳動
におけるへテロダィマーＡＢの電荷は、それぞれのサブ
ュニットの同じ部分がすべての場合に結合に関与してい
ると仮定すると、ホモダィマ−Ａ２およびＢ２のそれの
平均値でなければならない。最初氷水中２．８時間、つ
いで室温で１時間、ＩＭ、ｐＨ７．５のリン酸緩衝液中
過剰の無水酢酸でアシル化した天然オルゴティン分子、
および０．１Ｍ、ｐＨ７．５リン酸緩衝液中室温で３．
朝時間スルクシニル化して製造したスクシニルオルゴテ
ィンは、少過剰の天然オルゴティンと５０ｏｏで４時間
加熱することによって天然オルゴテインでそれぞれ混成
化し得る。

生成するへテロダィマーは、アセチルオルゴティン／オ
ルゴティン混成物に対してはアセチル基１の卸こ相当す
る電荷をもって、スクシニルオルゴティン／オルゴティ
ン混成物に対しては９個のスルシニル基に相当する電荷
をもってそれぞれ主として１バンドとして電気泳動する
。ウシオルゴテインは１０または１１個のＩＪジンをサ
ブュニット当り含有するだけであるから、１個の天然オ
ルゴテインベプチツドサブユニツトプラス、そのすべて
のりジンご−アミノ基がアセチルアミノ基である１個の
アセチルオルゴティンベプチッドサブュニツトから、そ
して１個の天然オルゴティンベプチッドサブュニットプ
ラス、その１個を除くすべてのりジンごーアミノ基がス
クシニルアミノ基である１個のスルシニルオルゴテイン
ベプチッドサブュニットから、それぞれ混成物が生成す
る。容易にわかるであろうが、これらの混成半アシル化
オルゴティン分子は、別のアシル化剤によって一方のべ
プチッド鎖中のアシル基が他方のそれと異なる混成アシ
ル化オルゴティンを製造するためにさらにアシル化でき
る。

本発明によるＮ−アシルオルゴティンは、天然のオルゴ
テイン分子と殆んど同じ立体構造を持っているように見
える。キレート化されたＣｕ＋＋およびＺｎ十十（モル
当りのグラム原子数）含量もオルゴテインのそれと殆ん
ど同じである。オルゴテインと同じく、それらはプロナ
ーゼおよび他のタンパク分解酵素による分解に対して高
度に抵抗性である。しかしながら、スーパーオキシドジ
スムターゼ（ＳＯＤァーゼ）活性は下表に示すようにア
シル化の程度が増すにつれ、著しく大きく、オルゴテイ
ンのそれの約２０乃至５０％まで減少する。アシル基の
数の平均ＳＯＤアーゼ活性（オルゴティンに対する比率
）０ （１００％）』Ｎーアセ
チル １００９Ｎ−アセチル
８０１１Ｎ−アセチル
７０２０Ｎーアセチル
５０９Ｎースクシニル
６０１７Ｎースクシニル
２０Ｎーアシル基の種類は、Ｎーアシ
ル基の数と同様にそれが生理的に許容し得る酸のァシル
基である限り臨界的ではない。

オルゴティン分子の高分子量のために、オルゴティン分
子を全部中間的な分子量のァシル基、例えばＲＣＯ≧１
６０でアシル化する場合でも、全体の化学組成に対する
衝撃は比較的小さく、例えば１０％以下である。勿論、
遊離アミノ基のアシル化は、明らかに等露点に顕著な影
響を与え、そして等蚕点の移動を生ずるが、しかし後で
述べるように、分子のち密な立体形状には、外見上有意
義な影響を及ぼさず、そして結果として生ずる安定性、
例えば６０ＣＯにおいて１時間の加熱、およびタンパク
分解酵素による攻撃に対して影響を与えない。明白なこ
とであるが、アシル基は水中または緩衝溶液中でアミノ
基をアシル化できるアシル化剤から誘導されなければな
らない。

なんとなれば通常反応はその中で行われるからである。
このようなアシル化剤としては、水溶性カルボジィミド
類のようなアシル化触媒と組み合わせた遊離酸、酸ハラ
イド、無水物、チオェステル、ケテン、ケテンダイマー
、エノールエステルおよびチオエステル、Ｑ−アミノ酸
−Ｎ−カルボキシアンヒドライドなどがある。さらに詳
しくは、本発明はアシル基が炭素数８までの一もし〈は
二塩基性炭化水素カルボキシル酸、例えば一塩基性アル
カン酸、例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ィソ
酪酸、Ｑ−エチル酪酸、バレ１」アン酸、ィソバレリア
ン酸、Ｑ−エチルバレリアン酸、トリメチル酢酸、２−
メチル酪酸、３−エチル酪酸、ヘキサン酸、ジェチル酢
酸、トリェチル酢酸、ェナント酸、オクタン酸、環状酸
好ましくは脂環酸、例えばシクロプロピリデン酢酸、シ
ク。

ブチルカルボキシル酸、シク。ベンチルカルボキシル酸
、シクロベンチル酢酸、８ーシクロベンチルプロピオン
酸、シクロヘキシルカルボキシル酸、シクロヘキシル酢
酸、炭素環状アリールまたはアラルキル酸、例えば、安
息香酸、２−、３−もしくは４−メチル安息香酸、また
は二塩基性アルカン酸、例えばシュウ酸、マレィン酸、
フマル酸、グルタル酸、Ｑ−メチルグルタル酸、８ーメ
チルグルタル酸、８・３−ジメチルグルタル酸、アジピ
ン酸、ピメリン酸およびスベリン酸のアシル基であるＮ
ーアシルオルゴティンに関するものである。好ましいア
シル基のグループは、好ましくは炭素数２〜８個の直鎖
もしくは分枝一塩基性アルカン酸のアシル基、例えばア
セチル、プロピオニル、ブチリル、イソブチリルであり
、そのうちアセチル基がもっとも好ましい。

他の好ましいアシル基のグループは二塩基性酸のアシル
基、例えば特に環状酸無水物を形成し得るアルカン酸も
しくはアリル酸のアシル基、例えばコハク酸、マロン酸
、グルタル酸およびフタル酸のそれであり、そのうちコ
ハク酸が好ましい。アシル基の正確な化学的性状は、そ
れが生理的に毒性でなく、そしてリジンのごーアミノ基
をアシル化し得るものである限り重要ではないので、上
記の好ましいアシル基に対しての企図する均等物は、ま
た分子中に１個、２個またはそれ以上の簡単な置換基、
例えばヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、アシルオキシ、
スルホニルオキシ、アミド、スルフアト、ニトロ、メル
カプト、およびシアノを分子中に有している酸、例えば
グリコール酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、ｄ−リンゴ酸
、ｄーグリセリン酸、マンノン酸、グルコン酸およびサ
リチル酸のアシル基、アミノ酸、例えばグリシン、アミ
ノプロピオン酸、ジグリコールアミン酸、トリグリコー
ルアミン酸、メチルグリシン、ジメチルグリシン、ジエ
チルグリシン、パラアミノサリチル酸、パラアミノ安息
香酸、およびエチルメルカプト酢酸、クロル酢酸、フル
オロ酢酸、トリクロル酢酸、トリフルオロ酢酸、チオグ
リコール酸、ｍ−ニトロ安息香酸、フェノキシ酢酸のア
シル基であってもよい。以下に記載する実施例のＮ−ア
セチル「ウシ」オルゴテインおよびＮ−スクシニルオル
ゴテインのほかに、本発明のＮ−アシル「ウシ」オルゴ
ティンの他の例は、Ｎ−プロピオニルオルゴティン、Ｎ
一ブチリルオルゴテイン、Ｎ−ペンゾイルオルゴテイン
、Ｎ一フタリルオルゴテインであり、それぞれの場合オ
ルゴティン分子の二つのサフュニツトのそれぞれにこの
ようなアシル基が９個存在するもの、およびこのような
サブュニット中にそれぞれこのようなアシル基が１個、
６個およびＩＮ固存在する対応するオルゴティン、さら
にこれらのそれぞれのヒト、ヒツジ、ウマ、ブタ、ィヌ
、ウサギ、モルモットおよびニワトリの対応する同族体
である。

命名法を統一して使用するために、二塩基性酸から誘導
されるＮーアシルオルゴティンのアシル基の命名に当っ
ては、二個基の命名法、例えばスクシニル、マロニル、
グルタリルおよびフタリルを使用する。

しかしながら容易に理解し得られるように、このＮ−ア
シル基は一価であり、そして２個のアシル基の一方は遊
離のカルボキシル基であるから、もっと正確にはこのア
シル基はカルボキシ置換アシル基、例えばそれぞれ８−
カルボキシプロピオニル基、カルボキシアセチル基、ｙ
−カルボキシブチリル基、および０−カルボキシベンゾ
ィル基である。アシル化したオルゴティンは反応液から
、好ましくは爽雑イオンを除去するため透析した後、慣
用の凍結乾燥、例えばアメリカ特許第３７５８６８２号
に記載の方法で単離することができる。所望であれば、
アシル化したオルゴティンは最初にイオン交換樹脂クロ
マトグラフィー、竜気泳動、および分子ふるいとして行
動するポリマーを使用するゲルロ過法で精製することが
できる。微小孔フィルター、例えば「ミリポァ」による
、慣用の方法での場合によりＮａＣＩおよび／またはリ
ン酸ナトリウムによるイオン強度の調整、例えば等眼化
後における無菌／ゞィャルへのロ過は、注射役に通した
無菌溶液を与える。

Ｎ−アシルオルゴテイソの医薬製剤はＮーアシルオルゴ
ティンと、医薬的に許容し得る担体とよりなる。

この担体の形および性格は、勿論投与方法によって決ま
る。好ましい製剤は、例えば無菌の注射し得る水溶液の
ような無菌注射製剤である。

この溶液は上述の担体を使用してこの分野で公知の技術
に従って処方することができる。無菌注射製剤は、無毒
性の非経口的に許容し得る希釈剤もしくは溶剤、例えば
１・３ープタンジオール中の無菌の注射可能な溶液また
は懸濁液とすることもできる。Ｎ−アシルオルゴティン
製剤はＮ−アシルオルゴティンの有効単位投与量を含む
。すなわちこの製剤の単位投与量を特定の医薬担体に適
したルートによって投与するときに所望の応答を示すの
に有効な濃度にＮ−アシルオルゴティンが存在する。例
えば、注射液および局所用の液剤は、通常０．２５乃至
１０ｃｃ当り、好ましくは約０．５乃至５ｃｃ当りＮ−
ァシルオルゴティン約０．５乃至２０の９を含有する。
静脈輸液はもっと希薄で、例えば節液５０乃至１０００
肌当り、好ましくはｌｏｏ乃至５００の‘当りＮ−アシ
ルオルゴティン０．５乃至２０の９を含有し得る。錠剤
、カプセル、座薬は通常単位当り、Ｎ−アシルオルゴテ
ィンを０．１乃至２５の９、好ましくは１乃至１０の９
を含有する。Ｎーアシルオルゴティンは通常点滴または
注射により、例えば筋肉内、皮下、静脈もしくは皮内で
投与する。

筋肉内投与が好ましいが、ショックの場合は効果のもっ
と急速の発現のために静脈内がいよいよ好ましく、そし
てある種の局所化した病状、例えは放線および間質性‘
まうこう炎の場合は、局所注射がいまいまもっと有効で
ある。個々の投与塩は０．５乃至２０の９の範囲内にあ
る。ヒトに対する好ましい範囲は約０．５乃至４の９で
あり、ウマでは約５．０乃至１０．０の９の範囲である
。正確な投与量は一概に決められず、そして病気の型と
重篤度による。Ｎ−アシルオルゴテインは、オルゴテイ
ンと同様に、合成抗炎症剤が、例えば長期使用時の毒性
ある副作用のために使用が制限されている場合を含む多
種類の炎症状態の治療に有効である。

さらに詳しくは、Ｎ−アシルオルゴティンは、各種補乳
動物の炎症の軽減およびその症状の緩解、例えば尿道お
よび関節を含むそれらに効果がある。それはまた回復後
の関節炎にともなう徴候および構造変形、および粘液嚢
炎、けん炎、骨関節炎のようなリュウマトイト病の緩和
に有用である。オルゴティン同族の単離法、投与モード
、投与形態、用法およびＮ−アシルオルゴティンでの処
置に服し得る炎症その他の症状を含む本発明のＮ−アシ
ルオルゴテインの使用法に関するこれ以上細部の詳細は
、アメリカ特許第３７５８６８２号明細書を参照された
い。

これ以上工夫することなく、当業者は上述の記載を使用
して本発明をその限度全部に使用できるものと信ぜられ
る。

従って以下の特定した具体例は単に例証のためであり、
記載の他の部分を決して限定するものではないと考える
べきである。

以下の実施例のすべてにおいて、オルゴティンとして、
第１表に示したようなウシオルゴティンを使用した。

Ｎ一アセチルオルゴテイン 実施例 １ アセチルサリチル酸（アスピリン）の使用天然オルゴテ
ィンとアスピリンとの下記条件下でのインキユベーシヨ
ンはＮ−アセチルオルゴティンの混合物（露気泳動像に
よる）を与える。

ァセチノ誓数ソＰＨ 量 綱願を宣言鰭 る平均） ａ ７．５ １０の２〆地 ２時帯電３７℃
０．５ｂ ７．５ １０雌〆秋 ４時帯電 ３７
℃ ０．３ｃ ７．５ １０雌〆地２０時帯
電３７０Ｃ １ｄ ７，８ ５雌〆のＺ
４日 ３７℃ １０〜１１（毎日補充）ｅ ９．０
１０物〆抗Ｚ ３時帯電 ３７０Ｃ ８ｆ
９．０ １０職〆のＺ ５峠帝節 ３７℃
９ｇ ９．０ １０物〆地２１日間３７℃
１１平均１１個までのＮ−アセチル基は０．０８Ｍ
アスピリンとＰＨ９．３７０でオルゴテインをインキユ
ベーションすることによって導入することができる。

もっと広範囲なアセチル化は、アスピリンのさらに大過
剰および／またはもっと長い反応時間とで達成すること
ができる。実施例 ０ Ｎ−アセチルイミダゾール（ＮＡｃｌｍ）の使用（ａ）
オルゴテイン１２の夕／１の【、ｐＨ７．ふ ０．０５
Ｍホウ酸塩十１６の９ＮＡｃｌｍ／２の【、ｐＨ７．５
、０．０９Ｍホウ酸塩、室温１時間。

セフアデックスＧ−２５のカラムを通過させ、脱塩し、
かつ反応を停止せよ。０．７アセチル化チロシン／分子
と当量の△。

。２７５ｎｍ（水中）。

トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮ斑）定量は残存滴
定可能遊離アミノ基４個を示した。

‘ｂ’オルゴテイン１２の９十２０の９ＮＡｃｌｍ／１
の‘、ｐＨ７．ふ ０．０９Ｍホウ酸塩、室温１時間。
上のように脱塩せよ。０．９アセチル化チロシン／分子
と当量の△。

Ｄ２７５ｎ肌（水中）【Ｃ）オルゴティン４０の９（不
純試料）十３２爪９ＮＡｃｌｍ／１．０の‘、ｐＨ７．
５ホウ酸塩、室温１時間。

上のように脱塩せよ。２．４アセチル化チロシン／分子
と当量の△。

ｏ２７５ｎの（水中）。（高い値は不純物のチロシンア
セチル化によるものと思われる）。｛ｄ｝ オルゴテイ
ン２５の９十８０の９ＮＡｃｌｍ／６Ｍ、０．０５の、
ｐＨ７．５ホウ酸塩、室温１時間。

透析し、凍結乾燥せよ。収量２１の９（マイクロビュゥ
レットによりタンパク８６％）。１．３アセチル化チロ
シン／分子と当量の△の２７５ｎの（７ＭグアニジンＨ
ＣＩ中）。

Ｎ−ァセチル化度：広範囲（雷気泳動）。

１７．け固のうち遊離ァミノ基１個残存（ＴＮ既定＊＊
量）。

アンガーバィオアッセィ：十分に活性。

金属：Ｚｎ十十＝１．８、Ｃｕ＋十＝２．１グラム原子
／分子電気泳動：オルゴティン＝１．３、アセチルオル
ゴテイン＝１６ＳＣＤアーゼ活性：ｐＨ７．５、チトク
ロームＣ定量において天然オルゴティンの５１％活性。

【ｅ’ オルゴテイン２５の９十８０の９ＮＡｃｌｍ／
６Ｍ、０．０９Ｍ、ｐＨ７．５ホゥ酸塩緩衝液、室温２
時間。亀気泳動：オルゴティン＝１．１：アセチルオル
ゴテイン＝１３【ｆ’ オルゴテイン＋ＮＡｃｌｍ／ｐ
Ｈ７．５、０．０９のホウ酸塩、室温３時間。ＮＡｃｌ
■／ ＴｙｒＯＡｃ／ ＮＡＣオルゴティン
オルゴティン （雷気泳動）（〇Ｄ２７５ｎｍよ
り）（１） ５物イ他 ２．１モルノモル ５モルノ
モル（平均）（２）１０物イ物 １．５モルノモル
広範団用実施例 ｍ無水酢酸の使用 Ａ ＰＨ６．２および８におけるアセチル化：緩衝溶液
中における天然オルゴティンの無水酢酸による処理は、
Ｎーァセチル化オルゴティンの混合物を与える。

達成されるアセチル化の程度は主として溶液のｐＨと、
そして溶液体積当り加えられる無水酢酸の量と、そして
一部は緩衝液と温度とに依存する。以下において体積の
単位「マイクロリットル」を慣用によってギリシャ文字
入で表す。

オルゴティン Ａｃ２０ ＰＨ
温度 時帯電
反応度３．４４雌イのＺ、 ３ス、 ６．２
， ０．１３Ｍ ＮａＯＡＣ，ぅにｋ， ２時
市酌， 僅 少同 上 ５０え，
６．２， ２．０２Ｍ ＮａＯＡ０，４０Ｃ
１６暗闇、 いくらか４．０５物イのＺ， ５１
ス， ８，出発 Ｐ日 氷水，
１峠帯母， 広範囲Ｂ ｐＨ７．５および氷水温度に
おける継続ァセチル化：（１’ ４．０８の９／叫のオ
ルゴティン溶液０．２５０の【を水２．００肌【で希釈
した。

６、１０、１４および２０入部の無水酢酸を一定のかき
まぜ下にこのオルゴティン溶液に加えた。

２机とギルモントミクロビュゥレットから０．瓜ＮａＯ
Ｈを加えて反応ｐＨを７．５に維持した。

コンスタントなｐＨ値７．５（ＮａＯＨを加えなくても
）によって示されるように、無水酢酸の一部分が反応し
たときに、反応液１００入をバルクより取り出し、それ
以上の反応進行を停止するために０．０１ＭＮａＯＡｃ
の１．００の‘に加えた。

この部分的にアセチル化されたオルゴティン溶液を、後
に電気泳動によってアセチル化度を測定するために４℃
で貯えた。これらのサンプルの鰭気泳動描写図 （ＥＰＧ）は、２．０地中の最初の無水酢酸６＾が消費
された後においてはオルゴテイン分子のアセチル化は殆
んど完全であったことを示した。

（２）４肌Ｃｇ′の‘オルゴティン溶液３本を、それぞ
れ０．０弧、ＰＨ７，５リン酸緩衝液１，ｏｏ凧‘を含
有するバィアル３本に４．０８の９／泌オルゴテイン溶
液１０＾を加えて調製した。

これらの溶液各自に、１・４ージオキサン中１０％Ａｃ
２０Ｗ／Ｖ）の５入、１０入もしくは３０入を氷水温度
で激しくかきまぜながら加えた。１時間かきまぜた後、
これらの反応混合物を電気泳動でしらべた。

これら３本の溶液すべてにおいて部分的にアセチル化さ
れたオルゴティンのバンドが見られ、反応が不完全であ
った。灘 節数 肌た形ソ濠 ａ） ５ス１０※ Ａｃ２０ ‐７からｉ平均１０１４
ｂ）１０え１０％ Ａｃ２０ □９から‐平均１２〜１
３１４以上ｃ）３０え１０％ Ａｃ２０ ＝９から中平
均１２〜１３１４し〆上Ｃ Ｏ。

０および室温下での継続アセチル化：オルゴテイン約２
０ｍｐをＩＭ、ＰＨ７．５のリン酸緩衝液に溶解した。

かきまぜながら、氷水もしくは室温下で４０入の無水酢
酸を徐々に加えた。２叫ギルモントマイクロビユウレツ
トから母ＮＮａＯＨを加えることにより、反応液のｐＨ
を７．５に維持した。

無水酢酸の添加分が消費されてしまったという指示であ
る反応液の軸が７．５力）ら低下するのを停止したとき
、反応液をアセチル化度を決定するために露気泳動でし
らべる。通常無水酢酸の４．碇都が氷水温度では１乃至
２時間で、室温では２０乃至６０分間で、それ以前に無
水酢酸をいくら加えたかに依存して消費された。アセチ
ル化は、約１６０の無水酢酸が消費された後、蚤気泳動
移動の最高の増加を生じた。反応生成物を水で透析し、
凍結乾燥した。反応時間 製品 オルゴテイン Ａｃ２０ 氷ス船渡 室温 収 量 （１）２０５雌ソ勿Ｚ１２０え４．５時帝罰 一 １
６．５吻ソ５のＺ（２）２０．郭咳〆２のＺ １２０ス
２．８時帯電１峠支配１８．８劫物ソ５妙アセチル化し
たオルゴティンの性質は以下のように要約される。

電気泳動描写図 タンパク（アミドブラツク）染色： ｐＨ８．２における天然オルゴテインより約１７倍も遠
く移動する不鮮明ではあるが、しかし狭いバンド。

酵素（ＮＢＴ−リボフラビン）染色： タンパクバンドの同じ位置において、不鮮明ではあるが
しかし狭いバンド。

ＴＮＢＳ定量（遊離の滴定し得るアミノ基の数）実施例
ｍＣ｛１１ ３個のアミノ基実施例ｍＣ■ １〜２
個のアミノ基 ヒドロキサム酸塩定量（０ーアセチル基の数）実施例ｍ
Ｃ【１｝ ≧２ ０ーアセチル基ＵＶ吸収天然オルゴ
ティンに非常に類似。

アセチル化および天然オルゴティンについて光学密度（
０ぴ７８）の比較は、実施例ｍＣ【１｝および■のアセ
チルオルゴテインにはチロシンー０−アセチル基が存在
しないことを示す。

金属含量（原子吸収による） Ｃｕ十十 実施例ｍＣｍ １．８５グラム原子／モル
実施例ｍＣ■ ２．０４グラム原子／モルＺｎＨ 実施
例ｍＣ‘１｝ １．７３グラム原子／モル実施例ｍＣ
‘２’１．９１グラム原子／モルｐＨ７．５で２．７×
１０‐４ＭＥＯＴＡに対する透析は、約５％のＺｎ＋＋
およびＣｕ十十のそれ以下だけがタンパクから除去され
得ることを示した。

プロナーゼ消化性 アセチルオルゴテインをプロナーゼと３７０、２１時間
インキュベートした後も、露気泳動描写図（タンパク染
色）に変化が認められない。

チトクロームＣ定量（ＳＯＤアーゼ活性）実施例ｍＣ（
１ーの活性パーセント（天然オルゴテインの活性１００
％を基準として）ＰＨ７．６ ＰＨＩＯ．２ ３３±２％ ４３土３％ Ｄ アセチルにおけるリン酸緩衝液の効果：０．０８Ｍ
、ＰＨ７．５のリン酸緩衝液およびトリスーＨＣＩ緩衝
液中、氷水温および室温でアセチル化を実施した。

電気泳動描写図によると、氷水温でのリン酸およびトリ
ス一日ＣＩ緩衝液中では、アセチル化反応に認むべき差
異はなかった。室温では、リン酸緩衝液中のアセチル化
は、トリス一日ＣＩ緩衝液のそれよりも、もっと広範囲
であった。Ｎースクシニルオルゴテイン 実施例 Ｗ ｐＨ８、氷水温度における無水コハク酸の使用ォルゴテ
ィン 無水コバク酸 反応氏前記 反応度３．８０雌ソ
１．０のＺ ０．７力咳 １．５時帯電 広範囲上
の１／２ ０．３７雌 １．５時帯電 広範囲
Ａ 継続的スクニシル化。

継続的スクニシル化の操作は、実施例ｍＢ｛１）の継続
的アセチル化に類似のものであった。

反応はｐＨ８および７．５で行われた。ＳＯＤアーゼ活
＊＊ 性を反応の各段階で反応液を分取し、ｐＨＩＯ．
２のチトクロームＣ定量によって測定した。活性パーセ
ント（天然オルゴティンの１００％活性を基準として）
を、オルゴティン水溶液（５．１６の９／私）ｐＨ８．
０００に対するエタノール溶液（５．１５の９／泌）と
しての無水コハク酸のモル比の各段階について示せば下
の通りである。無水コハク酸 添加した金属／ １．６×１０−４Ｍオルゴテイン ＳＯＤアーゼ活性天然オルゴティンの％ 〇 （１〇〇）１．１×１０
‐３Ｍ ８９２．７×
１０−３Ｍ ７０４．
９ｘｌｏ−３Ｍ ３９８
．２ｘｌｏ−３Ｍ ３６
１２．８ｘｌｏ‐３Ｍ
２３無水コハク酸を４．３７の９′地のエタノール溶液
として１０．４５の夕／肌のオルゴティン水溶液２．２
５机上に加えることを除いては、前記と同じ操作を繰り
返すことにより、ＳＯＤアーゼ活性はオルゴティンのそ
れの６０％に急速に低下し（０．１の【以下の添加後）
、その後０．６地の添加後において約４８％に徐々に低
下した。

Ｂ スクシニルオルゴテイン： 操作は実施例ｍＣによるアセチルオルゴティンの製造の
ためのそれと同じであった。

ただし、もっと低濃度の（０．１Ｍ）ｐＨ７．５のリン
酸緩衝液を使用し、そして無水コハク酸は４の９（反応
開始時）または８の９（反応終了に向って）を添加した
。オルゴテイン 無水コハク酸 父山
日邦日 ４ミ成物氷水温 峯温
収 量（１）２０．３０ｍｇ／２ｍｌ １４‐９３
ｍｇ ５時間 −「 １７２５ｍｇ／５ｍｇ
（２）２０′７ｍｇ／２ｍ１ ２２。

３ｍｇ −３．６叫間 １８．１５ｍｇノ
５ｍｇスクシニル化したオルゴティンの性質は以下のよ
うに要約される。

電気泳動描写図 タンパク（アミドプラック）染色： 不鮮明だが、しかしＰＨ８．２において天然オルゴティ
ンより約２Ｍ音も速く（十）極に向って移動した比較的
狭いバンド。

酵素（ＮＢＴ−リボフラビン）染色： 不鮮明だが、しかしタンパクバンドと同位暦の比較的狭
いバンド。

ＴＮＢＳ定量（遊離の滴定できるごーァミノ基の数）実
施例ＷＢ【１ー ３個のアミノ基 実施例ＷＢ（２； ３個のアミノ基 ＵＶ吸収 天然オルゴティンに非常に類似。

スクシニル化、および天然オルゴティンについて○びね
ｎｍの比較は、スクシニルオルゴティン中にはチロシン
−０ースクシニル基は存在しないことを示す。金属含量
（原子吸収による） Ｃｕ十十 実施例ＷＢ‘１’ ２．０４グラム原子／モ
ル実施例ＷＢ■ ２．３７グラム原子／モルＺｎ十十
実施例ＮＢ（１１ １．９０グラム原子／モル実施例
ＷＢ■ ２．１５グラム原子／モル２．７×１０‐４Ｅ
ＤＴＡに対してスクシニルオルゴティンをｐＨ７．５で
透析すると、Ｚｎ十十の約５％と、ＣｕＨのそれ以下だ
けがタンパクから除去できることを示した。

実施例 Ｖ Ｃーデ力（Ｎーアセチル）ーオルゴテイン、Ｃ−１十（
Ｎースクシニル）−オルゴテイン：アセチルオルゴティ
ンと天然オルゴテインとの混成化を、二種のタンパクの
等モル混合物を溶液中、ｐＨ７〜８、５０ｏｏ、４時間
加熱して行なった。

生成する混成物のｐＨ８．２における軍気泳動描写図は
、１０アセチル基／へテロダィマーに相当する電荷で、
電気決勤上主として単一のバンドであった。この部分的
にアセチル化したオルゴティン、Ｃーデカ（Ｎーアセチ
ル）ーオルゴテインは、Ｎーアセチル基がオルゴテイン
を構成する二つのべプチド鎖Ｃに無差別に分布している
のではなく、鎖のうちの一方だけに存在するという点で
、アセチル化剤の低濃度でオルゴティンを処理して得ら
れた部分的にアセチル化したオルゴティンとは異なつて
いる。スクシニルオルゴティンの天然オルゴテインとの
混成化を上記のアセチルオルゴティンについて記載した
のと同じ方法で行った。

へテロダイマーは再び露気泳動で単一バンドであるが、
しかし９個のスクシニル基／へテロダィマー、すなわち
Ｃ−１十（Ｎ−スクシニル）ーオルゴテインに相当する
電荷であった。二種の置換オルゴティンの混成化も同様
に行うことができる。

例えば、アセチルオルゴテインとスクシニルオルゴティ
ンとを溶液中で一所に加熱し、Ｃ−デカ（Ｎーアセチル
）−Ｃ′一１十（Ｎ−スクシニル）ーオルゴティンを製
造することができる。実施例 Ａ 実施例１〜Ｖで得られたＮ−ァシルオルゴティンの溶液
にデキストローズを５％Ｗ／Ｖに溶解し、ミリポア微小
孔ロ過によって滅菌し、あらかじめ滅菌したアンプルも
しくはバィアルに無菌充填する。

その後無菌粉末に凍結乾燥する。実施例 Ｂ 無菌水、もしくは無菌等張食塩水（０．１のｃ／１０泌
）中の実施例１〜Ｎのいずれかで得た、純粋なもしくは
実質上純粋なＮーアシルオルゴティンを１０ｃｃ毎直接
無菌ゴム栓つきバィァルに無菌充填する。

バィアルにキャップをし、シールする。

貯蔵のため凍結する。実施例 Ｃ 実施例Ｂの操作を反覆する。

ただしキャップをする前にバィアルを中味を凍結乾燥す
る。実施例 Ｄ 前述の実施例１〜Ｖのいずれかに記載した単離Ｎ−アシ
ルオルゴティン１５部と、ショ糖３疎部を秤取し混合す
る。

混合物をアンモニアガスであらかじめｐＨ９．４に調節
した脱ミネラル水３礎部‘こ溶解する。溶液をついで０
．４５一のあらかじめ濡らしたミリポアフィルターで少
し〈減圧してロ過する。ロ液の容積を測定し、その中の
タンパクの重量を以下のように算出する。ロ液２の‘を
ビュウレット試薬３の上と混合し、そして混合物を１８
分間３７ｏ０でインキュベートする。

混合物の５５則仇における吸収を水（緩衝液）プランク
と比較して測定する。雌／の【での濃度は５５５ｎｍに
おける吸収を８．９倍することで得られる。水性試料は
柵に冷蔵する。

凍結乾燥によって、室温での貯蔵に安定で、そして水で
復元するとき不溶性の変性したタンパクを含まない固体
のＮ−アシルオルゴテイン組成物が得られる。実施例
Ｅ 保存剤として、０．２５〜０．５％のフェノールと０．
００４〜０．０１％のチメロサール、０．００３〜３％
のメチルパラベン、０．０５〜０．２の窒化ナトリウム
または０．０５〜０．２％のペンジルアルコールを食塩
水に加えるほかは、実施例Ａ、Ｂ、Ｃ、またはＤの操作
を反復する。

実施例 Ｆ 純粋な、または実質上純粋なＮーアシルオルゴティン、
例えば実施例ｍＣ■で得られたものの溶液に、ショ糖を
５％Ｗ／Ｖまで溶解する。

ミリボアロ過で滅菌し、あらかじめ滅菌したアンプルも
しくはバイアルに、アンプルもしくはバイアル当り所望
量のオルゴティン、例えば一回投与のバィアルでは０．
１〜５の夕、多回投与のバィアルでは５〜５０の夕を与
えるような量を無菌充填する。バィアルを密閉し、また
は密閉し溶液を凍結する。実施例 ＧＮ−アシルオルゴ
テインの重量の１〜３倍のデキストロースをショ糖の代
りに用い、実施例Ｆの操作を反復する。

実施例 日 実施例１〜ＶのいずれかのＮ−アシルオルゴティンの０
．１〜５の９を用いて実施例Ａ〜Ｆの操作を反復する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ アシル基が少なくとも１個のリジンε−アミノ基に
   存在し、そして炭素数８以下の一もしくは二塩基性炭化
   水素カルボキシル酸のアシル基であるＮ−アシルオルゴ
   テイン。 ２ オルゴテインがウシオルゴテインである特許請求の
   範囲第１項のＮ−アシルオルゴテイン。 ３ 分子当たり少なくとも１０個のＮ−アシル基を持っ
   ている特許請求の範囲第１項のＮ−アシルオルゴテイン
   。 ４ オルゴテインがウシオルゴテインである特許請求の
   範囲第３項のＮ−アシルオルゴテイン。 ５ アシル基が炭素数２〜６のアルカノイル基である特
   許請求の範囲第１項のＮ−アシルオルゴテイン。 ６ アシル基がアセチル基である特許請求の範囲第１項
   のＮ−アシルオルゴテイン。 ７ オルゴテインがウシオルゴテインである特許請求の
   範囲第５項のＮ−アシルオルゴテイン。 ８ 分子当たり少なくとも１０個のＮ−アシル基を有す
   る特許請求の範囲第５項のＮ−アシルオルゴテイン。 ９ アシル基がスクシニル基である特許請求の範囲第１
   項のＮ−アシルオルゴテイン。 １０ オルゴテインがウシオルゴテインである特許請求
   の範囲第９項のＮ−アシルオルゴテイン。 １１ 分子当たり少なくとも１０個のＮ−アシル基を有
   する特許請求の範囲第９項のＮ−アシルオルゴテイン。