NO742001L - - Google Patents

Description

Farmasøytika.

Foreliggende oppfinnelse vedrører

A. lokalanestetisk aktive forbindelser av tertiær alkylamin-lavere-acylxylididtypen;

B. Et nytt anestetisk preparat bestående av en blanding av (1) tetrodotoxin eller visse derivater derav og (2) en annen forbindelse, van-, ligvis en konvensjonell lokalanestetisk forbindelse eller en lignende forbindelse med nerveblokkerende egenskaper. Oppfinnelsen angår også en fremgangsmåte til fremstilling av de nye anestetisk virksomme preparatene og deres anvendelse for fremkalling av anestesi;

C. Et nytt lokalanestetisk preparat bestående av en blanding av (1) saxitoxin og (2) en annen forbindelse, vanligvis en konvensjonell lokalanestetisk forbindelse eller én lignende forbindelse med nerveblokkerende egenskaper, en fremgangsmåte for fremstilling av et slikt preparat og anvendelse derav for fremkalling av anestesi; D. En fremgangsmåte for tilveiebringelse av spinalanestesi og et farmasøytisk preparat som kan anvendes ved denne metode. Oppfinnelsen angår spesielt nye anvendelser for saxitoxin;

E. En fremgangsmåte for tilveiebringelse av spinalanestesi og et farmasøytisk preparat som kan anvendes ved denne metode. Oppfinnelsen angår spesielt nye anvendelser for tetrodotoxin og desokxytetrodo-toxin.

Sammenfatning av oppfinnelsen

A. Tert.alkylamin-lavereacylxylidider har uvanlig langvarig lokalanestetisk effekt eller høy lokalanestetisk aktivitet og samtidig et tilfredstillende lavt nivå av vevsirritasjon og en tilfredstillende lav akutt toksisitet. • Kombinasjoner av slike lokalanestetika med biotoxinene tetrodotoxin eller saxitoxin tilveiebringes. Nye tert.-alkyl-s^ek. aminer og fremgangsmåte til fremstilling av slike lokalanestetika og aminer blir også tilveiebragt.

B. Et lokalanestetisk preparat bestående av en blanding i en farma-søytisk akseptabel bærer av et spesielt toxin, tetrodotoxin eller desoksy tetrodotoxin, og en annen forbindelse vanligvis en konvensjonell lokalanestetisk forbindelse eller en lignende forbindelse med nerveblokkerende egenskaper. C. Et lokalanestetisk preparat bestående av en blanding i en farma-søytisk akseptabel bærer av et spesielt toxin, saxitoxin, og en annen forbindelse, vanligvis en konvensjonell lokalanestetisk forbindelse eller en lignende forbindelse med nerveblokkerende egenskaper. D. Hvirveldyr kan anestiseres ved subdural administrasjon av saxitoxin. Den mengde som administreres i en foretrukken utførelsesform varierer mellom 0.25 og 10 yg.

E. Hvirveldyr kan anetiseres ved subdural administrasjon av tetrodotoxin eller desoksytetrodotoxin. Den mengde tetrodotoxin som administreres ifølge en foretrukken utførelse varierer mellom 1 og 12 yg, mens mengden av desoksytetrodotoxin varierer mellom 10 og 120 yg.

Følgende beskrivelse inneholder 5 deler kalt del A, B, C, D og E, respektivt. Innen hver del starter nummereringen av eksempler og tabeller med 1.

Del A

To kommersielt tilgjengelige lokalanestetiske forbindelser av acylxylididtypen er N-n-butylpipekoly1-2,6-xylidid eller bupivakain, ("Marcaine") som har strukturformelen: og diety laminoaceto-2 ,6-xy lidid eller oj-diety lamino-2 ,6-dimetylacet-anilid eller lidokain, ('Xylocaine") som-har strukturformelen:

Bupivakain eller "Marcaine" er et lokalanestetikum med langvarig virkning, men det har den ulempe at det er mer vevsirriterende enn lidokain og lidokain eller "Xylocaine" er ikke vevsirriterende, men det har den ulempe at det ikke er et lokalanestetikum med langvarig virkning.

Andre kommersielt tilgjengelige lokalanestetika er a-propyl-aminopropio-2-toluidid eller prilokain, ("Citanest"), a-pyrrolidino-aceto-2,6-xylidid ("Endocaine"; og Dynacaine"), og N-metylpipekoly1-2,6-xylidid eller mepivakain, ("Carbocaine"). Disse lokalanestetika er imidlertid korttidsvirkende.

Det vesentlige formålet med foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe forbindelser som har uvanlig lang .lokalanestetisk effekt eller høy lokalanestetisk aktivitet samtidig som de også har en lav grad av vevsirritasjon og en tilfredsstillende lav akutt toksisitet.

De lokalanestetiske forbindelsene ifølge oppfinnelsen er ter-tiære alkylamino-acetoxylidider eller -propionoxylidider. Mer spesielt er disse forbindelser følgende:

A. 2-(tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid

B. 2-(tert.butylamino)-2',6'-propionoxylidid

C. 2-(N-etyl-tert.amylamino)-2',6<1->acetoxylidid D. 2-(N-n-propyl-tert.amylamino)-2',6'-acetoxylidid E. 2-(N-n-buty1-tert.butylamino)-2',6'-acetoxylidid F. 2-(N-tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid

Disse forbindelser kan syntetiseres eller fremstilles ifølge'de metoder som er angitt i eksemplene og illustrasjonene.

1. En fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser med formelen:

og farmasøytisk akseptable salter derav, hvor R<1>er hydrogen eller

-CH^, R2. er H, "CgH eller -CH^H^CH^og R<3>er

TO 1

forutsatt at radikalene R , R og R i formel I kombineres som i det følgende:

karakterisert vedat

a) en forbindelse med formelen: .omsettes med en forbindelse med formelen:

for dannelse av en forbindelse med formel I, i hvilke formler X er 12 3

Cl, Br eller I og R , R og R har den ovenfor angitte betydning; eller

b) en forbindelse med formelen:

hvor R<4>er -CH2CH , ^H^CH^CH^,

omsettes med et alkyleringsmiddel for dannelse av en forbindelse med formel I; hvoretter forbindelsen med formel I som således .oppnåes, om ønskelig, omsettes med en farmasøytisk akseptabel syre og/eller opp-løses i sine optiske isomerer.

Disse metoder kan illustreres av følgende partielle reaksjons-formler:

I A Fremstilling av 2-( tert.- butylamino)- 2', 61- acetoxylidid

Istedenfor kloracetylxylidid kan tilsvarende brom- eller jod-forbindelse benyttes. Om ønsket kan Nal, Kl eller et egnet kvartært ammoniumjodid være tilstede under reaksjonen når klor- eller brom-forbindelsen anvendes.

I B Fremstilling av 2-( tert.- butylamino)- 2', 61- propioxylidid

Denne forbindelse kan fremstilles ved hjelp av den metode som er beskrevet i I A under anvendelse av 2-halogen-propionoxylidid istedenfor 2-halogen-acetoxylidid som utgangsmateriale.

II. Fremstilling av 2-( N- e. ty 1- tert.- amylamino)- 2 ', 6 '- acetoxylidid

Istedenfor klor-acetylxylidid kan tilsvarende bromforbindelse benyttes. Istedenfor Nal kan Kl eller et hensiktsmessig valgt kvar-

tært ammoniumjodid benyttes.

Hvis man istedenfor klor- eller bromacetylxylididet benytter jodacetylxylidid som utgangsmateriale, er det ikke nødvendig å benytte alkalimetalljodid eller kvartært jodid.

Istedenfor dietylsulfat kan andre etyleringsmidler slik som

etyljodid og etylbromid benyttes.

Forbindelsen kan også fremstilles ved hjelp av den reaksjon som er angitt nedenfor (HIA) under anvendelse av CH_ t>,CHO som utgangs-

. materiale istedenfor CH^CH„CHO.

3 2

III. Fremstilling av 2-( N- n- propyI- tert.- amylamino)- 2', 6 '- acetoxylidid

Istedenfor jod-acetylxylididet kan tilsvarende klor- eller bromforbindelse benyttes som utgangsmateriale og i et slikt tilfelle benyttes et passende alkalimetalljodid eller kvartært' ammoniumjodid for å fremme reaksjonen som i II ovenfor.

Reaksjonen utføres fortrinnsvis med et egnet syreopptagende middel. Istedenfor n-propyljodid kan n-propylbromid benyttes.

Fremstilling av de sek.aminene N-ety1-tert.-amylamin og N- n- propy1- tert.- amylamin.

Foruten ifølge ovenfor beskrevne metoder kan disse forbindelser, som er mellomprodukter i fremstillingen av de lokalanestetiske forbindelsene i oppfinnelsen, fremstilles ifølge følgende:

Forbindelsene A, B, C og D ifølge oppfinnelsen kan anvendes som lokalanestetika på konvensjonell måte med anvendelse av konvensjonelle doser derav. Basene kan benyttes på vanlig måte i form av oppløsninger av deres farmasøytisk akseptable salter, f.eks.-hydro- klorider, tartrater og citrater.. De anestetiske forbindelsene C og D som angitt ovenfor gir anestesi med betydelig lengre varighet enn forbindelsene A og B. Forbindelsene A og B kan benyttes for korte operasjoner innen kirurgien, f.eks. slike som krever infiltrasjonsanestesi, mindre nerveblokkering og visse former for regional anestesi. Forbindelsene C og D kan anvendes i kirurgien, når anestesi av lengre varighet ønskes. På grunn av muligheten til å variere konsentrasjonen og dosene av midlet er det imidlertid mulig å oppnå tilfredsstillende anestesi utenfor det området som er eksemplifisert ovenfor, med begge middelgrupper. Forbindelsene A, B, C, D, E og F gir dessuten ved anvendelse i kombinasjon med biotoxinene tetrodotoxin eller saxitoxin en langvarig lokalanestetisk effekt.

Oppfinnelsen illustreres videre av følgende eksempler: Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer fremstilling av 2-(tert.-buty1-amino)-2',6'-acetoxylidid. Til 1 liter absolutt alkohol ble det tilsatt 120 g (0.608 mol) 2-klor-2',6'-acetoxylidid og 272.2 g (3-108 moi) tert.-butylamin. Reaksjonsblandingen ble holdt ved 100°C i 18 timer i autoklav. Etter avkjøling ble opp løsningsmidlet fordampet i vakuum. Den fløtefargede resten ble tørket (vakuumeksikator) og deretter om-rørt i benzen i 30 minutter. Det ikke oppløste materiale (tert.-butylammoniumklorid) ble oppsamlet og kassert. Den ovenstående væske, ble fordampet i vakuum, hvilket ga en gulaktig rest som ble oppsamlet og omkrystallisert to ganger fra petroleumeter (kp. 60°-110°C). Dette ga et utbytte på 85.9 % av hvitt krystallinsk materiale, smp. 87°-88.5°C.

Beregnet analyse for C^H^I^O: C 71.75; H 9-^6

Funnet: C 71. 62 ; H 9 - **3. IR-spektrum (KBr-plate, base) 3318 (m, sek.amin), 3255 (m, amid, NH-strekning), 1673 (s, amid I), 1592 (w, aromatisk), 1^95 (s, amid II), 1384 (w) og 1370 (w) (metyl CH-bøyning), 778 (s, tre nærliggende aromatiske H fra planet) cm

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer fremstilling av 2-(tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid og fremstillingen av 2-(N-etyl-tert.-amylamino)- 2 ' ,6 '-acetoxylidid fra 2-(tert. -amylamino-2 ' , 6 '-acetoxy-lidid.

2-( tert.- amylamino)- 2', 6'- acetoxylidid - Til 400 ml vannfri benzen ble det tilsatt 18.9 g (0.0956 mol) 2-klor-2',6'-acetoxylidid, 20 g (0.2295 mol) tert.-amylamin og.1 g natriumjodid. Reaksjonsblandingen ble holdt ved 100°C i 36 timer i en autoklav. En utfelling ble oppsamlet og kassert. Fra filtratet ble oppløsningsmidlet avdrevet og den gule, oljeaktige rest oppløst i eter, hvorved ikke-oppløst materiale ble innsamlet og kassert. Etter tørking (Na^SO^) ble eteren avdrevet i vakuum og etterlot en oljeaktig væske, som ble opptatt i fortynnet saltsyre (sluttlig pH 2). Den sure vannfasen ble vasket flere ganger med eter som var blitt gjort basisk med pH 9 ved hjelp av kon-• sentrert ammoniakk, og den utfelte base ble ekstrahert med eter (4 x 100 ml). Eterekstraktet ble tørket (Na.SOJ og fordampet i vakuum. Dette ga en gul, oljeaktig rest som ble vakuumdestillert (kp. 150 oC, 0.05 mm) og ga ved avkj.øling 16.6 g av et hvitt fast stoff, smp. 54° 55°C.. (Også hydrokloridet ble fremstilt og omkrystallisert fra aceto-nitril, smp. 209°-211°C). '

Beregnet analyse for C^H^I^O: C 72.54; H 9-74; N 11.28

Funnet: C 72.32; H 9-98; N 11.34. IR-spektrum (KBr-plate, hydrogenklorid), 3150-3120 (m-s, amid, NH-strekking), 2710 (s), 2620 (m), 2580 (m), 2440 (m) og 2417 (m-w) (NH<+->strekking), 1665 (s, amid I), 1590 (m-w, aromatisk), 1542 (s, amid II), 1393 og 1375 (s-m, metyl CH-bøying),. 775 (s-m, tre nærliggende aromatiske H fra planet) cm

2-( N- etyl- tert.- amylamino)- 2', 6'- acetoxylidid - Til 46.52 g (0.3017 mol) dietylsulfat ble 10.7 g (0.0431 mol) 2-(tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid tilsatt og blandingen ble holdt ved 100°C i 4 timer og 20 minutter. Etter avkjøling ble reaksjonsblandingen opptatt i saltsyre (sluttlig pH 2). Blandingen ble vasket med eter og vannopp-løsningen ble gjort basisk til pH 9 ved hjelp av konsentrert ammoniakk hvoretter det hele ble ekstrahert med eter (5 x 75 ml). De sammen-lagte eterekstraktene ble tørket (Na2S0^) og eteren fjernet i vakuum, hvilket ga en hvit, fast rest. Resten ble omkrystallisert tre ganger

fra etanol/H20. Dette ga et utbytte på 37-1 % hvitt, krystallinsk materiale, smp. 111.5°-113.5°C.

Beregnet analyse for C17H28N2°: C 73-87; H 10-2i*J N 10.14. Funnet: C 73-94; H 9-94; N 10.21-.-IR-spektrum (KBr-plate, base) 3262 (s, amid, NH-strekking), 1655 (s, amid I), 1590 (w, aromatisk), .1498 (s, amid II), 1385 og 1375 (w,

metyl CH-bøying), 766, (s, tre nærliggende aromatiske H fra planet)cm 1.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer fremstilling av 2-(N-n-propy1-tert.-amylamino)-2'^6'-acetoxylidid fra N-n-propy1-tert.-amylamin.

N-n-propy1-tert.-amylamin - En suspensjon av 1.0 g 10 % palla-dium på trekull i 100 ml absolutt alkohol ble rystet med hydrogen inntil det ikke ble absorbert mer hydrogen. Til katalysatorblandingen ble det tilsatt 30 g (0.3442 mol) tert.-amylamin og deretter en opp-løsning av 18 g (0.3098 mol) propion.aldehyd i 50 ml absolutt alkohol. Samtlige ovennevnte bestanddeler ble avkjølt i isbad før blanding. Etter oppvarming til romtemperatur ble reaksjonsblandingen rystet med hydrogen med et begynnelsestrykk på 4.2 kg/cm i 10 timer. I løpet av denne tiden ble den teoretiske mengde hydrogen absorbert. Kataly-satoren ble fraseparert ved hjelp av filtrering og vasket med etanol og 40 ml konsentrert saltsyre ble tilsatt til det sammenslåtte filtrat. Oppløsningen ble tørket ved fordampning i vakuum. Det tørkede produkt ble oppløst i 250 ml destillert vann og 160 g 50 % natriumhydroksyd tilsatt langsomt under avkjøling for å frigjøre aminet. Blandingen ble ekstrahert med eter (3 x 200 ml) og de sammenslåtte eterekstraktene tørket over vannfritt natriumsulfat. Det tørkede ekstrakt ble destillert gjennom en 300 mm kolonne pakket med 1/8 tomme iD-glass-spiraler. Utbyttet ble 26.7 g (66.7 %) N-n-propy1-tert.-amylamin,

kp. 136.5° - 137.5°C (atmosfæretrykk), n<22>1.4106.

Beregnet analyse for CgH^N: C 74.34 ; H 14.82; N 10.84.

Funnet: C 74.76; H 15-16; N 10.96.

2-( N- n- propyl- tert■- amylamino)- 2', 6'- acetoxylidid - Til 150 ml benzen ble det tilsatt 10 g (0.0346 mol) 2-jod-2',6'-acetoxylidid og 11.18 g (0.0865 mol) N-n-propy1-tert.-amylamin. Reaksjonsblandingen ble tilbakeløpskokt i 29 timer. Etter avkjøling ble benzen og uomsatt amin avdrevet i vakuum. Det gjenværende halvfaste materiale ble behandlet med vannfri eter. Materialet som ikke var oppløst ble frafiltrert og kassert og eteren fordampet i vakuum. Det gule voks-lignende materiale ble omkrystallisert to ganger fra etanol/vann og to ganger fra aceton/vann.. Dette ga et utbytte på 49.4 % av et hvitt krystallinsk materiale, smp. 96.5° - 97.5°C.

Beregnet analyse for cl8H Q<N>20: C 74. 43; H 10.41; N 9.65. Funnet: C 74.4; H 10.35; N 9 - 59.

IR-spektrum (KBr-plate, base) 3240 (m, amid, NH-strekking), 1665 (s, amid I), 1495 (s, amid II), 1385 og 1370 (w, metyl CH-bøying), 766 . (s, tre nærliggende aromatiske H fra planet) cm 1. Det ble fremstilt et hydroklorid av basen, og dette ble oppnådd som et stabilt mono-hydrat som smeltet ved l8l.2° - l82.8°C.

Beregnet analyse for C^H^CIN^ . H2<0, H20 5.22.

Funnet: (Karl Fischer) H20 5.21.

Eksempel 4

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av 2-( tert.- buty1-amino)- 2', 6'- propioxylidid.

Til 300 ml absolutt alkohol ble -det tilsatt 38.42 g (0.15 mol) 2-brom-2',6'-propioxylidid og 54.85 g (0.75 mol) tertiært butylamin. Reaksjonsblandingen ble holdt ved 100°C i 18 timer i en autoklav. Etter avkjøling ble alkoholen og uomsatt amin fjernet ved vakuumdes-tillasjon. Resten ble oppløst i eter og konsentrert NH^OH ble tilsatt. Materialet som ikke var oppløst (tertiært butylammoniumbromid) ble oppsamlet og kassert. Den tofasede ovenstående væske ble fraseparert og den basiske vannfase kassert. Eterfasen ble tørket over vannfritt Na2S01|og eteren fjernet i vakuum. Den fløtefargede resten ble om-rørt i benzen i 30 minutter, og materialet som ikke ble oppløst (tertiært butylammoniumbromid) ble oppsamlet og kassert."Inndampning av benzen i vakuum ga en fløtefarget rest som ble oppsamlet, tørket og omkrystallisert tre ganger fra petroleumeter (kp. 60° - 110'°C), og dette ga et utbytte på 54.1 % hvitt krystallinsk materiale, smp. 124.5°-126°C.

Beregnet analyse for C^H^I^O: C 72.54; H 9-74; N 11.28.

Funnet: C 72.62; H 9-83; N 11.34.

■ Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer fremstilling av N- n- propy1- tert.-amylamin.

En blanding av 2 mol tert.-amylamin og 1 mol 1-brompropan ble tilbakeløpskokt i 6 timer. Reaks j onsblandingen ble avkjølt og ho.ldt ved +4°C i 1 time. Etter filtrering ble filtratet fraksjonert ved kolonnedestillasjon og den fargeløse, klare' fraksjon som koker mellom 136°-138°C ble beholdt.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer fremstillingen av 2-( N- etyl- tert.-amylamino)- 2', 6'- acetoxylidid.

En blanding av 0.170 mol 2-(tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid (kfr. eksempel 2), O.I87 mol etylbromid, O.O85 mol kaliumkarbonat og 300 ml metyletylketon ble tilbakeløpskokt under mekanisk omrøring i 36 timer. Etter inndampning av lavtkokende bestanddeler ble resten oppløst i fortynnet saltsyre, filtrert hvoretter den sure oppløsning ble ekstrahert to ganger med eter. Eterekstraktet ble kassert og vannfasen gjort alkalisk ved tilsetning av konsentrert ammoniakk til pH 9 - 10, hvoretter ekstraksjon ble foretatt flere ganger med eter. Dette eterekstrakt ble tørket og etter filtrering ble eteren fjernet

i vakuum. Resten ble omkrystallisert fra etanol/vann.

Eksempel 7

På lignende måte som ved fremstillingen av 2-(tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid i eksempel 2, ble 2-klor-2',6'-acetoxylidid omsatt med N-n-propy1-tert.-amylamin i nærvær av natriumjodid for å danne 2-(N-n-propy1-tert.-amylamin)-2<1>,6'-acetoxylidid. Reaksj onsblandingen ble opparbeidet som beskrevet i eksempel 3 for denne forbindelse.

Eksempel 8

Dette eksempel illustrerer fremstilling av 2~(N-(n-buty1)-tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid.

En blanding av 600 g 2-jod-2',6'-acetoxylidid, 643 g N-(n-butyl)-tert.-butylamin, og 4.5 liter benzen ble oppvarmet til til-bakeløp i en beholder forsynt med en mekanisk rører og tilbakeløps-kjøler, i 15-16 timer. Forbindelsen N-(n-butyl)-tert.-butylamin er beskrevet av J.N. Tilley og A.A.R. Sayigh i' J.Org.Chem. 28, 2076 (1963). Den fremstilles analogt med N-propy1-tert.-amylamin ifølge eksempel 3' fra n-butylaldehyd og tert.butylamin. Etter avkjøling ble utfellingen av N-(n-buty1)-tert.-butylammoniumjodid frafiltrert (tørrvekt 482 g). Filtratet ble ekstrahert med 4M klorhydrogensyre. (Det sure ekstrakt kan filtreres og vaskes med eter ved dette stadium). Det sure ekstrak-tet ble bjort alkalisk med 7M natriumhydroksyd. Utfellingen ble opptatt i metylenklorid og den' alkaliske oppløsningen ekstrahert med samme oppløsningsmiddel. Metylenkloridoppløsningene (kombinerte) ble tørket (Na^SO^), filtrert og inndampet. Resten ble omkrystallisert fra en blanding av aceton og vann (7-8:1) hvilket ga et utbytte på

414 g, smp. 140°-140.5°C.

Beregnet for C^H^<N>^: C 74.4; H 10.4; N 9-65;

Funnet: C 74.6; H 10.5; N 9-49-

Forbindelsen 2-[N-(n-buty l)-tert.-butylamino]-2 ' ^'-acetoxylidid kan også fremstilles ved hjelp av den metode som er beskrevet i eksempel 6 fra 2-(tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid og n-butyl-bromid.

Den kan også fremstilles ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 7 fra 2-klor-2',6'-acetoxylidid og N-n-buty1-tert.-butylamin.

I de tabeller som er angitt nedenfor, har følgende kodebetegn-elser blitt benyttet:

A står for 2-(tert.-butylamino)-2<1>,6'-acetoxylidid.

B står for 2-(tert.-butylamino)— 2',6'-propionoxylidid.

C står for 2-(N-ety1-tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid.

D står for 2-(N-n-propy1-tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid. E står for 2-(N-n-buty1-tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid. F står for 2-(N-tert.-amylamino)-2' ,6'-acetoxylidid.

X står for den tidligere kjente forbindelse N-n-butylpipecolyl--2,6-xylidid, dvs. bupivakain eller "Marcaine".

Y står for den tidligere kjente forbindelsen dietylaminoaceto--2,6-xylidid, dvs. lidokain eller "Xylocaine".

Tabellene 1, 2 og 3 inneholder sammenligningsdata angående virkningsvarigheten for flere av disse lokalanestetiske forbindelser, tabell 4 inneholder sammenligningsdata med hensyn til påvirkningen på aksjonspotensialet hos en frilagt hoftenerve fra frosk for noen av disse lokalanestetiske forbindelser, mens tabell 5 inneholder sammenligningsdata med hensyn til den akutte toksisitet hos flere av de lokalanestetiske forbindelsene. Tabell 6 inneholder data fra forsøk ' angående peridural anestesi på hund for forbindelse D. Tabell 7 inneholder data fra forsøk utført med forbindelse B angående blokkering av hoftenerven fra rotter, hudhevelser på marsvin,' irritasjon på ryggen hos kanin og akutt toksisitet på mus.

De irritasjonsverdier som er angitt i tabell 75ble bestemt

på følgende måte:

Hevelser ble fremkalt på den barberte rygg til albinokaniner ved intradermal injeksjon av vannoppløsninger av midlet. 24 timer senere ble hver hevelse gradert med hensyn til: tilstedeværelse og-grad av rødhet eller rødming, tilstedeværelse og grad av ødem og hvorvidt dødt vev er tilstede i hevelsen. Graderingen ble utført ifølge en vilkårlig numerisk skala og et "middelirritasjonsindeks" ble beregnet for alle hevelser med en gitt konsentrasjon. Metode: Fullt utviklede beagle-hunder av hankjønn ble forbedredt kirurgisk ved innsetting -av en kanyle i en lendhvirvel slik at legemiddeloppløsningene kunne administreres inn i det peridurale rom. Etter administrering av lokalanestetiske oppløsninger, ble dyrene undersøkt intervallsvis med hensyn på virkningsvarighet av smertetap i det skrotale området og i bakbenas tær. Respons på og bevissthet med hensyn til smertestimuli i de skrotale områdene er en test på anestetisk blokkering i ryggmargsrøttene L3-4 og S-l-2-3. Disse røtter er de som ligger lengst bort fra injeksjonspunktet (L6) og derfor minst sannsynelige å bli påvirket av det anestetiske middel. Tilbakekomst av respons på smerte i skrotum er ofte det første tegnet på tilbakevinning og antyder tilbakegang av anestesien til minst L4 fremre og S2 bakre.

I tabell 9 nedenfor angis data som viser virkningsvarigheten av blokkering av hoftenerver hos frosk forårsaket av forbindelse E i konsentrasjoner på 0.25 - 1.0 % w/v testet ved hjelp av samme metode V som ble benyttet for det arbeidet som er beskrevet i tabell 1. Frekvenser og virkningsvarigheter var gode.

Forbindelse E ble testet med hensyn til toksisitet hos mus, rotter og marsvin. Hos mus var i.p. toksisiteten (LD^) 284 (218 - 531) mg/kg, hos rotte var den subkutane toksisitet 1068 (813-1507) mg/kg.'Hos marsvin testet subkutant overlevde alle dyrene 646 mg/kg.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også benyttes i kombinasjon med de kjente biotoksinene tetrodotoxin, desoksytetrodotoxin og saxitoxin slik som beskrevet p<;>å annet sted i beskrivelsen.

'Følgende tabell 10 gir resultatene av tester med hensyn til den anestetiske effekt av forskjellige sammensetninger av de amino-acylxylidider som er beskrevet heri med biotoxinene tetrodotoxin eller saxitoxin. Det skal påpekes at aminoacylxylididene ifølge foreliggende oppfinnelse har den store fordel at de i kombinasjon med slike biotoxiner gir anestetiska med uvanlig lang nerveblokkerende effekt.

Effekten av sammensetninger av forbindelsene D og E, respektivt, med tetrodotoxin (TTX) ble også undersøkt ved forsøk på hoftenerve fra frosk. pH ved forsøkene var 5-6 og metoden somf''ble benyttet er beskrevet nedenfor.

Forbindelse D og TTX hver for seg ga 24 % og 29 % reduksjon, respektivt, av aksjonspotensialet, mens kombinasjonen av de to i samme konsentrasjoner reduserte nevnte potensial med 94 %. Med hensyn til forbindelse E så var reduksjonen i potensialet som ble oppnådd med kombinasjonen 94 % sammenlignet med 22- % og 15 %, respektivt, for forbindelsene E og TTX hver for seg. Det er derfor en uttalt fordel for kombinasjonen av de to forbindelsene sammenlignet med de indivi-duelle forbindelsene. Se tabell 11.

Ifølge den metode som er beskrevet ovenfor i tabell'6, ble den nerveblokkerende effekt hos forbindelsene D og E, respektivt, testet

i kombinasjon med biotoxinet, saxitoxin med hensyn til peridural anestesi hos hund. De data som ble oppnådd er angitt i tabell 12 nedenfor. Som det fremgår ga forbindelse D alene en virkningsvarighet av blokkering av fingersmerte og skrotal smerte på 289 min. og 218 min.,' respektivt, mens i kombinasjon. med saxitoxin var virkningsvarigheten

av blokkade 1-2 dager for fingersmerte og mer enn 8 timer for skrotal smerte. Forbindelse E i en 2 % oppløsning ga en virkningsvarighet av blokkade på 1-2 dager for fingersmerte og lengre enn 7s time for skrotal smerte. Alle dyrene kom seg helt.

Metode: se tabell 6.

Merk: Et volum av 10 ml 1 % oppløsning av forbindelse D ga virkningsvarigheter av blokkade av fingersmerte og skrotal smerte på 289 minutter og 218 minutter, reskeptivt (tabell 6).

Forbindelse D ble også testet alene og i kombinasjon med saxitoxin (STX) i spinal anestesi hos sauer. Resultatene og den metode som ble benyttet er beskrevet i tabell 13. Det er av betydning, spesielt når det gjelder fingersmerte, at tilsetningen av forbindelse D til saxitoxin øket virkningsvarigheten av blokkade fra omkring 69 til omkring 267, en økning med en faktor på omkring 3.5.

Metode :v Oppløsningene inneholdt 7.5 % dextrose (pH 4.0). 1 ml ble administrert i hvert forsøk. Sauen (23-29 kg) ble fastholdt i horisontalstilling under injeksjonen og ble umiddelbart bøyet slik at ryggradens bøying ble innstilt på 10 grader fra horisontalplanet (nedre caudal). Administreringen ble utført mellom L6-S1 og ble foretatt med 22 gauge tre tomms engangsnåler under anvendelse av den såkalte "laterale" og ikke den "midline"-met ode .

Merk: Forbindelse D alene i konsentrasjon på 1 % > dvs. fire ganger den konsentrasjon som ble benyttet i forsøket som er angitt ovenfor, ga en virkningsvarighet av blokkade av fingersmerte som varte i 45-60 minutter med en tilslagstid-på 5-10 minutter.

Forbindelsene D og E ble testet med hensyn til sin effekt på hjernen og ryggraden hos peridural katt ifølge den metode som er beskrevet i tabell 3 ovenfor. Forbindelse D ble testet i 1 % konsentrasjon og forbindelse E i 2 % .konsentrasjon. Etter forsøkene under-søkte man hjernen og hele ryggmargen. Ingen patologiske forandringer som kunne tilskrives de testede forbindelser ble påtruffet.

De resultater som angis i de foregående tabeller angående studier av hoftenerve fra frosk, ble oppnådd under anvendelse av følg-ende metode, vesentlig ifølge A.P. Truant, Archives Internationales de Pharmac.odynamie et de Therapie Belgium 115: 483-497 (1958): Hoftenervestammer fra Rana pipiens ble preparart ved å utskjære nervene mellom dens røtter i ryggmargen og ankelen og ved å plasere .nerven på sølv-sølvkloridelektroder slik at stimulering og registrering kunne utføres mens testforbindelsene ble anbragt og under restaureringsperioden. Som bad ble benyttet Tasaki Ringers opp-løsning og for hver blokkering og restaurering hadde legemiddelopp-løsningen og restaureringsoppløsningen samme pH.

Irritasjonstilbøyeligheten til forbindelsene ble bestemt ifølge en metode angitt av A.P. Truant. Arch. Int. Pharmacodyn. 115: 483-497

(1958). Ved de konsentrasjoner som har klinisk betydning, var forbindelsene C og D ikke mer irriterende enn bupivakain med konsentrasjonen 0.5 %.

Den testmetode som ble benyttet for de studier av akutt toksisitet som angis i tabell 53var følgende:

Kjønnsmodne hundyr ble benyttet.

Dyrene oppdeles i grupper på 10 og doseres med legemiddelopp-løsning eller -bærere. Etter dosering iakttaes dyrene intervallsvis i flere timer med hensyn på åpenbare virkninger og dødsfall. Over-levne dyr innlemmes i grupper ifølge dosenivå og kontrolleres daglig så lenge studiet varer for å bestemme hvorvidt forsinkede dødsfall inntreffer eller ikke.

LD,5-nU-verdi er og 95 % Fieller konf idensgrenser (eller 95 % approximative grenser) beregnes ifølge Berksons Minimum Logit Chi Square-. Method, J.Am.Stat.Assoc. 48: 565 (1953).

De forbindelser av typen tertiær-amylamino-acetoxylidid (for bindelsene C og D), som omfattes av oppfinnelsen, har uvanlig langvarig lokalanestetisk effekt og høy lokalanestetisk aktivitet, tilfredsstillende lav .vevsirritasjon og tilfredsstillende lav akutt toksisitet sammenlignet med bupivakain (forbindelse X). Den forbindelse av typen tertiær-butylamino-acetoxylidid, som omfattes av oppfinnelsen (forbindelse A), har uvanlig langvarig lokalanestetisk effekt og uvanlig lav intravenøs toksisitet sammenlignet med dens strukturisomer lidokain (forbindelse Y). Dens tilbøyelighet til vevsirritasjon er også helt tilfredsstillende.

Vanligvis vil de forbindelser som omfattes av oppfinnelsen, benyttes i 0.25-2 prosentig vannoppløsning, med eller uten tilsetning av vasokonstriktor i infiltrasjonsanestesi, peridural og subarachnoid anestesi. Anvendelsen er imidlertid ikke begrenset til dette konsen-trasjons område og den dose og konsentrasjon som anvendes må i hvert spesielle tilfelle bestemmes med hensyntagen til slike faktorer som alder og-kroppsvekt hos pasienten såvel som administrering og de kliniske krav ved anestesi.

De forbindelser som omfattes av oppfinnelsen, kan også til-føres lokalt til slimhinner og skadet, dvs. ved mekanisk påvirkning skadet, hud i form av oppløsninger, salver, geleer eller aerosoler. Eksempler på egnede farmasøytiske preparater som kan anvendes som lokalanestetika er angitt i tabell 8 der forbindelse D anvendes som aktiv bestanddel. Lignende preparater der forbindelsene A, B, C,'E eller F anvendes som aktiv bestanddel, kan tilberedes på kjent måte, muligens med endring av mengden NaCl for å oppnå isotonisitet.

DEL . B

Toxiner fra marine kilder av usedvanlig potens har vært kjent

i mange år. Foreliggende oppfinnelse vedrører spesielt nye anvendelser for tetrodotoxin.

Tetrodotoxin oppnåes fra ovariene og eggene hos flere arter av puffer-fisk av underordner: Gymnodontes. Det påtreffes også i visse arter av vannøgler i Kalifornia av slekten Taricha; og det toxin som oppnåes fra disse arter, kjent som tarichatoxin, er identisk med tetrodotoxin. Tetrodotoxin er blitt renfremstilt og dens molekyl-struktur er bestemt til å være en amino-perhydroquinazolin med formelen:

Tetrodotoxin og arter hvori denne forbindelse forekommer, er beskrevet mer utførlig i Pharmacological Reviews, vol. 18, nr. 2, side .997-1049. Forsøk med isolerte nerver har vist at tetrodotoxin oppfører seg på en måte som fundamentalt skiller seg fra lokalanestetika slik som prokain og kokain. I en kjempeaxon fra blekksprut' eller hummer som holdes under konstant spenning (voltageclamp-teknik), reduserer de sistnevnte midler både inngående initialt natrium-strøm og utgående kalium-strøm. Med tetrodotoxin kan imidlertid den inngående natrium-strøm reduseres eller til og med elimineres, mens den utgående kalium-strøm er helt upåvirket. Det finnes bare få, om i det hele tatt noen, forbindelser hos hvilken denne unike virkning er konsta-tert.

Tetrodotoxin har ikke funnet noen praktisk anvendelse som anestetikum. Forbindelsen kan riktignok benyttes for å fremkalle nerveblokkader i laboratoriedyr, men den anestetiske dose underskrider bare i liten grad den letale dosen hvilket i praksis forhindrer anvendelsen av forbindelsen i seg selv som et anestetikum.

Det er helt overraskende funnet at kombinasjoner av tetrodotoxin og et lokalanestetikum viser uvanlige anestetiske egenskaper. Dette kommer til uttrykk i sin mest betydningsfulle form i en forlenget varighet av virkning hos kombinasjoner av toxinet med lokalanestetika.

I- disse kombinasjoner anvendes tetrodotoxin vanligvis i konsentrasjoner som underskrider de som gir pålitelige nerveblokkader og langt under

det toksiske nivå.

Undersøkelse av et stort antall forskjellige lokalanestetika har vist at virkningen til det nevnte toxin når det gjelder å øke varigheten av virkningen, er generell. Lokalanestetika-kan karakteri- seres gjennom den karakteristiske kjemiske type. Innen hver kjemiske type kan det finnes uforklarlige variasjoner i aktiviteten. I alle undersøkte tilfeller har imidlertid hvert medlem av de undersøkte gruppene oppført seg på likeartet måte i kombinasjon med det nevnte toxin-. Spesifikke klasser av undersøkte lokalanestetika inkluderer anestetiske forbindelser kjennetegnet ved (1) aminoacylanilidgruppen som lidokain, prilokain, bupivakain, mepivakain og beslektede lokalanestetiske forbindelser med varierende substituenter på ringsystemet eller på amin-nitro-genatomet;

Følgende tre estertyper (2), (3) og (4):

(2) aminoalkylbenzoatgruppen slik som prokain, klorprokain, pro-poksykain, heksylkain, tetrakain, cyklometylkain, benoksynat, butakain, proparakain og beslektede lokalanestetiske forbindelser;" (3) kokain og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (4) aminokarbamatgrupper slik som diperodon og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (5) N-fenylamidingruppen slik som fenakain og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (6) N-aminoalkylamidgruppen slik som dibukain og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (7) aminoketongrupper slik som falikain, dyklonin og beslektede lokalanestetiske forbindelser; og (8) aminoetergrupper slik som pramoxin, dimetisoquin og beslektede lokalanestetiske forbindelser.

I hver og en av de ovennevnte klasser av lokalanestetiske forbindelser er det oppregnet representative medlemmer. De eksperimentelle data støtter konklusjonen om at den observerte effekt hos det testede toxin vedrørende overraskende- forlengelse av virknings varigheten gjelder for øvrige kjente lokalanestetiske forbindelser i disse grupper og for de åpenbare 'modifiseringer av de testede lokalanestetiske forbindelser. Det kan også sies i lys av disse oppdagelser at de nye kombinasjonene ifølge foreliggende oppfinnelse tillater anvendelse av konsentrasjoner av konvensjonelle lokalanestetika som under skrider de konsentrasjoner som normalt anvendes klinisk. Derved kan toksiske bivirkninger som iblant observeres settes til et minimum.

De kjemiske strukturer hos noen av de ovennevnte forbindelser er:

Andre lokalanestetiske forbindelser som kan benyttes i kombinasjon med biotoxinet TTX er acylanilidéne'som angis i følgende tabell.

Ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes de tidligere nevnte lokalanestetiske forbindelser i en farmasøytisk akseptabel bærer slik som vann, vann-etanol, dextroseoppløsninger, saltoppløsning og blandinger derav, i konsentrasjoner•som vanligvis anvendes av leger. Som eksempel på konsentrasjoner av-lokalanestetika med klinisk anvendelse kan nevnes:

Som nevnt ovenfor innebærer foreliggende oppfinnelse også at

de vanlige lokalanestetiske forbindelsene kan benyttes i en konsentrasjon som underskrider den normalt benyttede. F.eks. kan i kombinasjonen tetrodotoxin med lidokain den sistnevnte forbindelse benyttes

i en konsentrasjon så lav som 0.05 vektprosent.

Bæreren inneholder dessuten fra 0.5 til 10 mikrogram, hensiktsmessig fra 0.5 til 5 mikrogram per milliliter tetrotoxin eller fra 10 til 20 mikrogram per milliliter desoxytetrodotoxin. Dessuten kan den lokalanestetiske sammensetning inneholde en vasokonstriktor som er velkjent innen teknikken, slik som adrenalin, noradrenalin, fenylefrin og levonordefrin.

Anbringelsen av de lokalanestetiske preparater tilveiebringes

på vanlig måte, f.eks. ved infiltrering eller injeksjon.

De nye anestetiske preparater som fremstilles ved oppløsning

av den lokalanestetiske forbindelse, tetrodotoxin, eller derivater derav og vasokonstriktor, når denne forekommer, i bæreren eller i separate deler av bæreren som deretter sammenblandes.

Eksempel 1

Charles River-rotter av hunkjønn med kroppsvekt mellom 100 og 200 g benyttes. Hver gruppe besto av 5 rotter og'hvert dyr fikk 0.2 ml legemiddeloppløsning i høyre lår. Injeksjonen ble foretatt på en slik måte at oppløsningen ble deponert rundt ischiadicus-hoved-nerven nær det popliteale rom. Etter injeksjonen ble hvert dyr under-søkt intervallsvis for bestemmelse av tilslag, dyp, og varighet av nerveblokkaden slik den ble manifestert ved påvirkning av den motoriske funksjon til det injiserte ben. Frekvenser av a) blokkade, b) partiell blokkade, C) lett effekt på den motoriske funksjon, ble notert for hver gruppe av dyr. To sluttpunkter for varighet av blokkaden ble benyttet: restaurering av evnen til å gripe ved plaser-ing på et skrånende gitter samt komplett restaurering av den motoriske funksjon.

Alle oppløsninger inneholdt 1:100 000 deler adrenalin hvilket ble tilsatt umiddelbart før anvendelsen. Alle oppløsninger var ny-lagede på anvendelsesdagen.

Resultatene er oppsummert i tabellene 1-3. Depressjon ble notert tilfeldig, men det forekom ingen dødsfall med disse doser av tetrodotoxin.

Tabell 1: Ved 1 yg/ml og 2 yg/ml ga tetrodotoxin ingen totale blokkader. Ved 5 yg/ml ga det totale blokkader i alle de 5 injiserte ben. Middeltilslagstiden var omkring 20 minutter og blokkadene varte mellom 5i time og 24 timer. Alle dyrene var restaurert fullstendig ved undersøkelse 22 til 24 timer etter injeksjonen. På grunn av at denne konsentrasjonen av tetrodotoxin i seg selv.ga 100 % frekvens og blokkader av så lang varighet, er det ingen forskjeller med unntagelse av tilslagstiden, mellom de resultater som ble'"oppnådd med toxinet i seg selv og det som ble oppnådd med kombinasjonen tetrodotoxin-lidokain. Kombinasjonene av 1 yg/ml og 2 yg/ml av tetrodotoxin med lidokain viser imidlertid klart varigheter av blokkade som er betydelig lengre enn de som oppnåes med lidokain alene. Tabell 2. Som i det første forsøk ga 1 yg/ml tetrodotoxin'ingen totale blokkader; imidlertid ga. 2 yg/ml en total blokkade med en virknings varighet på omkring 2 timer i 1 av 5 injeksjoner. Blokkerings frekvensen med 3 yg/ml var bare 2 av 5, mens blokkaden varte mellom 5 og 24 timer. I denne studie benyttet man lavere konsentrasjoner av lidokain for å fastslå hvorvidt kombinasjonene viser bedre frekvenser enn tetrodotoxin eller lidokain hver for seg. Tabell 3. Tetrodotoxin i dosen 3 Hg/ml ga i 3 av 5 dyr blokkader som varte mellom 4 og 24 timer. I kombinasjoner med flere lokalanestetiske midler ble frekvensen forbedret og tilslagstidene var kortere enn med tetrodotoxin alene. Alle kombinasjoner som inneholdt 1 Vg/ml tetrodotoxin oppviste blokkadevarigheter som var meget 'lengre enn de som ble oppnådd' med det lokalanestetiske middel alene. Studiene viser klart at ved blokkade av ischiadicus-nerve hos rotter kan tilstede-værelsen av konsentrasjoner av tetrodotoxin, hvilke i seg selv er under grensen for effekt, gi opphav til markerte økninger i blokkade-varighetene hos et flertall lokalanestetiske midler.

Eksempel 2

Anvendelse av anestetika ifølge foreliggende oppfinnelse vises også ved peridurale blokkader hos katt. Den kirurgiske teknikk og testmetodene er beskrevet i detalj (Duce et al.: Brit. J. Anesth., vol. 41, 579-587 (1969).'Dyrene ble behandlet ifølge følgende skjema:

få)

Alle dyrene ble testet med 2 % "Xylocain^" (et kommersielt lokalanestetisk preparat basert på lidokain som aktiv bestanddel) på dag 1 og dag 5 for å fastslå stabiliteten på prepareringen av den peridurale katt. I testperioden benyttet man laboratoriepreparerte prøver av lidokain inneholdende bare lidokain og adrenalin eller lidokain, adrenalin og tetrodotoxin i spesifiserte mengder. Oppløs-ninger ble nyfremstilt hver anvendelsesdag; adrenalin ble tilsatt-og pH målt kort før administrasjonen. pH-verdiene til oppløsningene var: tetrodotoxin 4.5 - 6.75; likokain HC1 4.75 - 4.8; lidokain/tetrodotoxin 4.75-4.9.

Resultatene er oppsummert i tabell 4. I alminnelighet observerte man ingen åpenbare systemiske effekter som følge av administrasjonen av testoppløsningene. Dyr nr. 127 oppviste spyttavsondring og brekninger med galle omkring 3 timer og 45 minutter etter administrering' av lidokain/tetrodotoxin-kombinasjonen. Disse observasjoner ble

imidlertid ikke ansett for å være signifikante.

Cr) Statistisk analyse av de oppnådde data viste at "Xy locain " kontrollverdiene oppnådd på dagene 1 og 53ikke er signifikant forskjellige. Ettersom tetrodotoxin alene ikke ga noen blokkader ble det ikke tatt med i variansanalysen for å holde variansen rimelig homogen. En fireveis inndeling av varianse ble derfor utført bare på de data som ble oppnådd med 2 % lidokain og med lidokain/tetrodotoxin kombinasjonen. Blokkadevarigheten med lidokain/tetrodotoxin kombinasjonen var statistisk signifikant lavere enn med lidokain alene.

Eksempel 3

Effektiviteten hos lokalanestetika ifølge foreliggende oppfinnelse i fravær av adrenalin, vises av de data som er 'angitt i tabellene 5, 6 og 7. De data som oppsummeres i disse tabeller ble oppnådd ved hjelp av samme metode som beskrevet i eksempel 1.

Fem separate studier ble foretatt og en tetrodotoxin-kontroll-gruppe ble kjørt i hvert studie. Blokkeringsfrekvens med tetrodotoxin varierte mellom 0/5 og 3/5}og varigheten varte fra omkring l80 til 240 minutter. Blokkadefrekvensen var 5/5 med alle kombinasjonene unntatt den inneholdende fenakain (tabell 6). Den eneste partielle blokkade i dette tilfelle kan ha berodd på at man ikke har lykkes i å injisere oppløsning tilstrekkelig nær ischiadicus-hoved-nerven. Blokkadefrekvensen med diperodon-tetrodotoxin, cyklometykain-tetrodotoxin og dibukain-tetrodotoxin var bedre enn med diperodon, cyklometykain, dibukain eller tetrodotoxin alene.

I samtlige tilfeller ga kombinasjonene varigheter som var betydelig lengre enn de som ble oppnådd med lokalanestetiske midler hver- for seg. Varighetene med tetrodotoxin alene lå nærmere de som ble oppnådd med kombinasjonene; frekvensene var gjennomgående lavere enn de som ble oppnådd med kombinasjonene.

Eksempel 4

Anvendelsen av desoksytetrodotoxin ble testet ifølge den metode som er beskrevet i eksempel 1. Desoksy-derivatet ble benyttet istedenfor tetrodotoxin som det vises til i eksempel 1. Desoksy-.tetrodotoxin ble festet, uten adrenalin, med hensyn på blokkade av ischiadicus-nerve hos rotte. Ved konsentrasjonene 5, 10 og 20 yg/ml ga det ingen blokkader. Blokkadevarigheten av en kombinasjon inneholdende 2 % lidokain og 5 yg/ml desoksytetrodotoxin var ikke signifikant forskjellig fra varigheten av 2 % lidokain alene. Imidlertid ga kombinasjoner inneholdende 10 og 20 yg/ml desoksytetrodotoxin blokkader som var signifikant lavere (1.4 - 1.6 ganger) enn tilsvarende for lidokain alene (0.008 <p <0.0l6).

Dette resultat kan forventes på basis av testene med tetrodotoxin i betraktning av den lavere aktivitet som vises av desoksy-derivåtet ved toksisitetsforsøk. Litteratur vedrørende toksisiteten til tetrodotoxin og dets desoksyderivat angir at den sistnevnte forbindelse er mellom en fjerdedel og en tiendedel så toksisk som sitt modertoxin.

Eksempel 5. Peridural anestesi hos hunder

Metode: .

Fullt utvokste beaglehunder av hankjønn ble preparert kirurgisk ved anbringelse av en kanyle i en lend-rygghvirvel slik' at legemiddel-oppløsninger kan administreres til det peridurale rom. Etter administrering av lokalanestetika-oppløsninger, undersøkes dyrene intervallsvis med hensyn til uteblivelse av smerte i skrotalområdet og i tærne på bakbena, samt med hensyn til tap av evne til å støtte sin kroppsvekt.

Respons på og bevissthet om smertestimuli i skrotalområdene

er en test på anestetisk blokkade i ryggmargsrøttene L3-4 og Sl-2-3. Disse røtter er de som ligger lengst borte fra injeksjonsstedet, (L6) og derfor de som det er minst sannsynlighet for at skal bli påvirket av det anestetiske middel. Tilbakevending av respons på smerte i skrotumområdet er ofte første tegnet på restaurering og antyder tilbakegang av anestesien til minst L4 fremre og S2 bakre.

Resultatene er oppsummert i tabell 8.

Merk: 1) Med lidokain er tilslaget hurtig, blokkerings frekvens er 100 %}men varigheters er korte. 2) Med tetrodotoxin er varighetene lange, men tilslaget er langsomt og blokkerings frekvensen av smerte i skrotalområdet er dårlig. 3) Med kombinasjonen er tilslaget hurtig, frekvensen er 100 % og varighetene er lange.

Eksempel 6

Ifølge den metode som er beskrevet i eksempel 1 ovenfor ble forskjellige lokalanestetiske forbindelser testet hver for seg, TTX hver for seg og kombinasjoner av forbindelsene med TTX med hensyn til sin evne til å blokkere hoftenerve hos frosk. TTX benyttes gjennomgående i mengden 2 ug/ml. Hver og en av de testede preparater inneholdt adrenalin i en konsentrasjon på 1:100 000. Resultatene er angitt i tabell 9. Når det gjelder forbindelsen Ai 0.5 % konsentrasjon var varigheten omkring 126 minutter. TTX alene var omkring 295 minutter, men frekvensen var ikke bra. I kombinasjon ble det oppnådd en god frekvens og en varighet lengre enn 420 minutter.

For forbindelsen D ved 0.25 % konsentrasjon var varigheten omkring 12 8 minutter når forbindelsen ble testet alene, men lengre enn minutter i kombinasjon med TTX. For forbindelsen E i 0.25 % konsentrasjon ble det ikke observert noen blokkade når forbindelsen testes alene,, men i kombinasjon med TTX var varigheten omkring 148 minutter. For forbindelse F testet for seg ved 0.25 % konsentrasjon var varigheten bare 78 minutter med dårlig frekvens, mens varigheten i kombinasjon med TTX var lengre enn 322 minutter med forbedret frekvens. For forbindelse G.ved 0.5 % konsentrasjon var varigheten 104 minutter' når forbindelsen ble testet alene og omkring 286 minutter i kombinasjon med TTX.

Det skal videre bemerkes at for-TTX alene var frekvensen og varigheten temmelig varierende med et omfang fra frekvensen 0/5 til 4/5 og med spennvidde angående varigheten fra 0 til 295 minutter eller mer.

Eksempel 7

In vitro tester ble utført på isolert intakt hoftenerve fra frosk under anvendelse av forbindelser B, C og lidokain dels hver for seg og dels i kombinasjon med TTX. Resultatene og den benyttede metode er angitt i tabell 10. Reduksjonen i aksjonspotensialet for forbindelse B alene var 22 % og for TTX alene 15 % sammenlignet med en reduksjon på 94 % for kombinasjonen. For forbindelse C alene var reduksjonen 24 % og TTX alene 29 % mens kombinasjonen reduserte potensialet med 94 %. For lidokain og TTX hver for seg var reduk-sjonene 15 % og 7 respektivt, sammenlignet med en reduksjon på

61 % for kombinasjonen av de to forbindelser.

Metode: Metoden er i alt vesentlig som beskrevet av A.P. Truant, Arch. Int. Pharmacodyn. 115, 483-497 (1958).

Hoftenervestammer fra Rana pipiens ble preparert ved å utskjære nerven mellom dens røtter i ryggmargen og ankelen og å plassere nerven på sølv-sølvkloridelektroder slik at stimulering og registrering kan utføres mens testforbindelsen anbringes og i løpet av restaureringsperioden. Som bad anvendte man Tasaki Ringer' s '" oppløsning. Ob-servasjonene varte i 40 minutter hvorved aksjonspotensialene i alt vesentlig nådde en stabil verdi, (likevekt).

Eksempel 8

Under anvendelse av den metode som ér beskrevet i eksempelet ovenfor ble effekten til flere kjente vasokonstriktorer undersøkt på hoftenerver hos frosk under anvendelse av lidokain (0.125 %) og tetrodotoxin (2 yg/ml) i kombinasjon. Resultatene er angitt i tabell 11. Uten vasokonstriktorer var frekvensen dårlig og varigheten av blokkaden var 174 minutter. Med fenylefrin, levonordefrin eller adrenalin ble imidlertid frekvensen forbedret betydelig og varigheten ble nesten fordoblet.

Eksempel 8a

Under anvendelse av den metode som er beskrevet i eksempel 1 med unntagelse av at det ikke ble tilsatt noe adrenalin til de testede oppløsningene, ble de lokalanestetiske forbindelsene falikain og pramoxin undersøkt med hensyn på evne til å blokkere hoftenerve hos frosk dels hver for seg, dels i kombinasjon med TTX i konsentrasjonen 2 yg/ml. Resultatene er angitt i tabell 12.

Det bør observeres at komponentene ble testet i dosenivåer som ikke resulterte i noen anestesi i det hele tatt for to av forbindelsene, og bare 55 minutter for den tredje, mens kombinasjonen ga anestesi i omkring 2 til 3 timer. Frekvensen av total blokkade ble øket fra 0 til 40 % i tilfellet for pramoxin.

Forbindelsene A, B, C, D og L som angitt i tabell A ovenfor

ble syntetisert ifølge de fremgangsmåter som er beskrevet tidligere.

Metoden for fremstilling av forbindelsene S og T er beskrevet

i belgisk patent nr. 776 6-56.

Metoden for fremstilling av forbindelsen Q er beskrevet i

belgisk patent nr. 786 875-

Forbindelsene H, J og M og mepivakain er kjente og beskrevet

i publisert litteratur.

Eksempel 9

Syntese av 2-(N-etyl-isopropylamino)-21,6'-propionoxylidid

(forbindelse E).

En blanding av 12.81 g (0.050 mol) av 2-brom-2<1>,6'-propionoxylidid, 11.31 g (0.130 mol) ety1-isopropylamin og 30 ml tørr toluen, ble oppvarmet i en glasskledd trykkbeholder av rustfritt stål ved 105°C i 20 timer. Etter avkjøling til 25°C ble den brune reaksjonsblandingen filtrert og ekstrahert tre ganger med en total mengde på 50 ml 3N HC1. Vannoppløsningen ble oppvarmet til 75°C i 10 minutter med avfargende kull og deretter filtrert. Den avkjølte oppløsning ble tilsatt 10 ml konsentrert NH^. Produktet som ble utfelt ble filtrert, vasket og tørket. Utbyttet 6.93 g3(52.9 %), smp. 50°-52°C.

Vannfri HC1 i eter ble tilsatt til 6.90 g av den ovenfor oppnådde base oppløst i 100 ml tørr eter til oppløsningen var tilstrekkelig sur og fuktet pH-papir, hvorved 6.15 g av et klebrig brunt materiale, smp. 191°-201°C, ble oppnådd. Hydrokloridet ble omkrystallisert fra en blanding av butanon og alkohol. Utbytte: 6.02 g, smp. 207.5° - 209°C

Analyse: Beregnet for C^H^Cl^O: C'64.30; H 9-11; N 9-37; Cl 11.86.

Funnet: C 64.16; H 9-16; N 9-49; Cl 12.09-Eksempel 10

A. Syntese av 2-brom-4'-butoksy-2',6'-dimetylpropionanilid. Til en avkjølt (ca. 10°C) oppløsning av 50.7 g (0.263 mol)

av 4-butoksy-2,6-dimetylanilin /Buchi et al., Heiv. Chim. Acta, 34, 278 (1951)/ i 224 ml iseddik ble det hurtig tilsatt 62.4 g (O.289 mol)

2-brompropionylbromid og umiddelbart deretter en avkjølt (5°C) opp-løsning av 87.2 g natriumacetat-trihydrat i 362 ml vann. Denne blandingen ble rystet i 0.5 timer, filtrert, vasket med vann til vaske-væskene var nøytrale, og tørket i vakuum over silisiumdioksydgel og KOH;•utbyttet 68.9 g (71.6 %), smp. 132.5° - 133.5°C. Produktet ble omkrystallisert fra 95 % etanol, smp. 135-5° - 136°C.

Analyse: Beregnet for C-^H^NC^Br: C 54.87; H 6.76; Br 24.34.

Funnet: C 55-06; H 6.22; Br 24.69-

B. Syntese av 2-metylamino-41 — • butoksy-2',6'-dimetylpropionanilid (forbindelse F).

Til en kald omrørt oppløsning av 14.8 g monometylamin i 250 ml tørr benzen, ble det tilsatt (porsjonsvis mens temperaturen ble holdt under 10°C) 19-5 g (0.0594 mol) 2-brom-4<*->butoksy-2',6'-dimetyl-propionanilid (fremstilt ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i første del av dette eksempel), og dette materiale ble hurtig oppløst og dannet en klar oppløsning. Blandingen ble oppvarmet til 70°C i ca. 1. time under omrøring hvoretter det ble oppnådd et hvitt bunnfall og tilbakeløpskokingen ble så livlig at reaksjonsblandingen måtte kontrolleres ved hjelp av ytre avkjøling.

Det utfelte metylammoniumbromid ble frafiltrert. Overskudd amin og oppløsningsmiddel ble inndampet i vakuum fra filtratet hvilket ga en hvit rest som ble oppløst i 120 ml 0.5 HC1 og filtrert. Filtratet ble ekstrahert med 3 x 25 ml eter og eterekstraktene kassert.

Vannfasen ble gjort alkalisk til pH 11 og ekstrahert med eter, de sammenslåtte ekstraktene ble tørket.(Na^SO^),filtrert og inndampet hvorved det ble oppnådd et utbytte på 8.7 g (52.7 %) smp. 107°-107-5°C Omkrystallisering fra cykloheksan påvirket ikke smeltepunktet. Analyse: Beregnet for C16H26<N>2°2: c 69•0; H 9-41; N 10.06.

Funnet: C 69-OJ H 9-17; N 10.06.

Eksempel 11

Syntese av 2-(N-metyl-n-propylamino)-2',6'-butyroxylidid

(forbindelse G).

Til en omrørt oppløsning av N-mety1-n-propylamin (9-10 g, 0.125 mol) i 175 ml vannfri benzen, ble det tilsatt 2-jod-butyro-2',6'-xylidid (13-2 g, 0.0415 mol). Blandingen ble tilbakeløpskokt i 5 timer.

Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med 1 M HC1. Etter filtrering for å fjerne spor av uoppløselig materiale, ble pH-verdien innstilt til 9 med 7 M NaOH, hvilket forårsaket dannelse av et lyse-gult/ voksaktig fast stoff. Dette ble frafiltrert, vasket med vann og tørket; utbytte 4.00 g (36.7 %).

Denne base ble omdannet til hydrokloridet med HC1 i eter.

Hydrokloridet ble omkrystallisert to ganger fra etanol/eter hvilket ga krystaller som smeltet ved 2l4°-215.°C.

Analyse: Beregnet for C^H^CII^O: C 64.3; H 11; Cl 11.86.

Funnet: C 64.4; H 9-01; Cl 11.80.

Eksempel 12

Syntese av 2-cyklobutylamino-2',6'-acetoxylidid (forbindelse K).

Til en oppløsning av cyklobutylamin (39-8) i 600 ml benzen ble 2-klor-2',6'-acetoxylidid (49.4 g) tilsatt langsomt under omrør-ing og blandingen ble tilbakeløpskokt i 5 timer.

Etter avkjøling ble blandingen filtrert for å fjerne dannet cyklobutylammoniumklorid. Filtratet ble befridd for oppløsningsmid-del og overskudd amin i vakuum hvilket ga en rest.

Resten ble oppløst i 0.5 M klorhydrogensyre, oppløsningen gjort alkalisk med natriumhydroksydoppløsning og basen ekstrahert grundig med eter. Eteroppløsningen ble tørket (Na^SO^), eteren og lavtkokende komponenter inndampet i vakuum ved 40° - 50°C og resten overført til hydroklorid- ved tilsetning av klorhydrogen i eter til den filtrerte eteroppløsningen.. Fra hydrokloridet ble basen oppnådd ved oppløsning i vann, tilsetning av natriumhydroksydoppløsning til alkalisk pH-verdi, ekstrahering med eter, tørking av eterekstraktet (Ma^SO^), filtrering og inndampning av eteren. Basen kunne omkrys-talliseres fra cykloheksan, petroleumeter (k.p. 60°-110°C) eller

heptan. Smp. 75° - 78°C.

Analyse: Beregnet for Cli(H20N2O: C 72.4; H 8.68; N 12.06.

Funnet: C 72.4; H 8.88; N 11.93-Eksempel 15

A. Syntese av 2-(sek-butylamino)-2',6'-acetoxylidid.

Til en oppløsning av 62.2 g sek-butylamin i 500 ml benzen ble 41.5 g 2-klor-2',6'-acetoxylidid tilsatt langsomt. Blandingen ble oppvarmet til tilbakeløpskoking i 7 timer og fikk kjølne natten over.

Utfellingen av sek-butylaminhydroklorid som dannet seg, ble frafiltrert og filtratet inndampet til en oljeaktig rest. Resten ble opp-løst i eter og oppløsningen filtrert, tørket (Na2S0^) og inndampet til en oljeaktig rest (45.7 g)- Dette råprodukt ble destillert i vakuum hvilket ga en oljeaktig væske som gikk over til fast form ved avkjøling. Utbytte: 38.5 g (78 %), k.p. l46°C/0.05 mm, smp. 44.5° - 45-5°C. -Analyse: Beregnet for C-^H^f^O: C 71-75; H 9-46; N 11.96.

Funnet: C 71-99; H 9.35; N 12.12. Hydrokloridet smeltet ved 176.5° - 178.5°C.

B. Syntese av 2-(N-etyl-sek-butylamino)-2',6'-acetoxylidid (forbindelse P).

Til 140 g dietylsulfat ble det tilsatt 30.5 g 2-(sek-buty1-amino)-2',6'-acetoxylidid (fremstilt ifølge den metode som er beskrevet i første delen av dette eksempel). Blandingen ble oppvarmet til 100° - 110°C i 5 time-r og deretter avkjølt. Vann og 5N HC1 ble tilsatt til pH 2 hvorved en annen fase ble dannet. Etter omrøring separerte vannfasen seg (pH 2) og den ble vasket med to 100 ml's porsjoner av eter og overført til pH 9 med konsentrert NH . Den basiske vannfasen ble ekstrahert med fem 100 ml's porsjoner eter. Oppløs-ningsmidlet ble fjernet i vakuum fra de sammenslåtte eterfasene hvorved det ble oppnådd en fast olje som ble oppløst i eter, tørket (Na2SOi)), filtrert og inndampet i vakuum. Utbytte: 26.2 g (76.8 snip. 50. 5°~54.5°C. Produktet ble destillert to ganger under høyt vakuum: k.p. l47°C/0.025 mm, l65°C/0.4 mm. Utbytte av omkrystallisert produkt: 21.4 g (62.7 %)--

Analyse: Beregnet for C^H^J^O: C 73-23 %\H 9-99 % ; N 10.68 %.

Funnet: C 73-06 % ; H 9-66 % ; N 10.47 %.

DEL C

Toxiner fra marine kilder av betydelig potens har vært kjent

i mange år. Foreliggende oppfinnelse angår spesielt nye anvendelser for saxitoxin.

Saxitoxin ekstraheres fra en i Alaska forekommende mollusk (butterclam), betegnet Saxidomus giganteus. Andre navn under hvilke stoffet er kjent er mollusktoxin, musseltoxin og skalldyrtoxin. Til tross for sitt navn stammer toxinet ikke fra den mollusk eller mus-ling i hvilken det påtreffes. Det antaes å.stamme fra en alge, Gonyaulax, fra hvilken toxinet gonyaulax-toxin er oppnådd. Det er imidlertid■enda ikke fastslått om denne alge er den eneste kilden for toxinet i den i Alaska forekommende mollusk Saxidomus giganteus.

Saxitoxinets struktur har ikke blitt bestemt'med sikkerhet. Dets hydroklorid gis den empiriske formel C^gH^N^O<.><2>HC1. Ifølge publisert litteratur har toxinet mes sannsynlig en perhydropurinkjerne i hvilken to guanidinium-enheter er inkorporert (J.L. Wong et al., J. Am. Chem. Soc. 93, 73^4 (197D).

I en kjempe-axon fra blekksprut eller hummer som holdes under konstant spenning (voltage-clamp-teknik), reduserer lokalanestetika slik som prokain og kokain både inngående initial natrium-strøm og utgående kalium-strøm. Inngående natriumstrøm kan reduseres eller til og med elimineres med saxitoxin, mens den utgående kalium-strøm er helt upåvirket.

Saxitoxin har ikke funnet noen praktisk anvendelse som anestetikum. Forbindelsen kan riktignok benyttes for å indusere nerveblokkade i laboratoriedyr, men den anestetiske dosen underskrider bare i liten grad den letale dose, hvilket i praksis hindrer anvendelse av forbindelsen i seg selv som anestetikum.

Det er helt overraskende funnet at kombinasjoner av saxitoxin og et lokalanestetikum utviser uvanlige anestetiske egenskaper. Dette kommer best til uttrykk i sin mest betydningsfulle form i en forlenget varighet av virkningen hos kombinasjoner av toxinet med lokalanestetika. I disse kombinasjoner benyttes saxitoxin vanligvis i konsentrasjoner som underskrider de som gir pålitelige nerveblokkader.

Undersøkelse av en omfattende gruppe av lokalanestetika har vist at det nevnte toxinets virkning til å øke virkningsvarigheten er generell. Lokalanestetika kan klassifiseres ved angivelse av den karakteristiske kjemiske type. Innen hver kjemisk type kan det finnes uforklarte variasjoner av aktivitet. I alle undersøkte tilfeller har imidlertid hvert medlem av de undersøkte gruppene oppført seg likeartet i kombinasjon med det nevnte toxinet. Spesielle klasser av lokalanestetika som er undersøkt inkluderer anestetiske forbindelser kjennetegnet ved

(1) aminoacylanilidgruppen, slik som lidokain, prilokain, bupivakain, mepivakain og beslektede lokalanestetiske forbindelser med varierende hydrokarbonsubstituenter på ringsystemet eller på aminonitrogenatomet; (2) aminoalkylbenzoatgruppen slik som prokain,.klorprokain, pro-poksykain, heksylkain, tetrakain, cyklometykain, benoxinat, butakain, proparakain, og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (3) kokain og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (4) aminokarbamatgruppen slik som diperodon og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (5) N-fenylamidingruppen slik som fenakain og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (6) N-aminoalkylgruppen slik som dibukain og beslektede lokalanestetiske forbindelser; (7) aminoketongruppen slik som falikain, dyklonin og beslektede lokalanestetiske forbindelser; og (8) aminoetergruppen slik som pramoxin, dimetisoquin og beslektede lokalanestetiske forbindelser.

I hver og en av de ovennevnte klasser av lokalanestetiske forbindelser er det nevnt representative medlemmer. De eksperimentelle data støtter konklusjonen om at den observerte effekt for toxinet undersøkt for uventet forlengelse av virkningsvarigheten, omfatter de andre kjente lokalanestetiske forbindelser i disse grupper og åpenbare modifikasjoner av de testetede lokalanestetiske forbindelser. Det kan også sies i lys av disse oppdagelser at nye kombinasjoner ifølge foreliggende oppfinnelse vil tillate anvendelse av. konvensjonelle lokalanestetika i konsentrasjoner som ligger under de i normal klinisk anvendelse forekommende konsentrasjoner. Derved kan

.toxiske bivirkninger som iblant observeres holdes ved et minimum.

De kjemiske strukturer til noen av de ovennevnte forbindelser er:

Andre lokalanestetiske forbindelser som kan benyttes i kombinasjon med biotoxinet STX er de acylanilider som er angitt i neden-stående tabell:

Ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes de tidligere nevnte lokalanestetiske forbindelser i en farmasøytisk akseptabel bærer slik som vann, vann-etanol, dextroseoppløsninger, saltoppløsninger og blandinger derav, i konsentrasjoner som vanligvis benyttes av leger. Som eksempel på konsentrasjoner av lokalanestetika med klinisk anvendelse kan nevnes:

Som nevnt ovenfor innebærer foreliggende oppfinnelse også at de vanlige lokalanestetiske forbindelser kan benyttes i en konsentrasjon som er lavere enn den som normalt benyttes. Eksempets lvi, s ti,llater kombinasjon av saxitoxin med lidokain anvendelse av lidokain i konsentrasjon så lav som 0.05 vektprosent.

Bæreren inneholder dessuten fra 0.5 til 10, fortrinnsvis fra 0.5 til 5 mikrogram saxitoxin per milliliter.

Dessuten kan det lokalanestetiske preparat inneholde en vasokonstriktor som er velkjent innen teknikken, slik som adrenalin, noradrenalin, fenylefrin og levonordefrin.

Anbringelsen av de lokalanestetiske preparater oppnåes på vanlig måte, f.eks. ved infiltrering eller injeksjon. De anestetiske preparater kan fremstilles ved oppløsning av lokalanestetikumet, saxitoxin og i aktuelle tilfeller en vasokonstriktor i bæreren eller i separate deler av bæreren som deretter sammenblandes.

Farmakologiske tester

A* §l°^sring_ay_isoiert_is chiadicus-nerve_.

Eksempel 1

Charles River-rotter av hunkjønn, kroppsvekt mellom 100 og 200 gram, ble benyttet.. Hver gruppe besto av 5 rotter og hvert dyr fikk 0.2 ml av testoppløsningen i høyre lår. Injeksjonen ble foretatt på en slik måte at- oppløsningen ble deponert rundt ischiadicus-hoved- nerven nær det pbplitale rom. Etter injeksjonen ble hvert dyr under-søkt intervallsvis for å bestemme tilslag, dyp og varighet av nerveblokkaden slik den ble manifestert av påvirkning av den motoriske funksjon for det injiserte ben. Frekvensene av (a) total blokkade, (b) partiell blokkade og (c) lett effekt på den motoriske funksjon ble notert for hver gruppe' dyr. To sluttpunkter for varigheten av blokkaden ble benyttet: restaurering av evnen til å gripe ved plas-sering på et skråttstilt gitter samt komplett restaurering av den motoriske funksjon.

Alle oppløsninger ble nyfremstilt på anvendelsesdagen. Ingen av oppløsningene inneholdt adrenalin. Resultatene er angitt i neden-stående tabeller 1 og 2.

Merk: C = total blokkering

P = partiell blokkering

Varigheter er bare for totale blokkeringer.

Tilslagstidene er approximative.

Eksempel 2

Samme testmetode ble benyttet for å teste den blokkerende virkning på ischiadicus-nerve hos rotte av en oppløsning inneholdende 1 vektprosent prokain, 1 yg per ml saxitoxin og adrenalin i en mengde på 1:100 0Q0. Resultatene er angitt i tabell 2.

Tabell 1 og 2. Saxitoxin i konsentrasjoner på 0.5>1 og 2

■<y>g/ml ga ikke noen blokkering av ischiadicus-nerven hos rotte. Ved-4 yg/ml ga stoffet en blokkering som varte mellom 5 og 20 timer i 3

av 5 injiserte lemmer. I kombinasjon-med lidokain, prokain eller dibukain var blokkadefrekvensen 100 % og blokkadene varte mellom 6 og 22 timer. Saxitoxin-lidokain-kombinasjonen forårsaket en lett effekt på den motoriske funksjon i ett ben som varte i 3 dager; dette dyr viste imidlertid fullstendig restaurering av den motoriske funksjon ved slutten, av denne tid. Studiene av nerveblokkade-effekt på ikke anestiserte dyr av saxitoxin alene og i kombinasjon med. forskjellige lokalanestetiske midler, viser at saxitoxin vesentlig forlenger den nerveblokkerende effekt til lokalanestetika såvel med som uten vasokonstriktor .

Eksempel 3-"Peridural anestesi hos hunder.

Blokkade av skrotal smerte ble testet som følger.

Fullt utviklede beagle-hunder av hankjønn ble preparert kirurgisk ved innsetting av en kanyle i en lendhvirvel slik at'legemidde1-oppløsninger kan administreres til det peridurale rom. Etter administrering av lokalanestetiske oppløsninger undersøkes dyrene intervallsvis med hensyn til varighet av fravær av smerte i skrotalregi-onen og i tærne på bakbena og med hensyn til kroppsstøttende evne.

Respons på og bevissthet om smertestimuli i de skrotale om-råder er en test på anestetisk blokkade i ryggmargsrøttene L3 og Sl-2-3. Disse røtter er de som ligger lengst borte fra injeksjons- , punktet (L6) og det er derfor minst sannsynlig at de påvirkes av det anestetiske middel. Restaurering av respons på smerte i skrotum er ofte det første tegnet på tilbakevinning og antyder tilbakegang av anestesin til minst L4 fremre og S2 bakre.

Testresultatene er angitt i tabell 3. Testoppløsningene inneholdt lidokain, 2 vektprosent som base, og/eller saxitoxin 4 yg/ml og/eller adrenalin 1:100 000. Injeksjonsvolumet var 5 ml.

Eksempel 4. Akutt toxisitet.

Det faktum at saxitoxin ikke øker den generelle toxisitet til lokalanestetika vises ved bestemmelsen av intravenøs toksisitet for en blanding av saxitoxin og lidokain i albino-mus av hunkjønn, CRCD-stamme. Den testmetode som anvendes for den akutte toxisitet var som følger:

Seksuelt modne dyr av hunkjønn ble benyttet.

Dyrene ble oppdelt i grupper av 10 og dosert med legemiddel-oppløsning eller bærer (isotonisk saltoppløsning). Etter doseringen ' ble dyrene observert intervallsvis i flere timer for åpenbare effekter og dødsfall. De overlevende ble plassert i grupper ifølge dosenivå og kontrollert en gang daglig så lenge studiene varte for å bestemme hvorvidt ytterligere dødsfall inntraff eller ikke.

LD j-Q-verdi ene og 95 % Pieller konf idens-intervall (eller 95 % approximative intervall) ble beregnet ifølge Berksons Minimum Logit Chi Square Method, J.Am.Stat. Assoc. 48: 565 (1953).

Resultater:

Lidokain 1 %■ 26 (23"33) mg/kg

Lidokain 1 %. + saxitoxin 0.5 yg/ml LD • 27 (24-31) mg/kg av

5U

lidokain ved en saxitoxindose på 1.3 (1.2-1.6) mg/kg.

Den akutte intravenøse toxisitet til lidokain/saxitoxin-kombinasjonen synes derfor å skyldes lidokain ettersom LD .5-U..-verdiene for lidokain i kombinasjonen i alt vesentlig er identisk med LD._n-verdien for lidokain alene.

I lignende tester utført på Charles River rotter av hunkjønn, ble toxisiteten til forbindelsene B og C ifølge tabell A ovenfor undersøkt i kombinasjon med saxitoxin. Toxisiteten til saxitoxin alene var (LD^Q) 11 (9-14) yg/kg. En blanding av en 2 % oppløsning av en forbindelse B og 4 yg/ml av saxitoxin, hadde en LD^-verdi på 13 (12-23) yg/kg basert på saxitoxin. - Således var toxisiteten basert på saxitoxin i kombinasjonen nesten identisk, med toxisiteten til saxitoxin alene, hvilket viser at det ikke forekommer noen potensiering mellom toxisitetene for de to komponentene.

På samme måte ble det observert at en blanding av en 1 % opp-løsning av forbindelse C og 4 yg/ml saxitoxin, hadde en LD^-verdi på 11 (9-15) yg/kg, som igjen nesten er identisk med toxisiteten til saxitoxin alene. Man kan derfor trekke den konklusjon at det ikke forekommer noen potensiering av toxisiteten mellom saxitoxin og noen av forbindelsene B og C.

Langtidsforsøk ble foretatt på dyr til hvilke saxitoxin var administrert daglig under anvendelse av et bredt doseringsområde. Det ble utført grove observasjoner og utenfor det akutte LD^Q-området observerte man at dyrene oppførte seg normalt og økte i vekt på samme måte som kontrollgruppen.

Eksempel 5

Ifølge den metode som er beskrevet i eksempel 1 ovenfor, ble forskjellige lokalanestetiske forbindelser testet hver for seg, STX

og kombinasjoner av forbindelsene med STX med hensyn til sin evne til å blokkere hoftenerve hos rotte. STX ble benyttet gjennomgående i mengden 2 ug/ml. Ingen vasokonstriktor ble anvendt. Resultatene er gitt i tabell 4.' I tilfelle for forbindelsen H i 0.5 % konsentra-s<J>jon var virkningsvarigheten omkring 45 minutter. STX alene ga ingen anestesi. I kombinasjonen var frekvensen bra og virkningsvarigheten lenger enn 304 minutter.

For forbindelsen J i 1.0 % konsentrasjon var virkningsvarigheten omkring 123 minutter, men over 420 minutter i kombinasjon med STX. For forbindelsen K i 1.0 % konsentrasjon var virkningsvarigheten omkring 73 minutter, men øket til mer enn 420 minutter i kombinasjon med STX. For forbindelsen L i konsentrasjonen 0.5 % var virkningsvarigheten omkring 97 minutter for forbindelsen alene, mens i kombinasjon med STX var varigheten over 420 minutter. For forbindelsen M alene ved 1.0 % konsentrasjon var virkningsvarigheten omkring 75 minutter, men øket til mer enn 315 minutter i kombinasjon. med STX. For forbindelsen P i 0.5 % konsentrasjon var varigheten bare 45 minutter og frekvensen dårlig, mens i kombinasjon med STX var varigheten omkring 195 minutter med vesentlig forbedret frekvens. For forbindelse Q i 0.5 % konsentrasjon var varigheten omkring 44 minutter for forbindelsen alene, men øket til over 420 minutter i kombinasjon med

STX.

For det kjente lokalanestetiske middel falikain i 0.25 % konsentrasjon var virkningsvarigheten omkring 94 minutter, mens i kombinasjon med STX var varigheten opp til 420 minutter eller mer. For det kjente lokalanestetiske middel pramoxin i 0.25 % konsentrasjon ble det ikke observert noen anestetisk virkning i det hele tatt, mens i kombinasjon med STX ble det oppnådd en total blokkade med en varighet på 231 minutter.

x Symbolet > i den kolonne som-'viser varigheten antyder at blokkaden

varte lengre enn den angitte tid, men kortere enn 24 timer.

«x Tre dyr ble blokkert i mer enn 420 minutter.

Eksempel 6

Forsøk ble utført på peridural hund ifølge den metode som er beskrevet i eksempel 3 ovenfor. Forbindelsene B, C, S og T fra tabell A ovenfor og bupivakain ble testet alene (i de fleste tilfeller) og i kombinasjon med STX. Konsentrasjonene av lokalanestetisk middel var fra 0.5 til 2 %. STX ble benyttet gjennomgående i konsentrasjonen 4 yg/ml. Adrenalin ble benyttet som vasokonstriktor. Resultatene er angitt i tabell 5- For de lokalanestetiske forbindelser alene uten STX, varierte virkningsvarigheten fra omkring 94 minutter for bupivakain i konsentrasjonen 0.5 % til 445 minutter for forbindelsen C (ved 2 %). I kombinasjon med STX var varighetene vesentlig lengre, dvs. opp til 1-2 dager for forbindelsen B + STX (ved 2 %). Alle dyrene kom seg helt og det ble ikke observert noen alvorlige bivirkninger.

Eksempel 7

Forbindelse C i tabell A ble testet alene og i kombinasjon med STX i spinalanestesi på sauer. Resultatene og den benyttede metode er angitt i tabell 6 nedenfor. Det er av betydning at spesielt angående fingersmerte øket tilsetningen av forbindelse C til saxitoxin varigheten av blokkaden fra omkring 69 til omkring 267., en økning med en faktor på omkring 3-5-

Metode:

Oppløsningene inneholdt 7.5 % dextrose (pH 4.0). 1 ml ble administrert i hvert forsøk. Sauene (23-29 kg) ble fastholdt i horison-tal stilling under injeksjonen og ble deretter innstilt slik at ryggradens skråning ble stilt på 10 grader i forhold til horisontalplanet (kaudal nedre). Administrasjonen ble foretatt mellom L6-S1 og foretatt med 22 gauge tre tomm's engangsnåler under anvendelse av den såkalte "laterale" snarere enn "midline" teknikk.

Merk:

Forbindelse C alene i en konsentrasjon på 1 %, dvs. fire ganger den konsentrasjon som ble benyttet ved forsøkene oppsummert ovenfor, ga en varighet av blokkade av fingersmerte som varte i 45-60 minutter med en tilslagstid på 5-10 minutter.

Forbindelsene A, B, C, D og L som angitt i tabell A ovenfor, kan syntetiseres ved hjelp av de metoder som er beskrevet tidligere i beskrivelsen.

Fremgangsmåten til fremstilling av forbindelsene S og T angis

i belgisk patent nr. 776 656.

Fremgangsmåten til fremstilling av forbindelse- Q angis i belgisk patent nr.'786 875 •

Forbindelsene H, J og M og mepivakain er kjente forbindelser som er beskrevet i publisert litteratur.

Del D

Toxiner fra marine kilder av usedvanlig potens har vært kjent

i mange år. Saxitoxin ekstraheres fra den i Alaska forekommende mussling Saxidomus giganteus. Andre termer under hvilke forbinde 1-

sene er kjent er skalldyrtoxin og musslingtoxin. Toxinet stammer til tross for sitt navn ikke fra skalldyret eller musslingen, hvor det påtreffes. Det antas at det kommer fra en alge av arten Gonyaulax fra hvilket det er oppnådd et toxin identisk med saxitoxin.

Det er imidlertid enda ikke sikkert hvorvidt det er den eneste kilde for toxinet som forekommer i Alaska.

Saxitoxinets struktur er ikke blitt bestemt med sikkerhet.

Dets hydroklorid gis den empiriske formel C-^H-^<N>^<O>^<.><2>HC1. Ifølge publisert litteratur har toxinet trolig en perhydropurinkjerne i hvilken to guanidinrester er inkorporert. (J.L.Wong et al, J.Am. Chem.Soc. 93, 7344 (1971).

I en spenningsblokkert kjempeaxon fra blekksprut eller hummer reduserer lokalanestetiske forbindelser slik som prokain og kokain både inngående initial nat riumstrøm og utgående kaliumstrøm. Inngående natriumstrøm kan reduseres eller til og med utslettes med saxitoxin, mens den utgående kaliumstrøm er helt upåvirket.

Saxitoxin har hittil ikke funnet noen praktisk anvendelse som anestetikum. Mens forbindelsen kan benyttes for å fremkalle nerveblokkader hos laboratoriedyr, er den anestetiske dose bare litt under den letale dose hvilket har forhindret praktisk anvendelse av forbindelsen som et anestetikum i seg selv. M.H Evans, Toxicon, 1968, vol. 5, side 289-294, testet dets anvendelse på overflaten av perifere nervedeler og-eksponerte dorsale og ventrale spinalrøtter hos anesteserte katter, og fant blokkader i det siste tilfelle, men trakk som slutning at ugjennomtrengeligheten av det forbindende vevshyIster i de perifere nervene trolig utelukket dets anvendelse som et lokalanestetisk middel.

Kombinasjoner av saxitoxin med et lokalanestetikum'er funnet

å være i besittelse av uvanlige anestetiske egenskaper. Dette kommer best til uttrykk ved forbedret virkningsvarighet hos kombinasjonene av toxinet med lokalanestetika. I disse kombinasjoner benyttes saxitoxin i konsentrasjoner som ligger under de som gir pålitelige nerveblokkader og godt under det toksiske nivå. Det antaes at det lokalanestetiske middel gir saxitoxinet evne til å trenge gjennom hylsteret som omgir nerverøttene og derved gi lokalanestesi.

Foreliggende oppfinnelse baserer seg på en subarachnoid spinal-■ administrering til et intakt pattedyr av et preparat som i alt vesentlig består av små mengder saxitoxin. Det er derfor ikke nødvendig å kombinere disse forbindelser med et lokalanestetikum, og det er funnet at meget lave doser av forbindelsene gir en lengre varighet av anestesi enn den som oppnåes under anvendelse av visse tidligere kjente anestetiske forbindelser av forskjellig sammensetning. Subarachnoid anestesi hos pattedyr respektivt mennesker gjelder i denne forbindelse. Det er f.eks. mulig å oppnå blokkader med en varighet på 4 timer og lengre med doser så små som 2-3 yg- I motsetning til dette gir subarachnoid administrasjon av tetrakain (i større doser på 3 - 20 mg) en blokkade på bare fra lg til 3 timer, og lidokain (i meget større doser på 50 - 150 mg) gir blokkader på bare fra 1 til. 2 timer, P.C. Lund, Principles and Practice of Spinal Anesthesia, side 420 og 425 (Charles C. Thomas, publisher, 1971). Disse kjente spinalanestetika forårsaker mer irritasjon og har en større lokal toxisitet enn preparatet som benyttes ved utøvelsen av foreliggende oppfinnelse.

Det er funnet at subarachnoid administrasjon av det farmasøyt-iske preparat som benyttes i foreliggende oppfinnelse bør gi en fore-' trukken dose på omtrent 0.25 til 10 yg av forbindelsene til den subarachnoide del av ryggraden for å gi en effektiv anestesi.

Den aktive forbindelsen saxitoxin benyttes fortrinnsvis,i en hypobar, en isobar eller en hyperbar oppløsning. Hypobare oppløs-ninger kan fremstilles under anvendelse av feks. tredobbelt destillert vann som bærer for forbindelsen'. Isobare oppløsninger fremstilles vanligvis ved å benytte cerebrospinal væske som bærer, men natrium tilsatt i egnet konsentrasjon til en yannoppløsning av forbindelsen kan også benyttes for å oppnå isobaricitet. Hyperbare opp-løsninger kan fremstilles ved tilsetning av varierende mengder glukose (vanligvis 5-10 %) til en vannoppløsning av forbindelsen. En hyperbar oppløsning, det mest vanli-g benyttede preparat, kan lett beredes slik at det farmasøytiske preparat inneholder forbindelser som benyttes i foreliggende oppfinnelse, kan styres med tyngdekraften innen cerebrospinalvæsken, dvs. å skråstille pasienten med hodet oppover eller hodet nedover i forhold til horisontalplanet. Den hyperbare oppløsningen setter anestesiologen i stand til å kontrollere bevegelsen til det anestetiske middel og derved graden av anestesi på en måte som er velkjent innen teknikken. Surhetsgraden til opp- løsningene som er beskrevet ovenfor holdes innen grenser som gir bra stabilitet til saxoitoxinet.

Om ønsket kan en vasokonstriktor f.eks. adrenalin tilsettes til det farmasøytiske preparat på velkjent måte. Konsentrasjonen av aktiv bestanddel er vanligvis 0.25 - 10 yg/ml og volumer på omtrent 1-6 ml's oppløsning injiseres i den cerebrospinale væske som inneholdes i de.t subarachnoide rom hos det hvirveldyr som skal anestiseres. Typen av oppløsning som benyttes, konsentrasjonen og volumet som skal administreres avhenger av slike faktorer som f.eks. alder og størrelse av pasienten og av den kirurgiske metode som skal utføres.

Følgende eksempel viser hvordan oppfinnelsen utøves: Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer farmasøytiske preparater og metoder for fremstilling av disse. Preparatene er hypobare oppløsninger inneholdende 1.0, 2.0, 3-0, 4.0, 5.0, 6.0, 8.0 og 10.0 yg/ml saxitoxin dihydroklorid; pH 3.5 - 5.0.

Saxitoxin-dihydrokloridet oppløses i en liten mengde vann og fortynnes til et volum på 9.5 liter. pH justeres og et volum vann tilsettes som er tilstrekkelig■til å gi oppløsningen et volum på

10 liter. Oppløsningen blir deretter sterilisert.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer farmasøytiske preparater og metoder for fremstilling av disse. Preparatene e'r isobare oppløsninger som inneholder 1.0, 2.0, 3-0, 4.0, 5-0, 6.0, 8.0 og 10.0 yg/ml saxitoxin dihydroklorid; pH 3.5 - 5.0.

Saxitoxin-dihydrokloridet oppløses i en liten mengde vann. Natriumklorid tilsettes og vann for injeksjon tilsettes til et totalt volum på omkring 9-5 liter. Etter oppløsning av saltet justeres pH, deretter tilsettes et volum vann som er tilstrekkelig til å gi opp-løsningen et volum på 10 liter. Oppløsningen blir deretter sterilisert.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer farmasøytiske preparater og metoder for fremstilling av disse, hvilke preparater er hyperbare oppløsninger inneholdende 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 8.0 og 10.0 ug/ml saxitoxin-dihydroklorid ; pH 3.5 - 5.0.

Saxitoxin-dihydrokloridet oppløses i en liten mengde vann og fortynnes til 9.0 liter. pH justeres. Dextrose tilsettes og opp-løses. Det tilsettes et volum vann som er tilstrekkelig til å gi en oppløsning på 10 liter. Oppløsningen blir deretter sterilisert.

Andre former for saxitoxin som salter og andre syrer enn klorhydrogensyre eller baseformen, kan benyttes og oppløsninger kan fremstilles som inneholder mengder ekvivalente med mengden av saxitoxin-dihydroklorid ifølge eksempel 1 - 3.

Eksempel 4

Fire sauer med en vekt på mellom 24 og 59. kg og med en alder på omkring 4^ til 4 måneder, ble behandlet med saxitoxin (0.25, 1 og 2<y>g). Alle sauene ble fastholdt med sin lumbare og thoraciske ryggrad i horisontalstilling ved den subarachnoide injeksjon som ble foretatt i løpet av -5-IO sekunder under anvendelse av en 22 gauge-tre tommer spinalnål ved mellomrommet mellom det sjette lumbare og første sakrale segment. Sauene ble deretter umiddelbart skråttstilt slik at hellingen på den lumbare og thoraciske ryggrad ble beliggende 10 grader i forhold til horisontalplanet (nedre kaudal).

Responsen på saxitoxinet var et hurtig tilslag av anestesi (innen under 2-5 minutter) med en lang følelsesblokkade fulgt av total restaurering. Selv om begrensningene på grunn av den normale arbeidsdagens lengde påvirket de eksakte målinger av varigheten av blokkaden, ble det fastslått at følelsesblokkaden varte fra omkring 2\ til 5 timer etter injeksjonen.. I tre av dyrene inntraff full restaurering innen 24 timer. Hos de andre ble dette ikke målt. Tabell I gir de oppnådde resultater.

En serie på fire ytterligere sauer ble testet med anvendelse av en 3 yg dose saxitoxin. Tabell II gir de oppnådde resultater.

Figur 1 er et diagram som -viser spredningen og effekten av det subarachnoidalt administrerte lokalanestetikum i forhold til tiden etter administrering.

Ved anvendelse av den teknikk som beskrives i det foregående eksempel ble den lokalanestetiske forbindelse som skulle testes injisert i det subarachnoide rom (som inneholder cerebrospinalvæsken), mellom det sjette lumbar og det første sakrale vertebrale mellomrom hos sauen. 1.0 ml 0.25 % tetrakain, det vanligst benyttede spinalanestetikum hos mennesker og 1.0 ml av en 3 yg/ml oppløsning av saxitoxin,,ble administrert til forskjellige dyr. Den vanligst benyttede konsentrasjon av tetrakain i spinalanestesi, hvilket er det mest vanlige benyttede anestetikum hos mennesker, slik som angitt av Lund (Prinicipals and Practice of Spinal Anesthesia, CC. Thomas Publishers, Springfield, 111., 1971, side 420), er 0.25-% - 0.3 %• Over denne konsentrasjon blir forbindelsen stadig mer irriterende og anvendes ikke generelt. Hos mennesker foretas injeksjonen enten mellom det andre og tredje eller det tredje og fjerde lumbare mellomrom. Forbindelsen blander seg etter injeksjonen med spinalvæsken og føres eller spredes fremover eller bakover.

På Y-aksen (ordinaten) i figur 1 gis en skjematisk representa-sjon av segmentene i ryggraden. Hos sauer er de kaudale til cepha-lade (fremre til bakre) segmentene i ryggraden: coccygeal 3,2,1; sacral 4,3,2,1; lumbar 6,5,4,3,2,1; thoracisk 13,12 ,11,10 ,9 , 8,7 ,6., 5 , 4,3,2,1; cervical 7,6,5,4,3,2,1. Lumbar 6 er den eneste av de siste tre gruppene som illustreres eller representeres i fig. 1.

Avhengig av mange faktorer slik som konsentrasjon, volum av oppløsning, manipulering med pasienten og iboende karakteristika hos forbindelsen, kan det oppnåes varierende grad av virkningsvarighet og spredning av anestesi. Denne spredning eller dens tilbakehenting eller såkalte regressjon representeres billedmessig slik som i figur 1. Over (eller foran) hvert punkt er det ingen anestesi og spinalnervene er upåvirkede av forbindelsen. Under hvert punkt er alle spinalsegmenter eller nerver blokkerte. I løpet av en tidsperiode

■som. angis på abscissen eller X-aksen i figur 1 avtar anestesin med begynnelse fortil (fordi mindre forbindelse har nådd disse nerver)

og fremskrider til total tilbakehenting eller restaurering opptrer. Hver enkelt verdi på figur 1 representerer derfor nivået av anestesi ved en spesiell tid og også det totale antall spinalsegmenter som er

blokkerte ved det tidspunkt. Figur 1 sammenligner nivået av anestesi og det segmentale restaureringsmønsteret som oppnåes hos sauer etter administrering av hver av de to lokalanestetiske forbindelser.

Kurvene i figur 1 viser at de to testede lokalanestetiske forbindelser til å begynne med blokkerer nerveledning i totalt syv spinalsegmenter. Etter tre timer fortsatte imidlertid saxitoxin å gi anestesi i minst fire segmenter -(alt under S-4), mens tetrakain hadde gått fullstendig tilbake. Saxitoxin krevde 5 timer for tilbakegang eller regressjon (det punkt ved hvilket dyret var helt restaurert). Dessuten ga tetrakain anestesi og smertelindring ved segmentene under S-4 i bare omkring lg time, mens saxitoxin ved det nivå ga anestesi og smertelindring i 3 timer.

Gjenvinning av funksjonene hos de testede dyr var total og ingen secuelae fulgte den lange varigheten av anestesi som var forårsaket av saxitoxin.

Ved gjennomgåelse av den foregående beskrivelse vil en fag-mann på området bli- oppmerksom på flere modifikasjoner som kan gjøres i foreliggende oppfinnelse uten å anvende oppfinnelsesaktivitet. Disse modifikasjoner ansees å være inkludert innen rammen for oppfinnelsen og det foregående skal bare illustrere visse foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.

DEL E

Foreliggende oppfinnelse angår en metode for oppnåelse av-spinalanestesi (dvs. ved injeksjon av et anestetikum i det- subarachnoide rom som inneholder cerebrospinalvæsken) og et farmasøytisk preparat som kan benyttes med denne metode.

Toxiner fra marine kilder av usedvanlig potens har vært kjent i mange år. Denne oppfinnelse angår spesielt nye anvendelser for tetrodotoxin og for dens derivat desoksytetrodotoxin.

Tetrodotoxin oppnåes fra ovariene og eggene.hos. flere arter av pufferfisk av underordnen Gymnodontes. Det finnes også i visse arter av kaleforniske vannøgler av arten Taricha; og det toxin som oppnåes fra disse arter, kjent som tarichatoxin, er identisk med tetrodotoxin. Tetrodotoxin er blitt renfremstilt og dets.moleky1-struktur bestemt til å være en aminoperhydroquinazolin med formelen:

Tetrodotoxin og arter i hvilke det forekommer er mer fullstendig beskrevet i Pharmacological Reviews, vol. 18, nr. 2, side 997-1049. Noen av effektene av tetrodotoxin og dets derivater, f.eks. desoksytetrodotoxin er beskrevet i Chemical Abstracts, vol. 37,

side 1770<7>(1943) og volum 69, spalte 9494w (1968).

Forsøk med isolerte nerver har vist at tetrodotoxin oppfører seg på en måte som helt skiller seg fra lokalanestetiske forbindelser slik som prokain og kokain. I et spenningsblokkert kjempeaxon fra blekksprut eller hummer reduserer de sistnevnte forbindelser både inngående initial natriumstrøm og utgående kaliumstrøm. Med tetrodotoxin kan imidlertid inngående natriumstrøm reduseres eller helt opp-heves, mens den utgående kaliumstrøm er helt upåvirket. Det finnes få om i det hele tatt noen andre stoffer i hvilke denne unike aktivitet er påvist.

Tetrodotoxin har hittil ikke funnet noen praktisk anvendelse som anestetikum. Forbindelsen kan riktignok benyttes for å fremkalle nerveblokkader hos laboratoriedyr, men den anestetiske dose er bare noe under den letale dosen hvilket har forhindret praktisk anvendelse av forbindelsen som anestetikum i seg selv. M.H. Evans, Toxicon, 1968, vol. 5, sidene 289-294, testet dets anvendelse på overflaten på perifere nervedeler og eksponerte dorsale og ventrale spinalrøtter hos anesteserte 'katter, og fant blokkader i det siste tilfelle, men konkluderte med at ugjennomtrengeligheten til det forbindende vevshyIsteret og de perifere nervene syntes å forhindre dets anvendelse som et lokalanestetisk middel.

Kombinasjoner av tetrodotoxin med et lokalanestetikum er

funnet å være i besittelse av uvanlige anestetiske egenskaper.

Dette uttrykkes best ved en forbedret virkningsvarighet av kombinasjonen av toxinet med lokalanestetiske midler. I disse kombinasjoner benyttes tetrodotoxin typisk i konsentrasjoner som underskrider de som gir pålitelige nerveblokkader. Stedet foradministrasjon av tetrodotoxinet og det anestetiske middel er utenfor dura i ryggmargen, dvs. en peridural administrering. Det er tenkelig at det lokalanestetiske middel gir tetrodotoxinet eller desoksytetrodotoxinet evne til å trenge gjennom det hylster som omgir nerverøttene og derved.gir lokalanestesi.

Foreliggende oppfinnelse baserer seg på subarachnoid spinal-administrering til uskadede pattedyr av et preparat som i alt vesentlig består av små mengder av tetrodotoxin eller desoksytetrodotoxin. I dette tilfelle er det derfor ikke nødvendig å kombinere disse forbindelser med et lokalanestetikum og det er funnet at meget lave" doser av forbindelsene gir en lengre varighet av anestesi enn den som oppnåes under anvendelse av visse tidligere kjente anestetiske midler av varierende sammensetning. Det er f.eks. mulig å admini-strere en meget lav dose på 1-12 yg av tetrodotoxin eller 10-120 yg av desoksytetrodotoxin og derved oppnå en spinalblokkering med en varighet på mellom 3 og 24 timer. Subarachnoid anestesi hos pattedyr inklusive mennesker omfattes således av foreliggende oppfinnelse. Med hensyn til mennesker antas det på grunnlag av dyreforsøk at én minimumsdose på 1 mikrogram tetrodotoxin er effektivt for å gi anestesi. I motsetning til dette, gir subarachnoid administrering av' tetrakain i større doser på 3-20 mg en blokkade på fra li til 3 timer og xylokain ved meget større doser på 50-150 blokkader på fra 1 til 2 timer. P.C. Lund, Principles and Practice of Spinal, Anesthesia, sidene 420 og 4255Charles C. Thomas (publisher), 1971. Disse kjente spinalanestetika forårsaker mer irritasjon og har en større lokaltoxisitet enn det preparat som benyttes i foreliggende oppfinnelse.

Det er funnet at administrasjonen av forbindelsene som benyttes i foreliggende oppfinnelse bør gis i det subarachnoide rom i ryggraden for at det skal oppnåes en effektiv anestesi. En spesielt foretrukken doseringsmengde er fra J>- 6 yg tetrodotoxin og 30-60 yg desoksytetrodotoxin.

De aktive forbindelsene tetrodotoxin eller desoksytetrodo toxin bæres eller føres fortrinnsvis av enten en hypobar, en isobar eller en hyperbar oppløsning. Hypobare oppløsninger kan fremstilles med anvendelse av f.eks. tredobbelt destillert vann"som bærer.for forbindelsen. Isobare oppløsninger fremstilles vanligvis ved anvendelse av cerebrospinalvæske som bærer, men natriumkloridtilsetning i en egnet konsentrasjon til en vannoppløsning av forbindelsen kan også benyttes for å oppnå isobarisitet. Hyperbare oppløsninger kan fremstilles ve.d tilsetning av varierende mengder glukose (vanligvis 5- 10%) til en vannoppløsning av forbindelsene. En hyperbar oppløsning, det vanligst benyttede preparat, kan lett formuleres slik at det farma-søytiske preparat som inneholder forbindelsen som benyttes i foreliggende oppfinnelse kan kontrolleres ved hjelp av tyngdekraften i cerebrospinalvæsken, dvs. ved at pasienten skråstilles med hodet oppover eller nedover i forhold til horisontalplanet. Den hyperbare opp-løsning gjør det mulig for anestesiologen å kontrollere bevegelsen til ane.stetikumet og derved utbredelsen av anestesien på en måte som er velkjent innen teknikken. Surhetsgraden til de ovenfor beskrevne oppløsninger holdes innen grenser som gir god stabilitet til tetrodotoxinet eller desoksytetrodotoxinet.

Om ønsket kan en vasokonstriktor f.eks. adrenalin tilsettes til det farmasøytiske preparat på velkjent måte. Konsentrasjonen av aktiv bestanddel er vanligvis 1-12 yg/ml for tetrodotoxin og 10-20 yg/ml av desoksytetrodotoxin og volumer på omkring 1-6 ml oppløsning injiseres i den cerebrospinale væsken i det subarachnoide rom hos det hvirveldyr som skal anesteseres. Typen av oppløsning som benyttes, konsentrasjon og volum som administreres avhenger av slike faktorer som f.eks. alder og størrelse på pasienten og det kirurgiske inngrep som skai foretas.

Følgende eksempler viser hvordan oppfinnelsen utføres: Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer farmasøytiske preparater og fremgangsmåten for fremstilling derav. Preparatene er hypobare oppløs-ninger som inneholder 1.0, 2.0, 3-0, 4.0, 5-0, 6.0, 8.0 og 10.0 yg/ml tetrodotoxinhydroklorid; pH 3.5 - 5.0.

Tetrodotoxinhydrokloridet oppløses i en liten mengde vann og fortynnes til et volum på 9-5 liter. pH justeres og et volum vann som er tilstrekkelig til å gi en oppløsning på 10 liter tilsettes og oppløsningen blir deretter sterilisert.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer farmasøytiske preparater og fremgangsmåter for fremstilling derav. Preparatene er isobare oppløs-ninger som inneholder 1.0, 2.0, 3-0, 4.0, 5-0, 6.0, 8.0 og 10.0 yg/ml tetrodotoxinhydroklorid; pH 3.5 - 5.0.

Tetrodotoxinhydroklorid oppløses i en liten mengde vann. Natriumklorid tilsettes og vann for injeksjon tilsettes til et totalt volum på omkring 9«5 liter. Etter oppløsning av saltet justeres pH og deretter tilsettes et volum vann som er tilstrekkelig til å gi en .oppløsning på 10 liter. Denne oppløsning blir deretter sterilisert.

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer farmasøytiske preparater og fremgangsmåter til fremstilling derav. Preparatene er hyperbare oppløs- ninger som inneholder 1.0, 2.0, 3-0, 4.0, 5-0, 8.0 og 10.0Mg/ml tetrodotoxinhydroklorid; pH 3.5 - 5.0.

Tetrodotoxinhydrokloridet oppløses i en liten mengde vann og fortynnes til 9.0 liter. pH justeres. Dextrose tilsettes og oppløses. Et volum vann tilsettes.hvilket gir en oppløsning på 10 liter. Denne oppløsning blir deretter sterilisert.

Andre former av tetrodotoxin slik som salter med andre syrer enn klorhydrogensyre eller baseformen eller zwitterioneformen kan benyttes og oppløsningen kan fremstilles med anvendelse av mengder som er ekvivalente med de mengder av tetrodotoxinhydroklorid som finnes i eksemplene 1-3...

Når det gjelder desoksytetrodotoxin fremstilles preparater

på samme måte som vist i eksemplene 1-3 for tetrodotoxin, med unntagelse av at konsentrasjonen av biotoxinet er 10 til 100 ug/ml, fordi desoksytetrodotoxin er omkring 1/10 så aktiv som tetrodotoxin.

Eksempel 4

Tre sauer med en vekt på mellom 28 og 29.5 kg og med en alder på omtrent 45- 5 måneder, ble behandlet med tetrodotoxin (3 ug). Alle tre sauene ble fastholdt med sin lumbare og thoraciske ryggrad i horisontalstilling under den subarachnoide injeksjon som ble foretatt over et tidsrom på 5-10 sekunder under anvendelse av en 22 gauge-tre tommer spinalnål ved mellomrommet mellom det sjette lumbar og første sacral segment. Sauen ble deretter skråttstilt umiddelbart slik at skrå-stillingen til den lumbare og thoraciske ryggrad ble innstilt 10 grader i forhold til horisontalplanet (kaudal nedre).

Responsen på tetrodotoxinet var et hurtig tilslag av anestesi (innen mindre enn 4 minutter, vanligvis innen 2 til 3 minutter) med en lang følelsesblokkade fulgt av en total tilbakehenting eller restaurering. Skjønt den normale arbeidsdag begrenset målingene av den eksakte varighet av blokkaden, fastslo man at følelsesblokkadene frem-deles forekom etter 190, 320 og 420 minutter etter injeksjonen med restaurering som opptrådte før 17, 19.5 og .23 timer var gått fra tidspunktet for injeksjonen, respektivt, hos dyrene. Hos to dyr opptrådte total restaurering innen 28 timer, mens i det tredje ble det notert en viss ataxi i ytterligere 12 til 24 timer med full restaurering innen 48 timer fra tidspunktet for injeksjonen. Spredningen av anestesi mot hodet (cephalad spredning) var i gjennomsnitt fire til fem segmenter fra injeksjonsstedet. Sterk cephalad spredning indikeres gjennom tegn på Horners syndrom, med hengende hode, abdominal pusting, cyanose og lettere lammelse av forbena. Ingen av disse tegn ble observert. Anestesi i den nedre regionen av ryggraden (kaudal region) var total. Tabell I gir de oppnådde resultater.

Eksempel 5

Den fremgangsmåte som anvendes i eksempel 4 ble benyttet med anvendelse av en 6 yg dose av tetrodotoxin. I de tre sauer som ble behandlet med dette dosenivå var tilslaget av blokkade hurtig. Blokkadene varte lengre enn 62 timer, men mindre enn 24 timer. I ett tilfelle varte blokkaden i nøyaktig 24 timer. Vektstøttende evne krevde 48-72 timer for restaurering og total restaurering tok vanligvis 72-86 timer. Et dyr hadde en varig lett påvirkning på et ledd som varte i 18 dager, men som tilslutt vendte tilbake til det normale. Dette skyldtes inflammasjon av grunner andre enn slike som var forårsaket av forbindelsen. Cephalad segmental spredning var mer uttalt enn den spredning som ble observert når dyret ble behandlet med 3 yg-Regressjon av to segmenter krevde 2-3 timer i gjennomsnitt. Tabellen nedenfor oppsummerer testresultatene:

Eksempel 6

En 12 mikrogram dose ble testet på en sau med en vekt på 51.8 kg. Tabell III angir de oppnådde' resultater.

o

Figur 2 er en kurve som viser spredning og effekten til det subarachnoidalt administrerte lokalanestetikum i forhold til tid etter . administreringen.

Ved anvendelse av den teknikk som beskrives i foregående eksempler 4-6, ble den lokalanestetiske forbindelse som skulle testes injisert i det subarachnoide rom som inneholder cerebrospinalvæsken mellom det sjette lumbar og det første-sacrale vertebrale mellomrom hos sauen. Hver .av de tre dyrene fikk 1.0 ml av.0.25 % tetrakain eller 0.5 % tetrakain eller 1.0 ml inneholdende 6 yg tetrodotoxin.

Den vanligst benyttede konsentrasjon av tetrakain i spinalanestesi

(tetrakain er det vanligst benyttede anestetiske middel på mennesker)

som'angis av Lund (Principals and Practice of Spinal Anesthesia, CC. •Thomas Publishers, Springfield, 111., (197D, side 420) er 0.25 % 0.3 %• Over denne konsentrasjon blir forbindelsen stadig mer irriterende og anvendes ikke alltid. På mennesker foretas injéksjonen vanligvis mellom enten det andre og tredje eller det tredje og fjerde lumbare mellomrom. Forbindelsen blander seg etter injeksjonen med spinalvæsken og føres eller spredes fremover eller bakover.

På Y-aksen, ordinaten, i figur 2 gis en skjematisk represen-tasjon av segmentene i ryggraden. Hos sauer er de kaudale til cepha-lade (fremre til bakre) segmenter i ryggraden: coccygeal 3,2,1: sacral 4,3,2,1; lumbar 6,5,4,3,2,1; thoracisk 13,12,11,10,9,8,7,6,5,4, 3,2,1; cervical 7,6,5,4,3,2,1. Thoracisk 13 er den eneste av de siste to gruppene som illustreres eller representeres i figur 2.

Avhengig av mange faktorer slik som konsentrasjon, volum av oppløsning, manipulering av pasienten og iboende karakteristika hos forbindelsen, kan en varierende grad av varighet og spredning av anestesien oppnåes. Denne spredning og dens tilbakegang eller såkalte regressjon representeres billedmessig i figur 2. Over (eller cephalad til) hvert punkt er det ingen anestesi og spinalnervene er upåvirket av forbindelsen. Under (eller kaudal til) hvert punkt er alle spinalsegmenter eller nerver blokkerte. I løpet av en tidsperiode som representeres på abscissen eller X-aksen i figur 2 avtar anestesien med begynnelse fortil (cephalad) fordi mindre stoff har nådd disse nerver, og fremskrider baktil (kaudalt) inntil total restaurering opptrådte-. Hver enkel verdi i figur 2 representerer derfor nivået for anestesi ved et spesielt tidspunkt og også det totale antall spinalsegmenter som er blokkert ved dette tidspunkt. Figur 2 sammenligner nivået av anestesi og det segmentale restaureringsmønster som oppnåes hos sauer etter administrering av hver av de tre lokalanestetika. Tetrakain, det vanligst benyttede spinalanestetikum" hos mennesker,

ga i disse forsøk anestesi bare i totalt seks eller syv segmenter og ga regressjon (dyret kom seg) totalt etter'3- 5 timer. Tetrodotoxin på den annen side ga i en konsentrasjon langt underskridende konsentrasjonen for tetrakain blokkade av totalt mellom 9-12 segmenter i minst 6 timer og gikk ikke helt tilbake i løpet av ytterligere 24 timer.

Fra disse forsøk fremgår det, som illustrert grafisk i figur 2, at tetrakain ved konsentrasjoner på 0,25 og 0,5% vil gi anestesi og smertelindring i segmenter under S-3 i bare omrking 3 timer. Tetrodotoxin ga imidlertid anestesi og smertelindring under • S-3 i minst 15 timer. Tilbakehenting eller restaurering av funk-sjonen hos dyrene som ble testet var totalt og ingen sequelae fulgte den lange varighet av anestesi som var forårsaket av tetrodotoxin.

Ved lesing av foregående beskrivelse vil fagmannen uten å utøve noen oppfinnelsesaktivitet innse flere modifikasjoner som kan gjøres av den beskrevne oppfinnelse. Disse modifikasjoner'ansees å være omfattet av foreliggende oppfinnelse og det foregående skal' bare ansees å illustrere foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen.

Claims (20)

1. • Forbindelser for bruk som mellomprodukter ved fremstilling av lokalanestetiske virksomme forbindelser, karakterisert ved at de utgjøres av N-etyl-tert.-amylamin, N-n-propyl-tert.-amylamin og N-n-buty1-tert.-butylamin.

2. Fremgangsmåte til fremstilling av en lokalanestetisk virksom injeksjonsoppløsning med forlenget virkningsvarighet, karakterisert ved at 2-(N-etyl-n-propylamino)-2',6'-butyroxylidid, 2-dietylamino-2'-6'-valeroxylidid, 2-(N-n-butyl-tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid, 2-(N-n-propyl-tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid, 2-(N-tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid, eller 2-(N-tert.-butylamino)-2',6'-propionoxylidid, i en konsentrasjon som høyst tilsvarer konsentrasjonen i for normalt klinisk bruk. beregnede injeksjonsoppløsninger inneholdende de nevnte forbindelser, i vannoppløsning sammenføres med fra 0,5 til 10 yg tetrodotoxin eller fra 10-120 yg desoksytetrodotoxin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den lokalanestetisk virksomme forbindelse er 2-(N-n-butyl-tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid. M.

Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den lokalanestetisk virksomme forbindelsen er 2-(N-n^ propyl-tert.-amylamino)-2', 6'-acetoxylidid.

5. Fremgangsmåte til fremstilling av en lokalanestetisk virksom injeksjonsoppløsning med forlenget virkningsvarighet, karakterisert ved at 2-(N-etyl-n-propylamino)-2', 6'-butyroxylidid, 2-dietylamino-2' , 6'-valeroxylidid, 2-(N-n-butyl-tert.-butylamino-2',6'-acetoxylidid, 2-(N-n-propyl-tert.-amylamino)-2',6'-acetoxylidid, 2-tert.-butylamino-2',6'-acetoxylidid, eller 2-tert.-butylamino-2',6'-propionoxylidid, i en konsentrasjon som høyst tilsvarer konsentrasjonen i for normalt klinisk bruk beregnede injeksjonsoppløsninger inneholdende de nevnte forbindelser,i vann-oppløsning sammenføres med fra 0,5 til 10 yg saxitoxin.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at den lokalanestetisk virksomme forbindelsen er 2-(N-n-butyl-tert.-butylamino)-2',6'-acetoxylidid.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 5S karakterisert ved at den lokalanestetisk virksomme forbindelse er 2-(N-n-propyl-tert.-amylamino)-2'° 6'-acetoxylidid.

8. Fremgangsmåte til fremstilling av et lokalanestetisk preparat beregnet for spinalanestesi med forlenget virkningsvarighet, ■ karakterisert ved at saxitoxin i en mengde som er . effektiv for fremkalling av spinalanestesi sammenfc5res med en farmakologisk akseptabel bærer. '

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at bæreren er valgt fra gruppen bestående av normal salt-. oppløsning, cerebrospinalvæske, en hyperbar oppløsning og en hypobar oppløsning.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at mengden av saxitoxin i preparatet er fra 0,25 til 10 yg pr. enhetsdose av preparatet.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at mengden av saxitoxin i preparatet er fra 1 til 6 yg pr. enhetsdose av preparatet.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at bæreren er.en hyperbar oppløsning.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at preparatet inneholder en vasokonstriktor.

14. Fremgangsmåte til fremstilling av et lokalanestetisk preparat beregnet for spinalanestesi med forlenget virkningsvarighet, karakterisert ved at tetrodotoxin eller desoksytetrodotoxin i en mengde som er effektiv for fremkalling av spinalanestesi sammenføres med en farmakologisk akseptabel bærer.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at bæreren er valgt fra gruppen bestående av saltoppløsning, en oppløsning av cerebrospinalvæske, en hyperbar oppløsning og en hypobar oppløsning.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at tetrodotoxin forekommer i konsentrasjonsområdet fra omkring 1 til 12 yg/ml.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at desoksytetrodotoxin er tilstede i et konsentrasjonsområde på omkring 10 til 120 yg/ml.

18. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at tetrodotoxin er tilstede i et konsentrasjonsområde på omkring 3 til 6 yg/ml.

19. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at desoksytetrodotoxin er tilstede i et konsentrasjonsområde på omkring 30 til 60 yg/ml.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ., v e.d at bæreren er en hyperbar oppløsning. v