NO334077B1

NO334077B1 - Stabil isotopmerket aminosyre og kombinasjon derav, fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein bestående av stabile isotopmerkede aminosyrer og fremgangsmåte for NMR-analysering av strukturen av et målprotein

Info

Publication number: NO334077B1
Application number: NO20042991A
Authority: NO
Inventors: Masatsune Kainosho; Tsutomu Terauchi
Original assignee: Japan Science & Tech Corp
Priority date: 2001-12-19
Filing date: 2004-07-13
Publication date: 2013-12-02
Also published as: NO20042991L

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en stabil isotopmerket aminosyre og kombinasjoner derav. Oppfinnelsen angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein bestående av stabile isotopmerkede aminosyrer, samt en fremgangsmåte for NMR-analysering av strukturen av et målprotein.

Ved bestemmelse av proteinstruktur med NMR har et stabilt enhetlig merket protein med stabile isotoper, slik som<13>C/<15>N så langt blitt anvendt. Imidlertid blir disse teknikkene vanskelige når molekylvekten til proteinet overstiger 20.000. Det har vært foreslått fremgangsmåter for å løse dette problemet slik som en fremgangsmåte hvori ca 50 til 80% av hydrogen i proteinet erstattes randomisert med deuterium (<2>H) i tillegg til merking med<13>C/15Nfor å anvende NMR-signaler til kjernen av gjenværende hydrogen (<!>H) og en fremgangsmåte hvori alle hydrogenatomene unntatt de i metylgruppen og den aromatiske ringen i aminosyreresten erstattes med deuterium. Imidlertid er anvendelsen av disse vanlige fremgangsmåtene begrenset fordi disse teknikkene ikke har nøyaktighet nok når det gjelder strukturinformasjon for å bestemme strukturen til proteiner av høy molekylvekt.

[1-<13>C, 2,3-<2>H2]fenylalanin, [<2>H2]serin og [<2>H2]alanin er beskrevet i avsnittet med analyse av høyereordensstruktur av protein med hovedkjedekarbonyl 13C-NMR av protein HI høyereordensstruktur i " Shin Seikagaku Jikken Koza (Lectures on New Biochemistry Experiments)" publisert av Tokyo Kagaku Dojin 15. november 1990. Imidlertid blir denne teknikken anvendt for bestemmelse av dihedral vinkel x til aminosyrer ved en spesifikk multimerkingsfremgangsmåte. Det har ennå ikke blitt forsøkt at ikke bare de merkede aminosyrene, men også andre aminosyrer merkes, og disse aminosyrene inkorporeres i målproteinet for å analyse stereostrukturen derav.

WO 99/11589 beskriver strukturbestemmelse av proteiner. Merkede proteiner fremstilles fra aminosyrer som er isotopmerket på karbonskjelettet med 13C-, 15N-, og 2H-isotoper, og forenklede NMR spektra av disse tas opp.

Formålet med foreliggende oppfinnelse er å oppnå erstatning med deuterium i protein uten å skade NMR-sensitiviteten til andre hydrogenkjerner og også å oppnå rask analyse av NMR-spekter av protein som har en molekylvekt langt høyere enn den i tidligere fremgangsmåter og høynøyaktighetsbestemmelse av stereostrukturen.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en kombinasjon av en stabil isotopmerket aminosyre egnet for fremgangsmåte for NMR-strukturanalyse av et målprotein ved NMR-spekterbestemmelse med en stabil isotopmerket aminosyre som utgjør målproteinet.

Et annet formål emd foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en fremgangsmåte for inkorporering av stabile, isotopmerkede aminosyrer i et målprotein.

Nok et formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en NMR-fremgangsmåte for å analysere strukturen til et protein.

De ovenfor beskrevne formålene og andre formål ved foreliggende oppfinnelse vil klart fremgå fra følgende beskrivelse og eksempler.

De ovenfor beskrevne problemene kan løses ved foreliggende oppfinnelse. Først tilveiebringer følgende oppfinnelse en stabil isotopmerket aminosyre som er kjennetegnet ved at den er minst en av aminosyrer som utgjør et protein og som har minst et av følgende merkemønstre: (a) hydrogenatomer unntatt minst ett hydrogenatom i en eller flere metylengrupper er

deuterert,

(b) hydrogenatomer i en av prokirale gem-metylgrupper er fullstendig deuterert,

(c) hydrogenatomer i prokirale metylgrupper er delvis deuterert, og

(d) alle hydrogenatomer unntatt ett av dem i en metylgruppe er deuterert og

hydrogenatomer i den aromatiske ringen er delvis deuterert,

og hvor alle karbonatomer som har gjenværende hydrogenatomer i metylengruppen og/eller metylgruppen er erstattet med<13>C; og

alle nitrogenatomer er erstattet med<15>N.

Videre tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en kombinasjon av stabile isotopmerkede aminosyrer som omtalt ovenfor, som utgjør et målprotein, hvor alle aminosyrene som utgjør målproteinet har følgende merkemønstre: (a) når en metylengruppe som har to hydrogenatomer er til stede er ett av metylenhydrogenatomene deuterert, (b) når prokirale gem-metylgrupper er til stede er alle hydrogenatomene i en metylgruppe fullstendig deuterert og hydrogenatomer i andre metylgrupper er delvis deuterert, (d) når en metylgruppe forskjellig fra de angitt ovenfor er til stede, er alle hydrogenatomer unntatt ett av dem i metylgruppen deuterert eller alle hydrogenatomer i metylgruppen er deuterert, (e) når den aromatiske ringen har hydrogenatomer kan hydrogenatomene i den

aromatiske ringen være delvis deuterert,

(f) etter deuterering i (a), (b) og (d) ovenfor blir alle karbonatomer i den hydrogenatom-inneholdende metylengruppen og/eller metylgruppen erstattet med<13>C,og

(g) alle nitrogenatomer erstattes med<15>N.

For det tredje tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein bestående av stabile, isotopmerkede aminosyrer, som innbefatter syntetisering av det cellefrie proteinet ved anvendelse av kombinasjonen av de stabile, isotopmerkede aminosyrene omtalt ovenfor som alle aminosyrene som utgjør målproteinet.

For det fjerde tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for NMR-analysering av strukturen av et målprotein, som innbefatter å abalysere strukturen til målproteinet, hvori alle aminosyrene som utgjør målproteinet er erstattet med de stabile isotopmerkede aminosyrene omtalt ovenfor ved NMR-spektralbestemmelse. Fig. 1 viser strukturene til designede deuterider av 20 aminosyrer som utgjør protein. Fig. 2 viser et sammenligningseksempel på<!>H-<13>C HSQC-spektra av EPPlb-protein

(18,2 kDa) som inneholder SSD-glysin inkorporert deri.

Fig. 3 viser et sammenligningseksempel av HCCT TOCSY-spektra av EPPlb-protein av (18,2 kDa) som inneholder SAD-glysin inkorporert der i. Fig. 4 viser et sammenligningseksempel av HCCT TOCSY-spektra av EPPlb-protein

(18,2 kDa) som inneholder SAD-glutamin inkorporert deri.

Fig. 5 viser et sammenligningseksempel av 'H-<13>C HSQC-spektra av ^-^C /?-region til EPPlb-protein (18,2 kDa) som inneholder SAD/PDM-leucin inkorporert deri. Fig. 6 viser et sammenligningseksempel av 'H-<13>C HSQC-spektra i lK- 13C y-region til EPPlb-protein (18,2 kDa) som inneholder sAD/PDM-leucin inkorporert deri. Fig. 7 viser et sammenligningseksempel av H- C HSQC-spektra i H- C^-region til EPPlB-protein(18,2 kDa) som inneholder SAD/PDM-metionin inkorporert deri. Fig. 8 viser et sammenligningseksempel av<!>H-<13>C HSQC-spektra i ^-"C /?-region til EPPlb-protein(18,2 kDa) som inneholder en aromatisk aminosyre SSD-merket i /^-posisjonen.

Fig. 9 viser et sammenligningseksempel av slicedata av H 92-signaler.

Fig. 10 viser resultatene av en simulering av beregning av struktur til lysozym.

Fig. 11 viser en kombinasjon av stabile isotopmerkede aminosyrer (S AIL-aminosyrer) anvendt for å syntetisere kalmodulin. Fig. 12 viser 1 H- 11C CT-HSQC-spektra av kalmodulinprotein syntetisert ved

anvendelse av kombinasjonen av SAH-aminosyrer vist i fig. 11.

Fig. 13 viser de endelige 20 strukturer oppnådd ved strukturberegning med CYANA

av kalmodulinprotein syntetisert fra kombinasjonen av SAIL-aminosyrer vist i fig. 11.

Foreliggende oppfinnelse er kjennetegnet som beskrevet ovenfor, og måten å utføre oppfinnelsen på vil bli beskrevet nedenfor.

Det understrekes at det viktigste punktet i NMR-analysen av stabile isotopmerkede aminosyrer og proteiner som inneholder dem ifølge oppfinnelsen er som følger: hydrogen ved en spesifikk posisjon i et spesifikt sterisk miljø blir nøye bestemt og deuterert til forskjell fra en konvensjonell teknikk hvori deuteriumutbytting i aminosyrer utføres randomisert. Ved denne teknikken blir hydrogenatomer som ikke nødvendige for bestemmelse av strukturen fullstendig deuterert, mens sensitiviteten til nødvendig hydrogenatomer ikke blir redusert i det hele tatt. Som et resultat forsvinner unødvendige signaler og nøyaktigheten til den oppnådde stereostrukturen forbedres og tiden som kreves for signalanalysen og strukturbesternmelsen blir betydelig forkortet.

Forskjellige teknikker kan anvendes for deuterering og kjemisk syntese av de merkede aminosyrene ifølge oppfinnelsen. For eksempel kan de kjemisk syntetiseres i henhold til et reaksjonsskjema som er vist i eksemplene gitt nedenfor.

Stabile isotopmerkede aminosyrer fremstilt på denne måten blir deretter inkorporert i et målprotein for strukturanalyse av proteinet ved NMR: En hvilken som helst eller flere av aminosyrene som utgjøre proteinet eller alle kan erstattes med stabile isotopmerkede aminosyrer som har et mønster som er i stand til å gjøre oppnåelsen av stereostnikturinformasjonen og NMR-spektraanalysen mest effektiv. Teknikken for fremstilling av et protein for dette formålet kan være en hvilken som helst av teknikker for syntetisering av vanlige høye ekspresjonsproteiner med dyrkede biologiske celler, en teknikk for å syntetisere peptid og proteiner ved organisk kjemi eller enzymkjemi, eller en teknikk for å oppnå et protein ved anvendelse av et cellefritt ekstrakt. Kontroll av isotopisk fortynning og diffusjon av aminosyre-metabolismen er enkelt i foreliggende oppfinnelse, mens det ikke er enkelt og fremkaller problemer ifølge teknikkens stand, hvori de dyrkede biologiske cellene anvendes. Det er mulig ved foreliggende oppfinnelse at merkede aminosyrer, som ikke enkelt syntetiseres i store mengder, svært effektivt kan inkorporeres i proteiner. I lys av disse fakta er fremgangsmåten for syntetisering av et protein ved anvendelse av cellefritt ekstrakt svært effektiv og egnet for formålet ifølge oppfinnelsen. Videre går dette ikke utover annen praktisk verdi ved andre teknikker.

Forskjellige teknikker kan anvendes for spektralbestemmelsen ved NMR og også for strukturanalysen av protein. Det er også mulig å spesifisere den forandrede posisjonen i strukturen ved ligandbindingen.

Uansett er det viktigste karakteristiske trekket ved foreliggende oppfinnelse at aminosyrer anvendt heri har forskjellige deuteriummerkemønstre. Hovedpoenget med foreliggende oppfinnelse er at ved å inkorporere disse aminosyrene i protein kan fordeler som ikke kunne oppnås ved tidligere fremgangsmåte, oppnås ved analyse av stereostrukturen til proteinet. Det er således uunnværlig for forståelsen av foreliggende oppfinnelse klart å definere de forskjellige deuteriummerkemønstrene. Definisjon av hvert mønster av deuterering vil bli beskrevet nedenfor.

Stereoselektiv deuterering (SSD):

Selv når ett av metylenprotonene, dvs gem-metylgrupper (for eksempel to prokirale metylgrupper av val og Leu), til aminosyren er fullstendig utslettet fra spekteret ved deuterering kan en nødvendig stereostrukturinformasjon oppnås fra den steriske tildeling (pro-R, pro-S) informasjonen til det andre protonet (gjenværende proton) og tetrahedraliteten i omgivelsene til karbonatom. I dette tilfellet er det foretrukket å holde karbonatomet til metylgruppen tildekket for å forenkle spinnsystemet. Det er også mulig å oppnå nøyaktig informasjon av forgrenede aminosyrer slik som Val,Leu og Ile i signaltildelingen til en sidekjede ved vanlig magnetisering hvori den magnetiske ladningen svekkes i løpet av starten fra hovedkjeden til deteksjon av sidekjeden.

Regioselektiv deuterering, RSD:

Når spinnsystemet av en sidekjede av en aminosyre er komplisert kan spinnsystemet betydelig forenkles ved selektiv deuterering av en spesifikk posisjon for betydelig enklere å oppnå informasjon når det gjelder stereostrukturen til proteinet.

Stereomatrise deuterering, SAD:

Når to eller flere prokirale sentre er tilstede blir et svært stort antall isotopomerer fremstilt ved vanlig deuterering som på en alvorlig måte reduserer sensitiviteten og nøyaktigheten når det gjelder bestemmelse av slrukturinformasjon. I et slikt tilfelle kan kun enkle isotopomerer realiseres ved stereoselektiv deuterering mens stereokjemisk innbyrdeshet mellom nye kirale senter dannet ved deutereringen bevares. Dette nye merkingsmønsteret vil bli kalt "stereomatrisedeuterering" heretter.

Protontetthetsminimalisering, PDM:

Hydrogenatomer i metylgruppe, aromatisk ring, etc, er magnetisk ekvivalente. Derfor har de protoner som har overskuddsstrukturinformasjon. Protondensiteten i proteinet kan minimaliseres ved deuterering av alle protoner (CH3—» CHD2og lignende), hvilket etterlater nødvendige og minimum antall protoner. Denne teknikken kalles protontetthetsminimalisering.

Ifølge definisjonene beskrevet ovenfor har stabile isotopmerkede aminosyrer i praksis følgende merkemønstre som beskrevet ovenfor i første utførelsesform av foreliggende oppfinnelse: (a) hydrogenatomer unntatt minst ett hydrogenatom i en eller flere metylengrupper er

stereoselektivt deuterert (CDH),

(b) hydrogenatomer i en av prokirale gem-metylgrupper er fullstendig deuterert

(CD3),

(c) hydrogenatomer i prokirale metylgrupper er delvis deuterert (CDH2, CD2H), og (d) alle hydrogenatomer unntatt ett av dem i metylgruppen er deuterert (CD2H) og

hydrogenatomer i den aromatiske ringen er delvis deuterert.

Ved å kombinere deutereringsteknikker klassifisert som beskrevet ovenfor kan aminosyrer optimale for å oppnå informasjon om stereostrukturen til protein designes. Ved deuterering av metylengrupper og metylgrupper ifølge oppfinnelsen, som beskrevet ovenfor, er det fordelaktig fra NMR-bestemmelsesteknikksynspunkt at alle karbonatomene som har hydrogenatomer som er igjen etter at hovedkjede- og sidekjedesignaltildelingen er erstattet med<13>C og at alle nitrogenatomer som utgjør aminosyrer er erstattet med<15>N. Begrepet "tildelt" heri indikerer posisjonen til resten, fra hvilken signalet er avledet, i aminosyresekvensen.

I den første utførelsesformen beskrevet ovenfor er det foretrukket at, i stabile isotopmerkede aminosyrer, alle aminosyrer som utgjør målproteinet anvendes i form av en kombinasjon av stabile isotopmerkede aminosyrer som utgjør målproteinet og som har følgende merkemønster: (a) når metylengruppen som har to karbonatomer er tilstede blir ett av metylenhydrogenatomene deuterert, (b) når prokirale gem-metylgrupper er tilstede er alle hydrogenatomene i metylgruppen fullstendig deuterert og hydrogenatomer i andre metylgrupper blir delvis deuterert, (d) når metylgruppen forskjellig fra de som angitt ovenfor er tilstede, er alle hydrogenatomer unntatt ett av dem i metylgruppen, deuterert og alle hydrogenatomer i metylgruppen er deuterert, (e) når den aromatiske ringen har hydrogenatomer kan hydrogenatomene i den

aromatiske ringen være delvis deuterert,

(f) etter deuterering i henhold til (a), (b) og (d) ovenfor blir alle karbontaomer i hydroenatominneholdende metylengruppe og/eller metylgruppe erstattet med<13>C, og

(g) alle nitrogenatomer erstattes med<15>N.

Videre, når den aromatiske ringen har hydrogenatomer, er disse hydorgenatomene foretrukket delvis deuterert. Det er foretrukket at (f) etter deutereringen i (a), (b) og (d) ovenfor, alle karbonatomene i den hydrogenatominneholdende metylengruppen og metylgruppen omdannes til 13C. Det er også foretrukket at karbonatomene som utgjør karbonylgruppen og guanadylgruppen i aminosyrene erstattes med C. Foretrukket blir alle karbonatomer bundet med 'H fullstendig erstattet med<13>C.

Fig. 1 viser strukturer at 20 stabile isotopmerkede aminosyrer designet fra aminosyrer som utgjør protein ved å kombinere alle disse teknikkene. Målet med mønstrene vist i fig. 1 er anvendelse av dem for bestemmelse av stereostrukturen til proteinet. Videre er forskjellige design også mulige i henhold til den nødvendige strukturinformasjonen eller egenskapene til målproteinet.

For inkorporeringen av stabile isotopmerkede aminosyrer inn i målproteinet innbefatter en foretrukket fremgangsmåte cellefritt proteinsyntesesystem ved anvendelse av en kombinasjon av de ovenfor beskrevne stabile isotopmerkede aminosyrene som hele aminosyrer som utgjør målproteinet for fremstilling av målproteinet som innbefatter de stabile isotopmerkede aminosyrene.

For å analysere strukturen til proteinet med NMR er en foretrukket fremgangsmåte den for å analysere NMR-strukturen til målproteinet, som innbefatter å analysere strukturen til målproteinet hvori alle aminosyrene som utgjør målproteinet er erstattet med de

ovenfor beskrevne stabile isotopmerkede aminosyrene ved NMR-spektral bestemmelse.

Følgende eksempler illustrerer fremstilling av protein merket med aminosyrer som har forskjellige merkingsmønstre, og de underbygger også det faktum at NMR-spektra av hver av dem har svært gode karakteristikker når det gjelder å oppnå stereostrukturen.

Eksempler

Eksempel 1 Fremstilling av protein som inneholder SSD-glysin inkorporert

der i og NMR-bestemmelse:

Trinn 1 til 12 illustrerer syntese av stereoselektivt monodeuterert (2S)-[1,2-<13>C2;2-<15>H]glysin) heretter refert til som SSD-glysin) i henhold til følgende skjema 1:

Forbindelse (2) (12,55 g, 48,2 mmol, 87%) oppnås fra [ul-<13>C6]-glukose (10,06 g, 55,8 mmol) (1) med referanse til en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (K. P. R. Kartha et al., Tetrahedron Lett., 27, 3415,1986).

Forbindelse (2) (12,55 g, 48,2 mmol) ble omdannet til forbindelse (3) (22,08 g, 44,3 mmol) ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Nicolaou et al., J. Am. Chem. Soc., 110, 4673,1988). 300 ml 80 % eddiksyre tilsettes til forbindelse (3) for å gi en løsning. Etter fjerning av den beskyttende gruppen ved 75°C i 3 timer blir reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og deretter konsentrert under redusert trykk. Den azeotropiske prosessen med etanol gjentas 4 ganger for å gi forbindelse (4). Deretter blir den tiltenkte forbindelsen (5) (12,9 g, 30,2 mmol) oppnådd i et utbytte på 68% fra forbindelse (2) ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (C. Hubschwerlen et al., Synthesis. 962, 1986).

150 ml metylenklorid ble tilsatt til forbindelse (5) (3,66 g, 8,58 mmol) for å gi en løsning. Silikagel (73,8 g) og tributyltinndeuterium (5,0 g, 7,2 mmol) ble tilsatt til løsningen og blandingen ble omrørt i 18 timer. En silikagelkolonne ble fylt med reaksjonsblandingen. Organotinnforbindelser ble eluert med 1 L metylenklorid og deretter ble forbindelsen (6a) (3,13 g, 7,29 mmol) oppnådd i et utbytte på 85%.

Forbindelse (6A) ble tosylert i 5-posisjon med referanse til en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Joseph A. Tino et al., J. Med. Chem. 36,1221,1993). Den oppnådde forbindelsen (7) ble løst i 83 ml tetrahydrofuran. 1 M tetrabutylammoniumfluorid/tetra-hydrofuranløsning (13,9 ml, 13,9 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen som ble omrørt ved romtemperatur i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble renset med silikagelkolonnekromatogafi med heksan/etylacetat = 1/1 hvilket ga forbindelse (8)

(2,73 g, 7,79 mmol, 67%).

Forbindelse (8) (2,22 g, 6,34 mmol) ble løst i 110 ml metylenklorid og den oppnådde løsningen ble avkjølt til 0°C. Dess-Martin-reagens (8,05 g, 18,99 mmol) ble tilsatt til løsningen som ble omrørt mens temperaturen ble holdt ved 0°C. Temperaturen ble hevet til romtemperatur og den oppnådde blandingen ble omrørt i 1,5 timer. 40 ml mettet nartunmydrogenkarbonatiøsning som inneholder 6 g natriumtiosulfat og 50 ml etylacetat ble tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt i 5 minutter. Etter vasking med 50 ml mettet natriumhydrogenkarbonatløsning to ganger, med 50 ml vann en gang og med 50 ml saltvann en gang ble det organiske sjiktet tørket over natriumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (9).

En løsning av forbindelse (9) i 75 ml metanol ble avkjølt til 0°C. En løsning av natriumborhydrid (120 mg, 3,17 mmol) i 50 ml metanol ble tilsatt dertil. 2 minutter etter ble reaksjonsblandingen tatt fra isbadet og omrørt i 1,5 timer. 80 ml aceton ble tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt i 5 minutter. 20 ml vann ble tilsatt dertil. Etter konsentrering under redusert trykk ble 40 ml etylacetat tilsatt til reaksjonsblandingen og blandingen ble vasket med vann (40 ml x 1) og saltvann (40 ml x 1). Det organiske sjiktet ble tørket over natriumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (10).

Forbindelse (10) ble løst i DMF. Etter nitrogenerstatning ble kaliumftalimid (1,76 g, 9.51 mmol) tilsatt dertil. Den oppnådde blandingen ble omrørt ved 70°C i 10 timer, konsentrert og renset med silikagelkolonnekromatografi med heksan/etylacetat =1/1 for å oppnå forbindelse (11).

Forbindelse (11) ble løst i en løsemiddelblanding bestående av 50 ml eddiksyre og 50 ml 5 N svovelsyre og den oppnådde løsningen ble omrørt ved 65°C i 1 time. Etter avkjøling til romtemperatur ble KMn04(4,15 g, 26,11 mmol) tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer. Natriumtiosulfat ble tilsatt til reaksjonsblandingen til løsningen ble fargeløs. 20 ml vann ble tilsatt dertil. Etter ekstraksjon med metylenklorid (30 ml x 3) ble den organiske fasen vasket med vann (20 ml x 2) tørket med natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (12).

Forbindelse (12) ble refluksert i 50 ml 1 N saltsyre. Etter avkjøling ble de hvite nållignende krystallene som var dannet skilt fra ved filtrering. Filtratet ble renset med Dowex 50W-X8 hvilket ga SSD-glysin (13a) (391 mg, 94,95 mmol, 78%).

Ved omdanning av forbindelse (5) til forbindelse (6b) kan SSD-glysin (13b) som har en omvendt konfigurasjon i 2-posisjonen syntetiseres.

Forbindelse (5) (5,0 g, 11,72 mmol) ble således løst i dietyleter (300 ml) og den oppnådde løsning ble avkjølt til 0°C i argonatmosfære.

Magnesiumdibromid/dietyleterkompleks (17,96 g, 69,54 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen som ble omrørt i 5 minutter. Litium tri-tert-butoksyaluminiumdeuterid (8,88 g, 34,77 mmol) ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt ved 0°C i 4 timer. 30 ml 1 N saltsyre ble tilsatt til reaksjonsblandingen ved 0°C og blandingen ble omrørt i 10 minutter. Etter ekstraksjon med etylacetat (250 ml x 4) ble det organiske sjiktet vasket med saltvann (100 ml x 1), tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (6b).

Prolin cis-trans isomerase EPPlb (molekylvekt: 18 kDa) fra Escherichia coli ble anvendt som modellprotein for etablering av en fremgangsmåte for høyselektiv inkorporering av det ovenfor beskrevne SSD-glysin (13a og 13b). Ved vanlig in vivo proteinfremstillingsfremgangsmåte hvori E. coli eller lignende anvendes er det vanskelig for metylenprotonet til Gly å kontrollere den isotope fortynningen eller diffusjonen ved hjelp av serinhydroksymetyltransferase (SHMT) som katalyserer den gjensidige omdanning av glysin og serin. Oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse har lykkes i fremstilling av isotopmerket EPPlb {merkene er to typer SSD-glysin og (2S)-og (3R)-[1,2-<13>C2; 1-<15>N; 2-<2>H]-Gly} ved en in vitro proteinsyntetiseringsfremgangsmåte med S30 cellefritt ekstrakt (heretter referert til som "cellefritt proteinsyntesesystem") mens en høy stereoselektivitet holdes på grunn av at den proteinsyntetiserende funksjonen ikke blir redusert, selv ved tilsetning av en tilstrekkelig mengde av cykloserin kjent for å være en inhibitor av SHMT.

<NMR-bestemmelse av merket protein>

Prøver for NMR-bestemmelse ble fremstilt med SSD-glysinmerket EPPlb under betingelser beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76, 2000). Signaltildeling av metylenproton av glysinrest som var basert på tildelingsinformasjon til hovedkjede NMR-signal beskrevet i denne litteraturreferansen.

lU- l3C HSQC-spektra av EPPlb prøve som har (2S)- inkorporert (3R)-[1,2-13C2; 1-<15>N; 2-<2>H]glysin deri og det til EPPlb-prøven som har [1,2-<13>C2; l-<15>N]-glysin inkorporert deri sammenlignes med hverandre i fig. 2. Følgende faktum er klart fra fig. 2.1 den vanlige fremgangsmåten hvori en enhetlig merket prøve anvendes er NMR-spektra overlesset hvilket gjør stereospesifikk tildeling av metylenprotonet uunngåelig og bestemmelse av stereostruktur av proteinet er praktisk talt umulig. På den annen side, når proteinet som har stereospesifikt deuterert SSD-glysin inkorporert deri testes blir totalt antall signaler i NMR-spekteret redusert til det halve og øker når det gjelder signalspalting og øker når det gjelder linjebredde på grunn av at spinnkopling av metylenprotoner er utelatt. Således, i spekteret blir glysinselektiv merking forenklet og alle signalene kan separat observeres på todimensjonal NMR. I tillegg har tildeling av stereospesifikke signaler allerede blitt oppnådd i trinnet med fremstilling av prøven og, derfor, er tildelingen unødvendig. Et viktig punkt er at, på grunn av at den stereospesifikke tildelingen allerede har blitt gjort, er kun en av de to SDD-glysinmerkede proteinprøvene nødvendig.

I henhold til den beskrevne teknikken, forsvant således signaler unødvendig for bestemmelse av strukturen og tiden som kreves for signalanalyse og stxukturbestemmelse er bemerkelsesverdig forkortet.

Eksempel 2 Fremstilling av protein som inneholder SAD-lysin og NMR-bestemmelse:

Syntese av 2S,3R,4R,5S,6R)-[1,2,3,4,5,6-<13?C>6; 2,6-<15>N; 3,4,5,6-<2>H]lysin (heretter referert til som "SAD-lysin") i trinnet 13 til 16 vil bli illustrert i henhold til følgende skjema 2:

(2S, 3S, 4)-[l,2,3,4,5-<13>C5; 2-<15>N; 3,4-<2>H2]glutamsyre (heretter referert til som SAD-glutamsyre) (14) (25,202 mmol) avledet fra enhetlig<13>C-merket L-glutamsyre ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (M. Oba, et al., J. Org. Chem. 64, 9275,1999) ble løst i 0,2 M løsning (200 ml) av pyridinhydroklorid i deuterert oksid. PH'en til den oppnådde løsningen ble justert til 5 med pyridin som inneholdt pyridoksalfosfat (200 mg) og ditiotreitol (120 mg). Glutamsyredekarboksylase (1000 U, 210 ml) ble tilsatt til løsningen og den oppnådde blandingen ble omrørt ved 37°C i 3 timer dekket for lys. Den oppnådde reaksjonsblandingen ble konsentrert ved en temperatur på ikke høyere enn 30°C under redusert trykk. Residuet ble renset med SK1B. Den merkede aminobutansyren således oppnådd ble løst i 50 ml vann. Natriumhydrogenkarbonat (2,83 g, 26,66 mmol) og N-etoksykarbonylftalimid (6,37 g, 29,08 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen. Den oppnådde løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time. Reaksjonsløsningen ble justert til pH 5 ved forsiktig tilsetting av konsentrert saltsyre. De således dannede krystallene ble skilt fra ved filtrering. Krystallene på filterpapiret ble vasket med kaldt vann og deretter tørket i et vakuumtørkekar hvilket ga forbindelsen (15) (4,43 g, 18,32 mmol, 75 %).

Forbindelse (15) ble løst i metylenklorid (20 ml). Tionylklorid (11,9 g, 100 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen ved romtemperatur. Den oppnådde løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og deretter ved 40°C i 2 timer. Reaksjonsløsningen ble konsentrert under redusert trykk. Det oppnådde residuet ble løst i benzen. Tefrakistrifenylfosfinpalladium (0,21 g, 5 vekt%) og tributyltinndeuterid (3,227 ml, 12 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen i argonatmosfære og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og deretter ble produktet renset med silikagelkolonnekromatorgrafi med heksan/etylacetat = 7/3 hvilket ga forbindelse (16) (2,101 g, 9,34 mmol, 93 %).

En løsning av merket diketopiperazinderivat vist i figuren (1,777 g, 4,95 mmol) og forbindelse (16) (1,013 g, 4,5 mmol) i tefrahydrofuran (45 ml) ble avkjølt til -40°C under røring i argonatmosfære. En løsning av kalium tert-butoksid (0,616 g) i tefrahydrofuran (45 ml) ble tilsatt til løsningen. Temperaturen i reaksjonsløsningen ble sakte hevet til romtemperatur. Mettet ammoniumklorid ble tilsatt dertil. Etter ekstraksjon med etylacetat ble det organiske sjiktet vasket med mettet vandig natriumkloridløsning og tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk. Residuet ble renset med silikagelkolonnekromatografi med heksan/etylacetat = 65/35 hvilket ga forbindelse (17) (1,270 g, 2,72 mmol, 61%).

<Trinn(16)

Forbindelse (17) (1,251 g, 2,68 mmol) ble løst i etylacetat (20 ml). Platinadioksid (0,023 g, 0,1 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen og luften i reaksjonskolben ble erstattet med deteriumgass. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 timer mens trykket av deteriumgass ble holdt ved 1 kgf/cm<2>. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og reaksjonsblandingen ble konsentrert. Konsentrert hydrobromsyre ble tilsatt i reaksjonsblandingen og blandingen ble omrørt ved 140°C i 48 timer. Etter konsentrering under redusert trykk ble produktet ionebyttet med Dowex 50W-X8 hvilket ga SAD-lysin (18) (0,360 g, 1,73 mmol, 65%).

SAD-lysinmerket EPPlb ble fremstilt ved bisetning av SAD-lysin ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen(E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76, 2000).

En NMR-prøve ble tildelt i henhold til informasjon når det gjelder tildeling av hovedkjede NMR-signaler til proteinet beskrevet i litteraturen eller betingelser beskrevet i samme litteratursted (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76,2000).

HCCH TOCSY-spektra av EPPlb-prøve som inneholder SAD-lysin inkorporert deri ble bestemt. Fig. 3 viser sammenligning av resultatene med de proteiner som inneholder [ul- 11 C;<1S>N]-lysin oppnådd ved en vanlig fremgangsmåte. Det er klart fra fig. 3 at protein som inneholder SAD-lysin blir mer forenklet enn proteinet oppnådd ved vanlig fremgangsmåte. På grunn av at signalene til sidekjeden til langkjedede aminosyrer ble svært sensitivt observert ble NMR-signalene til sidekjeden til langkjedede aminosyrer som ikke kan anvendes så langt nå anvendt for å oppnå strukturinformasjon.

Ved teknikken som her beskrives blir således signaler som er unødvendige for strukturbesternmelse fjernet og sensitiviteten til resten av signalene blir forbedret. Følgelig blir rask og pålitelig signalanalyse av høymolekylvektprotein og bestemmelse av stereostruktur derav med høy nøyaktighet gjort mulig over området for tidligere teknikker.

Eksempel 3 Fremstilling av protein som inneholder SAD-glutamin og NMR-bestemmelse derav:

Syntesen av (2S,3S,4R)-[1,2,3,4,5-<13>C5; 2,5-<13>N2; 3,4-<2>H2]glutamin (heretter refert til som "SAD-glutamin") i trinn 17 vil bli illustrert i henhold til følgende skjema 3:

Konsentrert svovelsyre (55 ul) ble tilsatt til metanol (1305 ul) og blandingen ble avkjølt til -5 til -10°C. Den oppnådde løsningen ble tilsatt til 2 ml medisingass som inneholdt SAD-glutamsyre (14) (98 mg, 719 umol). Den oppnådde blandingen ble omrørt ved - 4°C i 1 time og deretter ved romtempereratur i 2 timer. Etter fullstendig omrøring ble 156 ul karbondisulfid tilsatt til reaksjonsblandingen mens temperaturen ble holdt ved 0°C.<15>N-merket ammoniakkgass ble introdusert til beholderen i 14 minuter. Etter henstand ved romtemperatur i 10 dager ble metanol tilsatt dertil og krystallene således dannet ble separert ved filtrering. Filtratet ble konsentrert og deretter løst i destillert vann. Eter rensing med kationbytterharpiks DOWEX-50, anionbytterharpiks IRA96SN og anionbytterharpiks IRA67 etter hverandre ble SAD-glutamin (19) (26 mg) oppnådd.

En proteinprøve som inneholdt det ovenfor beskrevne SAD-glutaminet (19) inkorporert deri ble fremstilt ved tilsetting av metioninsulfoksimin og 6-diazo-5-oksonorleucin som inhiberer enzymer med hensyn til omdannelse av SAD-glutamin og glutamsyre - glutamin til EPPlb-protein som modellprotein under betingelser beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76,2000). Merkede produkter kan ikke fremstilles ved vanlig in vivo proteinfremstillingsfremgangsmåte på grunn av at betingelser som kreves for inhibering av metabolittisk forandring og for fremstilling av proteiner ikke kan etableres.

En NMR-prøve ble tildelt i henhold til informasjon når det gjaldt tildeling av proteinhovedkjede NMR-signalene beskrevet i litteraturen under betingelser beskrevet i samme litteratursted (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76,2000).

HCCH TOCSY-spektra av EPPlb-prøve som inneholder SAD-glutamin inkorporert deri ble bestemt. Fig. 4 viser sammenligning av resultatene med de til protein som inneholder [ul-<13>C;<15>N]-glutamin oppnådd ved en vanlig fremgangsmåte. Det er klart fra fig. 4 at protein som inneholder SAD-glutamin blir mer forenklet enn protein oppnådd ved vanlig fremgangsmåte. På grunn av at signalene til sidekjedene til langkjedede aminosyrer ble observert svært sensitivt blir NMR-signalene til sidekjede til langkjedede aminosyrer som ikke så langt kunne anvendes nå anvendt for å oppnå strukturinformasjon.

Ved teknikken som her er beskrevet blir således signaler som er unødvendige for strukturbestemmelse fjernet og sensitiviteten til resten av signalene blir forbedret. Følgelig blir rask og pålitelig signalanalyse av et høymolekylvektprotein og bestemmelse av stereostrukturen derav med høy nøyaktighet gjort mulig over området til tidligere teknikker.

Eksempel 4 Fremstilling av protein som inneholder SAD/PDM-leucin og NMR-bestemmelse derav:

Syntese av (2S,3R,4R)-[1,2,3,4,5<13>C5; 2-<15>N2; 3,5,5,5',5',5'-<2>H6]leucin (heretter refert til som "SAD/PAD-leucin) i trinnene 18 til 31 vil bli illustrert i henhold til følgende skjema 4:

Tionylklorid (4,52 g, 38,0 mmol) ble tilsatt dråpevis til en løsning (20 ml) av SAD-glutamsyre (14) (2,56 g, 16,5 mmol) i etanol under iskjøling. Den oppnådde blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og deretter refluksert i 1 time. Løsemiddelet ble fordampet. EfeO ble tilsatt til residuet. Reaksjonsblandingen ble nøytralisert med mettet natriumhydrogenkarbonat og deretter omrørt ved 150°C under redusert trykk i 1 time. Det organiske stoffet ble ekstrahert med kloroform. Ekstraktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og deretter ble løsemiddelet fordampet hvilket ga forbindelse (20) kvantitativt.

En suspensjon (17 ml) av litiumtetrahydroborat (0,40 g, 18,2 mmol) i tetrahydrofuran ble tilsatt dråpevis til en løsning (17 ml) av forbindelse (20) (2,73 g, 16,5 mmol) i tetrahydrofuran og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 25 timer. 20% eddiksyre (20 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen og blandingen ble konsentrert under redusert trykk. Residuet ble behandlet med Dowex 50W-X8 og deretter konsentrert under redusert trykk. Det organiske materialet ble ekstrahert med kloroform. Det organiske sjiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (21) (1,06 g, 8,65 mmol, 52 %).

Tert-butyldimetylsilylklorid (1,44 g, 9,52 mmol) og imidazol (1,36 g, 19,9 mmol) ble tilsatt til en løsning (10 ml) av forbindelse (21) (1,06 g, 8,65 mmol) i DMF og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 21 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk og produktet ble ekstrahert fra residuet ved ekstraksjon med dietyleter. Det organiske sjiktet ble vasket med vann og mettet vandig natriumkloirdløsning, tørket over vannfritt magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (22) (1,69 g, 7,14 mmol, 83 %).

Di-tert-butyldikarbonat (1,87 g, 8.57 mmol) ble tilsatt til en løsning (15 ml) av forbindelse (22) (1,69 g, 7.15 mmol) i DMF. Deretter ble dimetylaminopyridin (0,87 g, 7,14 mmol) tilsatt dertil og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 22 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk og produktet ble ekstrahert fra residuet med etylacetat. Det organiske sjiktet ble vasket med en vandig kaliumhydrogensulfatløsning og vann og deretter tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og residuet renset ved silikagelkromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 85/15) hvilket ga forbindelse (23) (1,90 g, 5,64 mmol, 79 %).

3,3-Dimetylpropylenurea (1,45 ml, 11,8 mmol) ble tilsatt til 1 M heksametyldisilazan-natriumamidVtetrahydrofuranløsning (11,8 ml, 11,8 mmol) og blandingen ble omrørt ved 0°C i 10 minutter. Reaksjonsløsningen ble avkjølt til -78°C. En løsning (10 ml) av forbindelse (23) (1,90 g, 5,64 mmol) i tetrahydrofuran ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt ved samme temperatur i 30 minutter. En løsning (10 ml) av fenylselenylklorid (1,19 g, 6,20 mmol) i tetrahydrofuran ble tilsatt til reaksjonsblandingen og blandingen ble omrørt ved -78°C i 2 timer. Deuterert metyljodid (0,90 g, 6,20 mmol) ble tilsatt til reaksjonsblandingen ved samme temperatur. Deretter ble temperaturen hevet til romtemperatur. Eter ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Det organiske sjiktet ble vasket med vann og mettet vandig natriumkloridløsning og deretter tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og residuet renset med silikagelkolonne-kromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 94/6) hvilket ga forbindelse (24) (1,52 g, 3,06 mmol, 54 %).

En løsning av forbindelse (24) (1,52 g, 3,06 mmol) i tetrahydrofuran (12 ml) ble avkjølt til 0°C og 30 % vannfri hydrogenperoksydløsning (3,47 g, 30,6 mmol) ble dråpevis tilsatt dertil. Temperaturen ble hevet til romtemperatur. Etter omrøring i en time ble forbruk av utgangsmaterialet bekreftet ved TLC. Etter ekstraksjon fra reaksjonsblandingen med eter ble det organiske sjiktet vasket med mettet vandig natriumkarbonatløsning og tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og residuet renset med silikagelkolonnekromatografri (utvikler: heksan/etylacetet = 85:15) hvilket ga forbindelse (25) (0,806 g, 2,36 mmol, 77 %).

Platinadioksid (0,04 g, 5 vekt%) ble tilsatt til en løsning (25 ml) av forbindelse (25)

(0,806 g, 2,36 mmol) i metanol og blandingen ble omrørt ved hydrogenatmosfære i 1 time. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og filtratet konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (26) kvantitativt.

p-Toluensulfonsyre (0,04 g, 0,236 mmol, 10 mol %) ble tilsatt til en løsning (25 ml) av forbindelse (26) (0,81 g, 2,36 mmol) i metanol og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 18 timer. Reaksjonsblandingen ble konsentrert under redusert trykk. Etter ekstraksjon med etylacetat ble ekstraktet vasket med mettet vandig natxiumhydrogenkarbonatløsning. Det organiske sjiktet ble tørket over vannfritt

magnesiumsulfat og blandingen ble deretter konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (27) (0,426g, 1,78 mmol, 75 %).

En blanding av natriumperiodat (3,81 g, 17,8 mmol), rhuteniumkloirdmonohydrat (0,1

g) og H20 (12 ml) ble tilsatt til en løsning (10 ml) av forbindelse (27) (0,426 g, 1,78 mmol) i aceton og blandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time. Temperaturen ble hevet til

romtemperatur og reaksjonsblandingen ble omrørt i ytterligere 1 time. Det organiske sjiktet ble separert. Isopropanol (10 ml) ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt i 1 time. Uløselig stoff ble separert fra ved filtrering. Filtratet ble konsentrert under redusert trykk og residuet ble ekstrahert med kloroform. Det organiske sjiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og løsemiddelet fordampet hvilket ga forbindelse (28) kvantitativt.

En blanding av N,N-dimetylformamid-dineopentylacetal (0,74 g, 3,21 mmol) og tert-butanol (0,40 g, 5,34 mmol) ble tilsatt til en løsning (10 ml) av forbindelse (28) (0,45 g, 1,78 mmol) i benzen under refluks og blandingen ble refluksert i ytterligere 30 minutter. Reaksjonsløsningen ble avkjølt til romtemperatur. Etylacetat ble tilsatt hertil. Det organiske sjiktet ble vasket med vann, mettet vandig natriumhydrogenkarbonatløsning og mettet vandig natriumkloridløsning og deretter tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og residuet renset med silikagelkolonnekromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 80:20) hvilket ga forbindelse (29) (0,271 g, 0,88 mmol, 49 %).

En løsning av forbindelse (29) (0,271 g, 0,88 mmol) i tefrahydrofuran (10 ml) ble avkjølt til 0°C. 1 M vandig LiOH-løsning (1,05 ml) ble tilsatt dråpevis til løsningen. Temperaturen til reaksjonsblandingen ble hevet til romtemperatur. Etter omrøring i 30 minutter ble forbruk av utgangsmaterialet bekreftet ved TLC. Produktet ble ekstrahert ved mettet vandig natriumhydrogenkarbonatløsning og deretter vasket med etylacetat. pH til det vandige sjiktet ble justert til 3 til 4 med sitronsyre. Det organiske produktet ble ekstrahert med etylacetat. Det organiske sjiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og deretter ble løsemiddelet fordampet hvilket ga forbindelse (30) kvantitativt.

En løsning (10 ml) av forbindelse (30) (9,287 g, 0,88 mmol) i tetrahydrofuran ble avkjølt til -40°C under argongasstrøm. Trietylamin (0,12 g, 1,14 mmol) og isobutylklorformat (0,15 g 1,05 mmol) ble tilsatt til løsningen som ble omrørt i 1 time. Trietylaminhydroklorid således presipitert ble fjernet ved filtrering under argonstrøm. Filtratet ble avkjølt til 0°C og en blanding av natriumbordeuterid (0,11 g, 2,63 mmol), tetrahydrofuran (8 ml) og deuteriumoksid (6 ml) ble tilsatt dertil. Den oppnådde blandingen ble omrørt i 1,5 timer. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat og deretter vasket med mettet vandig natriumkloridløsning, 10 % vandig sitronsyreløsning og mettet vandig natriumkloridløsning. Det organiske sjiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og residuet renset med silikagelkolonnekromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 75:25) hvilket ga forbindelse (31) (0,168 g, 0,53 mmol, 61 %).

Jod (0,30 g, 1,17 mmol) ble tilsatt til en suspensjon (5 ml) av trifenylfosfin (polystyren-støttet 3 mmol P/g harpiks, 0,39 g, 1,17 mmol) i diklormetan, og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 10 minutter. Deretter ble imidazol (0,08 g, 1,17 mmol) tilsatt til den oppnådde blandingen og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 10 minutter. En løsning (15 ml) av forbindelse (31) (0,168 g,0,533 mmol) i diklormetan ble tilsatt til reaksjonsblandingen og blandingen ble refluksert i 2 timer. Det løselige materialet ble fjernet ved filtrering og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Produktet ble ekstrahert fra residuet med eter og deretter vasket med mettet natriumtiosulfatløsning. Det organiske sjiktet ble tørket med vannfri magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (32) (0,199 g, 0,468 mmol, 88 %).

Tributyltinnhydrid (0,21 g, 0,70 mmol) og azobisisobutyronitril (AIBN) (7,7 mg) ble tilsatt til en løsning (10 ml) av forbindelse (32) (0,199 g, 0,468 mmol) i benzen og blandingen ble omrørt i 1 time. Løsemiddelet ble fordampet. 1 M saltsyre (15 ml) ble tilsatt til residuet og blandingen ble refluksert ved 130°C i 1 time. Det vandige sjiktet ble vasket med kloroform og deretter konsentrert under redusert trykk. Etter ionebytting med Dowex 50W-X8 ble SAD/PDM-leucin (33) (0,0486 g, 0,34 mmol, 73 %) oppnådd.

En proteinprøve som inneholder det ovenfor beskrevne SAD/PDM-leucin inkorporert deri ble fremstilt ved tilsetning av SAD/PDM-leucin til EPPlb-protein som modellproteinet under betingelser beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76, 2000).

En NMR-prøve ble tildelt i henhold til informasjon vedrørende tildeling av proteinhovedkjede-NMR-signalene beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18,75-76,2000) under betingelser beskrevet i samme litteratursted.

^-"CCT-HSQC av EPPlb-prøve som inneholder SAD/PDM-leucin inkorporert deri ble bestemt. Fig. 5 og 6 viser sammenligning av resultatene med de proteinene som inneholder [ul-<13>C;15N]-leucin oppnådd ved en vanlig fremgangsmåte. Det er klart fra fig. 5 og 6 at signalene til protein som inneholder SAD/PDM-leucin er mer forenklet enn de for protein oppnådd ved vanlig fremgangsmåte. Det skal bemerkes at en av metylgruppene i leucin var fullstendig deuterert og karbonatomet ble holdt som nukleær spin-fri<12>C, mens i den andre metylgruppen var to av tre hydrogenatomer deuterert og resten av hydrogenatomene, som var minimum nødvendige hydrogenatomer, ble holdt for å oppnå strukturen. Sentralkarbonatomet er erstattet med<13>C for NMR-bestemmelse og tildeling. Linjebredden ble redusert idet protontettheten ble redusert for tilnærmet fullstendig å kompensere for reduksjon i antall protoner i deutereringen. I denne kompliserte målefremgangsmåten for virkelig strukturbestemmelse forventes bestemmelsessensitiviteten å bli sterkt forbedret sammenlignet med den i vanlige fremgangsmåter.

Således, når SAD/PDM-aminosyrer ble anvendt, er alle karbonatomer som har proton kun nC- 1R. Således ble det gjort mulig å oppnå merkede proteinprøver uunnværlig for utvikling av nye NMR-teknikker slik som bestemmelse og analyse av relaksasjonstid og anvendelse av restdipolinteraksjonkonstant for strukturbestemmelse.

Eksempel 5 Fremstilling av protein som inneholder SAD/PDM-metionin

inkorporert deri og NMR-bestemmelse:

Trinn 32 til 38 illustrerer syntese av (2S, 3R, 4R)-[1,2,3,4,6-<13>C5; 2-<l5>N; 3,4,6-<2>H4]metionin (heretter referert til som SAD/PDM-metionin) i henhold til følgende skjema 5:

(2S, 3R)-[1,2,3,4-<13>C4; 2-<15>N; 3-<2>H] aspartansyre (34) ble omdannet til forbindelse (35) med referanse til en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (K. Ramalingam et al., J. Org. Chem. 53,1900-1903,1988). Forbindelse (35) (2,82 g, 10 mmol) ble løst i diklormetan (10,0 ml). Den oppnådde løsningen ble tilsatt dråpevis til en løsning av Dess-Martinperiodinan (4,84 g, 11,4 mmol) i metylenklorid (30,0 ml) i løpet av 30 minutter. Etter omrøring i 1 time ble dietyleter (50 ml) tilsatt til den oppnådde blandingen og deretter ble en blanding av mettet natriumhydrogenkarbonat (50,0 ml) og natriumtiosulfat (15,0 g) tilsatt dertil og blandingen ble omrørt i 10 minutter. Det organiske sjiktet ble vasket med mettet natriumhydrogenkarbonat (50,0 ml) og vann (50,0 ml) og deretter tørket over magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og det oppnådde urene produktet ble renset med silikagelkolonnekromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 1/1) hvilket ga forbindelse (36) kvantitativt.

En blanding av etanol (60,6 ml, 2,78 g) og tetrahydrofuran (16,0 ml) og deretter en løsning av (s)-(-)-l,l'-bi-2-naftol (60,6 mmol, 17,34 g) i tetrahydrofuran (90,0 ml) ble sakte tilsatt til blanding av litumaluminiunhydrid (60,0 mmol, 2,28 g) og tetrahydrofuran (4,0 ml) via sprøyte under røring i nitrogenatmosfære. Den oppnådde blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til -100°C. En løsning av forbindelse (36) (1,67 g, 6,00 mmol) i tetrahydrofuran (11,0 ml) ble sakte tilsatt til reaksjonsblandingen med en sprøyte og blandingen ble omrørt ved denne temperaturen i 3 timer. Deretter ble reaksjonsblandingen omrørt ved - 78°C i 10 timer. 0,5 N saltsyre (1,0 ml) ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt i 15 minutter. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom Hyfio Super Cel. Det organiske sjiktet ble tørket over magnesiumsulfat og løsemiddelet fordampet. Heksan ble tilsatt til det oppnådde urene produktet. Overskudd-naftol ble fjernet ved krystallisering. Produktet ble renset med silikagelkolonnekromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 1:1) hvilket ga forbindelse (37). (0,315 g, 1,12 mmol, 19 %).

Forbindelse (37) (0,315 g, 1,12 mmol) ble løst i metylenklorid (15,0 ml). Trietylamin (0,125 g, 1,23 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen i nitrogenstrøm ved 0°C. Deretter ble metansulfonylklorid (0,141 g, 1,23 mmol) tilsatt til blandingen som ble omrørt i 1 time. Vann (10,0 ml) ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt i 15 minutter. Det organiske sjiktet ble vasket med 0,5 N hydrogenklorid (30 ml x 2), vann (30 ml x 2), mettet natriumhydrogenkarbonat (30 ml x 2) og mettet vandig natriumkloridløsning (30 ml x 2) og deretter tørket over magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet. Det oppnådde urene produktet ble renset ved silikagelkolonnekromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 1/1) hvilket ga forbindelse (38) (0,360 g, 1,10 mmol, 98 %).

Vann (20 ml), kalium O-t-butylditiokarbonat (0,225 g, 1,21 g) og Aliquat 336 (33,0 mg, 37,0 ul) ble tilsatt til forbindelse (38) (0,360 g, 1,10 mmol) og blandingen ble omrørt kraftig ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble blandingen omrørt ved 45 til 50°C i 10 minutter. Temperaturen ble hevet til området 75 til 80°C i 10 minutter og deretter ble blandingen omrørt i 20 minutter. Etter at det vandige sjiktet ble transparent ble et gult oljeaktig produkt dannet, og petroleter (20,0 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Det organiske sjiktet ble vasket med vann (30,0 ml x 2) og deretter tørket over magnesiumsulfat. Det oppnådde urene produktet ble renset med silikagelkolonne-kromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 1/1) hvilket ga forbindelse (39). (0,101 g, 0,340 mmol, 31 %).

Forbindelse (39) (0,101 g, 0,340 mmol) ble løst i tetrahyclrofuran (15,0 ml) i nitrogenstrøm. 1,6 M n-butyllitium (0,233 ml) ble tilsatt til den oppnådde løsningen ved

-78°C og blandingen ble omrørt i 15 minutter.<l3>C2HI (54,2 mg, 0,374 mmol) ble tilsatt til den oppnådde blandingen som ble omrørt i 90 minutter. Mettet ammoniumkloridløsning (1,00 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt i 5 minutter. Temperaturen ble hevet til romtemperatur. Etter fordamping av THF ble etylacetat (30,0 ml) tilsatt til residuet. Det organiske sjiktet ble vasket med vann (30,0 ml) og mettet vandig natriumkloridløsning (30,0 ml) og deretter tørket over magnesiumsulfat. Løsemiddelet ble fordampet og det oppnådde urene produktet ble renset med silikagelkolonne-kromatografi (utvikler: heksan/etylacetat = 1/1) hvilket ga forbindlese (40). (99,3 mg, 0,317 mmol, 93 %). <Trinn 38> 1 N saltsyre (15 ml) ble tilsatt til forbindelse (40) (99,3 mg, 31,7 mmol) og blandingen ble refluksert ved 110°C i 3 timer. Vann ble fordampet. Det oppnådde hydrokloridet ble løst i en liten mengde vann og deretter renset med ionebytter-harpiks Dowex 50W-X8 som tilnærmet kvantitativt ga SAD/PDM-metionin (41) (50,1 mg, 0,320 mg, <99 %).

En proteinprøve som inneholdt det ovenfor beskrevne SAD/PDM-metionin inkorporert deri ble fremstilt ved tilsetning av SAD/PDM-metionin til EPPlb-protein som modellprotein under betingelser beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J. Biomol. NMR 18, 75-76,2000).

En NMR-prøve ble tildelt i henhold til informasjon vedrørende tildeling av proteinhovedkjede-NMR-signalene beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J. BiomoL NMR 18, 75-76,2000) under betingelser beskrevet i samme litteratursted.

'H-<13>C CT-HSQC til EPPlb-prøve som inneholder SAD/PDM-metionin inkorporert deri ble bestemt. Fig. 7 viser sammenligning av resultatene med de proteinene som inneholder [ul-<13>C;15N]-metionin oppnådd ved en vanlig fremgangsmåte. Det er klart fra fig. 7 at protein som inneholder SAD/PDM-metionin er mer forenklet enn proteinet oppnådd ved vanlig fremgangsmåte. På grunn av at signalene i sidekjedene til langkjedede aminosyrer kan observeres svært sensitivt er nå NMR-signaler til

sidekjeden til langkjedede aminosyrer som ikke tidligere kunne anvendes anvendbare for å oppnå strukturinformasjon.

Ved teknikken som er beskrevet forsvinner signaler som er unødvendige for strukturbestemmelsen og sensitiviten til gjenværende signaler blir forbedret. Følgelig er det gjort mulig rask pålitelig signalanalyse av høy-molekylvektprotein og bestemmelse av stereostruktur derav med høy nøyaktighet over området til tidligere teknikker.

Eksempel 6 Fremstilling av protein som inneholder aromatiske aminosyrer

merket med SSD i P-posisjon og NMR-bestemmelse:

Syntese av (2S, 3R) og (2S, 3S)-[3,2'„3',4',5',6'-2H6; 1,3-<13>C2; 2-<15>N]-fenylalanin, tyrosin, tryptofan og histidin: De ble syntetisert med referanse til en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Makoto Oba et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1995,1603).

En proteinprøve som inneholder den ovenfor beskrevne stereoselektive deuterium-merkede aromatiske syren ble fremstilt ved anvendelse av EPPlb-protein som modellprotein under betingelser beskrevet i litteraturen (E. Karia et al., J.Biomol. NMR 18, 75-76, 2000).

En NMR-prøve ble tildelt i henhold til informasjon vedrørende tildeling av proteinhovedkjede-NRM-signalet beskrevet i litteraturen (E. Kariya et al., J.Biomol. NMR 18,75-76,2000) under betingelser beskrevet i samme litteratursted.

<!>H-<13>C HSQC til EPPlb-prøve som inneholder merkede aromatiske aminosyrer inkorporert deri ble bestemt. Fig. 8 viser sammenligning av resultater med de oppnådd ved en vanlig fremgangsmåte. Det er klart fra fig. 8 at NMR-spektra av protein som inneholder SSD-merkede aminosyrer blir forenklet (c og d), mens NMR-spektra av protein oppnådd ved vanlig fremgangsmåte ikke er enkelt (a og b). Tildeling av stereospesifikke signaler uten feil er også mulig.

Slice-data av His 92-signaler er vist i fig. 9. Slik det fremgår av fig. 9 er signalstyrken til SSD-merket histidin ca 7 ganger så høy som den for ikke-deuterert histidinrest på grunn av at førstnevnte er uten CH, HH dipolinteraksjon.

Ved teknikken som er beskrevet blir således signaler som er unødvendige for strukturbestemmelse fjernet og sensitiviteten til resten av signalene forbedres. Følgelig gjøres rask, pålitelig signalanalyse av høymolekylvektprotein og bestemmelse av stereostruktur med høy nøyaktig mulig over området i tidligere teknikker.

Eksempel 7 Fremstillingav protein som innbefatter kun stabile isotopmerkede aminosyrer (heretter referet til som SAIL-aminosyrer), NMR-bestemmelser og strukturanalyse: SAIL-aminosyrer forskjellige fra de som er syntetisert i ovenfor beskrevne eksempler, dvs. SAIL-alanin, SAIL-valin, SAIL-isoleucin, SAIL-serin, SAIL-prolin og SAIL-arginin, ble syntetisert ved fremgangsmåten beskrevet nedenfor.

Syntese av SAIL-alanin:

Denne forbindelsen ble syntetisert med Schiff-basealkylering av metylesteren til [1,2-C2; 2- N]glysin med benzofenonimin. Strukturformelen til syntetisert SAIL-alaniner vist i fig. 1.

Syntese av SAIL-valin:

SAIL-valin ble syntetisert delvis ved å forandre en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Jack E. Baldwin et al., Tetrahedron, 51 4089-4100 (1995)) for å oppnå det tiltenkte merkede møsteret (skjema 6). [1,2,3,4-<13>C4; 2-<15>N]aspartinsyre ble således anvendt som substrat, [<2>H3]metyljodid ble anvendt som metyleringsmiddel i trinn 39 og NaBDVMeOD ble anvendt for å utføre reduksjonen i trinn 40.

Syntese SAIL-prolin:

SAIL-prolin ble avledet fra enhetlig<13>C,<15>N-merket L-glutamsyre ved en fremgangsmåte beskrevet i littereaturen (M. Oba et al., J. Org. Chem. 64, 9275-9278, 1999). Strukturformelen til syntetisert SAIL-prolin er vist i fig. 1.

Syntese av SAIL-arginin:

SAIL-arginin ble syntetisert i henhold til skjema 7. Trinnet 41 til 43 vil bli illustrert i detalj nedenfor.

Forbindelse (15) (2,41 g, 10 mmol) oppnådd i trinn 13 ble løst i metylenklorid (20 ml). Tionylklorid (11,9 g, 100 mmol) ble tilsatt til den oppnådde løsningen ved romtemperatur. Den oppnådde løsningen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og deretter ved 40°C i 2 timer. Reaksjonsløsningen ble konsentrert under redusert trykk. Dette oppnådde residuet ble løst i benzen. Tetrakistrifenylfosfinpalladium (0,21 g, 5 vekt%) og tributyltinndeuterid (3,227 ml, 12 mmol) ble tilsatt under argonatmosfære og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 5 minutter. Reaksjonsblandingen ble konsentrert. Produktet ble renset med silikagelkolonnkromatografi med heksan/etylacetat = 7/3 hvilket ga forbindelse (42) (2,101 g, 9,34 mmol, 93 %).

(2J?;[2-<15>N]-fenylglysinol (0,44 g, 3,2 mmol) ble tilsatt til en løsning (32 ml) av forbindelse 42 (0,721 g, 3,2 mmol) i metylenklorid og blandingen ble omrørt ved romtemperatur under nitrogenatmosfære i 1 time. [ C]-natriumcyanid (0,32 g, 6,4 mmol) og eddiksyre (0,387 ml, 6,4 mmol) ble suksessivt tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt ved romtemperatur i 24 timer. 6 M saltsyre (10 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter ekstraksjon med kloroform ble det organiske sjiktet tørket over vannfritt magnesiumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk. Residuet ble renset med flashsilikagelkolonnekromatografi med heksan/etylacetat hvilket ga forbindelse 43 (0,7634 g, 2,044 mmol, 64 %).

Forbindelse 43 (0,7624 g, 2,044 mmol) oppnådd i trinn 42 ble løst i en løsning av metanol/kloroform = Yt og den oppnådde løsningen ble avkjølt i 0°C. Palladiumacetat (1,5 g, 3,17 mmol) ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt i 5 minutter. 0,2 M fosfatbuffer (50 ml) ble tilsatt til reaksjonsløsningen som ble omrørt ved 0°C i 40 minutter. Således dannede krystaller ble filtrert fra og filtratet ble gjort til gjenstand for ekstraksjon med kloroform. Kloroformsjiktet ble tørket over vannfritt magnesiumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk. Konsentrert saltsyre (50 ml) ble tilsatt til residuet og blandingen ble omrørt på oljebad ved 140°C i 5 timer. Reaksjonsløsningen ble konsentrert og deretter ionebyttet med Dowex 50W-X8 for å gi ornitin (0,583 g). Ornitin således oppnådd ble løst i vann (3 ml). Basisk kopperkarbonat (1,62 g, 7,32 mmol) ble tilsatt til løsningen som ble omrørt ved 80°C i 24 timer. Uløselige krystaller ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert ved frysetørking. Det oppnådde faste stoffet ble løst i vann (1,8 ml) og den oppnådde løsningen ble avkjølt til 0°C. O-metylisoureahydroklorid (0,246 g, 2,116 mmol) og deretter 7,4 % vandig natriumhydroksidløsning (1,15 ml, 2,116 mmol) ble tilsatt til løsningen. Temperaturen til den oppnådde blandingen ble hevet til romtemperatur og blandingen ble omrørt i 5 dager. Reaksjonsløsningen ble renset med Dowex 50W-X8. Saltsyre ble tilsatt til det således dannede argininet for å justere pH 6. Etter frysetørking ble argininhydroklorid (0,394 g, 1,765 mmol) oppnådd.

Syntese av (2R)-[2-<15>N]fenylglysinol:

En magnetrører, a-bromfenyleddiksyre (4,3 g, 20 mml) og metanol (20 ml) ble tilsatt et 50 ml autoklavrør, og dette ble avkjølt på isbad. Ammoniakkgass ble introdusert deri til mettet løsning, røret ble tett forseglet og temperaturen ble hevet til romtemperatur. Etter omrøring i 24 timer ble krystallet dannet i reaksjonssystemet tatt ut ved filtrering og deretter tørket hvilket ga (2SR)-[2-<15>N]fenylglysin (2,733 g, 17.98 mmol). (2SR)-[2-<15>N]fenylglysin således oppnådd ble omdannet til (2R)-[2-<15>N]fenylglysin ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (T. Shiraiwa et al., Bill. Chem. Soc. Jpn., 64, 191-195,1991). Utbyttet var 1,90 g (12,498 mmol). Det oppnådde (2R)-[2-<15>N]fenylglysin ble omdannet til (2R)-[2-<15>N]fenylglysinol ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Ernesto Nicols et al., J. Org. Chem., 58, 766-770,1993). Utbyttet var (10,125 mmol).

Syntese av SAIL-isoleucin:

SAIL-isoleucin ble syntetisert i henhold til følgende skjema 8 og skjema 9 med referanse til litteraturstedene vist nedenfor:

[1,2,3,4-,3C4; l,l,4,4-<2>H4]2,3-butandiol hie syntetisert fra l3C enhetlig merket vinsyrederivat ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (V. Schurig et al., J. Org. Chem., 45,538-541,1980).

Butandiol oppnådd i trinn 46 ble omdannet til isosmørsyre ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Richard K. Hill et al., J. Am. Chem. Soc, 102,7344-7348, 1980).

Isosmørsyre oppnådd i trinn 51 ble omdannet til SAIL-isoleucin ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Nicholas M. Kelly et al., Tetrahedron Let., 37,1517-1520, 1996).

Syntese av SAIL-treonin:

SAIL-treonin ble syntetisert i henhold til skjema 10 med referanse til litteratursteder vist nedenfor:

Forbindelse (8) (794 g, 2,21 mmol) ble omdannet til forbindelse (51) (500 mg, 2,26 mmol) ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Y. Ueno et al., Chem. Lett.795

(1983)).

Forbindelse (51) (500 mg, 2,26 mmol) ble løst i 30 ml metylenklorid. Temperaturen ble redusert til 0°C. Dess-Martin-reagens (1,90 g, 4,49 mmol) ble tilsatt til løsningen som ble omrørt mens temperaturen ble holdt ved 0°C. Temperaturen ble hevet til romtemperatur og reaksjonsblandingen ble omrørt i 1,5 timer. 60 ml mettet natriumhydrogenkarbonat som inneholder 12 g natriumtiosulfat løst deri og 50 ml etylacetat ble tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt i 5 minutter. Etter vasking med 50 ml mettet natriumhydrogenkarbonatløsmng to ganger, med 50 ml vann en gang og med 50 ml saltvann en gang ble det organiske sjiktet tørket over natriumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (52).

Forbindelse (52) ble løst i 20 ml metanol. Den oppnådde løsningen ble avkjølt til 0°C. En løsning av natriumborhydrid (70 mg, 1,75 mmol) i 10 ml metanol ble tilsatt dertil. 2 minutter senere ble den oppnådde blandingen tatt ut fra isbadet og omrørt i 1,5 timer. 10 ml aceton ble tilsatt dertil og blandingen ble omrørt i 5 minutter. 20 ml vann ble tilsatt til reaksjonsblandingen. Etter konsentrering under redusert trykk ble 40 ml etylacetat tilsatt dertil. Reaksjonsblandingen ble vasket med vann (40 ml x 1) og saltvann (40 ml x 1). Det organiske sjiktet ble tørket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (53).

Forbindelse (53) ble løst i metylenklorid. Etter nitrogenerstatning ble

dimetylaminopyridin (500 mg, 4,03 mmol) og trifluormetansulfonylklorid (500 ul, 4,68 mmol) tilsatt til reaksjonsblandingen som ble omrørt ved 0°C i 1 time. 30 ml etylacetat ble tilsatt dertil og blandingen ble vasket med vann (20 ml x 2) og saltvannsløsning (20 ml x 1). Det organiske sjiktet ble tørket over natriumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk hvilket ga forbindelse (54).

Forbindelse (54) ble løst i 80 ml toluen. Etter nifrogenerstatning ble kaliumftalimid (1,40 g, 7,68 mmol) og 18-krone-6 (150 mg, 0,56 mmol) tilsatt til løsningen. Den oppnådde blandingen ble omrørt ved 130°C i 3 dager. 100 ml etylacetat ble tilsatt dertil og den oppnådde blandingen ble vasket med vann (50 ml x 2) og saltvann (50 ml x 1). Det organiske sjiktet ble tørket over natriumsulfat og deretter konsentrert under redusert trykk. Reaksjonsblandingen ble renset med silikagelkolonnekromatografi med heksan/etylacetat = 1/1 hvilket ga forbindelse (559 (421 mg, 1,36 mmol, 60 %).

Forbindelse (55) (389 mg, 1,25 mmol) ble omdannet til forbindelse (56) ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Frieder W. Lichenthaler, et al., Synthesis. 790, 1988).

Forbindelse (56) (309 mg, 1,21 mmol) ble refluksert med 50 ml 1 N saltsyre i 12 timer. Etter avkjøling ble de hvite nål-lignende krystallene således dannet tatt ut ved filtrering. Filtratet ble renset med Dowex 50W-X8 hvilket ga treonin (57) (50 mg, 0,400 mmol).

Syntese av SAIL-serin:

[1,2,3-<13>C3; 2-<15>N]serin ble omdannet til et aldehyd (58) ved en fremgangsmåte beskrevet i litteraturen (Mark A. Blaskovich et al., J. Org. Chem., 63, 3631-3646,1998). Produktet ble asymmetrisk redusert med (S)-BINAL-D i henhold til skjema 11 og deretter hydrolysert for å omdanne til SAIL-serin (60). Strukturen til SAIL-serinet således syntetisert er vist i fig. 1.

LiAlD4(57,587 mol, 57,587 ml), EtOD (58,162 mmol, 2,738 g, 419 g) i THF (29 ml) og (s)-(-)-binaftal (58,738 mmol, 16,819 g) løst i THF (80 ml) ble suksessivt tilsatt en reaktor. Etter omrøring av blandingen ved romtemperatur under argonstrøm i 30 minutter ble temperaturen redusert til -100°C. En løsning av forbindelse (58) (3,728 g, 12,797 mmol) i THF (13 ml) ble tilsatt til reaksjonsblandingen og denne ble omrørt i 3 timer og deretter ved 78°C i 18 timer. Etter etter-behandlingen med 0,5 N HC1 (200 ml) fulgt av filtrering gjennom celitt ble produktet ekstrahert med eter og deretter konsentrert hvilket ga forbindelse 59 (utbytte: 15 %).

Forbindelse 59 (1,451 mmol) ble løst i CH2C12(30 ml). TFA (0,7 ml) og H20 (0,50 ml) ble tilsatt til den oppnådde løsningen som ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter og deretter konsentrert. CSCO3(9,6 mmol, 3,14 g) ble tilsatt til konsentratet. Den oppnådde blandingen ble løst i MeOH (22,5 ml) og H20 (6 ml). Etter røring i 17 timer ble produktet surgjort med HC1 og deretter ionebyttet hvilket ga SAIL-serin (60).

Syntese av cystein:

SAIL-cystein ble syntetisert i henhold til skjema 12.

Trifenylfosfin (2,46 mmol, 618 mg) ble tilsatt til THF (6 ml), og den oppnådde blandingen ble avkjølt til 0°C under argonatmosfære. 40 % løsning av DEAD i toluen (2,46 mmol, 1,12 ml) ble tilsatt dertil. En løsning av forbindelse 59 (1,23 mmol, 356 mg) og tioeddiksyre (2,46 mmol, 187 mg) i THF (3 ml) ble tilsatt dråpevis til den oppnådde blandingen i løpet av 2 minutter. Blandingen ble omrørt ved 0°C i 1 time og deretter ved romtemperatur i 1 time. Etter konsentrering fulgt av behandling med kolonnen ble forbindelse 7 oppnådd. THF (5,0 ml) og 2 N NH4OH (5 ml) ble tilsatt til forbindelse 7 og blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter og deretter konsentrert hvilket ga forbindelse 8. Etter fjerning av den beskyttende gruppen ble produktet behandlet med en ionbytterharpiks hvilket ga tiltenkte forbindelse 61 i et utbytte på 27%.

SAIL-aspartansyre ble syntetisert ved anvendelse av<15>N merked ammoniakkgass som nitrogensyre ved en fremgangsmåte beskrevet i litteaturen (A. F. Beecham, J. Am. Chem. Soc, 76,4615,1953).

Som for proteinprøvene som inneholder ovenfor beskrevne merkede aminosyrer ble kalmodulinprotein anvendt som modellprotein. Kalmodulin ble uttrykt ved en fremgangsmåte beskrevet av Zubay (Protein Expression, A Practical Approach, S. J. Higgins og B.D. Hames, s. 201 til 223, Oxford University Press) utvalgt fra fremgangsmåter for cellefri proteinsyntese. Forskjeller mellom fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og denne kjente fremgangsmåten er som følger: Et E. coli-ekstrakt ble demineralisert med PD-10-kolonne (Amersham Biotech) og en blanding av de ovenfor beskrevne aminosyrene i mengder proporsjonale med residueantallet ble anvendt (fig. 11). pET-3a (Novagen) som har kalmodulinsekvens innsatt deri ble anvendt som kalmodulinekspesjons-DNA. Etter utføring av reaksjonen i cellefritt syntesesystem ved 37°C i 8 timer ble 4,4 mg renset kalmodulin oppnådd fra 44 mg av aminosyre-blandingen. SAIL-kalmodulin fremstilt således hadde en deutereringsgrad på 56 %, og antallet signaler i sidekjedene til aminosyrene ble redusert til 60% basert på det som ble observert når de ikke var merket med deuterium.

<NMR-bestemmelse av merket protein>

For å oppnå 1 nM av NMR-prøve fra 4,4, mg av således oppnådd SAIL-kalmodulin ble produktet løst i en blanding av 100 mM KC1,10 mM CaCl2, 0,1 ml mM NaN3og 10 % D20, som har pH 6,5. For sammenligningen med SAIL-kalmodulin ble deuteriumfritt kalmodulin anvendt. For NMR-bestemmelse i alle tilfellene ble Bruker DRX600 eller DRX800 anvendt ved 37°C. ZWINNMR ver. 2,6 (Bruker) eller NMRPipe ver. 1,7 (Delaglio et al., J. Biomol. NMR, 6,277-293,1995) ble anvendt for NMR-spektrumomdanning.<!>H-<13>C CT-HSQC-spektra av dem er vist i fig. 12.1 spekteret av SAIL-kalmodulin ble skarpheten til signalene og reduksjon i degenerering lagt merke til. I henhold til skarpheten av linjebredden til spekteret av SAIL-kalmodulin var sensitiviteten til bestemmelsen flere ganger høyere enn den for enhetlig merkede kalmodulin.

Ytterligere ble følgende bestemmelser utført for å tildele NMR-signalene til hovedkjede og sidekjeder til kalmodulin: lH- 15N HSQC, HNCA, HN(CO)CA, HNCO, HN(CA)CO, HNCACB, CBCA(CO)NH,

<15>N-TOCSY, HBHA(CO)NH, HCCH-COSY, HCCH-TOCSY, TOCSY (aromatisk) og NOESY (aromatisk).

Ved bestemmelse av dem ble deuteriumdekopling med kontinuerlige bølger anvendt for

'H-^C CT-HSQC, NHCACB, CBCA(CO)NH, HBHA(CO)NH, HCCH-COSY og HCCH-TOCSY.

Spektra oppnådd ved denne bestemmelsen ble analysert i henhold til Sparky ver. 3.105 (UCSF) for å tildele signaler.

For deteksjon av NOE for stereosrrukturberegning, ble,<5>N-NOESY,,<3>C-NOESY og NOESY bestemt.

NOESY-spektrumanalyse og stereostrukturberegning ble utført i henhold til tildelingsresultatene vedrørende hovedkjede og sidekjedesignaler. I denne fremgangsmåten ble et program CYANA (kombinert tildeling og dynamikkalgoritme for NMR applikasjoner, c av Peter Guntert) (P. Guntert et al., J. Mol. Biol. 273,283-298

(1997), T. Herrmann et al., J. Mol. Biol. 319,209-227 (2002)) anvendt. Dette programmet var en kombinasjon av CANDID (NOESY automatisert analyseprogram)

(Herrmann, T. et al., (2002). Protein-NMR-strukturbestemmelse ble automatisk NOE-tildelt ved anvendelse av det nye software CANDID og torsjonsvinkeldynamisk algoritme DYANA, J. MOL. Biol.- 319, 209-227) og DYANA (torsjonsvinkeldynamisk algoritme for strukturbestemmelse) (P. Guntert et al., (1997), torsjons\dnkeldynamikk for NMR-strukturberegning med det nye programmet DYANA. J. Mo. Biol. 273,283-298). CYANA ble drevet på Linux-kluster med 14 Xenon-prosessor. En cykel starter med NOE-analyse og slutter med bestemmelse av 20 stereostrukturer. Cyklen blir gjentatt syv ganger ved automatisk repetisjon. Data anvendt for den endelige strukturbestemmelsen etter fullføring av 7 cykler er vist i følgende tabell:

I den manuelle NOESY-spekteranalysen hvori homogen merket prøve ble anvendt tok beregning av stereostrukturen mer enn flere måneder. Imidlertid kan strukturen bestemmes i løpet av 30 minutter ved den ovenfor beskrevne teknikken. Denne betydelige reduksjon i tid oppnås av følgende grunner: Nøyaktig signalanalyse gjøres mulig på grunn av at signaler som er unødvendige for strukturbestemmelsen fjernes og sensitiviteten til resten av signalene og dekomponeringskapasiteten forbedres. Videre er et automatisert program til hjelp. De endelige 20 strukturene således oppnådd er vist i fig. 13.

Ved teknikken som her er beskrevet blir således signaler som er unødvendige for strukturbestemmelsen fjernet og sensitiviteten til restsignalene forbedres. Følgelig er det blitt gjort mulig med rask og nøyaktig analyse av signalene til høymolekylære proteiner og også med høy nøyaktighet å bestemme stereostrukturen derav.

Således viser eksempel 1 til 7 syntese av aminosyrer som har forskjellige isotop-merkingsmønstre og også teknikken for effektivt å inkorporere de merkede aminosyrene inn i et målprotein ved den cellefrie proteinfremstillingsfremgangsmåten uten metabolittisk transformasjon eller fortynning. Eksempler 1 til 7 viser også det faktum at presis strukturinformasjon når det gjelder høymolekylære proteiner kan oppnås ved bestemmelse av NMR-spektre av det oppnådde merkede proteinet og at denne informasjonen er overlegen den som oppnås ved vanlig isotop-NMR-teknikk. I eksempel 7 ble RSD/SSD/SAD/PDM-aminosyremerket protein fremstilt ved å erstatte alle 20 aminosyrerestene som utgjør proteinet med merkede aminosyrer vist i fig. 1 og denne fremstillingen ble praktisk anvendt for stereostrukturbestemmelse. Ved teknikken ifølge oppfinnelsen hvori stereostrukturtildelingen av restprotonene er klar er det blitt gjort mulig at strukturen til den merkede proteinløsningen raskt og presist kan bestemmes. Som vist i fig. 10 blir, ved den beskrevne teknikken, stereokjemi-tildeling av resten av protonet gjort klart ved beregningseksperimenter med computer. Dette faktum indikerer at, ved denne teknikken, er høynøyaktighetsbestemmelse av løsningsstrukturen til det merkede proteinet (c) mulig og at de oppnådde resultatene på ingen måte er dårligere enn de som oppnås når informasjon vedrørende alle proteinene oppnås (b).

Når det gjelder forløp er alle forskjellige moduser mulige når det gjelder detaljer vedrørende foreliggende oppfinnelse.

Som beskrevet ovenfor i detalj, ved utførelsesformene av foreliggende oppfinnelse, blir deuterering i hele proteinet og forbedring i sensitivitet av gjenværende signaler gjort mulig. Således er nøyaktig signalanalyse av høymolekylprotein og høypresisjonsstereostrukrurbestemmelse derav gjort mulig over området til vanlige teknikker.

Således blir følgende effekter oppnådd ved foreliggende oppfinnelse:

(1) Linjebredden til NMR-signalet blir betydelig skarpere (forbedring i signaloppløsningskraft).

(2) Bestemmelse av sensitiviteten forbedres (nedkorting av bestemmelsestiden).

(3) Nøyaktighet av NMR-spektralanalyse forbedres og nedkorting av analysetid og automatisering av analysene er gjort mulig. (4) Omfanget av molekylvekt av protein til hvilket NMR er mulig er gjort bredere (minst 2 ganger bredere; bestemmelse av strukturen til protein som har en molekylvekt på ca 50.000 gjøres mulig). (5) Nøyaktighet når det gjelder strukturanalysen forbedres (på grunn av automatisert stereospesifikk tildeling av alle signalene). (6) Strukturbestemmelse og strukturinformasjon er mulig i henhold til signaler selv på enden av sidekjeden (mulighet ved anvendelse av teknikken overfor på genomisk legemiddelutvikling og legemiddeldesign).

Som beskrevet ovenfor er foreliggende oppfinnelse og teknikken med å bestemme strukturen som klart effektiv når det gjelder å bestemme strukturen med høy nøyaktighet og høyt utbytte.

Claims

1. Stabil isotopmerket aminosyre,karakterisert vedat den er minst en av aminosyrer som utgjør et protein og som har minst et av følgende merkemønstre: (a) hydrogenatomer unntatt minst ett hydrogenatom i en eller flere metylengrupper er deuterert, (b) hydrogenatomer i en av prokirale gem-metylgrupper er fullstendig deuterert, (c) hydrogenatomer i prokirale metylgrupper er delvis deuterert, og (d) alle hydrogenatomer unntatt ett av dem i en metylgruppe er deuterert og hydrogenatomer i den aromatiske ringen er delvis deuterert, og hvor alle karbonatomer som har gjenværende hydrogenatomer i metylengruppen og/eller metylgruppen er erstattet med 1 ^C; og alle nitrogenatomer er erstattet med<15>N.

2. Kombinasjon av stabile isotopmerkede aminosyrer ifølge krav 1,karakterisert vedat den utgjør et målprotein, hvor alle aminosyrene som utgjør målproteinet har følgende merkemønstre: (a) når en metylengruppe som har to hydrogenatomer er til stede er ett av metylenhydrogenatomene deuterert, (b) når prokirale gem-metylgrupper er til stede er alle hydrogenatomene i en metylgruppe fullstendig deuterert og hydrogenatomer i andre metylgrupper er delvis deuterert, (d) når en metylgruppe forskjellig fra de angitt ovenfor er til stede, er alle hydrogenatomer unntatt ett av dem i metylgruppen deuterert eller alle hydrogenatomer i metylgruppen er deuterert, (e) når den aromatiske ringen har hydrogenatomer kan hydrogenatomene i den aromatiske ringen være delvis deuterert, (f) etter deuterering i (a), (b) og (d) ovenfor blir alle karbonatomer i den hydrogenatom-inneholdende metylengruppen og/eller metylgruppen erstattet med<13>C,og (g) alle nitrogenatomer erstattes med<15>N.

3. Kombinasjon av stabile isotopmerkede aminosyrer ifølge krav 2, hvori (e) når den aromatiske ringen har hydrogenatomer er hydrogenatomene i den aromatiske ringen delvis deuterert.

4. Kombinasjon av stabile isotopmerkede aminosyrer ifølge krav 3, hvor karbonatomer som utgjør karbonylgruppe eller guanidylgruppe i aminosyrene er erstattet med 1 "\C.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein bestående av stabile isotopmerkede aminosyrer,karakterisert vedat den innbefatter syntetisering av det cellefrie proteinet ved anvendelse av kombinasjonen av de stabile isotopmerkede aminosyrene angitt i krav 2 som alle aminosyrene som utgjør målproteinet.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein ifølge krav 5, hvor kombinasjonen av stabile isotopmerkede aminosyrer ifølge krav 3 anvendes som alle aminosyrene som utgjør målproteinet.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av et målprotein ifølge krav 5, hvor kombinasjonen av stabile isotopmerkede aminosyrer ifølge krav 4 anvendes som alle aminosyrene som utgjør målproteinet.

8. Fremgangsmåte for NMR-anMysering av strukturen av et målprotein,karakterisert vedat den innbefatter å analysere strukturen til målproteinet, hvori alle aminosyrene som utgjør målproteinet er erstattet med de stabile isotopmerkede aminosyrene ifølge krav 2, ved NMR-spektralbestemrnelse.

9. Fremgangsmåte for NMR-analysering av strukturen til et målprotein ifølge krav 8, hvor alle aminosyrene som utgjør målproteinet erstattes med de stabile isotopmerkede aminosyrene ifølge krav 3.

10. Fremgangsmåte for NMR-analysering av strukturen til et målprotein ifølge krav 8, hvor alle aminosyrene som utgjør målproteinet erstattes med de stabile isotopmerkede aminosyrene ifølge krav 4