NO331974B1 - Fremgangsmate for a detektere i en biologisk prove et kompleks av chaperon Q2 og beta-amyloid, antistoff som gjenkjenner komplekset og anvendelse av chaperon Q2 for fremstilling av et preparat for behandling av Alzheimers sykdom. - Google Patents

Abstract

Et chaperoneprotein Q2 og B-amyloid kan danne et kompleks. Dette komplekset kan bli detektert i en biologisk prøve, såsom f.eks. vev eller væsker fra et pattedyr. Q2-nivåer kan også bli detektert i en biologisk prøve. En fremgangsmåte for å bestemme Q2-nivået i en biologisk prøve og sammenligne det nivået med et normalt Q2-nivå kan bli benyttet for å detektere, screene, diagnostisere eller på annen måte bestemme en persons følsomhet for Alzheimers sykdom, såsom f.eks. nærværet eller fraværet av Alzheimers sykdom, symptomer på denne sykdommen, på faktorer som fører til eller er assosiert med denne sykdommen, på sannsynligheten for å utvikle denne sykdommen og lignende. I en utforming korrelerer en nedgang i Q2- nivået med en økt sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom. I en annen utforming korrelerer en nedgang i Q2-nivå med en økning i B-amyloidaggregering. Fremgangsmåten kan videre inkludere å screene for et apolipoprotein E genotype, som er assosiert med Alzheimers sykdom.

Description

Flere fysiologiske problemer, så som et tap i muskelmasse, svikt i immunsystemet, reduksjon i maksimal syntese og frigivelse av hormoner (f.eks. insulin og veksthormon), tap av nyrefunksjon og reduksjon i kognitive ferdighet finner sted med aldring. Disse problemene fører til en total reduksjon i funksjonell kapasitet. Flere modeller har vært fremsatt for å forklare disse aldersrelaterte fysiologiske problemene. Slike modeller inkluderer f.eks. økt programmert celledød, dvs. apoptose; akkumulering av oksidativ skade, svikt i cellen for å opprettholde telomerene ved endene på kromosomene; og defekter i å respondere på stress. De observerte aldersrelaterte defektene i å respondere på stress kan involvere chaperoneproteiner.

På det cellulære nivået er de viktigste stressproteinene chaperonene. Chaperoner spiller en viktig rolle i cellulær funksjon. De hjelper til å gjenoppstille proteiner i sin native form, derved renaturere skadede proteiner og hjelpe til i sluttrinnet med proteinfolding ved å dirigere nylig syntetiserte proteiner til inn i endelige, optimale struktur. Chaperoner hjelper også til å stabilisere det endelige proteinproduktet, så som ved dannelsen av intra- og intermolekylære disulfidbindinger. En slik familie med chaperoner er kjent som tiol:proteindisulfid-oksidoreduktase (TPDO'er). Studier av stressproteinene og chaperoner støtter konseptet at mange av de aldersrelaterte funksjonelle reduksjonene er assosiert med reduksjon i aktiviteten av chaperonsystemene. Reduserte nivåer og aktivitet av chaperoner kan resultere i økt dannelse av ukorrekt foldede og uløselige masser av proteiner.

Uløselige masser, eller plakk, av p-amyloidproteinet, et 38-43 aminosyrepeptid avledet fra amyloidforløperproteinet, dannes i hjernen på eldre personer som lider av Alzheimers sykdom. Amyloidforløperproteinet er et indre membranprotein som blir syntetisert i endoplasmatisk retikulum. I løpet av syntese og insersjon i plasmamembranen blir p-amyloid kløyvet av fra amyloidforløperproteinet og skilt ut inn i det intercellulære rommet.

I fysiologiske løsninger aggregerer P-amyloid lett for å danne plakk karakteristiske for Alzheimers sykdom. Imidlertid er Alzheimers sykdom kompleks og involverer mer enn kun overekspresjon av (3-amyloidpeptidet. Nevropatologien ved Alzheimers sykdom erkarakterisert vedoverdrevet nervecelletap og avleiring av flere senile plakk og nevrofibrillære sammenfiltringer i cerebral cortex. Selv om et lite antall med klassiske senile plakk utvikles i den normale hjernen med alder, blir store mengder med plakk funnet nesten kun i Alzheimerspasienter.

En studie viste at når cerebrospinalvæske blir tilsatt til P-amyloid, aggregerer ikke P-amyloid, noe som tyder på at cerebrospinalvæske inkluderer en komponent som inhiberer P-amyloid-aggregering. Dette indikerer at cerebrospinalvæske i pasienter som er fri for Alzheimers sykdom kan inneholde en komponent som hindrer dannelse av senile plakk. Denne komponenten kan være et chaperon. Således er det ønskelig å bedre karakterisere rollen til chaperoner i prosesseringen av amyloidforløperproteinet, som danner P-amyloidplakk, og Alzheimers sykdom. Korrekt folding eller prosessering av amyloidforløperproteinet eller P-amyloid kan være involvert i etiologien av Alzheimers sykdom.

Alternativt kan en pasient med Alzheimers sykdom ha et protein som øker kjernedannelsen av P-amyloidplakk. En teori tyder på at apolipoprotein E kan spille en rolle i Alzheimers sykdom. Apolipoprotein E eksisterer i minst tre alleliske former kjent som apoE2, apoE3og apoEzt. Beviser indikerer at en person som har minst ett allel med apolipoprotein E4(apoE4) er mer følsom for Alzheimers sykdom, noe som tyder på at proteinproduktet til apoE4kan spille en rolle i Alzheimers sykdom (Moir et al., Biochemistrv. 38: 4595-4603 (1999)). F.eks. kan apoE4bidra til kjernedannelsen eller dannelsen av P-amyloidplakk ved å bidra til aggregeringen av p-amyloid.

Tidligere har studier av Alzheimers sykdom fokusert på overproduksjon av P-amyloid. F.eks. har mange laboratorier studert rollen til proteaser involvert i kløyvingen av forløperproteinet for å fremstille P-amyloid. Et antall studier har vist at, med unntak av noen sjeldne genetiske former for tidlig start av Alzheimers sykdom og den tidligere Alzheimers sykdommen som ses i Downs syndrom, har pasienter med Alzheimers sykdom faktisk lavere konsentrasjoner av P-amyloid i sin cerebrospinalvæske enn aldersoverensstemmende kontroller. Videre har en nylig studie av transgene mus som har et amyloidforløperproteingen som mangler Kunitz-proteaseinhibitordomene, vist at den økte konsentrasjonen av P-amyloid ikke kan bli forklart med en økning i ekspresjon av amyloid forløperprotein, som syntes å forbli uendret med alder. Disse studiene indikerer at p-amyloidnivåer alene ikke er nok for å forklare Alzheimers sykdom. Således er det ønskelig bedre å karakterisere rollen til chaperoner og prosesseringen av amyloidforløperproteinet i dannelsen av P-amyloidplakk og i Alzheimers sykdom. Korrekt folding eller prosessering av amyloidforløperproteinet eller P-amyloid kan være involvert i etiologien av Alzheimers sykdom.

Videre, på det nåværende tidspunkt, inkluderer den eneste fremgangsmåten for å detektere en mulighet for dannelse av P-amyloidplakk eller Alzheimers sykdom eller nærvær av slike plakk eller sykdom, disseksjon av hjernen eller dyrking av hjerneceller til subjektet. Slike invasive prosedyrer er selvfølgelig uønskede for de fleste subjekter. Dette er spesielt slik siden, som det er nevnt over, selv etter en slik deteksjon ville det tidligere være uklart hvordan man skal teste for visse faktorer som fører til plakkdannelse eller sykdom. Dette demonstrerer et behov for en fremgangsmåte for å detektere muligheten for eller nærværet av plakk eller sykdom i levende intakte subjekter.

Foreliggende oppfinnelse omhandler generelt en sammensetning og fremgangsmåte for å detektere denne sammensetningen som møter behovene beskrevet over.

Foreliggende oppfinnelse inkluderer nærmere bestemt en fremgangsmåte for å detektere, i en biologisk prøve, et kompleks av chaperoneQ2 og P-amyloid ved å utføre et immunassay eller fluorescenspolariseringsassay for spesifikt å gjenkjenne komplekset av chaperoneQ2 og P-amyloid; og korrelere et nivå av komplekset med et nivå av P-amyloid aggregering i den biologiske prøven.

Fremgangsmåten for å detektere et kompleks av chaperoneQ2 og p-amyloid kan bli benyttet som et reagens i et klinisk eller forskningslaboratorium, som en fremgangsmåte for å bestemme tilbøyeligheten av et biologisk system til å danne plakk av p-amyloid eller for å bestemme nærværet eller sannsynligheten av Alzheimers sykdom eller symptomer assosiert med Alzheimers sykdom.

I følge en utførelsesform omfatter den biologiske prøven humant biologisk materiale fra sentralnervesystemet og fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av komplekset med en mottakelighet for Alzheimers sykdom.

I følge en annen utførelsesform omfatter den biologiske prøven humant materiale fra sentralnervesystemet og fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av komplekset med en sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom.

I følge enda en annen utførelsesform omfatter den biologiske prøven human materiale fra sentralnervesystemet og fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av komplekset med adferdsendring i et menneske som den biologiske prøven er oppnådd fra.

I enda en annen utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen påviser også immunassayet eller fluorescenspolariseringsassayet chaperoneQ2, P-amyloid, eller både chaperon Q2 og P-amyloid.

Videre inkluderer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å detektere aggregering av p-amyloid omfattende bestemmelse av nivået av chaperon Q2 i en biologisk prøve.

I følge en utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåten å korrelere en nedgang i chaperon Q2 nivået med en økning i aggregering av P-amyloid.

I følge en annen utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen er chaperoneQ2 en komponent av et kompleks omfattende et chaperon Q2 og et P-amyloid. I følge en utførelsesform av dette aspekt omfatter fremgangsmåten å korrelere en nedgang i nivået av chaperoneQ2 i et kompleks omfattende chaperoneQ2 og P-amyloid med en økning i aggregering av P-amyloid.

I følge enda en utførelsesform av oppfinnelsen omfatter P-amyloid omfatter animalsk p-amyloid 1-42, animalsk p-amyloid 1-38, humant P-amyloid 1-42, eller humant P-amyloid 1-38.

I følge enda en utførelsesform av oppfinnelsen omfatter den biologiske prøven humant eller animalsk biologisk materiale fra sentralnervesystemet, fortrinnsvis human eller animalsk cerebrospinalvæske.

I følge en ytterligere utførelsesform omfatter detektering av aggregering av p-amyloid detektering av dannelse av en P-amyloid plakk.

I følge en ytterligere utførelsesform omfatter detektering av aggregering av p-amyloid skreening av en økt mottakelighet for Alzheimers sykdom.

I følge en ytterligere utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere screening av apoE genotypi.

Oppfinnelsen inkluderer også en fremgangsmåte for å screene Alzheimers sykdom omfattende

å bestemme et nivå av chaperoneQ2 i en human biologisk prøve; og korrelere chaperon Q2 nivået med en mottakelighet for Alzheimers sykdom.

I følge en utførelsesform av dette aspekt ved oppfinnelsen omfatter fremgangsmåte trinnene: å bestemme et nivå av chaperoneQ2 i en human biologisk prøve; og korrelere chaperone Q2 nivået med en mottakelighet for Alzheimers sykdom. I følge enda en utførelsesform omfatter korreleringen av chaperon Q2 nivået for mottakelighet for Alzheimers sykdom omfatter å korrelere en nedgang i chaperon Q2 nivået med en økning i aggregeringen av P-amyloid.

I følge enda en utførelsesform er chaperone Q2 en komponent av et kompleks omfattende chaperon Q2 og p-amyloid.

I følge enda en utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet å bestemme nivået av et kompleks omfattende chaperon Q2 og P-amyloid.

I følge enda en utførelsesform er P-amyloidet i komplekset P-amyloid 1-42 eller P-amyloid 1-38.

I følge enda en utførelsesform omfatter den humane biologiske prøven biologisk materiale fra sentralnervesystemet.

I følge enda en utførelsesform omfatter den humane biologiske prøven omfatter biologisk materiale fra cerebrospinalvæske.

I følge enda en utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere trinnet å korrelere nivået av chaperon Q2 med nivået av et kompleks omfattende chaperone Q2 og P-amyloid og et nivå av P-amyloid i cerebrospinalvæske.

I følge ytterligere en utførelsesform er p-amyloid i komplekset henholdsvis human P-amyloid 1-42, eller human P-amyloid 1-38, og P-amyloidet i cerebrospinalvæske er henholdsvis human p-amyloid 1-42 eller human p-amyloid 1-38.

I følge enda en utførelsesform omfatter fremgangsmåten ytterligere screening av apoE genotypi.

I følge enda en utførelsesform omfatter korreleringen å korrelere nivået av chaperon Q2 med en sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom.

Oppfinnelsen inkluderer videre anvendelsen av chaperon Q2 til fremstilling av et preparat for behandling av Alzheimers sykdom.

Endelig inkluderer foreliggende oppfinnelse et antistoff som spesifikt gjenkjenner et kompleks som omfatter chaperon Q2 og P-amyloid. Fortrinnsvis omfatter komplekset som antistoffet i følge oppfinnelsen gjenkjenner humant P-amyloid 1-42, humant P-amyloid 1-38, dyre-P-amyloid 1-42 eller dyre-p-amyloid 1-38.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 illustrerer vekten av rotter som funksjon av alder.

Fig. 2 illustrerer vekten av rotter som funksjon av alder.

Fig. 3 illustrerer mengden med mikrosomalt protein pr. gram lever som en funksjon av alder.

Fig. 4 illustrerer en overlevelsesraten for rotter som en funksjon av alder.

Fig. 5 illustrerer en dødelighetsraten for rotter som en funksjon av alder.

Fig. 6 illustrerer rottehepatiske, mikrosomale Q5-nivåer som en funksjon av alder.

Fig. 7 illustrerer rottestressresponsnivåer av Q5 som en funksjon av alder.

Fig. 8 illustrerer rottehepatisk, mikrosomale Q2-nivåer som en funksjon av alder.

Fig. 9 illustrerer rottestressresponsnivåer av Q2 som en funksjon av alder.

Fig. 10 illustrerer rottehepatiske, mikrosomale Erp72-nivåer som en funksjon av alder. Fig. 11 illustrerer rottehepatiske, mikrosomale BiP-nivåer som en funksjon av alder. Fig. 12 illustrer rottehepatiske, mikrosomale calnexinnivåer som en funksjon av alder. Fig. 13 illustrerer rottehepatiske, mikrosomale calreticulinnivåer som en funksjon av alder. Fig. 14A illustrerer et immunblott av biologiske prøver med polyklonale antistoffer mot Q2. Fig. 14B illustrerer et immunblott av biologiske prøver med monoklonale antistoffer mot P-amyloid 1-42. Fig. 15A illustrerer et annet immunblott av biologiske prøver med polyklonale antistoffer mot Q2. Fig. 15B illustrerer et annet immunblott av biologiske prøver med polyklonale antistoffer mot p-amyloid 1-42. Fig. 16 illustrerer cerebrospinalvæskekonsentrsjoner av Q2 sammenlignet med senile plakkpoeng målt fra deltagere i nonnestudiet beskrevet i eksempel 5.

Foreliggende oppfinnelse omhandler som nevnt over en fremgangsmåte for å detektere et kompleks av chaperone Q2 og P-amyloid. Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen er spesielt anvendelig i diagnostiseringen av Alzheimers sykdom. En fremgangsmåter for å øke nivåer av dette chaperoneproteinet er videre anvendelig i behandling eller forebygging av Alzheimers sykdom. Spesielt beskrives heri et isolert kompleks av P-amyloid og chaperone Q2, fremgangsmåter for å detektere nivåer av Q2 i f.eks. kliniske eller i autopsiprøver, fremgangsmåter for å diagnostisere Alzheimers sykdom basert på å detektere en reduksjon i konsentrasjon av Q2 i kliniske prøver, så som cerebrospinalvæske. Alzheimers sykdom kan behandles ved å stimulere Q2-produksjon eller ved å administrere Q2.

Alzheimers sykdom induserer dannelsen av P-amyloidplakk i hjernene til subjekter med sykdommen. Plakkene dannes fra aggregater av P-amyloid, som dannes av kløyvingen av amyloidforløperproteinet og sekresjon inn i det intercellulære rommet. P-amyloid aggregerer fritt i løsning i laboratoriesystemer og danner aggregater lignende til plakkene dannet i Alzheimers sykdom.

Amyloidforløperproteinet, P-amyloid og ulike fragmenter av P-amyloid er blittkarakterisert. Kjente trekk på amyloidforløperproteinet og P-amyloid inkluderer pattedyrgener som koder for dem, rekombinante ekspresjonssystemer (f.eks. vektorer, plasmider og lignende) for disse proteinene, fremgangsmåter for å produsere disse proteinene, proteinsekvenser og strukturer og proteaser som kløyver amyloidforløperen til p-amyloid. Hverken amyloidforløperproteinet, P-amyloid, eller noen av de ulike fragmentene av P-amyloid har tidligere vært observert å interagere med et chaperoneprotein.

P-amyloid kan bli laget og/eller isolert i ulike former. Den mest vanlige formen for P-amyloid i pattedyrvev er P-amyloid 1-42, der nummereringen representerer antallet av aminosyrer og starter ved aminosyreterminalen til fullstendig P-amyloid, som har fra 38-43 aminosyrer avhengig av art. Den andre vanligste formen for P-amyloid i pattedyrvev er P-amyloid 1-38.

P-amyloider har blitt produsert ved kjemiske og/eller biotekniske metoder,karakterisertog vist å ha mange av egenskapene til fullstendig P-amyloid. P-amyloid som benyttet heri refererer til alle de ulike formene for p-amyloid, inkludert glykosylerte, ikke-glykosylerte, former av ulik lengde og lignende.

Chaperoner (også kjent som chaperoneproteiner, og inkludet chaperoniner og visse varmesjokkproteiner) katalyserer folding, dannelse av tertiær struktur, dannelse av kvaternær struktur og/eller andre prosesseringer for å danne et aktivt protein. Som beskrevet heri kan flere chaperoner reduseres i nivå med alder, og kan være korrelert med aldersrelaterte sykdommer og forstyrrelser. Spesielt kan vevsnivåer av én eller flere av chaperonene BiP, calreticulin, calnexin, Erp72, Q2 og Q5 reduseres med alder i et pattedyr, så som en gnager eller et menneske, og kan korrelere med en sykdom. Chaperoner inkluderer en familie kjent som tiohprotein-disulfidoksidoreduktase (TPDO). En TPDO representerer et foretrukket chaperone i den foreliggende oppfinnelsen. En foretrukket TPDO er TPDO-Q2. TPDO-Q2 har også blitt kalt ERp57 og GRp58. Som benyttet heri refererer Q2 til et hvilket som helst av de vanlige navnene for dette proteinet, inkludert TPDO-Q2, ERp57 og GRp58, og alle naturlig forekommende variantformer av dette proteinet, inkludert glykosylerte og ikke-glykosylerte former.

Chaperoner er generelt godt studerte og/eller karakteriserte proteiner. Godt karakteriserte trekk og flere chaperoner inkluderer genene som koder for dem i organismer som strekker seg fra bakterier til mennesker, rekombinante ekspresjonssystemer (f.eks. vektorer, plasmider og lignende) for disse proteinene, fremgangsmåter for å fremstille disse proteinene, proteinsekvenser og strukturer, visse proteinsubstrater og visse biologiske funksjoner. Chaperoner har ikke tidligere vært observert å reduseres med alder i et pattedyr, heller ikke har de vært implisert i Alzheimers sykdom eller dannelse av P-amyloidplakk.

En reduksjon i chaperonesyntese kan være et resultat av en reduksjon i chaperonetranskripsjon. For å bestemme hvorvidt mengden av chaperoner reduseres med alder i vev og/eller væsker relevante for Alzheimers sykdom og/eller P-amyloidplakkdannelse, kan konsentrasjoner av spesifikke mRNA'er for ulike chaperoner bli studert ved kjente metoder, f.eks. standard hybridiseringsteknikker.

Selv om andre chaperoner kan være tilstede i cerebrospinalvæsken, har bare Q2 blitt identifisert i cerebrospinalvæske. Q2-nivåer reduseres relativt normalt til Q2-nivåer i pattedyrvev med alder. «Begrepet normale Q2-nivåer» som benyttet heri, inkluderer gjennomsnittelig konsentrasjon av Q2 som vanligvis kan finnes i cerebrospinalvæske fra en kontrollpopulasjon. Passende kontrollpopulasjoner inkluderer f.eks. unge mennesker, eldre mennesker uten Alzheimers sykdom og lignende. Et normalt Q2-nivå kan være omkring 27 + 2 ng/ml.

Q2 kan danne et kompleks med P-amyloid. Dette komplekset kan bli isolert fra cerebrospinalvæske og lages i laboratoriet. Q2 og P-amyloid er antatt å danne et sterkt bundet kompleks. F.eks. viser immunblott svært lite bevis for dissosiasjon av komplekset. Komplekset mellom Q2 og P-amyloid er antatt å være et mellomprodukt i normal prosessering av amyloidforløper i subjekter som ikke lider av Alzheimers sykdom. En reduksjon i nivået av Q2 relativt til normale Q2-nivåer i aldrende dyr kan føre til reduserte mengder av komplekset, og øke mengden av fritt P-amyloid. Økte mengder av P-amyloid kan gi økning i økte avleiringer av amyloidplakk assosiert med Alzheimers sykdom.

Komplekset mellom Q2 og P-amyloid kan bli isolert fra cerebrospinalvæske, renset ogkarakterisert vedvanlige fremgangsmåter for proteinkjemi. F.eks. kan komplekset bli isolert og/eller renset ved affinitetskromatografi med et system som har affinitet for den ene eller den andre av Q2 eller P-amyloid. Komplekset kan dermed bli videre renset ved andre former for kromatografi, så som separasjon på en Sefakrylkolonne og/eller en monoQ-kolonne. Etter isolering og/eller rensing kan komplekset blikarakterisert vedå benytte standard metoder så som peptidkartlegging, sekvensering, PAS-reaksjonen (periodisk syre-Schiff-reaksjon) og matriksassistert laserdesorpsjonioniseringstid av «time of flight» massespektrometri (MALDI-TOF).

Komplekset mellom Q2 og P-amyloid kan bli glykosylert i naturlige systemer. Under de fleste omstendigheter, bortsett fra i komplekset synes hverken Q2 eller P-amyloid å være glykosylert. Vanligvis er komplekset glykosylert, f.eks. N-glykosylert på asparginrester med komplekse oligosakkarider.

Komplekset mellom Q2 og P-amyloid og de ubundede komponentene Q2 og P-amyloid kan bli detektert ved fremgangsmåter som er kjent for å detektere proteiner, sukker og/eller glykosylerte proteiner. Komplekset har en molekylvekt på omkring 62 kD på forsiktig eller moderat denaturerende gelelektroforese, og blir gjenkjent av antistoffer mot enten Q2 eller P-amyloid. Polyklonale eller monoklonale antistoffer som gjenkjenner enten Q2 eller P-amyloid er kjent i faget og kan bli fremstilt ved standard metoder. Slike antistoffer kan bli merket eller på annen måte benyttet i standard immunassay. Foretrukne standard immunassay inkluderer ELISA-assay, immunblokk, sandwich-assay, øket kjemiluminiscens og lignende. Ytterligere fremgangsmåter for å detektere komplekset eller dets ubundne komponenter inkluderer fluorescenspolariseringsassay, standard proteinrensing ved kolonne- og affinitetskromatografi, proteolytisk kløyving etterfulgt av Edman-degraderinganalyse, MALDI-TOF og «time-of-flight» massespektrometri.

Fremgangsmåter for å detektere Q2-nivåer i biologiske prøver kan bli benyttet i en fremgangsmåte for å detektere, bestemme, studere, diagnostisere, screene for eller på annen måte vurdere en pasients eller subjekts mottakelighet for Alzheimers sykdom. Begrepet «mottakelighet for Alzheimers sykdom» som det benyttes heri, inkluderer nærværet eller fraværet av Alzheimers sykdom, av symptomer av denne sykdommen, av faktorer som fører til eller er assosiert med denne sykdommen, og sannsynligheten for å utvikle denne sykdommen i et subjekt eller en pasient og lignende. Som benyttet heri inkluderer faktorer som fører til eller er assosiert med denne sykdommen inkludert dannelsen av p-amyloidplakk, sykdommer i prosesseringen av amyloidforløperprotein og lignende.

Som benyttet heri inkluderer biologiske prøver materiale så som vev, celle, eller væskeprøve fra et dyr eller menneske med behov for å bli screenet for eller som er antatt for å være følsom for eller som lider av avleiring av P-amyloidplakk, sykdommer involvert i prosesseringen av amyloidforløperprotein, Alzheimers sykdom, sannsynligheten for å utvikle Alzheimers sykdom og lignende. Biologiske prøver kan også inkludere laboratorieprøver fra et forsøksdyr, celle eller kultur som blir studert for sin sannsynlighet til å danne P-amyloidplakk eller aggregater eller for ukorrekt å prosessere amyloidforløperprotein. Den biologiske prøven som inkluderer f.eks. vev eller celler, så som lever, blodplater, serum eller hud, kan bli gjenvunnet fra et levende dyr eller en pasient ved fremgangsmåter så som nålbiopsi, venepunktur eller hudskraping. I et aspekt i den foreliggende oppfinnelsen inkluderer den biologiske prøven biologisk materiale fra sentralnervesystemet i et menneske eller dyr. En foretrukket biologisk prøve inkluderer biologisk materiale fra cerebrospinalvæske for å studere mottakeligheten for Alzheimers sykdom i levende dyr eller pasienter. Cerebrospinalvæske kan bli samlet inn ved spinaltapping, under kirurgiske prosedyrer eller ved en hvilken som helst av de ulike metodene som er kjent for personer med kunnskaper i faget.

Generelt korrelerer reduksjonen i Q2-nivåer relativt til normale Q2-nivåer, til mottakeligheten for Alzheimers sykdom. Nivået av Q2 eller Q2-nivå inkluderer nivået av fri Q2 i den biologiske prøven, nivået av Q2 bundet i kompleks med P-amyloid, nivåene av fri Q2 pluss bundet Q2 og fortrinnsvis totalt Q2. En reduksjon i Q2-nivået korrelerer med en økt mottaklighet for Alzheimers sykdom. En økt mottaklighet, som benyttet heri, refererer til at det er mer sannsynlig enn ikke at Alzheimers sykdom, i det minste et symptom på sykdommen, i det minste en faktor som fører til eller er assosiert med denne sykdommen, sannsynligheten for å utvikle denne sykdommen eller lignende, er tilstede i en pasient eller subjekt. F.eks. korrelerer en reduksjon i Q2-nivået på minst 35 % relativt til et normalt Q2-nivå, med en 100 % sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom. Aggregeringen av amyloid i et dyr eller menneske kan også bli detektert ved å bestemme nivå av Q2 i den biologiske prøven. En nedgang i Q2-nivåer relativt til normale Q2-nivåer korrelerer med og indikerer en økt mottakelighet for en økning i P-amyloidaggregering. Ved å detektere aggregeringen av p-amyloid, blir dannelsen av P-amyloidplakk også detektert.

Mottakeligheten for Alzheimers sykdom kan også bli bestemt ved å korrelere nivået av fri Q2, nivået av P-amyloid, og nivået av Q2:P-amyloidkompleks. En relevant nedgang i Q2-nivåer relativt til normale Q2-nivåer inkluderer en nedgang på omkring 35 %, fortrinnsvis omkring 50 %, mer fortrinnsvis omkring 65 %. En slik relevant nedgang korrelerer til en økt mottakelighet for Alzheimers sykdom, f.eks. til faktorer som fører til eller er assosiert med Alzheimers sykdom, spesielt P-amyloidplakkdannelse; til Alzheimers sykdom; til symptomer assosiert med Alzheimers sykdom; for å utvikle Alzheimers sykdom eller lignende.

Nedgangen i Q2-nivået relativt til normale Q2-nivåer kan bli korrelert med symptomer karakteristiske for Alzheimers sykdom ved å sammenligne Q2-nivåer med nevropsykiatriske funksjonsmålinger. Nevropsykiatriske funksjonsmålinger kan bli gjort ved å utføre f.eks., nevropsykiatrisk evaluering, en fullstendig historie og en fysisk eksaminering og evaluere denne informasjonen basert på kriterier definert ved f.eks. DSMIII-R og NinCDS-ADRDA.

I noen tilfeller kan individer som har Q2-nivåer som er ca. normale også være følsomme for Alzheimers sykdom. F.eks. har individer som har normale Q2-nivåer men et apoE4allel, en økt mottakelighet for Alzheimers sykdom. Det kan være andre risikofaktorer for Alzheimers sykdom som resulterer i en økt mottakelighet for Alzheimers sykdom i nærværet av Q2-nivåer.

Q2-nivåer kan økes ved å administrere et medikament passende for å øke Q2-ekspresjon eller ved å administrere Q2. Å administrere Q2 inkluderer å administrere Q2 i en form eller forløper for dette proteinet, på en måte som øker Q2-nivåene i f.eks. cerebrospinalvæsken. Å øke Q2-nivåene kan øke mengden med kompleks av Q2 med P-amyloid, øke nivået av passende prosesserte p-amyloid og/eller amyloidforløperprotein, og/eller redusere mengden med P-amyloidplakk i et subjekt og lignende.

Q2 kan bli administrert i en farmasøytisk akseptabel bærer til cerebrospinalvæsken ved metoder så som injeksjon, ved en intracerebroventrikulær pumpe og lignende. Alternativt kan Q2 bli administrert som et forløpergen eller en vektor som koder for Q2, som er målrettet for sentralnervesystemet og tilveiebringe ekspresjon og økte nivåer av Q2. Vektorer som kan kode for Q2 og som vil uttrykke protein og/eller målhjerneceller er kjent for personer med kunnskaper i faget.

Fortrinnsvis blir Q2 eller et medikament som er passende for å øke Q2-ekspresjon, administrert i en mengde som er effektiv for å øke Q2-nivået i f.eks. cerebrospinalvæske, for å øke mengden av kompleks mellom Q2 og P-amyloid, for å øke nivået av passende prosessert P-amyloid og/eller amyloidforløperprotein, og/eller for å redusere mengden med P-amyloidplakk i subjektet eller lignende. Videre kan slik administrering påvirke forløpet eller utkommet av Alzheimers sykdom. En «effektiv mengde» av Q2 eller et medikament passende for å øke Q2-ekspresjon, er en mengde som er tilstrekkelig til å hindre, behandle, redusere og/eller lindre symptomene og/eller de underliggende årsakene for Alzheimers sykdom, inkludert nivået av Q2, nivået av passende prosessert P-amyloid og/eller amyloidforløperprotein, og/eller mengden av p-amyloidplakk i subjektet og lignende. I noen tilfeller er en «effektiv mengde» tilstrekkelig til å eliminere symptomene på sykdommen og kanskje overvinne sykdommen selv. I denne sammenheng i den foreliggende oppfinnelsen refererer begrepene «behandle» og «terapi» og lignende, til å lindre, redusere progresjonen, profylakse, svekkelse eller kurering av eksisterende sykdom. «Hindre» som benyttet heri refererer til å fjerne, forsinke, redusere, inhibere eller på annen måte stoppe, redusere eller lindre starten av slike hjernesykdommer eller lidelser.

Foreliggende oppfinnelse kan bli bedre forstått med referanse til de følgende eksempler.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - karakterisering av effekten av aldring på

chaperonekonsentrasjon i dyrehepatiske mikrosomer

Effekten av aldring på chaperonekonsentrasjon ble bestemt for å demonstrere en reduksjon i konsentrasjon som kan bli koblet til aldersrelaterte sykdommer så som plakkavleiring eller Alzheimers sykdom.

Materialer og metoder

Dyrene benyttet i dette studiet var hann, spesifikke patogenfrie, Sprague-Dawley rotter innkjøpt ved 21 dagers alder fra Harlan Laboratories (Madison, WI). For resten av sine liv var de inne i vindusløse, kontrollerte omgivelser, barrierefasilitet i henhold til teknikkens stand med en konstant temperatur på 22°C + 2°C og en 12 timer på og 12 timer av lyssyklus. Fuktigheten ble opprettholdt ved 50 % + 20 %. To dyr ble inneholdt i hvert bur, og dyrene hadde fri tilgang til mat og vann. Hvert bur som inneholdt testdyr ble utstyrt med et luftfilterdekke. 10 % av buret hadde ikke filter. Dyrene i burene uten filter ble opprettholdt som «vakter» («sentinels») for å bestemme hvorvidt det var noe brudd i de sterile betingelsene. Disse dyrene ble rutinemessig erstattet med nye batcher av yngre dyr. De viste ikke noen økning i dødelighet, noe som indikerer at kolonien var patogenfri.

Alle dyrene ble fjernet fra burene én gang pr. uke når burene ble renset, og hver fjerde til sjette uke når dyrene ble veid. Disse fremgangsmåtene ble utført under rene betingelser. Alle personer som entret dyrerommet hadde på seg sterile hansker, kapper og masker. Dyrene ble foret med en diett basert på AIN76A rekommanderinger med unntak av at karbohydrat var erstattet som 40 % stivelse og 25 % sukrose (BioServe, Frenchtown, NJ). Karbohydratsammensetningen ble endret for å tilpasse en foretrukkenhet for dietten til å bestå av pelletter istedenfor pulver, og for å redusere sannsynligheten for forstoppelse som er assosiert med høye sukrosedietter. Kaliumcitrat (6,5 %) ble tilsatt for å hindre vaskulære sykdommer. Diettbetingelsene møtte NRC næringsmessige standarder for den voksne rotte.

(NRC 1978).

Dyrene nådde og opprettholdt en voksenvekt på omkring 600 g (fig. 1). Imidlertid, etter en alder på 750 dager, ble deres gjennomsnittsvekt redusert til 475 g. Denne nedgangen i gjennomsnittsvekt for dyrene som overlevde til slutten av studiet var den samme som gjennomsnittsvekt for den totale populasjonen. Gjennomsnitt voksen levervekt var 17,5 g og forble der hele voksenlivet (fig. 2). Mg med mikrosomalt protein pr. g lever viste ikke signifikante endringer med alder (fig. 3). Det var ingen signifikant dødelighet inntil en alder på omkring 500 dager (fig. 4). Etter 500 dager viste dødelighetsraten en Gompertz-effekt med en dobling hver 96,1 dag (fig. 5). Mennesker viser en lignende dobling i dødelighet hvert tiår.

I de første 18 månedene ble seks dyr drept ved seks ukers intervaller. For de gjenværende 12 månedene ble dyrene drept med tre måneders intervaller. Vevsprøver ble oppnådd fra omkring 1/3 av dyrene. De gjenværende døde av naturlige årsaker.

Mikrosomer ble fremstilt ved differensialsentrifugering i henhold til Srivastava et al., J. Biol. Chem., 265:8392-99 (1990). Mikrosomale suspensjoner ble frosset og opprettholdt ved -70°C for bestemmelsen av konsentrasjonen av chaperoner. De følgende chaperonene ble studert: BiP, calreticulin, calnexin, ERp72, Q2 og Q5. Chaperoner ble fremstilt ved fremgangsmåter som er kjent i faget. Det mikrosomale innholdet av chaperoner ble bestemt ved immunblotting i henhold til Zhou et al., Arch. Biochem. Biphvs.. 322:390-94 (1995); Zhou et al. (1996); og Chen et al., Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996). En sammenslått mikrosomal suspensjon ble kjørt på hver gel og benyttet som en standard. Chaperoneinnholdet i mikrosomene ble kalibrert mot rensede chaperoner. Immunassay ble kjørt i et lineært område for individuelle chaperonene.

Chaperoner ble fremstilt ved metoder som kjent i faget. Srivastava et al., J. Biol. Chem..265:8392-99 (1991); Chen et al., Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996).

Immunblotting ble gjort i henhold til metoden til Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 76:4350-4354 (1979). Se også Srivastava et al., J. Biol. Chem.. 265:8392-8399 (1991); Zhou et al., Arch. Biochem. Biophvs.. 322:390-394 (1995); Zhou et al., Chem. Res. Toxicol.. 9:1176-1182 (1996); og Chen et al., Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996). Proteinene ble først separert ved SDS-PAGE. Laemmli, Nature. 227:680-685 (1970). Proteinene ble deretter overført til PVDF-membraner (Immobilon, P. Millipore Corp.), og membranene ble reagert med kylling-anti-chaperon-antistoffer. Dette ble etterfulgt av geit-antikylling lgY-antistoff koblet til alkalisk fosfatase. Indikatorfargestoffet benyttet er en kombinasjon av nitroblå tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BioRad, Richmond, CA). Tettheten av båndene ble bestemt på en flat sengskanner (bed scanner) (UMAX, Taiwan, R.O.C.) og analysert ved å benytte NIH Image (versjon 1.61) på en Power PC (Apple Computer). Konsentrasjonen ble bestemt ved sammenligning med ulike konsentrasjoner som korresponderer til den gjennomsnittelige tettheten av tre kanaler på hver del som inneholdt en suspensjon av referansemikrosomer. De mikrosomale standardene ble kalibrert mot flere konsentrasjoner av rensede proteiner. Bestemmelsen av chaperoner i mikrosomene var alle innenfor det lineære området til immunassayene.

Polyklonale antistoffer til alle chaperonene, bortsett fra BiP, ble utviklet i eggleggende høner som beskrevet i Daminani et al., J. Biol. Chem.. 263:340-343

(1988) og Chen et al., Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996). Spesifisiteten av disse antistoffene har blitt verifisert i tidligere studier. Srivastava et al., J. Biol. Chem.. 265:8392-8399 (1991); Zhou et al., Arch. Biochem. Biophvs. 322:390-394 (1995); Zhou et al.. Chem. Res. Toxicol.. 9:1176-1182 (1996); Chen et al.. Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996). Antistoffer mot BiP ble oppnådd fra StressGen (Vancouver, BC, Canada). I tillegg ble antistoffene fremstilt mot calreticulin også benyttet for å probe for calnexin fordi den luminale delen av calnexin svært homolog til calreticulin. Zhou et al. (1996); Chen et al. (1996); Cala et al. (1993).

Resultater

Disse studiene ga resultatene som er rapportert i tabell 1 og i fig. 1-13. Spesielt viser fig. 6 en nedgang i Q5-konsentrasjoner ettersom en rotte blir eldre; fig. 7 viseT en nedgang i Q5-konsentrasjon for stressrespons ettersom rotter blir eldre; fig. 8 viser en nedgang i Q2-konsentrasjon ettersom en rotte blir eldre; fig. 9 viser en reduksjon i Q2-konsentrasjon av stressrespons ettersom en rotte blir eldre; fig. 10 viser en nedgang i ERp72-konsentrasjon ettersom en rotte blir eldre.

Fig. 11 viser en nedgang i BiP-konsentrasjon ettersom en rotte blir eldre; fig. 12 viser en nedgang i calnexinkonsentrasjon ettersom en rotte blir eldre; og fig. 13 viser ingen signifikant nedgang i calreticulinnivåer ettersom en rotte blir eldre.

Diskusjon

Effekten av aldring på det mikrosomale innholdet av de seks chaperonene viste markert ulike mønstre (fig. 6-13; tabell 1). De mest uvanlige mønstrene ble sett med Q5 (fig. 6; tabell 1), W2 (fig. 8; tabell 1), og BiP (vedlegg fig. 11; tabell 1). De konstitutive nivåene av Q5 var høyest i de yngste dyrene og viste en 51 % nedgang ettersom dyrene nådde modenhet (stiplet linje, fig. 6). Dette mønsteret ville bli antatt å være en bestanddel som er kritisk for vekst og proliferasjon. Siden hepatocyttene, når de når modenhet, endrer Go-fase, har cellene mye mindre behov for nye membrankomponenter. Således ville det bli antatt, som observert, at et chaperone involvert i membransyntese vil vise signifikant nedgang. Etter alder på

200 dager viste Q5-innholdet en lavere, men stabil, nedgang. Q5 viste også markert sesongvariasjon, og hadde topper som falt sammen med midtvinter og midtsommer (fig. 6). Dette illustreres tydeligere når de konstitutive nivåene blir subtrahert og det gjenværende blir plottet på nytt (fig. 7).

Rytmen sammenfaller med de mest stressende tidene på året. Således indikerer syklisk variasjon «stressrespons» for det respektive chaperone. Dette stresset kom fra fuktighetsforandringer, som varierer mellom 30 og 70 % i løpet av året. Den initiale toppen i den første vinteren er markert butt sammenlignet med den følgende sommeren, noe som er resultat av svært høye konstitutive nivåer observert inntil 200 dagers alder (fig. 6). Således produserte allerede cellene nesten maksimale mengder av det respektive chaperonet. De konstitutive nivåene viste nedgang senere i alder, men dyrene viste fremdeles en markert stressrespons (fig. 7). Som det har blitt antydet i andre studier reduseres stressresponsen med alder, og viser 73 % nedgang ved 874 dager.

Q2 viste et mønster lignende til Q5, bortsett fra konstitutive nivåer. Q2-innholdet viste økte konstitutive nivåer ettersom dyrene nådde modenhet, og deretter viste de 32 % nedgang mellom alder på 84 dager og 874 dager (fig. 8). Disse nivåene viste også en stressrespons. Når de konstitutive nivåene blir subtrahert ut, har nivåene en ca. halvårlig rytme. Disse toppene korresponderer også til midtvinter og midtsommer (fig. 9). Denne stressresponsen viste en 71 % nedgang med alder.

Endringene i forholdet av de konstitutive nivåene av Q2 og Q5 som korresponderer til alder er viktig. Q5 katalyserer konfigureringen av begynnende og denaturerte proteiner inn i deres native tertiære struktur, og dannelsen av disulfidbindinger. I tillegg, selv om den ikke er en transferase, er Q5 også krevet for N-glykosyleringen av membran og sekretoriske proteiner. Nyere studier indikerer at Q2 er involvert i insersjonen av N-glykosylerte proteiner inn i membranen. Toppbehovet for insersjonen av N-glykosylerte proteiner inn i membranen er i en tidlig alder når dyrene er i rask vekst. Etter at leveren når sin modne vekt, vil cellen ha mye mindre behov under konstante miljøbetingelser for høye nivåer av proteiner som hjelper med insersjon, fordi cellene ikke lenger er voksende eller prolifererende. Således er Q2 ikke det primære chaperone i hepatocytten, i hvert fall ikke i unge dyr.

I motsetning til Q2 og Q5 viste ERp72 ingen sesongmessig variasjon. Imidlertid, tilsvarende til Q5, hadde de unge dyrene de høyeste konsentrasjonene og viste 30 % nedgang med alder (fig. 10; tabell 1). Selv om den nøyaktige funksjonen ERp72 ikke har blitt klart definert, er den kjent å være et chaperone og er ett av de best konserverte proteinene i dyreriket. Human ERp72 er rapportert å være identisk til nematode, Caenorhabdilis elegans. Ethvert slikt svært godt konservert protein fungerer sannsynligvis i en kritisk rolle i den cellulære metabolismen. Sannsynligvis er dette relatert til dets chaperoneaktivitet.

BiP er et medlem av HSP 70 familien som er antatt å fungere primært som en avfallssamler (scavenger) for uriktige editerte proteiner. BiP viser et mønster lignende til Q2 og Q5 (fig. 11), og har 37 % nedgang med alder og noe sesongmessig variasjon.

I motsetning til alle de ovennevnte beskrevne chaperonene, viste calreticulin (et chaperone kritisk for cellefunksjon) ingen signifikant nedgang med alder (fig. 12). Likevel viste dens membranbindende homolog, calnexin, en markert nedgang men ingen sesongmessig variasjon (fig. 13). Videre, som Q2, hadde calnexin lave konsentrasjoner i unge dyr, nådde en topp ved 84 dager, og deretter reduserte 32 % med alder ved 874 dager. Rollen til dette chaperonet i proteinsyntese har blitt nøye studert og er kritisk for syntesen av både membran og sekretoriske proteiner.

Konklusjon

Siden de ovennevnte dataene er rapportert pr. mg mikrosomalt protein er det klart at alle, med unntak av calreticulin, viste markert, statistisk signifikant nedgang i spesifikt innhold med alder (30-50 %) (R<2>= 0,9586 til 0,8414). (Dvs. disse

proteinene ble redusert ut av proporsjon i forhold til andre proteiner i hepatisk ER). Videre fant denne nedgangen sted i et organ, leveren, hvis funksjon er antatt å forbli relativt godt konservert med alder. I motsetning til CNS, immunsystemet, endokrine organer eller nyrer, mister leveren hverken vekt eller særlig funksjon. F.eks. vil serumnivåer til det primære sekretoriske proteinet produsert av leveren, albumin, ikke reduseres med alder, til tross for et tydelig tap av proteinsyntetisk kapasitet.

Eksempel 2 - Identifisering av et chaperon i human cerebrospinalvæske Chaperoner danner løselige komplekser med et vidt spekter av sekretoriske proteiner. Siden dyrestudiet av chaperoner i de hepatiske mikrosomene viste en nedgang i nivå av noen chaperoner ettersom dyrene ble eldre, er det viktig å bestemme hvorvidt noen av disse chaperonene er assosiert med human cerebrospinalvæske og hvorvidt de spiller noen rolle i Alzheimers sykdom.

Materialer og metoder

Cerebrospinalvæskeprøver som var klinisk avfall ble tilveiebrakt av Anesthesia Service VAMC og Laboratory Service, Regions Medical Center, St. Paul, MN, fra normale friske pasienter som var utsatt for en spinaltapping for spinalanestesi eller for å teste for meningitt. Pasientene som cerebrospinalvæskeprøvene ble tatt fra inkluderte tre barn, én ung voksen og fire eldre pasienter.

Cerebrospinalvæsken ble studert for nærværet av seks chaperoner: ERp72, calnexin, calreticulin, BiP, Q2 og tiol:proteindisulfid-oksidoreduktase av formen Q5 (Q5). ERp72, calreticulin, calnexin, Q2 og Q5 ble fremstilt ved fremgangsmåter som er kjent i faget. Srivastava et al., J. Biol. Chem.. 265:8392-99 (1991); Chen et al., Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996).

Chaperoneinnholdet ble bestemt ved å immunblotte prepareringene i henhold til fremgangsmåtene beskrevet i eksempel 1. Konsentrasjonen av chaperonene ble bestemt ved sammenligning av ulike konsentrasjoner av den gjennomsnittelige tettheten av tre kanaler på hver gel som inneholdt en referanseprøve med cerebrospinalvæske. Cerebrospinalvæskestandardene ble kalibrert mot flere konsentrasjoner av standard cerebrospinalvæske. Bestemmelsene av proteinene i cerebrospinalvæsken og er alle innenfor det lineære området til immunassayene. Polyklonale antistoffer mot alle chaperonene ble utviklet eller oppnådd i henhold til fremgangsmåten i eksempel 1.

Immunblottet ble også inkubert med antistoffer mot P-amyloid 1-42 (AMY-33; Zymed, Sør San Francisco, CA).

Resultater

Bare Q2 ble identifisert i human cerebrospinalvæske. Nivåene av andre chaperoner, dersom disse var tilstede, var ikke detekterbare. Q2 viser et diffust bånd som korresponderte til en molekylvekt på omkring 62 kDa (fig. 14A, rader 3-7 og 9-14). Human cerebrospinalvæske ble sammenlignet med rottehepatiske mikrosomer. Rottemikrosomene viste et skarpt bånd som korresponderer til en molekylvekt på omkring 57 kDa (fig. 14A, rad 2). På samme måte viste renset Q2 et skarpt bånd som korresponderer til en molekylvekt på 57 kDa (fig. 14A, rad 8). Identiteten til Q2 ble bekreftet med kanin monoklonale antistoffer mot Q2 (GRP58, StressGen, Vancouver, B.C.) (ikke vist).

Antistoffene mot P-amyloid 1-42 reagerte med rottehepatiske mikrosomer (fig. 14B, rad 2), men de reagerte ikke med renset Q2 (fig. 14B, rad 8).

Diskusjon

Som en følge av at reaksjonen av P-amyloid 1-42 antistoffer med rottehepatiske mikrosomer og reaksjonen av antistoffer mot Q2 med rottehepatiske mikrosomer viste tilsvarende bånd ved molekylvekter som korresponderte til omkring 75 kDa, tyder dette på at p-amyloid og Q2 danner et kompleks i leveren. Videre, fordi p-amyloid 1-42 antistoffer ikke reagerte med renset Q2, stammer resultatene ikke fra kryssreakti vitet.

Selv om immunblottet inkubert med Q2-antistoffer og immunblottet inkubert med P-amyloid 1-42 antistoffer viste ulike mønstre, var mønstrene fremdeles lignende hverandre. Dette tyder på at de to er tilstede i cerebrospinalvæske som et tett kompleks.

Konklusjon

Chaperonet Q2 er tilstede i human cerebrospinalvæske.

Eksempel 3 - Isolering av et kompleks av Q2 med P-amyloid fra human cerebrospinalvæske

Et kompleks av Q2 og P-amyloid ble oppdaget og isolert fra human cerebrospinalvæske, som førte til en bedre forståelse av rollen til Q2 i human cerebrospinalvæske og Alzheimers sykdom.

Materialer og metoder

Et immunblott ble fremstilt som angitt i eksempel 1 for å studere det 62 kD båndet som var observert i human cerebrospinalvæske. Immunblottet ble inkubert med et polyklonalt antistoff mot Q2 og et annet immunblott ble inkubert med monoklonale antistoffer mot P-amyloid 1-42 (AMY-33 fra Zymed, Sør San Francisco, CA). Et diffust bånd ble identifisert igjen ved 62 kDa for cerebrospinalvæske. Båndet for den monomere formen av P-amyloid 1-42 korresponderte til en molekylvekt på 5,5 kDa.

Q2: p-amyloidkompleks ble isolert ved affinitetskromatografi ved å benytte kylling-anti-P-amyloidantistoff. Alternativt ble isolering ved affinitetskromatografi utført med anti-Q2. Komplekset ble identifisert ved immunblotting som beskrevet i eksempel 1. Komplekset ble videre renset ved kromatografi på en Sephacryl-kolonne etterfulgt av en monoQ-kolonne.

Polyklonale antistoffer mot en renset prøve av Q2 ble utviklet i eggleggende høner som beskrevet i eksempel 1. Syntetisk p-amyloid 1-42 antistoffer ble også fremstilt i kyllinger ved den samme fremgangsmåten.

Cerebrospinalvæskeprøver eluert fra affinitetskromatografi med kylling-anti-p-amyloid og, alternativt, fra affinitetskromatografi med anti-Q2, ble studert ved immunblotting. Kyllingantistoffene mot Q2 og P-amyloid ble bundet til CNBr-aktivert sefarose. Cerebrospinalvæskeprøvene ble plassert på kolonnen i NaCl (IM). Kolonnen ble vasket og proteinene eluert med glysin (0,1M, pH 9,0) i NaCl.

Immunblott ble utført etter SDS-PAGE og transblotting på PVDF-membraner. Srivastava, J. Biol. Chem.. 266: 20337-20344 (1991); Chen et al., Biochemistrv. 25:8299-8306 (1996); Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 76:4350-54

(1979). Prøvene ble varmet til 55°C i 5 min. i nærværet av merkaptoetanol. Dersom de ble varmet til 90°C aggregerte kompleksene og ingen bånd ble observert. Båndene ble reagert med det passende geit-anti-immunoglobulinantistoffet koblet til alkalisk fosfatase. Indikatorfargestoffet var en kombinasjon av nitroblå titrasolium og 5-brom-4-klor-3-indoyl fosfat (BioRad, Richmond, CA). Båndintenstiteten ble kvantitert ved datamaskinskanning og analyse (NIH Image versjon 1,60).

Resultater

Blott inkubert med antistoffer mot Q2 viste diffuse bånd som korresponderer til en molekylvekt på omkring 62 kDa (fig. 15A, rader 3 og 4). Tilsvarende bånd ble også detektert når blottene var inkubert med antistoffer mot P-amyloid 1-42 (fig. 15B, rader 3 og 4). I tillegg ble anti-P-amyloid 1-42 vist ikke å være reaktive mot Q2.

Blott inkubert med antistoffer mot P-amyloid 1-42 åpenbarte også et bånd som korresponderer til en molekylvekt på omkring 62 kDa. Men P-amyloid har en molekylvekt på omkring 5,5 kDa. I tillegg til 62 kDa båndet identifisert på immunoblottene ble et 27 kDa bånd identifisert når det ble inkubert med anti-P-amyloid 1-42 (fig. 15B, rad 3). Dette 27 kDa båndet ble også observert når syntetisk P-amyloid 1-42 ble lagret ved -20°C i flere uker og deretter kjørt på en gel, og derfor representerer en P-amyloid 1-42 pentamer.

Monoklonalt P-amyloid antistoff (AMY-33) er svært spesifikt for P-amyloid, og er kjent for å binde kun til fibrinogen på utsiden av P-amyloid. Stern et al., FEBS Let.. 245:43-47 (1990). Men molekylvektbåndene observert i dette studiet var forskjellig fra de som er observert med fibrinogen. Videre reagerte ikke anti-fibrinogenanti-stoffer med noe protein i cerebrospinalvæske.

Skanning av blottene indikerte at 95 % av det immunreaktive P-amyloidet var assosiert med 62 kDa båndet, men 5 % var assosiert med bånd med lavere molekylvekt. Dette korresponderer til en høy bindingsaffinitet.

Disse resultatene ble bekreftet i 100 ytterligere cerebrospinalvæskeprøver. Det samme mønsteret med immunreaktive bånd mot Q2 og P-amyloid ble observert for alle 100 prøvene.

Diskusjon

De fleste grupper som har studert effekten av Alzheimers sykdom på cerebrospinalvæskekonsentrasjonene av P-amyloid, har benyttet ulike ELISA'er eller lignende assay, men fem har utført immunblottstudier og hver har observert markert forskjellige resultater. En studie observerte kun lav Mr immunreaktive bånd. Ida et al., J. Biol. Chem.. 271: 22908-22914 (1996). Likevel viste det foreliggende studiet at 95 % av det immunreaktive P-amyloid 1-42 korresponderte til en molekylvekt på 62 kDa, og kun 5 % med den lavere molekylvekten. De andre gruppene har åpenbart benyttet mer kraftig denaturerende betingelser i fremstillingene av deres prøver enn de som ble benyttet i dette studiet, noe som sannsynligvis har dissosiert komplekset. I det foreliggende studiet var komplekset ikke dissosiert.

Andre studier kan ha observert ulike immunreaktive bånd fordi antistoffene kan ha vært annerledes i spesifisitet enn de som ble benyttet her. Seubert et al., Nature. 361:260-63 (1993); Globek et al., Neurosci. Let.. 191:79-82 (1995).

I en studie av interaksjonen av P-amyloid med svært tette lipoproteiner ble et immunreaktivt bånd ved 62 kDa observert (Koudinov et al., Biochem. Biophvs. Res. Commun.. 223:592-97 (1996); Ghiso et al., Biochem. J.. 293:27-30 (1993)), men løselig P-amyloid fra fraksjonen som ga 62 kDa båndet ble ikke hentet, og fraksjonen som produserte 62 kDa båndet var ikke identifisert ellerkarakterisert.

Båndet som korresponderer til en molekylvekt på 62 kDa ville være indikerende for et kompleks mellom P-amyloid 1-42 og Q2. Fordi dette båndet var diffust tyder dette på at komplekset mellom P-amyloid 1-42 og Q2 er glykosylert.

Konklusjon

Et kompleks av Q2 og P-amyloid 1 -42 ble funnet i human cerebrospinalvæske. Ved å binde til P-amyloid 1-42, holder Q2 P-amyloid 1-42 i løsning og hjelper til å hindre aggregering og presipitering av P-amyloid.

Eksempel 4 - Karakterisering av et kompleks av Q2 med P-amyloid 1-42 Komplekset av Q2 og p-amyloid blekarakterisertfor bedre å forstå rollen til dette komplekset og hindre dannelse av P-amyloidplakk og i Alzheimers sykdom.

Materialer og metoder

Et kompleks av Q2 med P-amyloid ble renset som beskrevet i eksempel 3. Nærværet av karbohydratenheter på komplekset ble bestemt ved fremgangsmåter som er kjent for personer med kunnskaper i faget. Spesielt ble komplekset reagert med PAS. Det PAS-reagerte komplekset ble eluert gjennom en boronatkolonne.

Resultater

Når komplekset var reagert med PAS ble et bånd som korresponderer til en molekylvekt på 62 kDa identifisert. Videre bant det PAS-reagerte komplekset til en boronatkolonne, noe som tyder på nærværet av en karbohydratenhet.

Diskusjon

Resultatene fra reaksjonen av komplekset med PAS er i overensstemmelse med observasjonen av det diffuse båndet som korresponderer til en molekylvekt på 62 kDa beskrevet i eksempel 3. Disse resultatene er også i overensstemmelse med andre studier som er indikert at Q2 har lektinlignende egenskaper, og at Q2 kan binde til proteiner kun etter å ha blitt N-glykosylert. Oliver et al., Science, 275:86-88 (1997); Elliott et al., J. Biol. Chem.. 272:13849-13855 (1997). N-glykosylering kan være viktig i den post-translasjonelle prosessering av mange proteiner som blir syntetisert i det endoplasmatiske retikulum. Suzuki et al., J. Biol. Chem., 272: 10083-10086 (1998).

Sannsynligheten for at komplekset er N-glykosylert blir også støttet av observasjonen av at komplekset var stabilt under de moderat alvorlige denatureringsbetingelsene som ble benyttet for å løse opp prøvene for SDS-PAGE og immunblottanalyser.

Konklusjon

Selv om Q2 og P-amyloid har vært vist ikke å være glykosylert når de ikke er i kompleks, tyder disse resultatene på at Q2: P-amyloid er glykosylert som et kompleks.

Eksempel 5 - Deteksjon av P-amyloidplakk og korrelasjon av plakknærvær til Q2-nivåer og/eller apoE Genotype

Ettersom Q2-nivåer går ned relativt til normale Q2-nivåer, kan en person ha økt mottakelighet for, f.eks. P-amyloidaggregering, ha Alzheimers sykdom, ha symptomer assosiert med Alzheimers sykdom, eller sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom. Det er ønskelig å forstå denne korrelasjonen.

Metoder og materialer

Cerebrospinalvæskeprøver og hjerneprøver ble tatt fra autopsiprøver. Prøvene ble skaffet fra 21 nonner som deltok i en studie der deres helsestatus og psykomotoriske evner ble evaluert og monitorert inntil de døde. Snowdon, JAMA, 277:813-17

(1997). Cerebrospinalvæskeprøven ble frosset på tidspunktet de ble samlet inn og lagret ved -70°C.

Cerebrospinalvæskeprøvene ble studert for nærværet av chaperoner som beskrevet i eksempel 1 med noen modifikasjoner. Immunblott ble utført etter SDS-PAGE og transblotting på nitrocellulosemembraner. Laemmli, Nature. 227:680-85 (1970); Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 76:4350-54 (1979). Prøvene ble varmet til 55°C i 5 min. i nærværet av SDS og merkaptoetanol. Dersom de ble varmet til 90°C aggregerte kompleksene og ingen bånd ble observert. I et første studie ble båndet reagert med antistoffer spesifikke for molekyler av interesse, og deretter med passende geit-anti-immunglobulinantistoffer koblet til alkalisk fosfatase. Antistoffene spesifikke for molekylet av interesse var polyklonale antistoffer mot calmodulin, calnexin, BiP, ERp72, Q5, Q2 og syntetisk P-amyloid 1-42. Antistoffer mot BiP og Q2 ble skaffet til veie fra StressGen (Vancouver, B.C.). Antistoffer mot p-amyloid 1-42 ble skaffet til veie fra Zymed (AMY-33; Sør San Francisco, CA). Alle andre antistoffer ble fremstilt i eggleggende høner som beskrevet i eksempel 1. Indikatorfargestoffet som ble benyttet var en kombinasjon av nitroblå tetrazolium og 5-brom-4-klor-3-indolylfosfat (BioRad, Richmond, CA).

I et annet studie ble cerebrospinalprøver eluert fra affinitetskromatografi med anti-Q2 og, alternativt, anti-P-amyloid 1 -42, studert ved immunblott. Antistoffene ble først bundet til CNBr-aktivert sefarose. Harpiksen ble suspendert i NaCl (IM), blandet med IM CSF-prøve, inkubert over natt ved 4°C og deretter helt over på en kolonne. Kolonnen ble vasket med NaCl inntil eluatet ikke hadde noen absorbans ved 280 nm. De bundede proteinene ble eluert med glysin (0,1 M, pH 9,0) i NaCl. Q2 og P-amyloid 1-42 ble identifisert i henhold til immunblottingsprosedyrene beskrevet over.

I en tredje studie ble konsentrasjonen av Q2 bestemt fra immunblottene ved økt kjemiluminiscens med en peroksidasereaksjon (RPN 2106; Amersham Life Science, Piscataway, NJ). Båndintensitetene ble kvantitert ved computer skanning av kjemiluminiscerende fotografisk film og analysert av NIH Image (versjon 1,60).

Hjerneprøvene fra nonnene ble studert for å bestemme det totale antallet av P-amyloidplakk, inkludert både diffuse og nevrittiske typer av plakk. Det totale plakkantallet ble bestemt fra de fem mest alvorlige påvirkede feltene i Bielschoasky-fargede snitt av frontal, temporal og parietale lapper fra neokorteks. Hjerneprøvene oppnådd fra nonnene ble også studert for å bestemme apoE genotypen til subjektene. Snowdon et al., J. Am. Med. Assoc. 277:813-17 (1997).

Resultater

Det kjemiluminiscerende assayet var lineært med konsentrasjoner av Q2 mellom omkring 5 og 45 ng/ml med cerebrospinalvæske.

Fig. 16 og tabell 2 viser en signifikant korrelasjon mellom konsentrasjonen av Q2 og det totale antall med plakk (r = -0,52, p<0,02, 95 % CI-0,25 til -0,79 ved Spearman rank korrelasjonstesten).

Diskusjon

Cerebrospinalvæskeprøvene fra nonnene viste tre distinkte grupper. Den første hadde et rikelig antall med plakk og mindre enn 17 ng/ml med Q2 (6 av 21). Den andre gruppen hadde normale nivåer med Q2 og et rikelig antall med plakk (8 av 21). Den tredje gruppen hadde lite eller ikke noen plakk, og normale nivåer med Q2. Men den tredje gruppen er den eneste gruppen som viste kun apoE2eller apoE3alleler (tabell 2).

Som beskrevet i eksempel 3 er omkring 5 % av P-amyloid 1-42 fri i løsning i normale subjekter. Noen studier har vist at apoE4mer enkelt danner uløselige komplekser med P-amyloid enn andre isoformer av apolipoproteinet. Moir et al., Biochemistrv. 38:4595-4603 (1999). Resultatene vist i tabell 2 tyder på at individer som har en apoE4genotype kan danne plakk ved lavere konsentrasjoner av fri p-amyloid enn de andre genotypene.

Dataene vist i fig. 16 og tabell 2 viser at en person som ikke har apoE4genotype og har normale Q2-nivåer, har ingen eller få plakk. Likevel har en person med lave nivåer av Q2 økt mottakelighet for rikelig mengde av plakk, uavhengig av apoE genotype. Det vil si at 100 % av personene som ble studert som viste en nedgang i Q2-nivåer relativt til normalen, hadde en rikelig mengde med plakk. En person med normale nivåer av Q2, men med et apoE4allel, hadde også økt mottakelighet for en rikelig mengde av plakk. Det bør imidlertid bemerkes at kun halvparten av personene som hadde normale nivåer av Q2, og en rikelig mengde med plakk, hadde et apoE4allel. Således kan også et tredje gen eller protein være involvert i utviklingen av Alzheimers sykdom.

Prøvene fra nonnene ble også sammenlignet med prøver fra 12 unge personer (3-16 år gamle) og fra 12 eldre personer uten Alzheimers sykdom (66-82 år gamle). Q2-nivåene fra de unge subjektene (27,3±1,2 ng/ml) og de eldre subjektene (29,9 + 1,6 ng/ml) var de samme som Q2-nivåene observert i nonnene som hadde lite eller ingen senile plakk (24,6 + 1,9 ng/ml).

Konklusjon

Dette studiet demonstrerer en økt forekomst av Alzheimers sykdom i individer som har minst ett apoE4allel og individer med Q2-nivåer som er mindre enn 17 ng/ml, uavhengig av apoE4genotype.

Alle publikasjoner og patentsøknader i denne spesifikasjonen er indikative for nivået med ordinær kunnskap i faget som denne oppfinnelsen omhandler.

Claims (29)

1. Fremgangsmåte for å detektere i en biologisk prøve et kompleks av chaperon Q2 og p-amyloid, karakterisert vedat den omfatter: å utføre et immunassay eller fluorescenspolariseringsassay for spesifikt å gjenkjenne komplekset av chaperon Q2 og p-amyloid; og korrelere et nivå av komplekset med et nivå av P-amyloid aggregering i den biologiske prøven.

2. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert vedat den biologiske prøven omfatter humant biologisk materiale fra sentralnervesystemet og fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av komplekset med en mottakelighet for Alzheimers sykdom.

3. Fremgangsmåte i følge krav 2, karakterisert vedat den biologiske prøven omfatter humant materiale fra sentralnervesystemet og fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av komplekset med en sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom.

4. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert vedat den biologiske prøven omfatter human materiale fra sentralnervesystemet og fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av komplekset med adferdsendring i et menneske som den biologiske prøven er oppnådd fra.

5. Fremgangsmåte i følge krav 1, karakterisert vedat immunassayet eller fluorescenspolariseringsassayet også påviser chaperon Q2, P-amyloid, eller både chaperon Q2 og P-amyloid.

6. Fremgangsmåte for å detektere aggregering av P-amyloid,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter å bestemme nivået av chaperon Q2 i en biologisk prøve.

7. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere en nedgang i chaperon Q2 nivået med en økning i aggregering av P-amyloid.

8. Fremgangsmåte i følger krav 6, karakterisert vedat chaperon Q2 er en komponent av et kompleks omfattende et chaperon Q2 og et P-amyloid.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere en nedgang i nivået av chaperon Q2 i et kompleks omfattende chaperon Q2 og (3-amyloid med en økning i aggregering av P-amyloid.

10. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert vedat P-amyloid omfatter animalsk p-amyloid 1-42, animalsk p-amyloid 1-38, humant P-amyloid 1-42, eller humant P-amyloid 1-38.

11. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert vedat den biologiske prøven omfatter humant eller animalsk biologisk materiale fra sentralnervesystemet.

12. Fremgangsmåte i følge krav 11, karakterisert vedat den biologiske prøven omfatter human eller animalsk cerebrospinalvæske.

13. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert vedat detektering av aggregering av p-amyloid omfatter detektering av dannelse av en P-amyloid plakk.

14. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert vedat detektering av aggregering av p-amyloid omfatter screening av en økt mottakelighet for Alzheimers sykdom.

15. Fremgangsmåte i følge krav 6, karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter screening av apoE genotypi.

16. Fremgangsmåte for å screene Alzheimers sykdom, karakterisert vedat fremgangsmåte omfatter: å bestemme et nivå av chaperon Q2 i en human biologisk prøve; og korrelere chaperon Q2 nivået med en mottakelighet for Alzheimers sykdom.

17. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert vedat korreleringen av chaperon Q2 nivået for mottakelighet for Alzheimers sykdom omfatter å korrelere en nedgang i chaperon Q2 nivået med en økning i aggregeringen av P-amyloid.

18. Fremgangsmåte i følger krav 16, karakterisert vedat chaperon Q2 er en komponent av et kompleks omfattende chaperon Q2 og P-amyloid.

19. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter å bestemme nivået av et kompleks omfattende chaperon Q2 og P-amyloid.

20. Fremgangsmåte i følge krav 18, karakterisert vedat (3-amyloidet i komplekset er (3-amyloid 1-42 eller (3-amyloid 1-38.

21. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert vedat den humane biologiske prøven omfatter biologisk materiale fra sentralnervesystemet.

22. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert vedat den humane biologiske prøven omfatter biologisk materiale fra cerebrospinalvæske.

23. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter å korrelere nivået av chaperon Q2 med nivået av et kompleks omfattende chaperon Q2 og (3-amyloid og et nivå av (3-amyloid i cerebrospinalvæske.

24. Fremgangsmåte i følge krav 23, karakterisert vedat P-amyloid i komplekset er henholdsvis human P-amyloid 1-42, eller human P-amyloid 1-38, og P-amyloidet i cerebrospinalvæske er henholdsvis human P-amyloid 1-42 eller human P-amyloid 1-38.

25. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert vedat fremgangsmåten ytterligere omfatter screening av apoE genotypi.

26. Fremgangsmåte i følge krav 16, karakterisert vedat korreleringen omfatter å korrelere nivået av chaperon Q2 med en sannsynlighet for å utvikle Alzheimers sykdom.

27. Anvendelse av chaperon Q2 for fremstilling av et preparat for behandling av Alzheimers sykdom.

28. Antistoff, karakterisert vedat det spesifikt gjenkjenner et kompleks som omfatter chaperon Q2 og p-amyloid.

29. Antistoff som angitt i krav 28, karakterisert vedat komplekset omfatter human P-amyloid 1-42, human P-amyloid 1-38, dyre P-amyloid 1-42 eller dyre P-amyloid 1-38.