MXPA01004317A - Un complejo de una chaperona con -amiloideo y metodos que emplean este complejo. - Google Patents

Abstract

Una proteina de chaperona Q2 y °-amiloideo pueden formar un complejo. Este complejo puede detectarse en una muestra biologica, tal como, por ejemplo, tejidos o fluidos de un mamifero. Los niveles de Q2 tambien pueden detectarse en una muestra biologica. Un metodo para determinar el nivel de Q2 en una muestra biologica y comparar aquel nivel con un nivel de Q2 normal puede utilizarse para detectar, seleccionar, diagnosticar, o de otra forma determinar una susceptibilidad de la persona a la enfermedad de Alzheimer tal como, por ejemplo, la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer, de sintomas de esta enfermedad, de factores que conducen a o asociados con esta enfermedad, de probabilidad de desarrollar esta enfermedad, y lo similar. En una modalidad, un descenso en el nivel Q2 se correlaciona con un aumento de probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. En otra modalidad, un descenso en el nivel Q2 se correlaciona con un aumento en la agregacion de °-amiloideo. El metodo puede ademas incluir la seleccion de un genotipo E de apolipoproteina, la cual se asocia con la enfermedad de Alzheimer.

Description

UN COMPLEJO DE UNA CHAPERONA CON ß-AMILOIDEO Y MÉTODOS QUE EMPLEAN ESTE COMPLEJO W ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 5 Numerosos problemas fisiológicos, tales como una pérdida en la masa muscular, una deficiencia en el sistema inmune, reducciones en la síntesis máxima y liberación de hormonas (por ejemplo, insulina u hormona de crecimiento), pérdida de la función renal, y reducciones en habilidades cognoscitivas ocurren con la edad. Estos problemas conducen a un total en la capacidad funcional. Se han acelerado varios modelos para explicar estos problemas fisiológicos relacionados a la edad. Tales modelos incluyen, por ejemplo, muerte celular programada aumentada, es decir, apoptosis; acumulación de daño de oxidante; deficiencia de la célula para mantener los telomeros y las extremidades de 15 los cromosomas; y defectos en respuesta al stress. Los defectos relacionados a la edad observados en la respuesta al stress pueden incluir proteínas de chaperona. A nivel celular, las proteínas de stress más importantes son las chaperonas. Las chaperonas juegan un papel importante en la función 0 celular. Ayudan a realinear las proteínas en su estado nativo, mediante el cual renaturalizan las proteínas dañadas y ayudan a las etapas finales del pliegue de proteína al dirigir nuevamente las proteínas sintetizadas en su estructura óptima, final. Las chaperonas también ayudan a estabilizar el producto de proteína final, tal como por la formación de enlaces de 5 disulfuro intra- e intermolecular. Una familia tal de chaperonas se conoce como tiol: oxidoreductasas de disulfuro de proteína (TPDOs). Los estudios de las proteínas de stress y chaperonas soportan el concepto de que varios de los descensos funcionales relacionados a la edad se asocian con ^flas reducciones en la actividad de los sistemas de chaperona. Los niveles 5 y la actividad de chaperonas reducida (os) puede dar como resultado la formación de masas de proteínas inadecuadamente plegadas e insolubles. Las masas insolubles, o placas, de la proteína de ß-amiloideo, un 38 a 43 péptidos de aminoácido derivados de la proteína precursora de amiloideo, se forman en el cerebro de las personas más viejas que sufren la enfermedad de Alzheimer. La proteína precursora de amiloideo es una proteína de membrana intrínseca que se sintetiza en el retículo endoplásmico. Durante la síntesis y la inserción en la membrana de plasma, el ß-amiloideo se desgaja de la proteína precursora de amiloideo y se secreta en el espacio intracelular. 15 En soluciones fisiológicas, fácilmente se agrega ß-amiloideo para formar las características de placa de la enfermedad de Alzheimer.

Sin embargo, la enfermedad de Alzheimer es compleja e incluye más que fmera sobreexpresión del péptido de ß-amiloideo. La neuropatología de la enfermedad de Alzheimer se caracteriza por la extensiva pérdida celular 0 neuronal y la deposición de numerosas placas seniles y enredos neurofibrilares en la corteza cerebral. A pesar de que se desarrollan pequeños números de placas seniles clásicas en el cerebro normal con la edad, se encuentran grandes números de las placas casi exclusivamente en los pacientes de Alzheimer. 5 Un estudio mostró que cuando el fluido cerebroespinal se agrega a ß-amiloideo, el ß-amiloideo no se agrega, sugiriendo que el fluido cerebroespinal incluye un componente que muestra la agregación de ß- amiloideo. Esto indica que el fluido cerebroespinal de los sujetos que se encuentran libres de la enfermedad de Alzheimer, puede incluir un 5 componente que previene la formación de las placas seniles. Este componente podría ser una chaperona. De esta manera, se desea para caracterizar mejor el papel de las chaperonas en el procesamiento de la proteína precursora de amiloideo, la formación de placas de ß-amiloideo, y la enfermedad de Alzheimer. El pliegue o procesamiento adecuado de la lO proteína precursora de amiloideo o el ß-amiloideo pueden incluirse en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. Alternativamente, un paciente con la enfermedad de Alzheimer puede tener una proteína que mejore la nucleación de las placas de ß- amiloideo. Una teoría sugiere que la apoliproteína E puede jugar un papel 15 en la enfermedad de Alzheimer. La apoliproteína E existe en al menos 3 formas alélicas conocidas como apoE2, apoE3, apoE . La evidencia indica que una persona que tiene al menos un alelo de apoliproteína E (apoE ) se encuentra más susceptible a la enfermedad de Alzheimer, sugiriendo que el producto de proteína de apoE4 l puede jugar un papel en la 0 enfermedad de Alzheimer. Moir et al. , Biochemistrv. 38: 4595-4603 (1999).

Por ejemplo, la apoE4 puede contribuir a la nucleación o formación de las placas de ß-amiloideo. Anteriormente, los estudios de la enfermedad de Alzheimer se han enfocado en la sobreproducción de ß-amiloideo. Por ejemplo, muchos 5 laboratorios han investigado el papel de las proteasas incluidas en la separación de la proteína precursora para producir ß-amiloideo. Todavía un número de estudios han mostrado que, a excepción de algunas formas genéticas raras del principio temprano de la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad temprana de Alzheimer observada con síndrome de Down, los 5 pacientes con la enfermedad de Alzheimer actualmente tienen concentraciones más bajas de ß-amiloideo en su fluido cerebroespinal que en los controles relacionados a la edad. Además, un estudio reciente de ratones transgénicos que tienen un gen de proteína precursora de amiloideo insuficientes del dominio del inhibidor de proteasa de Kunitz, mostró que la concentración aumentada de ß-amiloideo no puede explicarse por una elevación en la expresión de la proteína precursora de amiloideo, el cual parecía mantenerse inalterado con la edad. Estos estudios indican que los niveles de ß-amiloideo solos no son suficientes para explicar la enfermedad de Alzheimer. De esta manera, es deseable 15 para caracterizar mejor el papel de las chaperonas y el procesamiento de la proteína precursora de amiloideo en la formación de las placas de ß- amiloideo y la enfermedad de Alzheimer. El pliegue o procesamiento l adecuado de la proteína precursora de amiloideo o ß-amiloideo pueden incluirse en la etiología de la enfermedad de Alzheimer. 0 Además, en el presente el único método para detectar una predisposición para la formación de la placa de ß-amiloideo o la enfermedad de Alzheimer o la presencia de tales placas o enfermedad incluye la disección del cerebro o cultivo de células cerebrales del sujeto. Tales procedimientos invasivos son, por supuesto, indeseables por la 5 mayoría de los sujetos. Esto se debe particularmente a que, mientras se resume anteriormente, aún después de la disección, habría sido previamente no claro como probar para ciertos factores la conducción a la formación de placa o enfermedad. Esto demuestra una necesidad para un 'método para detectar la predisposición para o la presencia de placas o la 5 enfermedad en un sujeto intacto, viviente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención generalmente se refiere a una composición y método de detección de esta composición que conoce las lC fcnecesidades arriba descritas. La presente invención incluye un complejo aislado de una chaperona y proteína de ß-amiloideo. Preferentemente el complejo incluye la chaperona Q2 y ß-amiloideo. El complejo puede ser natural o producido por medio de métodos biotecnológicos y puede purificarse. 15 La presente invención también incluye un método para detección de niveles Q2. El método puede incluir un inmunoanálisis, un método de detección química, un método de detección física, o lo similar, i Preferentemente, el método emplea un inmunoanálisis. El método para detectar los niveles Q2 puede emplearse como un reactivo en un 0 laboratorio científico o biológico, así como un método para determinar la predisposición de un sistema biológico para formar las placas de ß- amiloideo o para determinar la presencia o la probabilidad de la enfermedad de Alzheimer o los síntomas asociados con la enfermedad de Alzheimer.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra los pesos de rata como una función de edad. La Figura 2 ilustra los pesos del hígado de rato como una 5 función de edad. La Figura 3 ilustra la cantidad de la proteína microsomal por gramo del hígado como una función de edad. La Figura 4 ilustra una proporción de supervivencia de ratas como una función de edad. lC La Figura 5 ¡lustra una proporción de mortalidad de ratas como una función de edad. La Figura 6 ilustra los niveles Q5 microsomales de la rata hepática, como una función de edad. La Figura 7 ilustra los niveles Q5 de respuesta al stress de 15 rata como una función de edad. La Figura 8 ilustra los niveles Q2 de la rata hepática como una función de edad. fc La Figura 9 ilustra los niveles Q2 de respuesta al stress de rata como una función de edad. 0 La Figura 10 ilustra los niveles de los niveles Erp72 microsomales de la rata hepática, como una función de edad. La Figura 1 1 ilustra los niveles BiP de la rata hepática como una función de edad. La Figura 12 ilustra los niveles de calvenexina microsomales 5 de la rata hepática, como una función de edad.

La Figura 1 3 ilustra los niveles de calreticulina microsomales de la rata hepática, como una función de edad. La Figura 14A ilustra una inmunomancha de muestras ^^iológicas con anticuerpos policlonales a Q2. 5 La Figura 1 B ilustra una inmunomancha de muestras biológicas con anticuerpos monoclonales a ß-amiloideo 1 -42. La Figura 15A ilustra otra inmunomancha de muestras biológicas con anticuerpos policlonales a Q2. La Figura 15B ilustra otra inmunomancha de muestras lO biológicas con anticuerpos policlonales a ß-amiloideo 1 -42. La Figura 16 ilustra las concentraciones del fluido cerebroespinal de Q2 comparadas a las referencias de placa senil medidas de los participantes en el estudio de la paloma de toca descrito en el Ejemplo 5. 15 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un complejo de una proteína de chaperona con ß-amiloideo, métodos para detectar niveles Q2, métodos para emplear tal detección en el diagnóstico de la enfermedad de 0 Alzheimer, y métodos de mejora de niveles de esta proteína de chaperona para tratar o prevenir la enfermedad de Alzheimer. En particular, la presente invención se dirige a un complejo aislado de ß-amiloideo y la chaperona Q2, métodos para detectar los niveles Q2 en, por ejemplo, las muestras de autopsia o clínicas, métodos para diagnosticar la enfermedad 5 de Alzheimer en base a la detección de una reducción en la concentración de Q2 en las muestras clínicas, tal como el fluido cerebroespinal, y los métodos de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer al estimular la producción de Q2 o al administrar Q2. ^Kinfermedad de Alzheimer y ß-amiloideo 5 La enfermedad de Alzheimer incluye la formación de placas de ß-amiloideo en los cerebros de los sujetos con la enfermedad. La forma de placas de ios agregados de ß-amiloideo, los cuales se forman de la proteína precursora de amiloideo y de la secreción en el espacio intracelular. El ß-amiloideo se agrega fácilmente en la solución en los lO sistemas de laboratorio y forma los agregados similares a las placas formadas en la enfermedad de Alzheimer. La proteína precursora de amiloideo, ß-amiloideo, y los diversos fragmentos de ß-amiloideo, se han caracterizado. Las características conocidas de la proteína precursora de amiloideo y de ß- 15 amiloideo incluyen los genes mamíferos que los codifican, los sistemas de expresión recombinantes (por ejemplo, vectores, plásmidos, y lo similar) para estas proteínas, los métodos de producción de estas proteínas, las ^secuencias y estructuras de proteína, y las proteasas que adhiere el precursor de amiloideo al ß-amiloideo. Ni la proteína precursora de 0 amiloideo, ß-amiloideo, ni cualquiera de los diversos fragmentos del ß- amiloideo se han observado previamente para interactuar con una proteína de chaperona. El ß-amiloideo puede elaborarse y/o aislarse en una variedad de formas. La forma de ß-amiloideo que más prevalece en los tejidos de 5 mamíferos, es el ß-amiloideo 1 -42, en donde la numeración representa el número de aminoácidos que comienzan en el término de amino de ß- amiloideo completo, que tiene de 38-48 aminoácidos dependiendo de las especies. La segunda forma de ß-amiloideo que más prevalece en los tejidos de mamíferos, es el ß-amiloideo 1 -38. 5 Los ß-amiloideos se han producido por medio de métodos químicos y/o biotecnológicos, caracterizados, y mostrados de que tienen varias de las propiedades del ß-amiloideo completo. El ß-amiloideo según se utiliza en la presente, se refiere a todas de las diversas formas de ß- amiloideo, incluyendo las formas de varias longitudes no glicosiladas, lOWglicosiladas, y lo similar. Chaperonas Las chaperonas (también conocidas como proteínas de chaperona, y que incluyen chaperoninas y ciertas proteínas de cepa de calor) catalizan el pliegue, la formación de estructura terciaria, la 15 formación de estructura cuaternaria, y/u otro procesamiento para elaborar una proteína activa. Según se describe en la presente, diversas chaperonas pueden descender en nivel con la edad y pueden ^ correlacionarse con las enfermedades y desórdenes relacionados a la edad. En particular, los niveles de tejido de una o más de las chaperonas 0 BiP, calreticulina, calnexina, Erp72, Q2 y Q5 pueden reducirse con la edad de un mamífero, tal como un roedor o un humano, y pueden correlacionarse con una enfermedad. Las chaperonas incluyen una familia conocida como un tiol: oxidoreductasa de disulfuro de proteína (TPDO). Un TPDO representa una chaperona preferida de la presente invención. 5 Un TPDO preferido es TPDO-Q2. el TPDO-Q2 también se ha llamado ERp57 y GRp58. Según se utiliza en la presente, el Q2 se refiere a cualquiera de los nombres comunes para esta proteína, incluyendo TPDO- Q2, ERp57, y GRp58 y todos las formas variantes que ocurren ^naturalmente de esta proteína, incluyendo formas no glicosiladas y glicosiladas. Las chaperonas son, en general, proteínas caracterizadas y/o bien estudiadas. Las características bien caracterizadas de numerosas chaperonas incluyen los genes que las codifican en los organismos que varían de las bacterias a los humanos, sistemas de expresión ?-ecombinantes (por ejemplo, vectores, plásmidos, y lo similar) para estas proteínas, los métodos de producción de estas proteínas, las secuencias y estructuras de proteínas, ciertos sustratos de proteína, y ciertas funciones biológicas. No se ha observado previamente que las chaperonas reducen con la edad de un mamífero, si se han implicado en la enfermedad de Alzheimer o la formación de placas de ß-amiloideo. Un descenso en la síntesis de chaperona se dará como resultado de un descenso en la trascripción de la chaperona. Para i determinar si la cantidad de chaperonas se reduce con la edad en los tejidos y/o fluidos relevantes a la enfermedad de Alzheimer y/o a la placa de formación de ß-amiloideo, la concentración de los mARNs específicos para diversas chaperonas pueden estudiarse por los métodos conocidos, por ejemplo, técnicas de hibridación estándares. Un Complejo de Chaperona Q2 y de ß-amiloideo A pesar de que otras chaperonas pueden presentarse en el fluido cerebroespinal, solamente se ha identificado el Q2 en el fluido cerebroespinal. Los niveles Q2 pueden reducirse en relación a los niveles Q2 normales en el tejido mamífero con la edad. "El término niveles Q2 normales" según se utiliza en la presente, incluye la concentración media "del Q2 que puede encontrarse típicamente en el fluido cerebroespinal 5 desde una población de control. Las poblaciones de control adecuadas incluyen, por ejemplo, gente joven, gente de edad avanzada sin la enfermedad de Alzheimer, y lo similar. Un nivel de Q2 normal puede ser de 27 + 2 ng/ml. El Q2 puede formar un complejo con ß-amiloideo. Este lflÉfc complejo puede aislarse del fluido cerebroespinal y crearse en el laboratorio. Se cree que el Q2 y el ß-amiioideo forman un complejo fuertemente de enlace. Por ejemplo, las inmunomanchas evidencian una disociación muy pequeña del complejo. Se cree que el complejo de Q2 y ß-amiloideo son un intermedio en el procesamiento normal del precursor de 15 amiloideo en los sujetos que sufren de la enfermedad de Alzheimer. Un descenso en el nivel de Q2 relativo a los niveles Q2 normales en un animal de edad avanzada puede conducir a las cantidades reducidas del complejo y las cantidades aumentadas de ß-amiloideo libre. Las cantidades aumentadas del ß-amiloideo pueden dar la elevación a las deposiciones 0 aumentadas de las placas de amiloideo asociadas con la enfermedad de Alzheimer. El complejo de Q2 y el ß-amiloideo pueden aislarse del fluido cerebroespinal, purificarse, y caracterizarse por medio de los métodos comunes de la química de proteína. Por ejemplo, el complejo puede 5 aislarse y/o purificarse por medio de la cromatografía por afinidad con un sistema que tiene la afinidad para una o ya sea de Q2 o de ß-amiloideo. El complejo puede así purificarse más por otras formas de cromatografía, tal como la separación en una columna de Sefacrilo y/o una columna de ^nonoQ. Siguiente al aislamiento y/o purificación, el complejo puede 5 caracterizarse al emplear los métodos estándares tales como el delineamiento de péptido, secuenciación, la reacción de PAS (ácido periódico-reacción ZIF), y la ionización de desorción por láser asistida de aglomerante-tiempo de vuelo de la espectrometría de masa (MALDI-TOF). El complejo de Q2 y el ß-amiloideo pueden glicosilarse en naturales. Bajo la mayoría de circunstancias fuera del complejo, ni el Q2 ni el ß-amiloideo parecen glicosilarse. Típicamente el complejo se glicosila, por ejemplo, N-glicosilada en residuos de asparagina con oligosacáridos de complejo. Detección de niveles Q2 15 El complejo de Q2 y el ß-amiloideo y los componentes desatados de Q2 y de ß-amiloideo pueden detectarse por los métodos conocidos para la detección de proteínas, azúcares, y/o proteínas glicosiladas. El complejo tiene un peso molecular de aproximadamente 62 kD en la electroforesis de gel moderadamente o suavemente 0 desnaturalizada y se reconoce por los anticuerpos para ya sea el Q2 o el ß-amiloideo. Los anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen su Q2 o su ß-amiloideo se conocen en la materia y pueden producirse por medio de los métodos estándares. Tales anticuerpos pueden marcarse o de otra forma emplearse en inmunoanálisis estándares. Los 5 inmunoanálisis estándares preferidos incluyen los análisis de ELIS, inmunomanchas, análisis de estructura interlaminar, quimioluminiscencia mejorada, y lo similar. Los métodos adicionales para detectar el complejo análisis de polarización de estándar por medio de la 5 cromatografía por afinidad y columna, la disociación proteolítica seguida por el análisis de degradación de Edman, MALDI-TOF, y el tiempo de vuelo de espectrometría de masa. Los métodos para detectar los niveles Q2 en las muestras biológicas pueden emplearse en un método para detectar, determinar, diagnosticar, seleccionarse para, o de otra forma evaluar la susceptibilidad de un sujeto o un paciente a la enfermedad de Alzheimer. El término "susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer'' según se utiliza en la presente, incluye la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer, de los síntomas de esta enfermedad, o los factores que 15 conducen a o asociados con esta enfermedad, de la probabilidad de desarrollar esta enfermedad en sujeto o paciente, y lo similar. Según se utilizan en la presente, los factores que conducen a o asociados con esta ^enfermedad incluyen la formación de placas de ß-amiloideo, desórdenes en el procesamiento de la proteína precursora de amiloideo, y lo similar. 0 Según se utiliza en la presente, las muestras biológicas incluyen el material biológico tal como un tejido, célula, o muestra de fluido de un animal o humano en necesidad de ser seleccionado para o sospechar de ser susceptible a o sufrir de, la deposición de placas de ß- amiloideo, los desórdenes en el procesamiento de la proteína precursora 5 de amiloideo, la enfermedad de Alzheimer, la probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer, y lo similar. Las muestras biológicas pueden también incluir las muestras de laboratorio de un animal, célula, o cultivo experimental a examinarse por su predisposición para formar los cigregados o las placas de ß-amiloideo o para procesar inadecuadamente 5 la proteína precursora de proteína. La muestra biológica que incluye, por ejemplo, tejidos o células, tales como hígado, trombocitos, suero, o piel, pueden recuperarse de un animal o paciente viviente por los métodos tales como la biopsia por punción, la venacupuntura, o el depilado de la piel. En un aspecto de la invención, la muestra biológica incluye el material lOfbiológico del sistema nervioso central de un humano o un animal. Una muestra biológica preferida incluye el material biológico del fluido cerebroespinal para evaluar la susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer en animales o pacientes vivientes. El fluido cerebroespinal puede recuperarse por la bifurcación espinal, durante los procedimientos 15 quirúrgicos, o por cualquiera de la variedad de métodos conocidos por aquellos de experiencia en la materia. Generalmente el descenso en los niveles Q2 relativos al Q2 normal se correlaciona a la susceptibilidad de la enfermedad de Alzheimer.

El nivel de Q2 o el nivel de Q2 incluye el nivel de Q2 libre en la muestra 0 biológica, el nivel del enlace Q2 en el complejo con ß-amiloideo, los niveles de Q2 libre más el Q2 de enlace, y preferentemente el Q2 total. Un descenso en el nivel de Q2 se correlaciona a una susceptibilidad aumentada a la enfermedad de Alzheimer. Una susceptibilidad aumentada, según se utiliza en la presente, se refiere a siendo más probable no otra 5 que la enfermedad de Alzheimer, al menos un síntoma de la enfermedad, al menos un factor que conduce a o se asocia con esta enfermedad, la probabilidad de desarrollar esta enfermedad, o lo similar se presenta en un paciente o un sujeto. Por ejemplo, en una modalidad un descenso en el ^^livel de Q2 de al menos 35% relativo al nivel de Q2 normal se correlaciona 5 con un 100% de probabilidad de desarrollar ia enfermedad de Alzheimer.

En otra modalidad, la agregación de ß-amiloideo en un animal o humano puede detectarse al determinar el nivel de Q2 en la muestra biológica. Un descenso en los niveles Q2 relativos a los niveles Q2 normales se correlaciona e indica una susceptibilidad aumentada con un aumento en la de ß-amiloideo. Al detectar la agregación de ß-amiloideo, la formación de placas de ß-amiloideo también se detecta. La susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer también puede determinarse al correlacionar el nivel de Q2 libre, el nivel de ß- amiloideo, y el nivel de Q2: ß-amiloideo en complejo. Un descenso 15 relevante en los niveles Q2 relativos a los niveles Q2 normales incluye un descenso de aproximadamente 35%, preferentemente aproximadamente 50%, más preferentemente aproximadamente 65%. Un descenso relevante • tal se colaciona a una sUsceptiblNdad aunada a .. enfermedad de Alzheimer, por ejemplo, a los factores que conducen a o asociados con la 20 enfermedad de Alzheimer, particularmente la formación de placa de ß- amiloideo, a la enfermedad de Alzheimer; a los síntomas asociados con la enfermedad de Alzheimer; al desarrollo de la enfermedad de Alzheimer; o lo similar. El descenso en los niveles Q2 relativos a los niveles Q2 5 normales pueden correlacionarse con los síntomas característicos de la enfermedad de Alzheimer al comparar los niveles Q2 con las medidas de función de neuropsiquiatría. Las medidas de función neuropsiquiatría pueden elaborarse al conducir, por ejemplo, una evaluación ' europsiquiatría, una historia completa, y un examen físico y evaluar esta información en base a los criterios definidos por, por ejemplo, DSMIII-R y NinCDS-ADRDA. En algunos casos, los individuos que tienen los niveles Q2 aproximadamente normales también pueden ser susceptibles a la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, los individuos que tienen niveles ^ Q2 normales pero un alelo apoE4 tienen una susceptibilidad aumentada a la enfermedad de Alzheimer. Puede haber otros factores de riesgo para la enfermedad de Alzheimer que den como resultado una susceptibilidad aumentada a la enfermedad de Alzheimer en la presencia de los niveles Q2 normales.

Niveles Q2 de mejora Los niveles Q2 pueden mejorarse al administrar un medicamento adecuado para aumentar la expresión Q2 o al administrar Q2. La administración de Q2 incluye administrar Q2 en una forma o precursor de esta proteína, en una manera que aumente los niveles Q2, por ejemplo, en el fluido cerebroespinal. Los niveles Q2 de mejora pueden aumentar la cantidad del complejo de Q2 con ß-amiloideo, aumentar el nivel del ß-amiloideo y/o la proteína precursora de amiloideo adecuadamente procesada, y/o reducir la cantidad de placa de ß-amiloideo en un sujeto, y lo similar.

El Q2 puede administrarse en un vehículo farmacéuticamente aceptable por medio de los métodos tales como la inyección, por una bomba intracerebroventricular, y lo similar. Alternativamente, el Q2 puede ' dministrarse como un gen precursor o un vector de Q2 codificador, que 5 puede ser objetivo para el sistema nervioso central y proporcionar la expresión y niveles aumentados de Q2. Los vectores que pueden codificar el Q2 y que expresarán la proteína y/o células cerebrales objetivo se conocen por aquellos de experiencia en la materia. Preferentemente, el Q2 o un medicamento adecuado para lO^ mejorar la expresión Q2 se administra en una cantidad eficaz para aumentar el nivel de Q2, por ejemplo, en el fluido cerebroespinal, para aumentar la cantidad del complejo de Q2 con ß-amiloideo, aumentar el nivel de ß-amiloideo y/o la proteína precursora de amiloideo adecuadamente procesada, y/o para reducir la cantidad de la placa de ß- 15 amiloideo en un sujeto, y lo similar. Además, tal administración puede afectar el curso o efecto de la enfermedad de Alzheimer. Una "cantidad eficaz" de Q2 o un medicamento adecuado para mejorar la expresión Q2 es OP una cantidad suficiente para prevenir, tratar, reducir, y/o mejorar los síntomas y/o las causas fundamentales de la enfermedad de Alzheimer 0 incluyendo el nivel de Q2, el nivel de ß-amiloideo y/o la proteína precursora de amiloideo adecuadamente procesada, y/o la cantidad de la placa de ß-amiloideo en un sujeto, y lo similar. En algunos casos, una "cantidad eficaz" es suficiente para eliminar los síntomas de la enfermedad y, quizás, vencer la enfermedad por sí misma. En el contexto de la 5 presente invención, los términos "tratar" y"terapia" y lo similar, se refieren a aliviar, disminuir el progreso, profilaxis, atenuación, o cura de la enfermedad existente. "Prevenir" según se utiliza en la presente, se refiere a diferir, suprimir, disminuir, inhibir, o de otra forma, detener, "reducir, o mejorar el principio de tales enfermedades o desórdenes del 5 cerebro. La presente invención puede entenderse mejor en relación a los siguientes ejemplos. Estos ejemplos se pretende que sean representativos de las modalidades específicas de la invención, y no se pretende que sean como limitantes al alcance de la invención.

"• EJEMPLOS Ejemplo 1 - Caracterización del Efecto del Envejecimiento en la Concentración de Chaperona en Microsomas Hepáticos de Animales Se determinó el efecto del envejecimiento en la concentración 15 de chaperona para demostrar un descenso en la concentración que puede unirse a los desórdenes relacionados a la edad tal como la deposición de placa o la enfermedad de Alzheimer.

Materiales y Métodos 0 Los animales utilizados en este estudio fueron, machos, libre de patógeno específico, ratas Sprague-Dawley adquiridas de 21 días de edad de los Laboratorios Harían (Madison, Wl). Para el resto de sus vivientes, se almacenaron en una facilidad de barrera de ambiente controlado, sin ventanas, "estado de la materia", con una temperatura 5 constante de 22°C + 2° y un ciclo de luz de 12 horas y 12 horas inactivo.

La humedad se mantuvo a 50% + 20%. Se almacenaron dos animales en cada jaula y los animales tuvieron acceso libre a comida y agua. Cada jaula que contiene los animales de prueba se equipó con una cubierta de ltro de aire. El diez por ciento de las jaulas no tenía filtros. Los animales en las jaulas sin filtros se mantuvieron como "centinelas" para determinar si había cualquier ruptura en las condiciones estériles. Estos animales se remplazaron rutinariamente con nuevos grupos de animales jóvenes. No mostraron un aumento en la mortalidad, indicando que la colonia esta libre de patógeno. Todos los animales se removieron de su jaula una vez a la semana cuando las jaulas se limpiaban y cada cuatro a seis semanas cuando los animales se pesaban. Estos procedimientos se realizaron bajo condiciones limpias. Cualquier persona que entrara al cuarto del animal portaba guantes estériles, togas, y máscaras. Los animales se alimentaron de una dieta en base a las recomendaciones de AIN76A con la excepción de que el carbohidrato se supliera como 40% de almidón y 25% de sucrosa (BioServe, Frenchtown, NJ). La composición de carbohidrato se cambió para acomodar una preferencia para la dieta que consiste de pildoras en lugar de un polvo y para reducir la incidencia de la obesidad que se asocia con las dietas de alta sucrosa. Se agregó citrato de potasio (6.5%) para prevenir la enfermedad vascular. Las condiciones de dieta encontraron los estándares nutritivos NRC para la rata adulta (NCR 1978). Los animales alcanzaron y mantuvieron un peso adulto de aproximadamente 600 g (Figura 1 ). Sin embargo, después de la edad de 750 días, sus pesos promedio descendieron a 475 g. Este descenso en el peso promedio de los animales que sobrevivieron al final del estudio fue el mismo que el peso promedio de la población total. El peso promedio del hígado de adulto fue de 17.5 g y permaneció ahí para sus vivientes adultos (Figura 2). El miligramo de la proteína microsomal por gramo del 5 hígado no mostró ningún cambio significativo con la edad (Figura 3). No existió mortalidad significativa hasta la edad de aproximadamente 500 días (Figura 4). Después de 500 días, la escala de mortalidad mostró un efecto Gompertz con un pliegue cada 96.1 días (Figura 5). Los humanos muestran un pliegue similar en mortalidad cada década. l fc Por los primeros 18 meses, se mataron seis animales en intervalos de seis semanas. Por el resto de 12 meses, se mataron los animales en intervalos de tres semanas. Las muestras de tejido se obtuvieron aproximadamente de uno-tres de los animales. El resto murió de causas naturales. 15 Los microsomas se prepararon por medio de la centrifugación diferencial de acuerdo a Srivastava ef al. , J. Biol. Chem.. 265: 8392-99 (1990). Las suspensiones microsomales se refrigeraron y mantuvieron a - A 70°C para la determinación de la concentración de chaperonas. Las siguientes chaperonas se examinaron: BiP, calreticulina, clanexina, 0 ERp72, Q2, y Q5. Las chaperonas se prepararon por los métodos conocidos en la materia. El contenido microsomal de chaperonas se determinó por la inmunomancha de acuerdo a Zhou ef al. , Arch. Biochem. Biophvs.. 322: 390-94 (1995); Zhou ef al. , (1996); y Chen ef al. , Biochemistrv. 25: 8299-8306 (1996). Una suspensión microsomal 5 agrupada se aumentó en cada gel y se utilizó como un estándar. El contenido de chaperona de los microsomas se reguló contra las chaperonas purificadas. Los inmunoanálisis se aumentaron en el rango lineal para las chaperonas individuales. Las chaperonas se prepararon por los métodos conocidos en la 5 materia. Srivastava ef al. , J. Biol. Chem.. 265: 8392-99 (1991 ); Chen ef al. , Biochemistrv. 25: 8299-8306 (1996). La inmunomancha se realizó de acuerdo al método de Towbin ef al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 76: 4350-4354 (1979). Ver también Srivastava ef al., J. Biol. Chem., 265: 8392-99 (1991 ); Zhou ef al. , Arch. lOABiochem. Biophvs.. 322: 390-394 (1995); Zhou ef al. , Chem. Res. Toxicol.. 9: 1 176-1 182 (1996); y Chen ef al., Biochemistrv. 25: 8299-8306 (1996). Las proteínas primero se separaron por SDS-PAGE. Laemmli, Nature. 227: 680-685 (1970). Las proteínas se transfirieron así a las membranas PVDF (Immobilon P, Millipore Corp), y las membranas reaccionaron con los 15 anticuerpos de anti-chaperona de pollo. Esto se siguió por un anticuerpo IgY de anti-pollo de cabra acoplado a la fosfatasa de alcalina. La mixtura indicadora utilizada es una combinación de nitroazul y fosfato 5-bromo-4- ^cloro-3-indolilo (BioRad, Richmond CA). La densidad de las bandas se determinó en un explorador de plataforma (UMAX, Taiwán, R.O.C.) y se 0 analizó utilizando NIH Image (versión 1 .61 ) en un PC de potencia (Computadora Apple). La concentración se determinó por la comparación a varias concentraciones correspondientes a la densidad promedio de los tres canales en cada gel que contiene una suspensión de microsomas de referencia. Los estándares de microsomas se regularon contra diversas 5 concentraciones de las proteínas purificadas. Las determinaciones de las chaperonas en los microsomas se encontraron todas dentro del rango lineal de los inmunoanálisis. Los anticuerpos policlonales a todas las chaperonas, excepto VF>ara BiP, se desarrollaron en gallinas de depósito según se describe por Damiani ef al. , J. Biol. Chem.. 263: 340-343 (1988) y Chen ef al. , Biochemistrv, 25: 8299-8306 (1996). La especificidad de estos anticuerpos se ha verificado en previos estudios. Srivastava ef al., J. Biol. Chem.. 265: 8392-99 (1991 ); Zhou ef al. , Arch. Biochem. Biophvs.. 322: 390-394 (1995); Zhou ef al. , Chem. Res. Toxicol.. 9: 1 176-1 182 (1996); y Chen ef A3/. , Biochemistrv. 25: 8299-8306 (1996). Los anticuerpos para BiP se obtuvieron de StressGen (Vancouver, BC, Canadá). Adicionalmente, los anticuerpos preparados para calreticulina también se utilizaron para investigarse para calnexina debido a que la porción lumenal de calnexina es altamente homologa a la calreticulina. Zhou ef al. , (1996); Chen ef al. (1996); Cala ef al. (1993).

Resultados ^ Estos estudios produjeron los resultados reportados en la Tabla 1 y en las Figuras 1 -13. En particular, la Figura 6 muestra un descenso en la concentración de Q5 a medida que una rata crece; la Figura 7 muestra un descenso en la concentración de Q5 para la capacidad de respuesta a la tensión a medida que una rata crece, la Figura 8 muestra un descenso en la concentración de Q2 a medida de que una rata crece; la Figura 9 muestra un descenso en la concentración de Q2 para la capacidad de respuesta a la tensión a medida que una rata crece; la Figura 10 muestra un descenso en la concentración de ERp72 a medida que una rata crece. La Figura 1 1 muestra un descenso en la concentración de BiP medida que una rata; la Figura 12 muestra un descenso en la concentración de calnexina a medida que una rata crece; y la Figura 13 no muestra ningún descenso en los niveles de calreticulina a medida que una rata crece. TABLA 1 : Efecto de la Edad y Tensión en las Concentraciones de las Diversas Chaperonas de ER Chaperona Concentraci Concentraci % (R2) de Muestran % de ón de valor ón de @ Descenso Respuest Descenso máximo 874 días Constitutivo a a la de Tensión µg/mg Prot µg/mg Prot Tensión __ __ 48.5 39 (0.9586) Sí 50 Calnexina 57.4 40.5 29 (0.9398) No — Calreticulina 7.6 4.8 8 No ~ ERp72 141 100 30 (0.8840) No ~ 32 15.4 8.2 32 (0.8414) Sí 71 Q5 34.8 13.1 51 (0.8989) Sí 73 Total 336.2 215.1 Discusión El efecto de envejecimiento en el contenido microsomal de las seis chaperonas mostraron patrones marcadamente diferentes (Figs. 6-13; Tabla 1 ). Los patrones más inusuales se observaron con Q5 (Fig. 6, Tabla 1 ), Q2 (Fig. 8; Tabla 1 ), y BiP (apéndice Fig. 1 1 ; Tabla 1 ). Los niveles constitutivos de Q5 fueron más elevados en los animales más jóvenes y amostraron un 51 % de descenso a medida que los animales alcanzaban 5 madurez (Línea de puntos, Fig. 6). Este patrón se pronosticaría por un constituyente que es crítico para el crecimiento y la proliferación. Mientras alcanzan la madurez, los hepatocitos entran en una fase Go, estas células tienen demanda muy baja para los componentes de membrana nuevos. De aquí en adelante, se esperaría, según se observa, que una chaperona lO?jncluida en la síntesis de membrana mostraría descensos significativos. Después de la edad de 200 días, el contenido Q5 mostró un descenso más lento, pero constante. El Q5 también mostró una variación estacional marcada, teniendo valores máximos que coinciden con el solsticio de invierno y el solsticio de verano. (Fig. 6). Esto se ilustra más claramente 15 cuando los niveles constitutivos se substraen y el resto se remarcaron (Fig. 7). El ritmo coincide con las estaciones más estresantes del año. ^feDe esta manera, la variación cíclica indica la "capacidad de respuesta a la tensión" de la chaperona respectiva. Esta tensión resulto de los cambios 0 de humedad, que varían entre 30 y 70% durante el año. El valor máximo inicial en el primer invierno se mitigo marcadamente en comparación al siguiente verano, resultando de los niveles constitutivos muy elevados observados hasta la edad de 200 días (Fig. 6). De aquí en adelante, las células desde entonces estuvieron produciendo casi las cantidades 5 máximas de la chaperona respectiva. Los niveles constitutivos descendieron en edades posteriores, pero los animales todavía mostraron una respuesta a la tensión marcada (Fig. 7). Según se ha sugerido por otros estudios, la respuesta a la tensión se redujo con la edad, mostrando ^un 73% de descenso por 874 días. 5 El Q2 mostró un patrón similar al Q5, excepto para los niveles constitutivos. El contenido de Q2 mostró niveles constitutivos de aumento a medida que los animales alcanzaban la madurez y mostraron así un 32% de descenso entre las edades de 84 días y 874 días. (Fig. 8). Los niveles también mostraron una respuesta a la tensión. Cuando los niveles lOAconstitutivos se substraen hacia fuera, los niveles tienen un ritmo semianual circular. Estos valores máximos también corresponden al solsticio de invierno y el solsticio de invierno. (Fig. 9). Esta respuesta a la tensión mostró un 71% de descenso con la edad. El cambio en la proporción de los niveles constitutivos de Q2 a 15 Q5 que corresponden a la edad es importante. El Q5 cataliza la configuración * de las proteínas desnaturalizadas y crecientes en su estructura terciaria nativa y la formación de enlaces de disulfuro.

^Adicionalmente, a pesar de que no es una transferasa, el Q5 también se requiere para la N-glicosilación de la membrana y las proteínas secretoras. 0 Los estudios recientes indicaron que el Q2 se incluye en la inserción de las proteínas N-glicosiladas en la membrana. La demanda del valor máximo para la inserción de las proteínas N-glicosiladas en la membrana es en una edad temprana cuando los animales se desarrollan rápidamente. Después de que el hígado alcanza su peso maduro, la célula tendría 5 menos necesidad bajo las condiciones ambientales constantes para los niveles elevados de proteínas que ayudan con la inserción debido a que las células no duran más desarrollándose o proliferándose. De esta manera, el Q2 no es la chaperona principal en el hepatocito, al menos en ^ros animales jóvenes. 5 A diferencia del Q2 y el Q5, el ERp72 no mostró ninguna variación estacional. Sin embargo, al igual que el Q5, los animales jóvenes tuvieron las concentraciones más elevadas y mostraron un 30% de descenso con la edad. (Fig. 10; Tabla 1 ). A pesar de que la función exacta del ERp72 no se ha definido claramente, se sabe que es una lOAphaperona y es una de las proteínas más altamente conservadas en el reino animal. Según se dice, el ERp72 es idéntico al nematodo, Caenorhabditis elegans. Cualquier proteína altamente conservada tal probablemente sirve un papel crítico en el metabolismo celular. Presuntamente, esto se relaciona a su actividad de chaperona. 15 El BiP es un miembro de la familia HSP 70 considerado que sirve principalmente como una célula apuradora de las proteínas inadecuadamente editadas. El BiP mostró un patrón similar al Q2 y al Q5 ^fc(Fig. 1 1 ), teniendo un 37% de descenso con la edad y alguna variación estacional. 0 A diferencia de todas las chaperonas arriba descritas, la calreticulina (una chaperona crítica para la función celular) no mostró ningún descenso significativo con la edad. (Fig. 12). Todavía su homólogo de enlace de membrana, la calnexina, mostró una descenso marcado pero ninguna variación estacional (Fig. 13). Aún más, igual que 5 el Q2, la calnexina tuvo bajas concentraciones en animales jóvenes, alcanzó un valor máximo en los 84 días, y descendió así un 32% por la edad de 874 días. El papel de esta chaperona en la síntesis de proteína se ha estudiado ampliamente y es crítico a la síntesis tanto de la ^membrana como las proteínas secretoras. 5 Conclusión Ya que los datos de arriba se reportan por miligramo de proteína microsomal, queda claro que todos ellos, con la excepción de la calreticulina, mostraron descensos estadísticamente marcados, en el lO^iontenido específico con la edad (30-50%) (R2 = 0.9586 a 0.8414). (Es decir, estas proteínas descendieron fuera de ia proporción a las otras proteínas en el ER hepático). Aún más, este descenso ocurrió en un órgano, el hígado, cuya función se piensa que es permanecer relativamente bien conservado con la edad. A diferencia del CNS, el 15 sistema inmune, los órganos endocrinos, o los riñones, el hígado ni pierde peso ni deja abiertamente de funcionar. Por ejemplo, los niveles de suero de la proteína secretora principal producida por el hígado, la albúmina, no ^fcdesciende con la edad, a pesar de una pérdida clara de la capacidad sintética de proteína. 0 Ejemplo 2 - Identificación de una Chaperona en el Fluido Cerebroespinal Humano Las chaperonas forman complejos solubles con una amplia variedad de proteínas secretoras. Ya que el estudio animal de las 5 chaperonas en los microsomas hepáticos mostraron un descenso en el nivel de algunas chaperonas a medida que los animales envejecieron, es importante determinar si cualquiera de estas chaperonas se asocian con el fluido cerebroespinal humano y si juegan un papel en la enfermedad de "izheimer.

Materiales y Métodos Las muestras del fluido cerebroespinal fueron pérdida clínica proporcionado por el Servicio de Anestesia del VAMC y el Servicio de Laboratorio, Regions Medical Center, St. Paul, el MN de los pacientes ?paludables, normales quienes se sometieron a una bifurcación espinal para la anestesia espinal o para probarse para la meningitis. Los pacientes de quienes se tomaron las muestras del fluido cerebroespinal incluyeron 3 infantes, 1 adulto joven, y 4 pacientes de edad avanzada. El fluido cerebroespinal se examinó para la presencia de seis chaperonas; ERp72, calnexina, calreticulina, BiP, Q2, y tiol: oxidoreductasa de disulfuro de proteína de la forma de Q5 (Q5). El ERp72, la clareticulina, la calnexina, el Q2 y el Q5 se prepararon por los ^métodos conocidos en la materia. Srivastava ef al. , J. Biol. Chem. , 265: 8392-99 (1991 ); Chen ef al. , Biochemistrv. 25: 8299-8306 (1996). El contenido de chaperona se determinó al inmunomanchar las preparaciones de acuerdo a ios métodos descritos en el Ejemplo 1. La concentración de la chaperona se determinó por la comparación de diversas concentraciones a la densidad promedio de los tres canales en cada gel que contiene una muestra de referencia del fluido cerebroespinal. Los estándares del fluido cerebroespinal se regularon contra diversas concentraciones del fluido cerebroespinal estándar. Las determinaciones de las proteínas en el fluido cerebroespinal se encontraron todas dentro del rango lineal de los inmunoanálisis. Los anticuerpos policlonaies a rodas las chaperonas se desarrollaron o se obtuvieron de acuerdo a los 5 métodos del Ejemplo 1 . La inmunomancha también se incubó con los anticuerpos al ß- amiloideo 1 -42 (AMY-33; Zymed, South San Francisco, CA).

Resultados Solamente el Q2 se identificó en el fluido cerebroespinal humano. Los niveles de otras chaperonas, si se presentan, fueron indetectables. El Q2 mostró una banda difusa correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 62 kDa (Fig. 14A, vías 3-7 y 9-14). El fluido cerebroespinal humano se comparó a los microsomas hepáticos de 15 rata. Los microsomas de rata mostraron una banda aguda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 57 kDa (Fig. 14A, vía 2). De igual forma, el Q2 purificado mostró una banda aguda correspondiente a Aun peso molecular de 57 kDa (Fig. 14A, vía 8). La identidad de Q2 se confirmó con los anticuerpos monoclonales de conejos a Q2 (GRP58, 0 StressGen, Vancouver, B.C.) (no mostrado). Los anticuerpos al ß-amiloideo 1 -42 reaccionaron con los microsomas hepáticos de rata (Fig. 14B, vía 2), pero no reaccionaron con el Q2 purificado (Fig. 14B, vía 8). 5 Discusión Debido a que la reacción de los anticuerpos de ß-amiloideo 1 - 42 con los microsomas hepáticos de rata, y la reacción de anticuerpos a WKi2 con los microsomas hepáticos de rata, mostraron bandas similares en los pesos moleculares que corresponden a aproximadamente 57 kDa, se sugiere que el ß-amiloideo y Q2 formen un complejo en el hígado. Aún más, debido a que los anticuerpos de ß-amiloideo 1 -42 no reaccionaron con el Q2 purificado, los resultados no resultan de la reactividad cruzada. A pesar de que la inmunomancha incubada con los anticuerpos le Q2 y la inmunomancha incubada con los anticuerpos de ß-amiloideo 1 - 42 mostraron diferentes patrones, los patrones todavía fueron similares.

Esto sugeriría que las dos se encuentran presentes en el fluido cerebroespinal como un complejo estrecho.

Conclusión La chaperona Q2 se presenta en el fluido cerebroespinal humano.

Ejemplo 3 - Aislamiento de un Complejo de Q2 con el ß-amiloideo del Fluido Cerebroespinal Humano Se descubrió y se aisló un complejo de Q2 y ß-amiloideo del fluido cerebroespinal humano, conduciendo a un mejor entendimiento del papel del Q2 en el fluido cerebroespinal y la enfermedad de Alzheimer.

Materiales y Métodos Se preparó una inmunomancha de acuerdo al Ejemplo 1 para examinar la banda 62 kD observada en el fluido cerebroespinal humano.

WtLa inmunomancha se incubó con un anticuerpo policlonal a Q2 y una 5 segunda inmunomancha se incubó con anticuerpos monoclonales a ß- amiloideo 1 -42 (AMY-33 de Zymed, South San Francisco, CA). Se identificó otra vez una banda difusa en 62 kDa para el fluido cerebroespinal. La banda para la forma monomérica del ß-amiloideo 1 -42 correspondió a un peso molecular de 5.5 kDa. l?tf) Q2: se aisló el complejo de ß-amiloideo por medio de la cromatografía por afinidad utilizando anticuerpo de pollo-anti-ß-amiloideo.

Alternativamente, el aislamiento por medio de la cromatografía por afinidad se acompañó con anti-Q2. El complejo se identificó al inmunomancharse según como se describe en el Ejemplo 1. El complejo además se purificó 15 por medio de cromatografía en una columna de Sefacrilo seguida por una columna monoQ. Los anticuerpos policlonales a una muestra purificada de Q2 Ise desarrollaron en gallinas de depósito según se describe en el Ejemplo 1 . Los anticuerpos de ß-amiloideo 1 -42 se prepararon en los pollos por el 0 mismo método. Las muestras del fluido cerebroespinal se eluyeron de la cromatografía por afinidad con el pollo-anti-ß-amiloideo y, alternativamente, de la cromatografía por afinidad con anti-Q2, se examinaron por la inmunomancha. Los anticuerpos de pollo a Q2 y ß- 5 amiloideo se enlazaron a Sefarosa activada de CNBr. La muestra del fluido cerebroespinal se colocó en la columna en NaCI (1 M). La columna se lavó y la proteína se eluyó con glicina (.1 M, pH 9.0) en NaCl. Las inmunomanchas se realizaron después del SDS-PAGE y Pransmanchar en las membranas de PVDF. Srivastava ef al. , J. Biol. Chem. , 5 265: 8392-99 (1991 ); Chen ef al. , Biochemistrv. 25: 8299-8306 (1996); Towbin ef al. , Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 76: 4350-54 (1979). Las muestras se calentaron a 55°C por 5 minutos en la presencia de mercaptoetanol. Si se calentaron a 90°C, no se observaron ni las bandas ni el complejo agregado. Las bandas reaccionaron con el anticuerpo de anti-lO^unmunoglobulina de cabra adecuado acoplado a la fosfatasa de alcalina. La mixtura indicadora utilizada fue una combinación de tetrazolio de nitroazul y fosfato 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BioRad, Richmond CA). La densidad de la banda se cuantificó por medio de un explorador de plataforma (NIH Image Versión 1 .60). 15 Resultados Las manchas incubadas con los anticuerpos a Q2 mostraron Alas bandas difusas correspondientes a un peso molecular de aproximadamente 62 kDa (Fig. 15A, vías 3 y 4). Las bandas similares 0 también se detectaron cuando las manchas se incubaron con los anticuerpos a ß-amiloideo 1 -42 (Fig. 15B, vías 3 y 4). Adicionalmente, el anti-ß-amiloideo 1 -42 mostró que no es reactivo a Q2. Las manchas incubadas con los anticuerpos a ß-amiloideo 1 -42 también revelaron una banda correspondiente a un peso molecular de 5 aproximadamente 62 kDa. Pero el ß-amiloideo tiene un molecular de aproximadamente 5.5 kDa. Además de la banda 62 kDa identificada en las inmunomanchas, se identificó una banda 27 kDa cuando se incubó con anti-ß-amiloideo 1 -42 (Fig. 15B, vía 3). Esta banda 27 kDa también se ^Rbservó cuando el ß-amiloideo 1 -42 sintético se almacenó a -20° por varias semanas y después se aumentó en una gel y, por lo tanto, se represento como pentámero de ß-amiloideo 1 -42. El anticuerpo de ß-amiloideo monoclonal (AMY-33) es altamente específico para el ß-amiloideo y se conoce para unir solamente para unirse al fibrinógeno fuera del ß-amiloideo. Stern ef al. , FEBS Let., 43-47 (1990). Pero las bandas de peso molecular observadas en este estudio fueron diferentes de aquellas observadas con el fibrinógeno. Aún más, los anticuerpos de anti-fibrinógeno no reaccionaron con cualquier proteína en el fluido cerebroespinal. La exploración de las manchas indicaron que el 95% del ß- amiloideo inmunoreactivo se asoció con la banda 62 kDa, mientras que el 5% se asoció con las bandas de peso molecular inferior. Esto corresponde a una afinidad de unión elevada. ^ Estos resultados se confirmaron en 100 muestras de fluido cerebroespinal adicionales. El mismo patrón de las bandas inmunoreactivas a Q2 y ß-amiloideo se observaron para todas las 100 muestras.

Discusión La mayoría de los grupos que han examinado el efecto de la enfermedad de Alzheimer en las concentraciones de fluido cerebroespinal de ß-amiloideo, han utilizado una variedad de ELISAs o análisis similares, pero cinco han realizado estudios de inmunomancha y cada uno observó resultados marcadamente diferentes. Un estudio observó solamente bajas ß andas inmunoreactivas de Mr. Ida et al. , J. Biol. Chem. , 271 : 22908- 5 22914 (1996). Todavía el presente estudio mostró que el 95% del ß- amiloideo 1 -42 inmunoreactivo correspondió a un peso molecular de 62 kDa y solamente un 5% con el peso molecular inferior. Los otros grupos aparentemente utilizaron condiciones de desnaturalización más elevadas en la preparación de sus muestras, más que aquellas utilizadas en este lO^fcestudio, presuntamente disociando el complejo. En el presente estudio el complejo no se disoció. Otros estudios pueden haber observado diferentes bandas de inmunoreactivo debido a que los anticuerpos pueden haber diferido en la especificidad de aquellas utilizadas aquí. Seubert et al. , Nature. 361 : 260-15 63 (1993); Globek ef al. , Neurosci. Let.. 191 : 79-82 (1995). En un estudio de la interacción del ß-amiloideo con las lipoproteínas de alta densidad, se observó una banda de inmunoreactivo a 62 kDa (Koudinov ef al. , Biochem. Biophvs. Res. Común.. 223: 592-97 (1996); Ghiso ef al. , Biochem. J.. 293: 27-30 (1993)), pero el ß-amiloideo 0 soluble de la fracción que produjo un 62 kDa no se recuperó y la fracción que produjo la banda 62 kDa no se identificó o se caracterizó. La banda correspondiente a un peso molecular de 62 kDa sería indicativa de un complejo entre el ß-amiloideo 1 -42 y el Q2. Debido a que esta banda fue difusa, se sugiere que el complejo entre el ß-amiloideo 1 -42 5 y el Q2 se glicolise.

Conclusión Se encontró un complejo de Q2 y ß-amiloideo 1 -42 en el fluido humano. Al unirse al ß-amiloideo 1 -42, el Q2 mantiene el 5 ß-amiloideo 1 -42 en la solución y ayuda a prevenir la agregación y precipitación del ß-amiloideo.

Ejemplo 4 - Caracterización de un Complejo de Q2 con ß-amiloideo 1 - 42 El complejo de Q2 y ß-amiloideo se caracterizó para entender mejor el papel de este complejo en la prevención de la formación de placas de ß-amiloideo y en la enfermedad de Alzheimer.

Materiales y Métodos 15 Se purificó un complejo de Q2 con ß-amiloideo según se describe en el Ejemplo 3. La presencia de las porciones de carbohidratos en el complejo, ^ se determinó por los métodos conocidos por aquellos de experiencia en la materia. En particular, el complejo se reaccionó con PAS. El complejo 0 reaccionado con PAS se eluyó a través de una columna de boronato.

Resultados Cuando el complejo se reacción con PAS, se identificó una banda correspondiente a un peso molecular de 62 kDA. Aún más, el 5 complejo reaccionado con PAS unido a una columna de boronato, que sugiere la presencia de una porción de carbohidrato.

Discusión Los resultados de la reacción del complejo con PAS son consistentes con la observación de la banda difusa correspondiente a un peso molecular de 62 kDa descrita en el Ejemplo 3. Estos resultados también son consistentes con otros estudios que han indicado que el Q2 tiene propiedades similares a la lectina y que el Q2 puede unirse a las proteínas solamente después de N-glicosilarse. Oliver ef al. , Science. 275: 86-88 (1997); Elliot ef al., J. Biol. Chem. , 272: 13849-13855 (1997). La N-glicosilación puede ser importante en el procesamiento posttranslación de varias proteínas que se sintetizan en el retículo endoplásmico. Suzuki ef al. , J. Bio. Chem.. 272: 10083-10086 (1998). La probabilidad de que el complejo se N-glicosile también se soporta por la observación de que el complejo fue relativamente estable bajo las condiciones de desnaturalización moderadamente severas que se utilizaron para solubilizar las muestras para los análisis de inmunomancha y SDS-Page.

Conclusión A pesar de que el Q2 y el ß-amiloideo no han mostrado que se glicosilan cuando no sea en complejo, estos resultados sugieren que el Q2: ß-amiloideo se glicosile como un complejo.

Ejemplo 5 - Detección de Placas de ß-amiloideo y la Correlación de la Presencia de Placa en Niveles Q2 y/o Genotipo apoE. A medida que los niveles de Q2 descienden a niveles de Q2 Riormales, una persona puede tener una susceptibilidad aumentada, por 5 ejemplo, a la agregación de ß-amiloideo, teniendo la enfermedad de Alzheimer, teniendo los síntomas asociados con la enfermedad de Alzheimer, o la probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer.

Se desea entender esta correlación. lO Métodos y Materiales Las muestras del fluido cerebroespinal y del cerebro se tomaron de especimenes de autopsia. Los especimenes se obtuvieron de 21 palomas de toca que participaron en un estudio en el cual su estado de salud y sus habilidades psicomotoras se evaluaron y se monitorearon 15 hasta sus muertes. Snowdon, JAMA. 277: 813-17 (1997). Las muestras del fluido cerebroespinal se congelaron al tiempo de colección y se almacenaron a -70°C. A Las muestras del fluido cerebroespinal se examinaron por la presencia de chaperonas según se describe en el Ejemplo 1 con algunas 0 modificaciones. Las inmunomanchas se realizaron después del SDS-PAGE y transmanchar en las membranas de PVDF. Laemmli, Nature. 227: 680-85 (1970); Towbin ef a/., Proc. Nati. Acad. Sci. USA.. 76: 4350-54 (1979). Las muestras se calentaron a 55°C por 5 minutos en la presencia de mercaptoetanol. Si se calentaron a 90°C, no se observaron ni las bandas ni 5 el complejo agregado. En un primer estudio, las bandas reaccionaron con el anticuerpo de anti-inmunoglobulina de cabra adecuado acoplado a la fosfatasa de alcalina. Los anticuerpos específicos para la molécula de interés fueron los anticuerpos policlonales a calmodulina, calnexina, BiP, ßtRp 2, Q2, Q5, y ß-amiloideo 1 -42 sintético. Los anticuerpos a BiP y Q2 se 5 adquirieron de StressGen (Vancouver, B.C.). Los anticuerpos a ß-amiloideo 1 -42 se adquirieron de Zymed (AMY-33; South San Francisco, CA). Todos los anticuerpos se prepararon en gallinas de depósito según se describe en el Ejemplo 1 . La mixtura indicadora utilizada fue una combinación de tetrazolio de nitroazul y fosfato 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (BioRad, lOfRichmond CA). En un segundo estudio, las muestras del fluido cerebroespinal se eluyeron de la cromatografía por afinidad con anti-Q2, alternativamente, anti-ß-amiloideo 1 -42, se examinaron por la inmunomancha. Los anticuerpos se enlazaron primero a Sefarosa activada de CNBr. La resina 15 se suspendió en NaCI (1 M), se mezcló con 1 ml de la muestra de CSF, se incubó durante la noche a 4°C, y se vertió así en una columna. La columna se lavó con NaCI hasta que el eluato no tuvo absorbencia en 280 nm. Las (proteínas de enlace se eluyeron con glicina (0.1 M, pH 9.0) en NaCl. El Q2 y el ß-amiloideo 1 -42 identificaron de acuerdo al procedimiento de 0 inmunomancha arriba descrito. En un tercer estudio, la concentración de Q2 se determinó de las inmunomanchas por medio de la quimioluminiscencia mejorada con una reacción de peroxidasa (RPN 2106; Amersham Life Science, Piscataway, NJ). Las intensidades de banda se cuantificaron por medio de la 5 exploración de plataforma de la película fotografía de quimioluminiscenica y se analizaron por NIH Image (Versión 1 .60). Las muestras del cerebro obtenidas de las palomas de toca se examinaron para determinar el número total de placas de ß-amiloideo, rncluyendo tanto los tipos neuríticos y difusos de la placa. Los números 5 totales de placa se determinaron de los cinco producciones microscópicas más severamente afectadas de las secciones Bielschoasky-coloreadas de los lóbulos parietales, temporales, frontales del neocórtex. Las muestras del cerebro obtenidas de las palomas de toca también se examinaron para determinar el genotipo apoE del sujeto. lO?Snowdon, JAMA, 277: 813-17 (1997).

Resultados El análisis de quimioluminiscencia fue lineal con las concentraciones de Q2 entre aproximadamente 5 y 45 ng/ml del fluido 15 cerebroespinal. La Figura 16 y la Tabla 2 muestran una correlación significativa entre la concentración del Q2 y el número total de placas (r = -0.52, p<0.02, A 95% Cl - 0.25 a -0.79 por medio de la prueba de correlación de rango Spearman). 0 Discusión Las muestras del fluido cerebroespinal de las palomas de toca mostraron tres distintos grupos. El primero tuvo un número abundante de placas y menos del 17 ng/ml del Q2 (6 de 21 ). El segundo grupo tuvo 5 niveles normales de Q2 y un número abundante de placas (8 de 21 ). El tercer grupo tuvo pocas o no placas y niveles normales de Q2. Pero el tercer grupo es el único grupo que mostró solamente alelos apoE3, o apoE2 (Tabla 2). TABLA 2: Concentraciones de Q2 del Fluido Cerebroespinal Ventricular, Resultados de la Placa Senil, Genotipo E de Apoliproteína y Envejecimiento de los Participantes Autopsiados en el Estudio de la Paloma de Toca.

Grupo CSF Q2 Resultados Genotipo Años de Edad ng/ml de Placa ApoE Senil Q2 bajo y 6.9 21 .1 3,3 79 Placa Senil 14.3 21 .3 3,3 94 Abundante 14.8 21 .3 4,4 81 I 15.5 21 .3 3,3 86 f 16.3 21.3 2,3 93 16.9 21 .3 3,3 84 Edad promedio 86.2 + 2.3 Q2 normal y 17.1 21.3 3,4 89 Placa Senil 17.8 21.3 3,4 83 Abundante 23.8 20.8 3,4 88 25.3 21 .3 4,4 85 26.7 20.8 3,3 91 29.0 21 .3 3,4 80 32.1 20.8 3,3 96 33.6 21.0 3,3 92 Edad promedio 88.0 + 1 .7 Q2 normal y 17.8 4.1 3,3 81 Poco o 21.0 1.9 3,3 83 No Senil 22.1 0.0 3,3 82 22.2 0.0 3,3 86 25.4 0.0 2,3 92 31 .6 0.0 2,3 97 31 .9 0.0 2,2 90 Edad promedio 87.3 + 2.1 Según se describe en el Ejemplo 3, aproximadamente un 5% de ß-amiloideo 1 -42 se encuentra libre en la solución en sujetos normales. Algunos estudios han mostrado el apoE4 forma más fácilmente complejos insolubles con ß-amiloideo que lo que otras isoformas de la apoliproteína hacen. Moir et al. , Biochemistrv, 38: 4595-4603 (1999). Los resultados mostrados en la Tabla 2 sugieren que los individuos que tienen un genotipo lpoE pueden formar placas en concentraciones más bajas de ß-amiloideo libre que lo que otros genotipos hacen. Los datos mostrados en la Figura 16 y la Tabla 2 muestran que una persona que no tiene genotipo apoE4 y tienen niveles de Q2 normales no tienen o tienen pocas placas. Todavía una persona con bajos niveles de Q2 ha aumentado la susceptibilidad a una cantidad abundante de placas, Ajrrespectivas del genotipo apoE4. Es decir, el 100% de la gente estudiada que mostró un descenso en los niveles Q2 relativos a normales tuvieron una cantidad abundante de placa. Una persona con niveles normales de Q2 pero con un alelo apoE4 también ha aumentado la susceptibilidad a una cantidad abundante de placas. Sin embargo, debería señalarse, que solamente la mitad de la gente que tiene niveles normales de Q2 y una cantidad abundante de placas tuvieron un alelo apoE . De esta manera, un tercer gen o proteína también puede incluirse en el desarrollo de la ^fcenfermedad de Alzheimer. Los especimenes de las palomas de toca se compararon también a los especimenes de 13 personas jóvenes (de 3 a 16 años de edad) y de 12 personas de edad avanzada sin la enfermedad de Alzheimer (de 66 a 82 años de edad). Los niveles Q2 de los sujetos jóvenes (27.3 + 1 .2 ng/ml) y los sujetos de edad avanzada (29.9 + 1 .6 ng/ml) fueron los mismos que los niveles Q2 observados en las palomas de toca que tuvieron pocas o no tuvieron placas seniles (24.6 + 1 .9 ng/ml).

Conclusión Este estudio demuestra una incidencia aumentada de ia ^ nfermedad de Alzheimer en los individuos con al menos un alelo apoE4 y 5 en los individuos con niveles Q2 menos de 17 ng/ml, independientes del genotipo apoE4.

Esta invención se ha descrito con relación a varias modalidades y técnicas preferidas y específicas. Sin embargo, se entendería que lO^pueden hacerse muchas variaciones y modificaciones mientras permanezcan dentro dei espíritu y alcance de la invención. Todas las publicaciones y solicitudes de patente en esta especificación son indicativas del nivel de experiencia ordinaria en la materia, a la cual pertenece esta invención. 15

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES 1 . Un complejo aislado que comprende un Q2 y ß-amiloideo. 2. El complejo aislado según la reivindicación 1 , laracterizado porque el ß-amiloideo comprende ß-amiloideo 1 -42 animal, ß-amiloideo 1 -38 animal, ß-amiloideo 1 -42 humano, o ß-amiloideo 1 -38 humano. 3. El complejo aislado según la reivindicación 1 , caracterizado porque el complejo se glicosila. 4. Un método de detección en una muestra biológica de un omplejo de Q2 y ß-amiloideo, que comprende: obtener una muestra biológica; y conducir un inmunoanálisis o un análisis de polarización de fluorescencia para reconocer un Q2, un ß-amiloideo, o el complejo de Q2 y ß-amiloideo. 5. El método según la reivindicación 4, que comprende conducir el inmunoanálisis con uno o más anticuerpos que reconocen el Q2, el ß-amiloideo, o el complejo de Q2 y ß-amiloideo. 6. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra biológica comprende material biológico humano o animal de un sistema nervioso central. 7. El método según la reivindicación 6, caracterizado porque la muestra biológica comprende fluido cerebroespinal animal o humano. 8. El método según la reivindicación 4, además comprende correlacionar un nivel del complejo a un nivel de la agregación de ß-amiloideo en la muestra biológica. 9. El método según la reivindicación 4, caracterizado porque la muestra biológica comprende material biológico humano del sistema nervioso central y el método además comprende correlacionar el nivel del ^ ;omplejo con una susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer. 5 10. El método según la reivindicación 9, caracterizado porque la muestra biológica comprende material biológico humano del sistema nervioso central y el método además comprende correlacionar el nivel del complejo con una probabilidad de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. 1 1 . El método según la reivindicación 4, caracterizado porque ^ la muestra biológica comprende material biológico humano del sistema nervioso central y el método además comprende correlacionar el nivel del complejo con el cambio conductual en un humano de quien se obtuvo la muestra biológica. 12. Un método de detección de la agregación de ß-amiloideo, 5 que comprende: obtener una muestra biológica; y determinar un nivel de Q2 en la muestra biológica. ^^ 13. El método según la reivindicación 12, además comprende correlacionar un descenso en el nivel de Q2 con un aumento en la 0 agregación de ß-amiloideo. 14. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque el Q2 es un componente de un complejo que comprende un Q2 y un ß-amiloideo. 15. El método según la reivindicación 14, además comprende correlacionar un descenso en un nivel de Q2 en un complejo que comprende Q2 y ß-amiloideo con un aumento en la agregación de ß-amiloideo. 16. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque el ß-amiloideo comprende ß-amiloideo 1 -41 animal, ß-amiloideo 1 -38 Inimal, ß-amiloideo 1 -42 humano, o ß-amiloideo 1 -38 humano. 17. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la muestra biológica comprende material biológico animal o humano del sistema nervioso central. 18. El método según la reivindicación 17, caracterizado porque la muestra biológica comprende fluido cerebroespinal animal o A umano. 19. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la detección de la agregación de ß-amiloideo comprende detectar la formación de una placa de ß-amiloideo. 20. El método según la reivindicación 12, caracterizado porque la detección de la agregación de ß-amiloideo comprende la exploración para una susceptibilidad aumentada a la enfermedad de Alzheimer. 21. El método según la reivindicación 12, además comprende la selección del genotipo apoE. 22. Un método de exploración para la enfermedad de Alzheimer, que comprende: obtener una muestra biológica humana; determinar un nivel de Q2; y correlacionar el nivel de Q2 a una susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer. 23. El método según la reivindicación 22, caracterizado porque la correlación del nivel de Q2 a la susceptibilidad a la enfermedad de Alzheimer comprende correlacionar un descenso en el nivel de Q2 con aumento en la agregación de ß-amiloideo. 5 24. El método según la reivindicación 22, caracterizado porque el Q2 es un componente de un complejo que comprende Q2 y ß- amiioideo. 25. El método según la reivindicación 24, además comprende determinar un nivel de un complejo que comprende Q2 y ß-amiloideo. lO^fc 26. El método según la reivindicación 24, caracterizado porque el ß-amiloideo en complejo es ß-amiloideo 1 -42 o ß-amiloideo 1 -38. 27. El método según la reivindicación 22, caracterizado porque la muestra biológica humana comprende material biológico del sistema nervioso central. 15 28. El método según la reivindicación 27, caracterizado porque la muestra biológica humana comprende material del fluido cerebroespinal. ^ 29. El método según la reivindicación 22, además comprende correlacionar el nivel de Q2 a un nivel de un complejo que comprende Q2 y 0 ß-amiloideo y un nivel de ß-amiloideo en el fluido cerebroespinal. 30. El método según la reivindicación 29, caracterizado porque el ß-amiloideo en complejo es ß-amiloideo 1 -42 humano o ß- amiloideo 1 -38 humano y el ß-amiloideo en el fluido cerebroespinal es ß- amiloideo 1 -42 humano o ß-amiloideo 1 -38 humano, respectivamente. 5 31 . El método según la reivindicación 22, además comprende la selección del genotipo apoE. 32. El método según la reivindicación 22, caractepzado porque la correlación comprende correlacionar el nivel de Q2 con una de desarrollar la enfermedad de Alzheimer. 33. Un método para tratar la enfermedad de Alzheimer que comprende administrar una cantidad eficaz de Q2 a un tejido relevante de un sujeto en necesidad del mismo. 34. El método según la reivindicación 33, caracterizado porque el tejido relevante es un cerebro. 35. El método según la reivindicación 33, caracterizado porque el tejido relevante es fluido cerebroespinal. 36. Un anticuerpo que reconoce un complejo que comprende un Q2 y un ß-amiloideo. 37. El método según la reivindicación 36, caracterizado porque el complejo comprende ß-amiloideo 1 -42 humano, ß-amiloideo 1 -38 humano, ß-amiloideo 1 -42 animal, o ß-amiloideo 1 -38 animal.