NO330614B1 - Elektrokjemisk system for bestemmelse av blodkoaguleringstid - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår et individuelt system for bestemmelse av helblod-koaguleringstid, en engangsføler med små dimensjoner omfattende en spesifikk trombinenzymreagens som tillater en elektrokjemisk bestemmelse, og et elektronisk måleapparat som tillater et elektrisk signal som mottas fra føleren, å korreleres når føleren er blitt innført i apparatet og en dråpe av blodet som skal analyseres, er blitt avsatt på denne.

Mer spesielt angår oppfinnelsen et måleapparat og en føler av denne type som tillater protrombintiden (PT) å bestemmes ved hjelp av amperometri når reagenssammensetningen som er avsatt på føleren, omfatter et kjemisk substrat av hvilket en terminalfraksjon selektivt kan avskjæres av trombinenzymet ved å frigjøre en ladet gruppe.

Kontroll av blodkoaguleringstiden, dvs. evnen til blodets bestanddeler til å danne en størknet klump for å hindre faren for blødning, utgjør en del av de rutineundersøkelser, eller også daglige undersøkelser, som utføres i tallrike, ervervede patologiske, traumatiske eller postoperative situasjoner. Det er for eksempel nødvendig under behandling med antikoagulanter når det dreier seg om hjertebeslektede syk-dommer, å kunne justere doseringen av medisinen nøyaktig, for eksempel warfarin eller heparin, for å unngå faren for blødninger i tilfelle av en overdose, eller omvendt, faren for trombose dersom mengden av tildelt antikoagulant er utilstrekkelig.

Forskjellige parametere er blitt bibeholdt for å utføre denne bestemmelse, men det mest vanlige er å måle protrombintiden (PT) etter aktivering, dvs. den tidsperiode etter hvilken dannelsen av en størknet klump observeres ved en blodprøve som er tatt fra en pasient. Slike analyser var i lang tid fullstendig avhengige av ekspertisen til spesialisert laboratoriepersonell som var utstyrt ved kompliserte og tungvinte apparater. Dette hadde den ulempe at det tvang pasienten til å reise, idet det krevde at preparering av en blodprøve som var tatt hjemme, for eksempel ved tilsetting av citrat, måtte vente til en laboratorieanalyse kunne utføres.

Fremskritt som er gjort med hensyn til miniatyrisering, særlig ved å benytte elektroniske komponenter, har i noe mer enn ti år eller deromkring, gjort det mulig for pasienten å ha forskjellige typer av kompakt utstyr, slik at han tillates å utføre en koaguleringstidsmåling hjemme. De fleste av disse individuelle utstyrsdeler stoler på de samme prinsipper som laboratorieapparater, nemlig direkte observasjon av erytrocytt-dynamikken i en blodprøve til hvilken de vanlige koaguleringsreagenser er blitt tilsatt, når den skifter fra flytende tilstand til en viskøs eller klumpet tilstand.

Ifølge et første prinsipp måles den tidsperiode etter hvilken en klargjort blodprøve ikke lenger strømmer gjennom kapillarrør, eller gjennom en kalibrert forsnevring av et rør med større diameter, understøttet av en enbruks-mottaksanordning som kan være montert til et måleapparat. Denne strøm er vanligvis tvungen ved hjelp av en pneumatisk pumpeinnretning som er integrert i måle apparatet, og den tidsperiode etter hvilken koagulasjon inntreffer, detekteres vanligvis ved hjelp av en optisk anordning. Innretninger av denne type er for eksempel vist i US-patentene 3 486 859, 3 890 098 og 5 302 348. Et apparat som er basert på dette prinsipp, er for eksempel det som er foreslått under varemerket "Hemochron", eller ifølge en nyere variant under varemerket "Protime Microcoagulation System" fra International Technidyne Corporation (NJ - USA). Måleapparatet omfatter åpenbart en kraftkilde for tilførsel av effekt både til den mekaniske del (pumpe) og koaguleringssluttkontrollen (optisk deteksjon). Man vil videre legge merke til at hver mottaksanordning for den blodprøve som skal analyseres, som er kasserbar etter den første anvendelse, er forholdsvis tungvint (omtrent 3x9 cm), og avhenger av en presisjonsteknologi (kalibrering av kapillarrøret eller forsnevringen), hvilket nødvendigvis bidrar til økning av prisen på hver analyse som skal utføres.

Ifølge et andre prinsipp måler man den tidsperiode etter hvilken en klargjort blodprøve som er avsatt i et engangskapell, tillater immobilisering ved koagulering av en magnetisk gjenstand som beveges ved hjelp av et roterende magnetfelt, idet deteksjonen av koaguleringsfenomenet igjen som oftest utføres ved hjelp av en optisk anordning. US-patent 3 967 934 viser allerede dette prinsipp, hvor den beholder som er ment å oppta prøven, inneholder en ferromagnetisk kule. En slik innretning benyttes for eksempel i det apparat som distribueres av Nycomed Pharma (Oslo, Norge) under varemerket "Thrombotrack". Ifølge en annen variant, som er beskrevet for eksempel i US-patent 5 154 082, er kulen erstattet av ferromagnetiske partikler som også utsettes for et elektromagnetisk felt. Dette har gjort det mulig for en reagens å fremstilles i tørr form, avsatt på et substrat, idet erytrocyttenes mobilitet fremdeles detekteres ved hjelp av en optisk anordning. En innretning av foregående type svarer for eksempel til en innretning fra Boehringer Mannheim (Tyskland) som selges under varemerket "Coaguchek". De foreslåtte produkter som svarer til dette andre prinsipp, har de samme ulemper som de som allerede er nevnt for innretningen ifølge det første prinsipp, kanskje med unntak av den lavere pris på blodprøve-opptaksanordningen for Coaguchek-apparatet.

Sammenliknende prøver som er utført med metodene og innretningene ifølge den forannevnte kjente teknikk ("Home Protrombin Estimation" av Angelida Bernado et al., Thrombosis, Embolism and Bleeding, ch. 3.5 - E.G. Butchart og E. Bodnar ICR Publishers 1992) har vist at den medisinske oppfølging av en pasient hjemme var minst like tilfredsstillende som for en pasient i et sykehusmiljø, men at pålitelige og reproduserbare resultater ikke kunne oppnås med mindre pasienten hadde hatt en rimelig treningsperiode. Apparatene ifølge den kjente teknikk tilveiebringes selvsagt for hjemmebruk, og kan lettvint flyttes, men forblir likevel forholdsvis altfor voluminøse til at en pasient skal være i stand til å oppbevare dem hjemme på sin egen person, for eksempel i en lomme, mens han beveger seg rundt. Det er uten tvil også ønskelig, for påliteligheten av målingene som avhenger av innretninger som er både er optiske og elektromekaniske, at det nevnte apparat beveges så lite som mulig.

Endelig skal det bemerkes at - ifølge det ene eller det andre av ovennevnte prinsipper - den elektriske kraftkilde som er nødvendig for tilførsel av effekt til de optiske og elektromekaniske innretninger, må være forholdsvis stor når den er uavhengig (batteri), men at den aldri er direkte involvert i koaguleringstidsmålingen.

Det kan imidlertid henvises til et US-patent nr. 3 674 014 fra 1972 som viser en sprøyte hvis innervegg omfatter en rekke elektroder som tillater variasjon i impedans av den analyt som skal måles, ved hjelp av et oscilloskop som er tilkoplet til sprøyten, i stigende grad etter hvert som koaguleringsfenomenet inntreffer. En slik innretning stoler fremdeles bare på variasjonene i analytens egenskaper under koagulering, og er åpenbart ikke beregnet for individuell bruk.

Den innretning som er vist i europeisk patent EP 0 679 193, som blant annet tillater protrombintiden å måles, omfatter to elektroder som bare er implisert i den nevnte bestemmelse for, ut fra et signal som representerer motstandsvariasjonen mellom elektrodene, å detektere tilstedeværelsen av en blodprøve på mottaks-anordningen, og har ingen direkte rolle ved måling av en tidsperiode. I denne innretning utføres tidsperiodemålingen ved hjelp av en fotometrisk bestemmelse av fluorescensen av mediet fra et oligopeptidisk substrat som har rhodamin som sin avgangsgruppe (leaving group) som er i stand til å frigjøres ved at den avskjæres av trombinenzymet. Et substrat av denne type er for eksempel vist i US-patent 4 557 862. En kolorimetrisk metode som benytter et noe forskjellig substrat som har p-nitroanilin som kromatofor eller fargelegeme, svarer for eksempel til det produkt som markedsføres av Ny corned Pharma under varemerket "NYCOTEST-CHROM".

Disse kolorimetriske metoder har den fordel at de ikke lenger stoler på mekaniske eller elektromekaniske anordninger, men på den annen side krever de et ytterligere sentrifugerings- eller ultrafiltreringstrinn gjennom en membran, slik som foreslått i europeisk patent EP 0 679 193, for å fjerne erytrocyttene for å utføre deteksjon på bare den plasmatiske del. Disse metoder har den ytterligere ulempe at de krever et måleapparat som har en optisk deteksjonsanordning med høy presisjon, og således et forholdsvis skrøpelig apparat som er vanskelig å transportere, og som krever en forholdsvis lang fargeutviklingstid, vanligvis lengre enn 5 minutter, før målingen kan utføres.

En metode med et enklere prinsipp, som stoler på en elektrokjemisk måling, er vist i US-patent 4 304 853. Denne metode består i at det i en målecelle som omfatter minst to elektroder, innføres en citrattilsatt blodprøve og et oligopeptidisk substrat som må holdes i et løsningsmedium, så som dimetysulfoksid (DMSO). Substratet er dannet av en kjede aminosyrer med arginin som slutt-aminosyre, forbundet med en elektroaktiv avgangsgruppe, og av hvilken et hydrogen av den innledende aminosyre kan erstattes av en beskyttelsesgruppe, idet disse aminosyrer, avgangsgrupper og beskyttelsesgrupper velges fra meget begrensede lister. På grunn av kompleksiteten av koaguleringsfenomenet som følge av en reaksjonskaskade, kan tilstedeværelsen av et løsningsmiddel forstyrre mellomproduktene, noe som fører til en frigjøring av trombin og således skader nøyaktigheten av målingen.

I en internasjonal PCT-søknad med tittelen "Oligopeptidderivative", som ble innlevert på samme dag av firmaet Pentapharm AG (Basel, Sveits), tillater en spesiell utvelgelse av substratets bestanddeler, særlig av aminosyrene og avgangsgruppen, utførelse av bestemmelse av koaguleringstiden for en blodprøve i et væskemedium, idet det benyttes en målecelle av samme type som tidligere benyttet, uten at det er nødvendig å tilsette en løsningsmiddel eller et samløsningsmiddel for å holde substratet i oppløsning. Selv om anvendelsen av disse nye substrater har en viss fordel, forsyner anvendelsen av en målecelle, med den håndtering som denne krever, fremdeles ikke en pasient, som gjerne vil kontrollere sin koaguleringstid selv, med et apparat som er lett å transportere og enkelt å benytte.

Kjent teknikk er også US-patentsøknadene 5 059 525 A og 4 304 853 A. Ifølge oppfinnelsen løses de ovennevnte problemer ved: en elektrokjemisk føler angitt i krav 1 og som har de karakteristiske trekk som angitt i den kjennetegnende del av kravet,

et elektronisk måleapparat angitt i krav 13 og som har de karakteristiske trekk som angitt i den kjennetegnende del av kravet, og

en amperometrisk metode angitt i krav 16, og som har de karakteristiske trekk som angitt i den kjennetegnende del av kravet.

Formålet med systemet ifølge oppfinnelsen er å overvinne de ulemper som fremdeles eksisterer i de tidligere kjente systemer, ved å tilveiebringe et apparat og følere med mye mindre størrelse som et resultat av anvendelsen av spesifikke reagenser og en forskjellig metodikk i forhold til den som tidligere ble benyttet for bestemmelse av en individuell koaguleringstid.

Oppfinnelsen angår således et elektrokjemisk system for måling av en verdi som representere koaguleringstiden til en dråpe av helblod, hvilket system er kjenne-tegnet ved at det omfatter

en elektrokjemisk føler i form av en strimmel med små dimensjoner som bærer i det minste en referanseelektrode og en arbeidselektrode på hvilken en spesifikk reagens er immobilisert, idet reagensens sammensetning omfatter minst ett kjemisk substrat av hvilket ett terminalledd kan avskjæres av trombinenzymet for å gi ladede grupper (LG), og

et måleapparat som er beregnet for å oppta føleren og hvis elektroniske krets, som tilføres effekt fra en kraftkilde, tillater en variabel eller ikke-variabel elektrisk strøm eller en variabel eller ikke-variabel spenningsforskjell å påtrykkes over følerens elektroder, det elektriske signal som er et resultat av vandringen av de ladede grupper, å

behandles, det nevnte signal å korreleres med en verdi som representerer koaguleringstiden, og den nevnte verdi å fremvises på et fremvisningspanel i måleapparatet.

Den spesifikke reagens som er immobilisert på arbeidselektroden, omfatter videre et tromboplastin og et buffermedium.

Det kjemiske substrat av hvilket ett terminal- eller sluttledd kan avskjæres av trombinenzymet for å frigjøre ladede grupper LG, må ha en stereospesifikk beliggenhet for trombinenzymet. Et passende kjemisk substrat er for eksempel dannet et oligopeptidisk derivat, og mer spesielt et oligopeptidisk derivat med arginin (arg) som sluttaminosyre forbundet med gruppe som er i stand til å avskjæres av trombin for å gi ladede grupper (LG). Ifølge en foretrukket utførelse er disse grupper som kan frigjøres av trombin, valgt fra aminoaryl- eller aminoheteroarylgruppene som kan substitueres, idet forbindelsen med arginin utføres av en av deres aminfunksjoner.

Oppfinnelsen skal i det følgende beskrives nærmere under henvisning til tegningene, der

fig. 1 viser et perspektivriss av et måleapparat og en føler for et system ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av blodkoaguleringstid,

fig. 2 viser et diagram av den prosess som fører til et elektrisk signal som kan utnyttes av måleapparatet,

fig. 3a til 3e viser signalvariasjonskurver som funksjon av PC/PS-forholdet, fig. 4 viser signalvariasjonskurver som funksjon av buffermediet,

fig. 5 viser signalvariasjonskurver som funksjon av tørkemodusen, og fig. 6 viser kurver som viser substratspesifisiteten.

Fig. 1 viser stort sett i målestokk 1:1 et måleapparat 10, og stort sett i målestokk 3:1 en elektrokjemisk føler 20 i form av en strimmel som er ca. 40 mm lang og 8 mm bred.

Den enhet som er dannet av apparatet og en pakke av flere følere, har således en størrelse som kan sammenliknes med størrelsen av hvilket som helst annet bærbart apparat, hvilket tillater en pasient å bære det på seg selv når han beveger seg rundt. Måleapparatet 10 og den elektrokjemiske føler 20 har sitt utspring i den samme teknologi som kan sammenliknes med den som benyttes for den kvantitative analyse av glukosenivåer, for eksempel ved hjelp en amperometrisk metode som vist i US-patentene 5 378 628 og 5 532 602 og europeisk patent EP 0 787 984.

Måleapparatet 10 som sådant omfatter en kappe 11 med eggliknende form i det viste eksempel, som er konstruert ved å sammenstille to støpte plastelementer lia og 11b av hvilket det øvre element lia omfatter et vindu for et fremvisningspanel 12, og en åpning for en betjeningsknapp 13 som gir tilgang til de forskjellige fremvisnings-modi.

Den elektroniske krets som er inkludert i kappen, er en tilpasning av de kretser som benyttes for glukoseanalyse, for eksempel ved hjelp av amperometri som angitt tidligere, og er bare forskjellig fra disse i de forskjellige elektriske signalparametere for å fremvise en koaguleringstid.

Måleapparatet 10 omfatter også en sliss 14 som er anordnet i hovedsaken mellom de to deler lia, 11b av kappen 11, og i hvilken et parti av føleren 20 omfattende en kontaktsone 28 innføres. Det andre parti av føleren 20 omfattende en målesone 29 som er beregnet for å oppta en blodprøve, vil forbli på utsiden av apparatet 10 under hele målingstiden. I de fleste av måleapparatene ifølge den kjente teknikk innføres prøven inne i apparatet inn i et innelukke som vanligvis er varmeregulert på 37° C, hvilket fører til ytterligere effektforbruk.

I systemet ifølge oppfinnelsen, i hvilket prøven ikke innføres i et varmeregulert innelukke, er det om nødvendig lett å tilveiebringe en varmesonde 15 på apparatet i nærheten av slissen 14 for å justere de elektriske signalparametere som funksjon av omgivelsestemperaturen med et mye lavere effektforbruk enn hva som er nødvendig for å varmeregulere et innelukke.

Den elektrokjemiske føler som er vist på fig. 1, er av den type som benyttes for bestemmelse av glukosenivåer ved hjelp av amperometri, slik som tidligere angitt. Den omfatter et tynt plastunderlag 21, fremstilt for eksempel av PET, som over hele sin lengde understøtter to strømsamlere 24,25 som er atskilt med et lite mellomrom 23 som isolerer dem elektrisk.

Underlaget 21 og strømsamlerne 24, 25 er belagt med et isolerende belegg 22 i hvilket det nær hver ende, for eksempel ved stansing, er utskåret to vinduer 28, 29 som tillater partier av strømsamlerne 24, 25 å fremkomme. Et første vindu 28 tillater føleren 20 å tilkoples elektrisk til måleapparatet 10, mens det andre vindu 29 utgjør målesonen, idet de synlige strømsamlerpartier danner henholdsvis arbeidselektroden 24a og referanseelektroden 25a.

Arbeidselektroden 24a er for eksempel dannet ved laminering av en tynn strimmel av platina, og referanseelektroden 25a ved laminering av en tynn strimmel av senere klorert sølv for på samme tid å danne en referanseelektrode. Det er også mulig å tilveiebringe hver for seg en arbeidselektrode, en referanseelektrode og en motelektrode i målesonen 29. Arbeidselektroden er belagt med en spesifikk reagens 30 som skal beskrives nærmere i det følgende, for å tillate protrombintiden (PT) å måles.

Den spesifikke reagens er immobilisert i tørr form fra en sammensetning som i det eksempel som er beskrevet her, omfatter minst ett tromboplastin, et buffermedium og et oligopeptidisk substrat som har en stereospesifikk konfigurasjon av en beliggenhet av trombinenzymet for å tillate avskjæring av et ladet sluttparti som er generelt betegnet som "avgangsgruppen" (LG = leaving group). I de eksperimenter som er beskrevet i det etterfølgende, er det benyttede substratkarakterisert vedat det oligopeptidiske derivat eller ett av dets salter i tillegg til arginin omfatter minst én annen radikal aminosyre som er utvalgt blant 2-aminosmørsyre (Abu), alanin (Ala), 3-sykhloheksylalanin (Cha), 2-sykhloheksylglysin (Chg), fenylalanin (Phe), pipkolisyre (Pip), prolin (Pro), valin (Val) og glysin (Gly), idet de nevnte aminosyrer er i stand til å være i L-, D- eller DL-form.

Disse oligopeptider og den måte på hvilken de oppnås, er nærmere beskrevet i den forannevnte patentsøknad til firmaet Pentapharm AG, i hvilken den store fordel ved disse oligopeptider for bestemmelse av en koaguleringstid er blitt fastslått ved eksperiment i et flytende medium ved hjelp av en laboratoriecelle. Det skal således spesielt bemerkes at den foreliggende oppfinnelse ikke angår de nevnte oligopeptider som sådanne, men betingelsene for optimering av sammensetninger som, når de avsettes i tørr form på en elektrokjemisk føler, tillater oppnåelse av et elektrisk signal som er tilstrekkelig til å behandles, som tillater god linearisering og hvis responstid er tilstrekkelig kort.

Likeledes blir avgangsgruppen (LG) som, under betingelsene for oppfinnelsen, både må reagere lettvint med syrefunksjonen til arginin (Arg), være i stand til å avskjæres av trombin og ha en tilstrekkelig ladning, fortrinnsvis utvalgt blant anilin-, quinolylamin- og naftylamin-derivater, eventuelt substituert av én eller flere substituenter som er utvalgt blant en halogen-, en hydroksy-, amin-, nitro-, alkyl-, alkoksy-, alanoyl-, anilin- og aminofenyl-radikal, som kan substitueres.

Eksperimenter har vist at et gitt substrat kan tillate et elektrisk signal å detekteres i et flytende medium, mens det er inoperativt eller uvirksomt når det samme substrat benyttes i tørr form avsatt på arbeidselektroden av en elektrokjemisk føler. En av de faktorer som kan forklare denne forskjell, er det faktum at oligopeptidet må være i immobilisert på arbeidselektroden via den motsatte ende av sin kjede i forhold til den som omfatter den avgående gruppe eller avgangsgruppen LG. Dette resultat kan oppnås ved hjelp av den første aminosyre av den oligopeptiske kjede, men fortrinnsvis erstattes et hydrogen av dens slutt-aminofunksjon med en beskyttelsesgruppe R som er valgt blant Boe (terbutoksykarbonyl)-, Tos (paratoluenesulfon)-, t-Bups (terbutylfenyl-sulfonyl)-, Mes (metylsulfonyl)-, Naps (2-naftylsulfonyl)-, Bzo (benzoyl)-, Z (benzoyloksykarbonyl)-, isopropylsulfonyl-, kamfosulfonyl-syrer.

Ifølge en foretrukket utførelse utvelges beskyttelsesgruppen, a-aminosyrene og deres kjedeformasjon, så vel som avgangsgruppen, slik at man har følgende oligopeptidiske substrater:

- Z-Gly-Pro-Arg-3-klor-4-hydroksyanilid

- Tos-Gly-Pro-Arg-3 -klor-4-hydroksyanilid

- Boc-(D)-Chg-Gly-Arg-3-klor-4-hydroksyanilid

- H-(D)-Chg-Gly-Arg-3 -klor-4-hydroksyanilid

- Z-Gly-Pro-Arg-2-klor-4-hydroksyanilid

og deres kompatible mineralsalter eller organiske salter.

Oligopeptidene i sammensetningen av den spesifikke reagens benyttes vanligvis i form at ett av deres salter, dannet for eksempel med saltsyre (HC1), eddiksyre eller trifluoreddiksyre (TF A).

Alle de reagenser som tillater en koaguleringstid å bestemmes, så som protrombintiden, inneholder et tromboplastin i sin sammensetning. Ved de nyeste analysemetoder benyttes rekondisjonert tromboplastin for å unngå ulempene med stoffer som uttrekkes fra levende vev, så som faren for besmittelse og forstyrrelse av medisiner eller deres metabolitter som medbringes av blodet. Dette angår for eksempel produktet Innovin® (Dade Int. 111. USA) som spesielt er gjenstand for europeisk patent EP 0 565 665, hvis sammensetning omfatter 25 til 35% fosfatidylserin (PS) med negativ polaritet og 65 til 75% fosfatidylserin (PS) med positiv polaritet.

Det ble overraskende observert at systemet ifølge oppfinnelsen gjorde det mulig å oppnå bedre bestemmelse (signalhøyde, linearitet) av protrombintiden (PT) ved omvendt å benytte en vevsfaktor med fosfolipider med et omvendt PS/PC-forhold, hvor kvantiteten av negative fosfolipider er større en kvantiteten av positive fosfolipider.

Den spesifikke reagens kan i sin sammensetning som aktivator omfatte et kalsiumsalt, så som Ca Cl2. De oppnådde optimeringsbetingelser betyr imidlertid at det ikke alltid er nødvendig å innlemme et kalsiumsalt, forutsatt at konsentrasjonen av Ca4-1" i helblodet allerede er tilstrekkelig for aktivering.

Slik som ved de fleste biologiske reaksjoner, er det nødvendig å holde mediet på en bestemt pH og å ha tilstrekkelig ionekraft. Blant alle de buffermedier som er velkjente for fagfolk på området, er Hepes-bufferen (sulfonisk N-2-hydroksyetyl-piperazin-N'2-aminoetan-syre) den buffer som har vist seg mest hensiktsmessig når oligopeptidsubstrater fra Pentapharm-firmaet benyttes, slik det vil bli vist i det etterfølgende.

Endelig skal det bemerkes at i immobiliseringen av den spesifikke reagens på arbeidselektroden fra en væske eller en forenlig sammensetning kan oppnås, uten andre additiver, ved hjelp av teknikker som er kjente for fagfolk på området. Lyofiliseringsteknikken har imidlertid vist seg å være mest tilfredsstillende, slik det skal vises i det etterfølgende.

Fig. 2 viser et skjematisk diagram av den kjemiske reaksjon som tillater en strøm å genereres over elektrodene 24a og 25a som er sammenkoplet ved hjelp av en elektronisk deteksjonskrets som ikke er vist. Substratet, som kan være skjematisk representert ved formelen Rl-AA2-AA]-Arg-LG, hvor AA| og AA2representerer andre aminosyrer slik som tidligere angitt, er koplet til arbeidselektroden 24a ved hjelp av gruppen RI som orienterer oligopeptidet, og hvor den andre ende av formelkjeden omfatter en avgangsgruppe LG som tidligere definert. I den venstre del av diagrammet fremgår det at trombinenzymet selektivt avskjærer forbindelsen mellom argininet og avgangsgruppen LG. I den høyre del av diagrammet fremgår det at den frigjorte avgangsgruppe kan vandre i retning mot elektroden 25a og generere en strøm som vil være proposjonal med antallet av avgangsgrupper LG som frigjøres, og således med mengden av trombin som er dannet i prøven.

De eksperimenter som beskrives i det etterfølgende, viser også at de benyttede oligopeptidsubstrater avskjæres selektivt av trombinenzymet med utelukkelse av alle andre enzymer som er til stede i helblod.

I de eksperimenter som er beskrevet i det etterfølgende, ble potensiostatiske målinger utført ved kronoamperometri ved hjelp av en potensiostat PGP 201 som var tilkoplet til Vmi-programvaren fra Radiometer (København), noe som tillot oppnåelse av følgende tilstander:

Overflaten av arbeidselektroden til den benyttede føler er 0,035 cm , og prøvemengden, bloddråpe, eller referanseoppløsningen er 10 ul. Registreringen av målinger starter 10 sekunder etter at prøven er avsatt. Det benyttede oligopeptid, heretter betegnet ifølge anvendelsen med "substrat", utvalgt fra de tidligere angitte, er:

Tos-Gly-Pro-Arg-3-klor-4-hydroksyanilid, 2HC1.

Eksperiment 1: Innvirkning av PC/ PS- forholdet

Det er kjent at den rekondisjonerte menneskevevsfaktor aktivert ved et fosfatidylserin (PS) og et fosfatidylkolin (PC) i et forhold 30:70, aktiverer koagulering i plasmaet ved tilstedeværelse av CaCl2. Denne sammensetning tillater også aktivering i helblod, men ettersøkingen for optimering har vist seg å være nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig høyt amperometrisk signal. For å gjøre dette, er serier av målinger blitt utført under variasjon av PS/PC-forholdet slik som angitt i det etterfølgende.

I 1000 ul av en oppløsning av "TRIS-buffer" (trimetylol-aminoetan 50 nM, NaCl/100 M, NaN3, 0,02%) som inneholdt 2,5 mg deoksykolsyre-natirumsalt, ble 5 uMol PC oppløst ved benyttelse av et ultralydbad i 5 minutter for å oppnå en første orignaloppløsning. Likeledes ble det klartgjort en andre originaloppløsning som inneholdt 5 uMol PS. De to originaloppløsninger ble deretter blandet for å oppnå en total fosfolipidkonsentrasjon (PS+PC) på 2,5 mg per 1000 ul, etter justering med den foran angitte fortynningsoppløsning, slik at man fikk følgende områder:

a-PC 100%- PS 0%

b-PC75%- PS 25%

c-PC50%- PS 50%

d-PC25%- PS 75%

e-PC0%- PS 100%

idet de nevnte prosenter er uttrykt i mol%.

10 (il vevsfaktor i en konsentrasjon på 164 mg/ml (rekombinant menneskevevsfaktor fra American Diagnostica 4500) ble også blandet med 20 ul destillert vann, deretter ble 10 ul av en foregående PS/PC-sammensetning tilføyd, etterfylt til 600 ul med en TRIS-oppløsning som inneholdt BSA (bovinserum-albumin), med en hastighet på 1 mg/ml BSA per 260 ul, og denne oppløsning ble deretter omrørt i 2 minutter. 220 ul av denne oppløsning ble deretter fortynnet med TRIS-oppløsning inntil et sluttvolum på 1100 ul ble oppnådd. Den foregående operasjon ble gjentatt med de andre PS/PC-sammensetninger, slik at man fikk et område på 5 forskjellige tromboplastin-oppløsninger.

Til slutt, ved å benytte et ultralydbad i 5 minutter, ble substratet oppløst i hver av de foregående oppløsninger ved en konsentrasjon på 0,33 mg/ml (0,5 M/l), slik at man oppnådde 5 substratoppløsninger, dvs. 5 spesifikke reagenser i hvilke PC/PS-forholdet varierer i de tidligere angitte proporsjoner.

De elektrokjemiske følere som ble utsatt for eksperimentet, ble til slutt klargjort ved avsetning av 10 (il spesifikk reagens på arbeidselektroden, og deretter ved tørking i en ovn ved 30° C i 2 timer.

Fig. 3a til 3e er kurver som representerer strømtetheten uttrykt i uA/cm som funksjon av tiden uttrykt i minutter, idet resultatene ble registrert for tre forskjellige tester (3al, 3a2, 3a3; 3bl, 3b2... etc.) med referanse til en blindtest (3a0, 3b0, 3c0,3d0, 3e0) som inneholdt 10 (il TRIS-buffer i stedet for 10 ul helblod. Slik det fremgår av fig. 3a, er kurvene 3a0, 3al, 3a2 og 3a3 identiske, dvs. det oppnås ikke noe elektrisk signal når PC/PS-forholdet er 100/0. Når PC/PS-forholdet er 75/25, hvilket svarer til det fortrukne forhold for sammensetningen Innovin®, viser fig. 3b at strømtetheten er meget lav og er nesten ikke forskjellig fra blindtestkurven 3b0. Når PC og PS er i like mengder (fig. 3c), oppnår man en betydningsfull strømtethet, men altfor stor spredning av målinger. Med et PC/PS-forhold på 25/75 fremgår det av fig. 3d at kurvene 3dl, 3d2, 3d3 er praktisk talt identiske, dvs. man oppnår god reproduserbarhet og tilfredsstillende linearitet. Ved benyttelse av PS alene (fig. 3e) er signalet høyere, men reproduserbarheten kan synes mindre tilfredsstillende. Disse eksperimenter viser at den foretrukne sammensetning må ha 65% til 100% fosfatidylserin (PS).

Man vil videre legge merke til at ovenstående resultater ble oppnådd uten at det var nødvendig å tilsette CaCl2, forutsatt at konsentrasjonen av kalsiumioner i helblod viste seg å være tilstrekkelig.

Andre eksperimenter viste at tilføyelsen av fosfatidyletanolamin (PE) ikke forårsaker noen forbedring av målingene, og at det ikke var mulig å oppnå aktivering utelukkende med vevsfaktoren, dvs. uten fosfolipider.

Eksperiment 2: Innvirkning av buffermediet

I overensstemmelse med samme prosess som den som ble beskrevet for eksperiment 1, ble det klargjort en første substratoppløsning (d) som inneholdt PC-PS i forholdet 25/75, med TRIS-buffer som buffermedium, og en andre substratoppløsning (f) i hvilken TRIS-bufferen var erstattet med Hepes-buffer. Deretter ble det utført to målinger svarende henholdsvis til kurver 4dl, 4d2 (TRIS) og 4fl, 4f2 (Hepes) på fig. 4, med hver substratoppløsning, idet det ble benyttet en blodprøve fra samme pasient. Slik det fremgår, oppnås et mye høyere signal med Hepes-bufferen, og denne kan således bibeholdes som det foretrukne buffermedium.

Eksperiment 3: Innvirkning av tørkemodusen

I det foreliggende eksperiment ble formen på det signal som oppnås når den spesifikke reagens tørkes ved lyofilisering, sammenliknet med det som ble oppnådd ved tørking i en ovn ved 30°C i 2 timer, slik det var tilfellet i de foregående eksperimenter. Den spesifikke reagens var den samme som reagensen i eksempel 2 med Hepes-bufferen. Ved benyttelse av den ene eller den andre tørkemodus ble det hver gang utført to målinger svarende til henholdsvis kurver 5fl, 5f2 (ovnstørking) og 5gl, 5g2 (lyofilisering) på fig. 5. Det kan bemerkes at lyofiliseringsteknikken tillater at et høyere signal kan oppnås, på mye kortere tid. Dette kan forklares ved at lyofilisering tillater mer homogen dekning av overflaten av elektrodene å oppnås, enn hva som kan oppnås med ovnstørking.

Andre eksperimenter som er blitt utført utelukkende med substratet i et buffermedium, ved benyttelse av additiver som tillot signalet å optimaliseres når det dreide seg om en glukoseføler, viste at anvendelsen av et karbonpulver for å øke den spesifikke overflate ikke hadde noen gunstig effekt, fordi basistrømmen på grunn av karbonpulveret forstyrret den strøm som skulle måles.

Eksperiment 4: S<p>esifisitet av den spesifikke reagens vis- å- vis trombinenzymet

Idet det er gitt at helblod inneholder særdeles tallrike bestanddeler, tillater det foreliggende eksperiment at det kan vises at bare trombinenzymet er i stand til å avskjære det spesifikke reagenssubstrat. Eksperimentet utføres under de optimaliser-ingsforhold som er definert ved eksperiment 3 (nemlig PC/PS i forholdet 25/75, Hepes-buffer og lyofilisering), idet man starter med en fortynning i like deler av blod og bufferoppløsning og gradvis hemmer trombinenzymet ved økende konsentrasjoner av r-hirudin (r-hirudin 2000 ATU/bulb, tilgjengelig fra Pentapharm AG, Basel, Sveits) som erstatter bufferoppløsningen, idet man fortrinnsvis har kontrollert at faktoren Xa ikke hemmes av r-hirudin. På fig. 6 er kurven 6a en kontrollkurve uten r-hirudin, og kurvene 6b til 6g er kurvene for målingene som ble utført med henholdsvis 12,5 ARU/ml, 25 ATU/ml, 37,5 ATU/ml, 50 ATU/ml, 100 ATU/ml, 1000 ATU/ml.

Slik det fremgår, avtar høyden av signalet gradvis etter hvert som konsentrasjonen av r-hirudin øker, inntil den blir praktisk talt lik null fra 100 ATU/ml. Man kan således trekke den slutning at systemet ifølge oppfinnelsen tillater substratet å avskjæres selektivt av trombin, og således tillater selektiv bestemmelse av dette enzym.

Slik det fremgår mer spesielt med henvisning til kurvene 6a, 6b og 6c, er maksimumsverdien i hovedsaken proposjonal med reduksjonen av trombinenzym i prøven, hvilket tillater at man kan regne med linære forhold. I praksis tas ikke maksimumsverdien, men den verdi som svarer til retningsendringspunktet for den stigende del av kurven, dvs. det punkt i hvilket hastigheten av frigjøring av trombin er maksimal. I praksis benyttes deteksjonsvinduer på 15 sekunder, og man bibeholder den verdi som ligger mellom to deteksjonsvinduer for hvilke passasjen fra en økning av gradientretningen til en reduksjon av gradientretningen observeres.

Claims (16)

1. Elektrokjemisk føler (20) for måling av en verdi (PT) som representerer koaguleringstiden til en dråpe helblod,karakterisert vedat det omfatter: en isolert underlag (21, 22) i form av en strimmel med små dimensjoner som bærer i det minste en referanseelektrode (25a) og en arbeidselektrode (24a) omfattende en målesone (29) innrettet for å motta en hel blodprøve, idet arbeidselektroden (24a) er dekket med en tørr spesifikk reagens (30) idet sammensetningen omfatter minst ett tromboplastin og et substrat omfattende et oligopeptidisk derivat med en stereospesifikk beliggenhet for trombinenzymet for å tillate avskjæring av et ladet sluttparti, som er generelt betegnet som "avgangsgruppen" (LG), av substratet.

2. Elektrokjemisk føler (20) ifølge krav 1,karakterisert vedat den spesifikke reagens (30) videre omfatter et buffermedium for å opprettholde en tilstrekkelig ionekraft.

3. Elektrokjemisk føler (20) ifølge krav 2,karakterisert vedat buffermediet er av typen HEPES for å måle et høyere signal.

4. Elektrokjemisk føler (20) ifølge krav 1 - 3,karakterisert vedat minst et thromboplastin av den spesifikke reagens (30) omfatter en sammenstilling der mengden av negative fosfolipider er større enn mengden av positive fosfolipider.

5. Elektrokjemisk føler (20) ifølge krav 4,karakterisert vedat nivået av negative fosfolipider, så som fotsfatidyliserin (PS) er større enn 65%

6. Elektrokjemisk føler (20) ifølge ett av de foregående krav,karakterisert vedat den spesifikke reagens (30) i sin sammensetning videre omfatter et kalsiumsalt, så som CaCl2.

7. Elektrokjemisk føler (20) ifølge ett av de foregående krav,karakterisert vedat det oligopeptidiske derivat har som terminal aminosyre arginin (Arg) linket til en annen aminfunksjon som er utvalgt blant 2-aminosmørsyre (Abu), alanin (Ala), 3-sykloheksylalanin (Cha), 2-sykloheksylglysin (Chg), fenylalanin (Phe), pipkolsyre (Pip), prolin (Pro), valin (Val) og glysin (Gly), idet de nevnte aminosyrer er i stand til å være i L-, D- eller DL-form.

8. Elektrokjemisk føler (20) ifølge ett av kravene 4-6,karakterisert vedat den ladede del (LG) er linket til nevnte arginine (Arg) og omfatter en aminoaryl- eller aminohetroaryl-gruppe (LG) utvalgt blant anilin-, quinolylamin- og naftylamin-derivater, eventuelt substituert med én eller flere substituenter som er utvalgt blant en halogen-, en hydroksy-, amino-, nitro-, alkyl-, alkoksy-, alkanoyl-, anilin- og aminofenyl-radikal, som kan substitueres.

9. Elektrokjemisk føler (20) ifølge ett av de foregående kravkarakterisert vedat substratet omfattende et oligopeptidisk derivat videre omfatter på den motsatte ende av den ladede del (LG) en beskyttende gruppe (RI) for å immobilisere substratet på arbeidselektroden (24a).

10. Elektrokjemisk føler (20) ifølge krav 9,karakterisert vedat den beskyttende gruppe (RI) er utvalgt blant Boe (ter-butoksykarbonyl)-, Tos (paratoluensulfonisk)-, t-Bups (ter-butylfenylsulfonyl)-, Mes (metylsulfonyl)-, Naps (2-naftylsulfonyl), Bzo (benzoyl)-, Z (benzyloksykarbonyl)-, isopropylsulfonyl, kamfosulfonyl-syrer.

11. Elektrokjemisk føler (20) ifølge ett av de foregående krav,karakterisert vedat det oligopeptidisk derivat omfatter et salt dannet med saltsyre (HC1), eddiksyre eller trifluoreddiksyre (TF A).

12. Elektrokjemisk føler (20) ifølge ett av de foregående krav,karakterisert vedat det oligopeptidiske substrat er utvalgt blant - Z-Gly-Pro-Arg-3 -klor-4-hydrokysanilid - Tos-Gly-Pro-Arg-3 -klor-4-hydroksyanilid - Boc-(D)-Chg-Gly-Arg-3-klor-4-hydroksyanilid - H-(D)-Chg-Gly-Arg-3-klor-4-hydroksyanilid - Z-Gly-Pro-Arg-2-klor-4-hydroksyanilid og deres kompatible mineralsalter eller organiske salter.

13. Elektronisk måleapparat for bestemmelse av protrombintid ((PT) for en dråpe helblod som er avsatt på en målesone (29) av en føler (20) ifølge krav 1-12, koplet til apparatetkarakterisert ved: en kappe (11) som rommer en kraftkilde og tillater føleren å tilkoples, en elektronisk krets som tillater en spenning eller strømstyrke å moduleres mellom følerens elektroder (24a, 25a), og som videre tillater et signal som representerer protrombintiden, å tolkes, og å fremvises på et fremvisningspanel (12).

14. Måleapparat ifølge krav 13,karakterisert vedat kraftkilden er en selvstendig kraftkilde, så som et batteri eller en akkumulator.

15. Måleapparat ifølge krav 13 eller 14,karakterisert vedat det videre omfatter en anordning for å måle temperatur (15) nær kontaktsonen (145) for føleren for å justere de elektriske signalparametre som en funksjon av den omgivende temperatur.

16. Amperometrisk metode for bestemmelse av protrombintiden for en dråpe helblod som er avsatt i målesonen (29) av en elektrokjemisk føler (20) ifølge krav 1-12 som er innført i et elektronisk måleapparat (10) ifølge krav 13-15,karakterisert vedat måleapparatets elektroniske krets tillater: tilstedeværelsen av en dråpe blod å detekteres for å etablere en bestemt spenning over elektrodene (24a, 25a), en kurve å registreres, som gir strømvariasjonen som funksjon av tid, punktet for retningsendring av den nevnte kurve som svarer til den maksimale trombinfrigjøringshastighet som skal bestemmes ved hjelp av målevinduer, koordinatene av det nevnte punkt å korreleres ved en protrombintidsverdi (PT-verdi), for eksempel ved hjelp av en kalibreringstabell, og den nevnte verdi å fremvises på et fremvisningspanel (12).