NO330264B1 - En fremgangsmate for isolering av osteopontin fra melk - Google Patents
En fremgangsmate for isolering av osteopontin fra melk Download PDFInfo
- Publication number
- NO330264B1 NO330264B1 NO20023057A NO20023057A NO330264B1 NO 330264 B1 NO330264 B1 NO 330264B1 NO 20023057 A NO20023057 A NO 20023057A NO 20023057 A NO20023057 A NO 20023057A NO 330264 B1 NO330264 B1 NO 330264B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- osteopontin
- protein
- milk
- retentate
- approximately
- Prior art date
Links
- 102000004264 Osteopontin Human genes 0.000 title claims description 96
- 108010081689 Osteopontin Proteins 0.000 title claims description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 25
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 title claims description 25
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 title claims description 25
- 239000008267 milk Substances 0.000 title claims description 25
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 20
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 claims description 19
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 claims description 17
- 239000005862 Whey Substances 0.000 claims description 16
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical group [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229940043430 calcium compound Drugs 0.000 claims description 2
- 150000001674 calcium compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000010909 chemical acidification Methods 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 45
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 44
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 36
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 33
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 25
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 20
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 19
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 15
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 12
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 10
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 10
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 9
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 9
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 9
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 9
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 8
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 8
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 4
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 239000000920 calcium hydroxide Substances 0.000 description 3
- 229910001861 calcium hydroxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011116 calcium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 3
- 101000613814 Bos taurus Osteopontin Proteins 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate Chemical compound [Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ZCCIPPOKBCJFDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 2
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 2
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 235000002198 Annona diversifolia Nutrition 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 241000282842 Lama glama Species 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000007982 Phosphoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089430 Phosphoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007365 Sialoglycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010032838 Sialoglycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004931 aggregating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 210000003027 ear inner Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 210000000609 ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 150000007529 inorganic bases Chemical class 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007530 organic bases Chemical class 0.000 description 1
- 201000008482 osteoarthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- RAFRTSDUWORDLA-UHFFFAOYSA-N phenyl 3-chloropropanoate Chemical compound ClCCC(=O)OC1=CC=CC=C1 RAFRTSDUWORDLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 238000004094 preconcentration Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000005084 renal tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000011155 wood-plastic composite Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Dairy Products (AREA)
- Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Feed For Specific Animals (AREA)
Description
Den foreliggende oppfinnelse vedrører en ny fremgangsmåte for isolering av osteopontin fra melk.
Osteopontin (OPN) er et utskilt adhesivt glykofosfoprotein som opprinnelig ble isolert fra den kollagenholdige ekstracellulære matriks av mineralisert benvev (Franzén A, Heinegård, D. 1985. Isolation and characterization of two sialoproteins present only in bone calcified matrix. Biochem. J. 232: 715-724.). I de senere år er osteopontin blitt funnet å bli uttrykt av et antall forskjellige celletyper inklusive osteoblaster, glatte muskelceller, leukocytter, forskjellige typer av epiteliale celler og transformerte celler av forskjellig avstamning (Denhardt DT, Butler WT, Chambers AF, Senger DR. (utg.). 1995. Osteopontin: role in cell signalling and adhesion. Ann. N.Y. Acad. Sei., 760). Følgelig er OPN blitt påvist i mange vev inklusive nyrevev, plasenta, sekretorisk epitelia og ganglia i det indre øret, og glatte muskler i det vaskulære system (Butler WT, Ridall AL, McKee MD. 1996. Osteopontin. I Bilezekian JP, Rai LG, Rodan GA (utg.). Principles of bone biology. Academic Press, San Diego, CA, U.S.A. s. 167-181. Videre er OPN også tilstede i mange kroppsvæsker, særlig plasma, urin, galle og melk, og det fremviser forhøyet ekspresjon i mange transformerte celler (Senger DR, Peruzzi CA, Gracey CF, Papadopoulos A, Tenen DG. 1988. Secreted phosphoproteins associated with neoplastic transformation: close homology with plasma proteins cleaved during blood coagulation. Cancer Res. 48: 5770-5774). Osteopontin er sterkt surt, idet omtrent 25% av aminosyrene er aspartat/asparaginsyre og glutamat/glutaminsyre så vel som et betraktelig antall av fosforylerte aminosyrer (Sørensen ES, Petersen TE. 1994 Identification of two phosphorylation motifs in bovine osteopontin, Biochem. Biophys. Res. Commun. 198: 200 - 205; Sørensen, ES, Højrup, P, Petersen, TE. 1995. Posttranslational modifications of bovine osteopontin: Identification of twenty-eight phosphorylation and three O-glycosylation sites. Protein Sei. 4: 2040 - 2049).
Osteopontin inneholder en RGD (arginin, glycin, asparaginsyre) integrinbindende sekvens og det kan fremme fastsetting av celler på forskjellige overflater, for eksempel fastsetting av osteoblaster til benvev under benvev-remodulering. I tillegg til cellefastsettingsevnen kan osteopontin virke som et cytokin. Andre foreslåtte anvendelser eller roller for osteopontin inkluderer kjemotaksis og inhibisjon av nitrogenoksid syntaseekspresjon.
Osteopontin er således blitt foreslått for bruk som et farmasøytisk middel. EP 705842 foreslår anvendelse av osteopontin i diagnose, profylakse og terapi av osteoartritt og revmatoid artritt. Osteopontin er også antatt å spille en rolle ved økning av benvevvekst og sårheling i pattedyr, jfr. for eksempel EP 942452 og WO 9933415. Videre er osteopontin blitt foreslått for inhibering av nitrogenoksid, jfr. US 5695761. Osteopontin er også blitt foreslått for oppløseliggjøring av divalente metallioner for tilsetning til næringsmidler, jfr. sammendrag i JP 9173018.
Osteopontin er blitt isolert i forskningsskalamengder (mikrogram til lavt antall milligram skala) fra et antall vev og væsker, inklusive mineralisert benvev. Videre er det et stort behov for osteopontin for eksperimentell så vel som for industriell anvendelse. Alle kjente prosesser for isolering av osteopontin er i eksperimentskala, som gir for små mengder for industriell anvendelse.
Sørensen, ES, Petersen T. 1993. Journal of Dairy Research 60, 189-197, beskriver I Purification and characterization of three proteins isolated from the proteose peptone fraction of bovine milk, en metode som involverer TCA, trikloreddiksyre, utfelling av proteiner. Denne metoden er ikke forenelig med produksjon av næringsmiddel-bestanddeler, på grunn av at TCA ikke er tillatt i næringsmiddelprodukter. Videre inkluderer metoden gelfiltrering som ikke er egnet for produksjon i stor skala.
Beyless KJ, Davis GE, Meininger GA. 1997. Protein Expression and Purification 9, 309-314, Isolation and biological properties of osteopontin from bovine milk, beskriver en metode som inkluderer ionebytting og to trinn med hydrofob kromatografi på fenyl-sepharosekolonner. Kompleksiteten av fremgangsmåten og særlig den hydrofobe kromatografi gjør metoden uanvendelig for rensing av osteopontin i stor skala.
Senger DR, Peruzzi CA, Papadopoulos A, Tenen DG. 1989, foreslår i Biochimica et Biophysica Acta 996, 43 - 48. Purification of a human milk protein closely similar to tumor-secreted phosphoproteins and osteopontin, en rensemetode. Rensemetoden beskrevet for human melk involverer barium citrataffinitet så vel som reversfase HPLC kromatografi, som gjør den uanvendelig for rensing i stor skala.
Den foreliggende oppfinnelse løser de ovenfor nevnte problemer. Oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for storskalarensing eller isolasjon av isopontin fra bovin melk (og melkeproduserende husdyr av pattedyrsopprinnelse som produserer melk, som for eksempel geit, sauer, bøfler, lama, kamel, etc). Melkeosteopontin er høyt foretrukket på grunn av at det forekommer naturlig i melk fra husdyr. Ifølge oppfinnelsen isoleres osteopontin ved hjelp av metoder som er godkjent for produksjon av meieriprodukter. Dette osteopontin med næringsmiddelrenhet kan derfor anvendes som en bestanddel i næringsmiddelprodukter for humant forbruk uten noen fare.
Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for isolering av osteopontin fra melk, kjennetegnet ved at et melkemateriale blandes med et oppløselig kalsiumsalt slik at Ca-konsentrasjonen er høyst 0,4 % og pH innstilles til pH 3,5 til 5,0, for å holde osteopontinet i oppløsning under utfelling av andre melkebestanddeler.
Fremgangsmåten kan utføres i ett eller flere trinn. Det er også mulig å kombinere trinnene med å holde osteopontin i oppløsning og binde eller aggregere det.
I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er råmaterialet foretrukket basert på melk inneholdende osteopontin. Myse er et godt råmateriale ettersom kaseinproteinene inneholdt deri, er blitt fjernet. Særlig myse som skriver seg fra kjemisk surgjøring av melk, er egnet på grunn av at dens osteopontin er intakt. På den annen side kan osteopontin inneholdt i ostemyse delvis hydrolyseres. Det er imidlertid ennå ikke kjent om dette reduserer eller fullstendig ødelegger egenskapene av osteopontinet.
Separasjon av osteopontin fra det denaturerte og utfelte protein kan gjennomføres ved mikrofiltrering eller sentrifugering som normalt utført innenfor meieriindustrien.
Porestørrelsen kan være fra 0,1 til 1,4 nm. Keramiske filtre er særlig velegnet på grunn av mekanisk stabilitet og lang levetid. Separasjonen kan finne sted ved temperaturer fra 10 til 80°C. 50 - 55°C er særlig velegnet på grunn av stor kapasitet og stabile bakteriologiske betingelser.
Alle typer anionbyttere kan anvendes. Her anvendes en DEAE Sepharose hurtigstrømningsionebytter. Under ionebyttingen kan pH variere fra omtrent 3 til omtrent 6.
Trinnene som involverer (A) oppløsning eller oppløseliggjøring av osteopontin eller (B) aggregasjon eller binding av osteopontin kan kombineres i en prosess. Produktstrømmene kan behandles på forskjellige måter før og/eller etter disse trinn for å konsentrere, separere, tørke eller utføre andre prosesser vanlig anvendt innenfor meieriindustrien. Således kan for eksempel mikrofiltrering anvendes. Den fagkyndige innenfor meierifaget vil lett bestemme et riktig filter, jfr. for eksempel Tera Paks "Dairy process Handbook" (1995), s. 123-132.
Normalt foretrekkes det å konsentrere myse før fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen igangsettes for å redusere den mengde vann som skal behandles. For forkonsentrasjonen av myse kan et hvilket som helst konvensjonelt ultrafiltreringssystem anvendes: plate og rammefiltre; hulfibre, rørfiltre, keramiske filtre og spiralfiltre, etc. Spiralfiltersystemer er fra et økonomisk synspunkt hittil ansett spesielt velegnet. En hvilken som helst membran som ikke tillater osteopontin å passere gjennom membranen, er egnet. Porestørrelsen av slike membraner er 20.000 D eller mindre. Egnede membraner er for eksempel "Koch" HFK131, "DesaPTW eller lignende membraner.
Den oppløselige Ca-kilde kan være en hvilken som helst oppløselig kalsiumforbindelse, som kalsiumhydroksid, kalsiumklorid eller kalsiumacetat. Kalsiumnitritt og kalsiumnitrat er også brukbare, men blir vanlig ikke anbefalt hvis osteopontinet skal anvendes innenfor næringsmiddelindustrien.
For å aggregere eller binde osteopontin til en uoppløselig Ca-kilde, kan det anvendes Ca3PC«4 eller annen uoppløselig Ca-kilde. pH-regulering for å utfelle kalsiumfosfat eller annet uoppløselig salt med osteopontin kan være innenfor området 6,0 til 8,5. pH-området 6,5 - 8,0 er særlig velegnede. Spesielt er pH på omtrent 7,0 egnet. En hvilken som helst base kan anvendes: organiske så vel som uorganiske baser, som pH-reguleringsmiddel i denne prosess. Særlig er basene NaOH, KOH, Ca(OH)2egnet. Særlig egnet er NaOH.
pH-regulering for å holde osteopontin i oppløsning er 3,5 til 5,0, foretrukket er 4,0 - 4,6. pH 4,2 er mest foretrukket. For pH-reguleringen kan det anvendes en hvilken som helst organisk eller uorganisk syre. Saltsyre er særlig egnet på grunn av styrke og pris. Hvis utgangs-melkematerialet inneholdende osteopontin også inneholder naturlig kalsium fra melken, skal det tilsettes mindre kalsium eller over hodet ikke noe kalsium. Også anvendelse av Ca(OH)2for pH-regulering kan minimere mengden av annen Ca-kilde. Normalt vil en egnet mengde være en mengde hvor konsentrasjonen av kalsium i oppløsningen er 0,2%. Der er ingen nedre grense, men mindre enn omtrent 0,05% pr. protein % vil gi et redusert utbytte av osteopontin. 0,1% kalsium vil være effektivt, men utbyttet av osteopontin er redusert sammenlignet med bruk av 0,2% kalsium. Konsentrasjoner av kalsium opp til 0,4% har vært forsøkt. Bare liten økning oppnås imidlertid ved konsentrasjoner over 0,2%. Derfor foretrekkes 0,2%, men også 0,3% kan anvendes.
Separasjon av utfelt kalsiumfosfat eller en annen fast Ca-kilde inneholdende osteopontin kan foretas fra resten ved hjelp av en hvilken som helst vanlig metode, som mikrofiltrering eller sentrifugering. Porestørrelsen kan være fra 0,1 til 1,4 nm. Keramiske filtre er særlig velegnet på grunn av mekanisk stabilitet og lang levetid. Separasjonen kan finne sted ved temperaturer fra 10 til 80°C. 50 til 5°C er særlig vel egnet på grunn av stor kapasitet og stabile bakteriologiske betingelser.
For separasjonen av osteopontin fra oppløst kalsiumsalt kan det anvendes et hvilket som helst ultrafiltreringssystem: plate og ramme; hulfiberfilter, rørfilter, keramisk og spiralfilter, etc. Spiralfiltersystemer er særlig velegnet fra et økonomisk synspunkt. En hvilken som helst membran som ikke tillater at osteopontin passerer gjennom membranen, kan anvendes. Den nominelle porestørrelse av slike membraner er typisk 20.000 D eller mindre. Egnede membraner er for eksempel "Kock" HFK328, "Desal" PV eller lignende membraner. Alle typer av ionebyttere kan anvendes. Her anvendes DEAE Sepharose hurtigstrømings ionebytter.
Under ionebyttingen kan pH variere fra omtrent 3 til omtrent 6.
Bakteriefiltrering av myseproteinkonsentrat, WPC, retentat før pH-regulering til 7,0 for å utfelle Caj(P04)2eller et annet faststoff med osteopontinet frembringer et renere aggregat, som også vil gi et renere produkt for videre bearbeiding i prosessene og således også litt renere osteopontinprodukter.
De følgende eksempler skal illustrere den foreliggende oppfinnelse.
Eksempel 1
1000 kg kaseinmyse med pH 4,55, 0,53% protein, omtrent 20 ppm osteopontin (0,002%) og 4,50% tørrstoff konsentreres i et spiralultrafiltreringsanlegg med membraner med en nominell porestørrelse, slik at proteinene ikke passerer gjennom membranen. Typisk nominell porestørrelse er 10.000 D. Temperaturen under filtreringen er 50°C og det midlere trykk er 3,5 bar. Konsentrering gjennomføres inntil 900 kg permeat, som ikke inneholder osteopontin, er fjernet. Under konsentrasjonen er midlere strømningstakt 45,6 liter/m<2>/h. 100 kg retentat med pH 4,55, 3,86% protein, omtrent 200 ppm osteopontin (0,02%) og 10,3% tørrstoff er tilbake.
De 100 kg retentat pasteuriseres ved 68°C i 15 sek. og avkjøles til 50°C. Deretter innstilles pH til 7,0 med 6% NaOH.
Etter at blandingen har fatt stå i 2 timer, gjennomføres mikrofiltrering på 0,1 til 1,4 nm keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 7,0 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 (xS. Under hele filtreringen er denmidlere strømningstakt 310 liter/mVh.
20,0 kg retentat fra mikrofiltreringen samles og avkjøles til 8°C i isblandet vann, med pH 7,0, 0,58% protein, omtrent 1000 ppm osteopontin (0,1%) og 4,1% tørrstoff. Retentatet forstøvningstørkes i en NIRO tårntørke og 0,7 kg pulver med 13,6% protein, omtrent 2,3% osteopontin og 96,4% tørrstoff oppnås. Tørrstoffet består av 80% aske, 27% kalsium og 13,8% fosfor.
Eksempel 2
2000 kg kaseinmyse med pH 4,55, 0,55% protein, omtrent 20 ppm osteopontin (0,002%) og 4,53% tørrstoff konsentreres i et spiralfilter UF-anlegg med membraner med en nominell porestørrelse slik at proteinene ikke passerer gjennom membranen. Typisk porestørrelse er 10.000D. Temperaturen under filtrering er 12°C og det midlere trykket er 3,5 bar. Konsentrasjon gjennomføres inntil 1800 kg permeat, som ikke inneholder osteopontin, er fjernet. Under konsentrasjonen er den midlere strømningstakt 27,6 liter/m<2>/h. 200 kg retentat med pH 4,55, 3,97% protein, omtrent 200 ppm osteopontin (0,02%) og 10,4% tørrstoff etterlates.
200 kg retentat pasteuriseres ved 68°C i 15 sek. og avkjøles til 50°C. Deretter innstilles pH til 7,0 med 6% NaOH.
Etter at blandingen har fått stå i 30 min., gjennomføres mikrofiltrering på 0,2 m<2>1,4 nm keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 7,0 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 nS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 310 liter/m<2>/h. 20,0 kg retentat fra mikrofiltreringen samles og avkjøles til 8°C i isblandet vann med pH 7,0, 1,25% protein, omtrent 2000 ppm osteopontin (0,2%) og 8,3% tørrstoff.
Retentatet innstilles med pH til 3,0 med 28% saltsyre som frembringer en nesten klar oppløsning.
Denne pH 3,0-innstilte oppløsning ultrafiltreres ved 10°C og middeltrykk 4,0 bar på en membran med terskelverdi 5.000D. Retentatet diafiltreres med demineralisert vann inntil konduktiviteten i permeatet er under 0,1 uS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 17,8 liter/m<2>/h. 10 kg retentat med 2,42% protein, omtrent 4.000 ppm osteopontin (0,4%) og 2,6% tørrstoff samles.
Retentatet forstøvningstørkes i en NIRO tårntørker og 0,2 kg pulver med 89,6%, omtrent 14,8% osteopontin og 96,4% tørrstoff oppnås.
Eksempel 3
1000 kg forkonsentrert kaseinmyse med pH 4,55, 3,76% protein, omtrent 200 ppm osteopontin (0,02%) og 10,3% tørrstoff pasteuriseres ved 67°C i 15 sek. og avkjøles til 50°C. Deretter innstilles pH til 7,0 med 6% NaOH.
Etter at blandingen har fått stå i 60 min., gjennomføres mikrofiltrering på 2,8 m<2>1,4 nm keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 7,0 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 (xS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 325 liter/m<2>/h.
100 kg retentat fra mikrofiltreringen med pH 7,0,1,22% protein, omtrent 2.000 ppm osteopontin (0,2%) og 8,3% tørrstoff samles og avkjøles til 5°C på en platevarmeveksler.
Retentatet pH-reguleres til 3,0 med 28% saltsyre som frembringer en nesten klar oppløsning. Denne pH 3,0-regulerte oppløsning ultrafiltreres ved 10°C og midlere trykk 4,0 bar på en membran med en terskelverdi på 5.000D. Retentatet diafiltreres med demineralisert vann inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 uS. Deretter gjennomføres diafiltrering med 0,45 M KH2PO4med pH=4,5 inntil pH er 4,5 i retentatet. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 15,9 liter/m2/h. 10 kg retentat med 12,1% protein, omtrent 20.000 ppm osteopontin (2,0%) og 13,4% tørrstoff samles.
Retentatet pumpes gjennom en kolonne med en ionebytter som er ekvilibrert med 0,45 M KH2PO4med pH = 4,5. Således bindes osteopontin til kolonnen mens den største del av andre myseproteiner ikke bindes. Kolonnen vaskes med 0,45 M KH2PO4med pH = 4,5 inntil absorpsjonen ved 280 nm er 0.
Osteopontin elueres fra ionebytteren med 0,7 M KH2PO4med pH = 4,5 inntil absorpsjonen ved 280 nm er 0 og 50 liter eluat inneholdende 500 g protein med 40% osteopontin samles. Eluatet konsentreres og diafiltreres for å fjerne salter på ultrafiltreringsmembraner med en porestørrelse på 5.000D ved 10°C og midlere trykk på 4,0 bar. 5 kg retentat med 10,7% tørrstoff, omtrent 4% osteopontin og 9,6% protein samles. Retentatet forstøvningstørkes på en NIRO tårntørker og 0,5 kg pulver med 86,0% protein, omtrent 36% osteopontin og 95,8% tørrstoff oppnås.
Eksempel 4
1000 kg kasein myse med pH 4,56, 0,52% protein, omtrent 20 ppm osteopontin (0,002%) og 4,0% tørrstoff pasteuriseres ved 71°C i 15 sek. og avkjøles til 50°C. Deretter innstilles pH til 7,0 med 6% NaOH.
Etter at blandingen har fått stå i 2 timer, gjennomføres mikrofiltrering på 1,4 m<2>1,4 nm keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 7,0 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 (xS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 520 liter/m<2>/h.
30,0 kg retentat fra mikrofiltreringen samles og avkjøles til 8°C med isblandet vann med pH 7,0, 0,78% protein, omtrent 670 ppm osteopontin (0,07%) og 16,1% tørrstoff. Retentatet forstøvningstørkes på en NIRO tårntørke og 4,5 kg pulver med 4,7% protein, omtrent 0,4% osteopontin og 96,4% tørrstoff oppnås. Tørrstoffet består av 85% aske, 27% kalsium og 13,8% fosfor.
Eksempel 5
5000 kg kaseinmyse med pH 4,56, 0,51% protein, omtrent 20 ppm osteopontin (0,002%) og 4,50% tørrstoff pasteuriseres ved 69°C i 15 sek. og avkjøles til 50°C. Deretter innstilles pH til 7,0 med 6% NaOH.
Etter at blandingen har fått stå i 2 timer, gjennomføres mikrofiltrering på 1,4 m<2>1,4 nm keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltreringen gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 7,0 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 (xS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 550 liter/m<2>/h.
150 kg retentat fra mikrofiltreringen samles og avkjøles til 8°C i isblandet vann, med pH 7,0, 0,73% protein, omtrent 670 ppm osteopontin (0,07%) og 16,4% tørrstoff.
Retentatet pH-innstilles til 3,0 med 28% saltsyre som frembringer en nesten klar oppløsning. Denne pH 3,0-innstilte oppløsning ultrafiltreres ved 10°C og middeltrykk 4,0 bar på en membran med en terskelverdi på 10.000D. Retentatet diafiltreres med demineralisert vann inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 uS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 24,3 liter/m<2>/h. 10 kg retentat med 11,0% protein, omtrent 10.000 ppm osteopontin (1,0%) og 12,6% tørrstoff samles.
Retentatet forstøvningstørkes i en NIRO tårntørke og 1,1 kg pulver med 83,8% protein, omtrent 7,6% osteopontin og 96,2% tørrstoff oppnås.
Eksempel 6
10.000 kg kasein myse med pH 4,56, 0,54% protein, omtrent 20 ppm osteopontin (0,002%) og 4,50% tørrstoff pasteuriseres ved 69°C i 15 sek. og avkjøles til 50°C. Deretter innstilles pH til 7,0 med 6% NaOH.
Etter at blandingen har fått stå i 2 timer, gjennomføres mikrofiltrering på 2,8 m<2>1,4 nm keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 7,0 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 nS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 570 liter/m<2>/h.
300 kg retentat fra mikrofiltreringen samles og avkjøles til 8°C i isblandet vann, med pH 7,0, 0,76% protein, omtrent 670 ppm osteopontin (0,07%) og 16,3% tørrstoff.
Retentatet pH-innstilles til 3,0 med 28% saltsyre som frembringer en nesten klar oppløsning. Denne pH 3,0-innstilte oppløsning ultrafiltreres ved 10°C og midlere trykk 4,0 bar på en membran med en terskelverdi på 10.000D. Retentatet diafiltreres med demineralisert vann inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 uS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 24,6 liter/m<2>/h. 20 kg retentat med 10,8% protein, omtrent 10.000 ppm osteopontin (1,0%) og 12,3% tørrstoff samles.
Retentatet pumpes gjennom en kolonne med en ionebytter som er ekvilibrert med 0,45 M KH2PO4med pH = 4,5. Osteopontinet bindes således til kolonnen mens den største del av andre myseproteiner ikke bindes. Kolonnen vaskes med 0,45 M KH2PO4med pH=4,5 inntil absorpsjonen ved 280 nm er 0.
Osteopontin elueres fra ionebytteren med 0,7 M KH2PO4med pH = 4,5 inntil absorpsjonen ved 280 nm er 0 og 50 liter eluat inneholdende 560 g protein, hvorav 36% er osteopontin, er samlet. Eluatet konsentreres og diafiltreres for å fjerne salter på ultrafiltreringsmembraner med en porestørrelse på 5.000D, ved 10°C og midlere trykk 4,0 bar. 5 kg retentat med 12,3% tørrstoff, omtrent 4% osteopontin og 11,2% protein samles. Retentatet forstøvningstørkes i en NIRO tårntørke og 0,6 kg pulver med 87,6% protein, omtrent 31% osteopontin og 96,2% tørrstoff oppnås.
Eksempel 7
10.000 kg kasein myse med pH 4,53, 0,55% protein, omtrent 20 ppm osteopontin (0,002%) og 4,50% tørrstoff ultra-/diafiltreres i et spiralfilter UF anlegg med membraner med en nominell porestørrelse slik at proteinene ikke passerer gjennom membranen. Typisk porestørrelse er 20.000D. Temperaturen under filtrering er 15°C og det midlere trykk er 3,5 bar. Med en gang filtreringen er avsluttet, samles 152 kg retentat med pH 4,54, 23,1% protein, omtrent 1.300 ppm osteopontin (0,13%) og 28,7% tørrstoff. Under konsentrasjonen er den midlere strømningstakt 25,6 liter/m2/h. De 152 kg retentat fortynnes med 722 kg demineralisert vann slik at proteininnholdet er 4,0. pH innstilles til 7,4 med 6% NaOH. Varmebehandlingen gjennomføres ved 85°C i 30 minutter og avkjøling til 8°C gjennomføres. 6,4 kg CaCl2.2H20 tilsettes til det varmebehandlede retentat og pH innstilles til 4,2 med 6% saltsyre.
Etter at blandingen har fått stå i minst 2 timer (eller til den neste dag), gjennomføres oppvarmingen til 50°C og mikrofiltrering gjennomføres på 1,4 m2 0,8 um keramiske membraner ved 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 4,2 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 uS. Under filtreringen er den midlere strømningstakt 415 liter/m<2>/h. Totalt 2.000 liter permeat som kontinuerlig er blitt avkjølt til 8°C over en platevarmeveksler (PVV), med pH 4,2, 0,16% protein, omtrent 100 ppm osteopontin (0,01%) og 4,1% tørrstoff samles.
Permeatet fra mikrofiltreringen pH-innstilles til 6,6 med 6% NaOH og ultra/diafiltreres i et spiralfilter UF anlegg ved 10°C med et midlere trykk på 4,0 bar inntil konduktiviteten i permeatet er under 500 uS. En filtrering på membraner med en porestørrelse på 5.000D gjennomføres. 40 kg retentat med pH 6,5, 7,9% protein, omtrent 5.000 ppm osteopontin (0,5%) og 9,6% tørrstoff samles.
Retentatet forstøvningstørkes i en NIRO tårntørke og det oppnås 3,5 kg pulver med 79,2% protein, omtrent 5,0% osteopontin og 96,2% tørrstoff.
Eksempel 8
200 kg kasein myseretentat med pH 4,55, 23,2% protein, omtrent 1.300 ppm osteopontin (0,13%) og 29,1% tørrstoff fortynnes med 1.000 kg demineralisert vann og pH innstilles til 7,4 med 6% NaOH. Deretter gjennomføres varmebehandling ved 85°C i 30 min. og det gjennomføres avkjøling til 8°C. 8,8 kg CaCl2.2H20 tilsettes til det varmebehandlede retentat; og pH innstilles til 4,1 med 6% saltsyre.
Etter henstand i minst 2 timer (eller til den neste dag) gjennomføres oppvarmingen til 50°C og mikrofiltrering gjennomføres på 2,8 m<2>0,8 um keramiske membraner med 50°C med et midlere trykk på 4,0 bar. Diafiltrering gjennomføres med 50°C varmt demineralisert vann med pH innstilt til 4,1 inntil konduktiviteten i permeatet er under 100 uS. Under hele filtreringen er den midlere strømningstakt 445 liter/m<2>/h. Totalt 2.800 liter permeat som er blitt avkjølt til 8°C over en platevarmeveksler (PVV), med pH 4,1, 0,16% protein, omtrent 100 ppm osteopontin (0,01%) og 4,0% tørrstoff samles.
Permeatet fra mikrofiltreringen innstilles til pH 6,6 med 6% NaOH og det ultra/difiltreres i et spiralfilter UF-anlegg ved 10°C med et midlere trykk på 4,0 bar inntil konduktiviteten i permeatet er under 500 uS. En filtrering gjennomføres på membraner med en porestørrelse på 5.000D. 40 kg retentat med pH 6,5,11,2% protein, omtrent 6.500 ppm osteopontin (0,65%) og 12,4% tørrstoff samles.
Retentatet pumpes gjennom en kolonne med en ionebytter som er ekvilibrert med 0,45 M KH2PO4med pH = 4,5. Osteopontin bindes således til kolonnen mens den største del av andre proteiner ikke bindes. Kolonnen vaskes med 0,45 M KH2PO4med pH = 4,5 inntil absorpsjonen ved 280 nm er 0.
Osteopontin elueres fra ionebytteren med 0,7 M KH2PO4med pH = 4,5 inntil absorpsjonen ved 280 nm er 0 og 501 eluat inneholdende 500 g protein, hvorav 50% er osteopontin, er oppsamlet. Eluatet konsentreres og diafiltreres for å fjerne salter på ultrafiltreringsmembraner med en porestørrelse på 5.000D ved 10°C og midlere trykk 4,0 bar. 5 kg retentat med 10,7% tørrstoff, omtrent 5% osteopontin og 9,6% protein samles. Retentatet forstøvningstørkes i en NIRO tårntørke og 0,5 kg pulver med 86% protein, omtrent 45% osteopontin og 95,8% tørrstoff er oppnådd.
Claims (10)
1.
Fremgangsmåte for isolering av osteopontin fra melk,karakterisert vedat et melkemateriale blandes med et oppløselig kalsiumsalt slik at Ca-konsentrasjonen er høyst 0,4 % og pH innstilles til pH 3,5 til 5,0, for å holde osteopontinet i oppløsning under utfelling av andre melkebestanddeler.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat pH innstilles til pH 4,0 til 4,6.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat pH innstilles til pH 4,2.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat den oppløselige kalsiumkilde er kalsiumklorid.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat fremgangsmåten gjennomføres trinnvis.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 5,karakterisert vedat minst ett trinn involverer at melkematerialet blandes med et oppløselig Ca-salt slik at Ca-konsentrasjonen er høyst 0,4% og pH innstilles til pH 3,5 til 5,0 og at minst ett ytterligere trinn involverer at melkematerialet blandes med en uoppløselig kalsiumforbindelse og pH innstilles til en nøytral eller basisk pH.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat melkematerialet er et myseprodukt.
8.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat melkematerialet er et konsentrert myseprodukt.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat melkematerialet er et myseprodukt fra kjemisk surgjøring av melk.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat melkematerialet og det oppløselige kalsiumsalt blandes slik at Ca-konsentrasjonen er 0,2%.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DKPA200000013 | 2000-01-07 | ||
| PCT/DK2001/000005 WO2001049741A2 (en) | 2000-01-07 | 2001-01-04 | A process for isolation of osteopontin from milk |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20023057D0 NO20023057D0 (no) | 2002-06-24 |
| NO20023057L NO20023057L (no) | 2002-06-24 |
| NO330264B1 true NO330264B1 (no) | 2011-03-14 |
Family
ID=8158885
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20023057A NO330264B1 (no) | 2000-01-07 | 2002-06-24 | En fremgangsmate for isolering av osteopontin fra melk |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US7259243B2 (no) |
| EP (1) | EP1244702B1 (no) |
| JP (1) | JP4615173B2 (no) |
| KR (1) | KR100733538B1 (no) |
| AR (1) | AR027507A1 (no) |
| AT (1) | ATE324378T1 (no) |
| AU (1) | AU784322B2 (no) |
| CA (1) | CA2396519C (no) |
| DE (1) | DE60119077T2 (no) |
| DK (1) | DK1244702T3 (no) |
| ES (1) | ES2258520T3 (no) |
| NO (1) | NO330264B1 (no) |
| NZ (1) | NZ519492A (no) |
| PT (1) | PT1244702E (no) |
| RU (1) | RU2264734C2 (no) |
| WO (1) | WO2001049741A2 (no) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ507335A (en) * | 2000-10-05 | 2004-10-29 | New Zealand Dairy Board | Bone health compositions derived from milk comprising an acidic protein fraction but that does not contain CGMP |
| GB0227886D0 (en) * | 2002-11-29 | 2003-01-08 | Medical Res Council | Prion inhibition |
| ES2444843T3 (es) * | 2003-09-18 | 2014-02-27 | Arla Foods Amba | Fórmula para lactantes |
| RU2379975C2 (ru) * | 2003-09-18 | 2010-01-27 | Арла Фудс Амба | Добавка в состав для детского питания |
| EP1625877A3 (en) * | 2004-08-09 | 2006-03-08 | Friesland Brands B.V. | Functional milk fraction |
| FR2901796A1 (fr) * | 2006-05-31 | 2007-12-07 | Lab Francais Du Fractionnement | Procede d'extraction d'une ou de plusieurs proteines presentes dans du lait |
| WO2009027284A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Laboratoires Serono Sa | Purification of osteopontin |
| US9783996B2 (en) | 2007-11-19 | 2017-10-10 | Valinge Innovation Ab | Fibre based panels with a wear resistance surface |
| GB0813015D0 (en) * | 2008-07-16 | 2008-08-20 | Plant Bioscience Ltd | Phosphoproteins and use of the same |
| EA023367B1 (ru) | 2011-03-03 | 2016-05-31 | Арла Фудс Амба | Способ выделения остеопонтина из молочных продуктов питания, содержащих смр |
| US20150344534A1 (en) * | 2011-12-07 | 2015-12-03 | Arla Foods Amba | Osteopontin variants for use in suppression or prevention of tumor growth and compositions containing such osteopontin variants |
| EP2830647A1 (en) * | 2012-03-28 | 2015-02-04 | Arla Foods amba | Nanoparticle aggregates containing osteopontin and calcium- and/or strontium-containing particles |
| MX369925B (es) | 2013-07-05 | 2019-11-25 | Arla Foods Amba | Osteopontina lactea de mamifero para mejorar la capacidad de respuesta inmunitaria. |
| US12109284B2 (en) | 2016-11-08 | 2024-10-08 | Dentherapy Ltd | Compositions comprising fluoride and calcium and method for preparing them |
| EP3544994B1 (en) * | 2016-11-27 | 2024-09-25 | Triton Algae Innovations, Inc. | Method of purification of recombinant osteopontin from microalgae |
| GB202010987D0 (en) | 2020-07-16 | 2020-09-02 | Dentherapy Ltd | Oral care compositions and methods |
| CN117377391A (zh) * | 2021-04-19 | 2024-01-09 | 雀巢产品有限公司 | 乳蛋白质级分作为骨桥蛋白源的用途 |
| GB202110114D0 (en) | 2021-07-14 | 2021-08-25 | Dentherapy Ltd | Oral care compositions for use in treaatment |
| EP4373290A1 (en) | 2021-07-20 | 2024-05-29 | Arla Foods amba | Method of preparing a phospholipid-enriched, whey-derived composition having a low content of microorganisms, the composition as such, and nutritional use of the composition |
| WO2024056840A1 (en) | 2022-09-16 | 2024-03-21 | Univerza V Ljubljani | Isolation of osteopontin and glycomacropeptide from whey |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0322971A (ja) * | 1989-06-20 | 1991-01-31 | Calpis Food Ind Co Ltd:The | ビフィズス菌増殖物質の精製法及び増殖物質 |
| CH681543A5 (no) | 1990-04-27 | 1993-04-15 | Nestle Sa |
-
2001
- 2001-01-04 US US10/168,303 patent/US7259243B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-04 KR KR1020027008782A patent/KR100733538B1/ko active IP Right Grant
- 2001-01-04 EP EP01900100A patent/EP1244702B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-04 CA CA2396519A patent/CA2396519C/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-04 NZ NZ519492A patent/NZ519492A/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-01-04 JP JP2001550281A patent/JP4615173B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-04 WO PCT/DK2001/000005 patent/WO2001049741A2/en active IP Right Grant
- 2001-01-04 DK DK01900100T patent/DK1244702T3/da active
- 2001-01-04 PT PT01900100T patent/PT1244702E/pt unknown
- 2001-01-04 RU RU2002118313/13A patent/RU2264734C2/ru active
- 2001-01-04 ES ES01900100T patent/ES2258520T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-04 DE DE60119077T patent/DE60119077T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-01-04 AU AU23528/01A patent/AU784322B2/en not_active Expired
- 2001-01-04 AT AT01900100T patent/ATE324378T1/de active
- 2001-01-05 AR ARP010100042A patent/AR027507A1/es active IP Right Grant
-
2002
- 2002-06-24 NO NO20023057A patent/NO330264B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100733538B1 (ko) | 2007-06-28 |
| AU2352801A (en) | 2001-07-16 |
| NZ519492A (en) | 2003-03-28 |
| NO20023057D0 (no) | 2002-06-24 |
| WO2001049741A3 (en) | 2002-01-17 |
| ES2258520T3 (es) | 2006-09-01 |
| US20030149249A1 (en) | 2003-08-07 |
| DE60119077D1 (de) | 2006-06-01 |
| DK1244702T3 (da) | 2006-08-28 |
| CA2396519A1 (en) | 2001-07-12 |
| AR027507A1 (es) | 2003-04-02 |
| US7259243B2 (en) | 2007-08-21 |
| EP1244702B1 (en) | 2006-04-26 |
| JP2003519239A (ja) | 2003-06-17 |
| RU2264734C2 (ru) | 2005-11-27 |
| DE60119077T2 (de) | 2006-09-07 |
| NO20023057L (no) | 2002-06-24 |
| RU2002118313A (ru) | 2004-02-20 |
| WO2001049741A2 (en) | 2001-07-12 |
| CA2396519C (en) | 2011-03-22 |
| JP4615173B2 (ja) | 2011-01-19 |
| AU784322B2 (en) | 2006-03-09 |
| ATE324378T1 (de) | 2006-05-15 |
| PT1244702E (pt) | 2006-08-31 |
| EP1244702A2 (en) | 2002-10-02 |
| KR20020073159A (ko) | 2002-09-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO330264B1 (no) | En fremgangsmate for isolering av osteopontin fra melk | |
| EP0822752B1 (en) | Method for microfiltration of milk, milk serum, colostrum, or colostral whey | |
| AU774203B2 (en) | Whey protein concentrate and method of producing the same | |
| NO151567B (no) | Fremgangsmaate for oppnaaelse av et alfa-laktalbumin-anriket produkt fra myse. | |
| GB2063273A (en) | Soluble Denatured Whey Protein | |
| NO167157B (no) | Fremgangsmaate for kromatografisk separering av laktose fra melk. | |
| US6720018B2 (en) | Method for producing milk calcium composition | |
| EP0291264B1 (en) | Process for the production of k-casein glycomacropeptide | |
| JP3236828B2 (ja) | 乳カルシウム組成物 | |
| Durham et al. | Waste management and co-product recovery in dairy processing | |
| US20110159163A1 (en) | Method for filtering milk | |
| EP0437958B1 (en) | Method for heat treatment of lactoferrin without losing physiological activities thereof | |
| US5654019A (en) | Bone enhancing factors from whey and compositions containing the same | |
| Quezada et al. | Optimization of conditions for Greek style yogurt acid whey demineralization and its effects on filterability | |
| JP3604159B2 (ja) | 乳清由来の骨芽細胞増殖促進及び骨強化因子ならびに該因子を含有せしめた骨強化食品、医薬および飼料 | |
| EP0580694B1 (en) | Production of phosphopeptides from casein | |
| WO2014153381A1 (en) | Alpha-lactalbumin enriched whey protein compositions and methods of making and using them | |
| García-Garibay et al. | Whey proteins: bioengineering and health | |
| SU651650A3 (ru) | Способ выделени белка из сыворотки коровьего молока | |
| AU2019243464A1 (en) | Method for producing composition containing kappa-casein glycomacropeptide | |
| US20240114919A1 (en) | Crystallisation of beta-lactoglobulin using multiple protein feeds | |
| AU5448801A (en) | Method for microfiltration of milk or colostral whey | |
| LT6193B (lt) | Ilgo laikymo jogurto gėrimas 3,6 % riebumo ir jo gamybos būdas | |
| LT6186B (lt) | Rekombinuotas 2,5 % riebumo, sterilizuotas pienas ir jo gamybos būdas | |
| LT6198B (lt) | Rekombinuota grietinėlė apdorota labai aukštoje temperatūroje 25 % riebumo ir jos gamybos būdas |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MK1K | Patent expired |