NO330243B1 - Forbindelser som er partielle og fullstendige agonister av A1-adenosinreseptorer, samt farmasoytiske preparater som omfatter slike forbindelser - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye forbindelser som er partielle eller fullstendige Ai-adenosinreseptoragonister. Forbindelsene har anvendelse i behandling av dyr for ulike sykdomstilstander inkludert kardiovaskulær sykdom, spesielt arytmi, og forebyggingen av plutselig død som skyldes arytmi, iskemi, CNS-forstyrrelser inkludert smerte, epilepsi, emese og metabolske forstyrrelser inkludert diabetes og overvekt. Oppfinnelsen vedrører også farmasøytiske preparater som inneholder slike forbindelser.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Adenosin er et naturlig forekommende nukleosid som utøver sine biologiske effekter ved å interagere med en familie av adenosinreseptorer som er kjent som Ai, A2aog A3, der alle disse modulerer viktige fysiologiske prosesser. For eksempel modulerer A2a-adenosinreseptorer koronar blodkarutvidelse, A2b-reseptorer har blitt tillagt en rolle i mastcelleaktivering, astma, blodkarutvidelse, regulering av cellevekst, tarmfunksjon og modulering av nevrosekresjon (se Adenosine A2b Receptors as Therapeutic Targets, Drug Dev. Res. 45:198, Feoktisov et al, Trends Pharmacol. Sei. 19:148-153) og A3-adenosinreseptorer modulerer celledelingsprosesser.

Aradnosinreseptoragonister modulerer de kardiostimulatoriske effektene av katekolamin (mediert via hemmingen av adenylatsyklase) og senker hjertetakten (HR) og forlenger impulsforplantningen gjennom AV-knuten, noe som i stor grad skyldes aktivering av IkacIo- (B. Lerman og L. Belardinelli, Circulation, vol.83 (1991), s.1499-1509 og J.C. Shyrock og L. Belardinelli, The Am. J. Cardiology, vol.79 (1997) s.2-10). Stimulering av Ai-adenosinreseptoren forkorter varigheten og minsker amplituden til aksjonspotensialet til AV-knuteceller. Stimulering av Ai-reseptorer tilveiebringer dermed en fremgangsmåte for behandling av supraventrikulær takykardi, inkludert terminering av knutetilbakekoblingstakykardi, og kontroll av ventrikulær takt ved atrieflimmer og ved atrieflutter.

Ai-agonister er også nyttige til emesis, og til behandling av ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, hyperglycemi, epilepsi (antikrampefremkallende aktivitet) og tilveiebringer kardio- og nevrobeskyttelse. De har også antilipolytiske effekter i adipocytter som fører til minsket frigjøring av frie fettsyrer.

I forhold til dette er det et mål for denne oppfinnelsen å tilveiebringe forbindelser som er sterke fullstendige Ai-adenosinreseptoragonister eller partielle Ai-reseptor-agonister med en halveringstid som er lengre enn halveringstiden for adenosin. Foretrukne forbindelser ifølge oppfinnelsen er selektive for Ai-adenosinreseptoren, noe som minimaliserer uønskede bivirkninger som er relatert til stimulering eller antagonisering av de andre adenosinreseptorene.

Oppsummering av oppfinnelsen

I et første aspekt vedrører oppfinnelsen forbindelser med formel I:

der:

R<1>er syklopentyl eller sykloheksyl som begge eventuelt kan være substituert med hydroksy eller -C02CH2CH3,

R<2>er hydrogen,

R<3>er fenyl, isoksazolyl, tiofenyl eller tiazolyl, idet enhver av disse eventuelt kan være substituert med én eller flere substituenter valgt blant metyl, metoksy, fluor og klor,

R<4>og R<5>er hydrogen,

T er en kovalent binding eller metylen,

X er en kovalent binding,

Y er -O-, -S-, -NH- eller en kovalent binding, og

Z er metylen.

Et andre aspekt av denne oppfinnelsen vedrører farmasøytiske preparater som kan anvendes til behandling av en sykdomstilstand hos et pattedyr, valgt blant hyperlipidemi, forkammerflimmer, supraventrikulær takykardi og forkammerflimmer, kongestiv hjertesvikt, epilepsi, slag, diabetes, overvekt, iskemi, stabil angina, ustabil angina, hjertetransplantasjon og hjerteinfarkt, og omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse med formel I.

Forbindelsene med formel I kan anvendes i behandlingen av en sykdom eller tilstand hos et pattedyr som nyttig kan bli behandlet med en partiell eller fullstendig Ar adenosinreseptoragonist. Slike sykdommer inkluderer atrieflimmer, supraventrikulær takykardi og atrieflutter, kongestiv hjertesvikt, inkludert plutselig død på grunn av disse tilstandene via den anti-lipolytiske virkningen til disse forbindelsene, iskemi, inkludert den som skyldes stabil og ustabil angina, hjertetransplantasjon, hjerteinfarkt, CNS-forstyrrelser inkludert epilepsi og slag, emesis og metabolske forstyrrelser, spesielt hyperlipidemi som skyldes diabetes eller overvekt via den antilipolytiske effekten til Ai-agonister på adipocytter.

Definisjoner av generelle uttrykk

Slik som de blir benyttet i foreliggende beskrivelse er det generelt ment at de følgende ordene og uttrykkene skal ha betydningene som blir fremlagt nedenfor, bortsett fra der det i konteksten går frem at betydningen skal være en annen.

"Eventuelt" betyr at de påfølgende beskrevne hendelsene eller forholdene kan forekomme eller at de ikke forekommer, og at beskrivelsen inkluderer tilfeller der nevnte hendelse eller forhold forekommer og tilfeller der de ikke forekommer.

Uttrykket "forbindelse med formel I" er ment å skulle omfatte forbindelsene ifølge oppfinnelsen slik som de gjøres kjent. I tillegg kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen inneha ett eller flere asymmetriske sentere og kan bli fremstilt som en rasemisk blanding eller som individuelle enantiomerer eller diastereoisomerer. Antallet stereoisomerer til stede i enhver gitt forbindelse med formel I avhenger av antallet asymmetriske sentere som foreligger (det er 2n mulige stereoisomerer der n er antallet asymmetriske sentere). De individuelle stereoisomerene kan bli fremskaffet ved å løse en rasemisk eller ikke-rasemisk blanding av et mellomprodukt ved et passende stadium i løpet av syntesen eller ved resolusjon av forbindelsen med formel I ved hjelp av konvensjonelle midler. De individuelle stereoisomerene (inkludert individuelle enantiomerer og diastereoisomerer) i tillegg til rasemiske og ikke-rasemiske blandinger av stereoisomerer er omfattet innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, der alle disse ment å skulle være avbildet ved hjelp av strukturene ifølge denne beskrivelsen hvis ikke annet spesifikt er indikert.

"Isomerer" er ulike forbindelser som har samme molekylære formel.

"Stereoisomerer" er isomerer som kun skiller seg fra hverandre ved måten atomene romlig står i forhold til hverandre.

"Enantiomerer" er et par av stereoisomerer som er ikke-overdekkende speilbilder av hverandre. En l:l-blanding av et enentiomerpar er en "rasemisk" blanding. Uttrykket blir benyttet for å betegne en rasemisk blanding der det er hensiktsmessig.

"Diastereoisomerer" er stereoisomerer som har minst to asymmetriske atomer, men som ikke er speilbilder av hverandre.

Den absolutte stereokjemien er spesifisert ifølge Cahn-Ingold-Prelog-R-S-systemet. Når forbindelsen er en ren enantiomer kan stereokjemien på hvert kirale karbon bli spesifisert ved enten R eller S. Løste forbindelser hvis absolutte konfigurasjon er ukjent blir betegnet (+) eller (-) avhengig av retningen (dekstro- eller levorotering) de roterer planet av polarisert lys ved bølgelengden til natrium-D-linjen.

Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" refererer til mengden av en forbindelse med formel I som er tilstrekkelig for å utføre behandling, som definert nedenfor, når den administreres til et pattedyr med behov for slik behandling. Den terapeutisk effektive mengden vil variere avhengig av individet og sykdomstilstanden som blir behandlet, vekten og alderen til individet, alvorligheten av sykdomstilstanden, administrasjonsmåten og liknende, noe som med enkelhet kan bli bestemt av erfarne fagfolk på området.

Uttrykket "behandling" eller "å behandle" betyr enhver behandling av en sykdom hos et pattedyr, inkludert: (i) forebygging av sykdommen, d.v.s., forårsake at de kliniske symptomene til sykdommen ikke utvikles, (ii) hemme sykdommen, d.v.s., stoppe utviklingen av kliniske symptomer, og/eller

(iii) lindre sykdommen, d.v.s., forårsake tilbakegang av kliniske symptomer.

Som benyttet her inkluderer "farmasøytisk akseptabel bærer" ethvert og alle løsningsmidler, dispergeringsmedier, belegg, antibakterielle midler og antisoppmidler, isotoniske og absorpsjonsforsinkende midler og liknende. Anvendelsen av slike medier og midler som farmasøytisk aktive stoffer er velkjent på fagområdet. Bortsett fra i den grad ethvert konvensjonelt medium eller middel ikke er kompatibelt med den aktive ingrediensen er dets anvendelse i de terapeutiske preparatene ansett som passende. Ytterligere aktive ingredienser kan også bli benyttet i preparatene.

Som benyttet her refererer uttrykket "agonist" til en forbindelses evne til å interagere med en reseptor og fremkalle en maksimal effekt. Denne effekten er kjent som den interne effektiviteten. Mange fullstendige agonister av adenosin-Arreseptoren er kjent for fagfolk på området, for eksempel N<6->syklopentyladenosin (CPA). I motsetning til dette interagerer "partielle agonister" med adenosin-Ai-reseptorer men fremkaller bare en respons som er mindre enn maksimal.

Den interne effektiviteten til en forbindelse kan variere i ulike vev. En forbindelse kan dermed være en fullstendig agonist i et gitt vev men bare en partiell i andre. Forbindelsene som er identifisert ifølge denne oppfinnelsen har terapeutisk nyttige affiniteter for adenosin-Al-reseptoren men har et internt effektivitetsområde som strekker seg fra fullstendige agonist til partiell agonist. Det vil si at noen forbindelser kan ha null effekt med hensyn på et gitt effektorsystem i en gitt celletype mens de i en annen celletype og/eller effektorsystem er fullstendige agonister. En partiell agonist som er målrettet mot et valgt mål fører for det meste til færre sideeffekter enn fullstendige agonister. En partiell Ai-reseptoragonist kan for eksempel ha null effekt på hjertet men være en sterk antilipolytisk forbindelse.

Partielle A t-agonister kan ha et ytterligere fortrinn i forhold til kronisk terapi fordi det er mindre sannsynlig at de fører til at Ai-reseptoren blir mindre sensitiv (R.B. Clark, BJ. Knoll, R. Barber TiPS, vol 20 (1999) s.279-286) og til at bivirkninger oppstår. Kronisk administrering av fullstendige agonister (R-N6-fenylisopropyladenosin, R-PIA) i 7 dager førte til at Arreseptoren ble mindre sensitiv med hensyn på den dromotropiske responsen hos marsvin (PS: en minking i reseptorantall ble observert - D.M. Dennis, J.C Shyrock, L. Belardinelli JPET, vol. 272 (1995) s.1024-1035). Den Aragonistinduserte hemmende effekten på produksjonen av cAMP fra adenylatsyklase i adipocytter har blitt vist å avsensitivisere ved kronisk behandling med en Aragonist også (WJ. Parsons og G.LJ. Biol. Chem. Vol. 262 (1987) s.841-847).

Nomenklatur

Benevnelsen og nummereringen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen er illustrert med en forbindelse som ikke omfattes av oppfinnelsen ettersom R<1>er tetrahydrofuran-3-yl:

som er betegnet: (4S,2R,3R,5R)-2-(2-fluorfenoksymetyl)]-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)purin-9-yl]tetrahydrofuran-3,4-diol.

Syntetiske reaksjonsparametere

Uttrykkene "løsningsmiddel", "inert organisk løsningsmiddel" eller "inert løsningsmiddel" betyr et løsningsmiddel som er inert ved betingelsene i reaksjonen som blir beskrevet i sammenheng med dette [inkludert for eksempel benzen, toluen, acetonitril, tetrahydrofuran ("THF"), dimetylformamid ("DMF"), kloroform, metylen-klorid (eller diklormetan), dietyleter, metanol, pyridin og liknende]. Hvis ikke det motsatte er spesifisert er løsningsmidlene som benyttes i reaksjonene ifølge foreliggende oppfinnelse inerte organiske løsningsmidler.

Uttrykket "q.s." betyr å tilsette en mengde som er tilstrekkelig for å oppnå en spesifisert funksjon, for eksempel sørge for at en løsning når et ønsket volum (dvs. 100 %).

Syntese av forbindelsene med formel I

Forbindelsene med formel I kan bli fremstilt ved å ta utgangspunkt i en forbindelse med formel (1) som vist i reaksjonsskjema I.

Trinn 1 - Fremstilling av formel ( 2)

Utgangsforbindelsene med formel (1) er kommersielt tilgjengelige (for eksempel er forbindelsen med formel (1) der R<2>er hydrogen tilgjengelig fra Aldrich, Milwaukee) eller de blir fremstilt på måter som er velkjent for fagfolk på området. 6-klor-enheten blir fjernet fra forbindelsen med formel (1) ved hjelp av reaksjon med en forbindelse med formel R<1>XNH2, der X er en kovalent binding eller eventuelt substituert alkylen, i nærværet av en base, foretrukket trietylamin. Reaksjonen blir utført i et inert protonisk løsningsmiddel, helst etanol, ved en temperatur ved omtrent refluks i omtrent 14-48 timer, helst omtrent 24 timer). Når reaksjonen i all vesentlighet er fullstendig blir produktet med formel (2) isolert ved hjelp av konvensjonelle måter, for eksempel ved å fjerne løsnings-middelet under redusert trykk etterfulgt av kromatografering av resten på silikagel.

Trinn 2 - Fremstilling av formel ( 3)

Forbindelsen med formel (3) blir fremstilt konvensjonelt fra forbindelsen med formel (2) ved hjelp av reaksjon med 2,2-dimetoksypropan i et inert løsningsmiddel, helst dimetylformamid, i nærvær av en katalytisk mengde av en syrekatalysator, helst p-toluen-sulfonsyre, ved en temperatur på omtrent 40-90 °C, helst omtrent 70 °C, i omtrent 24-72 timer, helst omtrent 48 timer. Når reaksjonen i all vesentlighet er fullstendig blir produktet med formel (3) isolert ved hjelp av konvensjonelle måter, for eksempel ved fjerning av løsningsmiddelet under redusert trykk og rensing av resten ved hjelp av kromatografi.

Trinn 3 - Fremstilling av formel I

For å fremstille en forbindelse med formel I der T er en kovalent binding og der Y er -O- eller -S- blir forbindelsen med formel (3) reagert med en forbindelse med formel R<3->YH, der R<3>er som definert ovenfor og Y er -O- eller -S-, i nærvær av trifenylfosfin og et dialkylazodikarboksylat, helst diisopropylazodikarboksylat, i et inert løsningsmiddel, helst en eter, og aller helst tetrahydrofuran. Reaksjonen blir utført ved en temperatur på omtrent 40-100 °C, helst ved omtrent 65 °C, i omtrent 24-100 timer, helst i omtrent 72 timer. Når reaksjonen i all vesentlighet er fullstendig blir produktet med formel I, som er beskyttet som et acetonid, isolert ved hjelp av konvensjonelle måter, for eksempel ved fjerning av løsningsmiddelet under redusert trykk og rensing av resten ved hjelp av kolonnekromatografi.

Fremstilling av en forbindelse med formel I der T er metylen og Y er -O- eller -S-, kan bli utført på samme måte som vist ovenfor. Alternativt kan forbindelser med formel I der Y er -O- bli fremstilt ved å reagere forbindelsen med formel (3) med en forbindelse med formel R<3->T-halo der T er metylen. Reaksjonen blir utført i nærvær av en sterk base, helst kaliumbutoksid, og produktet blir isolert på konvensjonelle måter.

Den beskyttede forbindelsen blir deretter konvertert til en forbindelse med formel I ved hjelp av behandling med en syre, helst en organisk syre, for eksempel med eddiksyre. Reaksjonen blir utført i en blanding av syren og vann ved omtrent 50-100 °C, helst ved omtrent 80-90 °C, i omtrent 10-48 timer, helst i omtrent 16 timer. Når reaksjonen i all vesentlighet er fullstendig blir produktet med formel I isolert ved hjelp av konvensjonelle måter, for eksempel ved fjerning av løsningsmiddelet under redusert trykk etterfulgt av kromatografering av resten på silikagel.

Det bør legges merke til at trinn 2 og 3 kan bli utført i omvendt rekkefølge.

Fremstilling av en forbindelse der Y er NH

Syntesen av en forbindelse med formel I der Y er NH er vist i reaksjonsskjema II nedenfor.

Trinn 1 - Fremstilling av formel ( 9)

Forbindelsen med formel (9) blir fremstilt konvensjonelt fra forbindelsen med formel (3) ved hjelp av reaksjon med metansulfonylklorid løst i et inert løsningsmiddel i 1-3 timer ved omtrent -10 °C til 20 °C. Produktet med formel (9) blir isolert på en konvensjonell måte og benyttet i den neste reaksjonen uten ytterligere rensing.

Trinn 2 - Fremstilling av formel ( 10)

Forbindelsen med formel (9) blir konvertert til en forbindelse med formel (10) ved hjelp av reaksjon med natriumazid i et inert løsningsmiddel, helst dimetylformamid, ved å varme opp til 55-75 °C i 12-20 timer. Når reaksjonen i all vesentlighet er fullstendig blir produktet med formel (10) isolert på en konvensjonell måte.

Trinn 3 - Fremstilling av formel ( 11)

Azidoderivatet med formel (10) blir redusert til det tilsvarende aminet ved hjelp av katalytisk reduksjon, helst ved å benytte 10 % PD/C i etanol under en atmosfære av hydrogen ved romtemperatur i 12-20 timer. Når reaksjonen i all vesentlighet er fullstendig blir produktet med formel (11) isolert på en konvensjonell måte.

Trinn 4 - Fremstilling av formel ( 12)

Forbindelsen med formel (11) blir konvertert til en forbindelse med formel (12) på samme måte som vist i reaksjonsskjema I, trinn 3.

Trinn 5 - Fremstilling av en forbindelse med formel I der Y er NH

Forbindelsen med formel (12) blir konvertert til en forbindelse med formel I på samme måte som vist i reaksjonsskjema I, trinn 3.

Anvendbarhet, testing og administrering

Generell anvendbarhet

Forbindelsene med formel I er effektive i behandlingen av tilstander som er kjent for å bli påvirket av administrering av partielle eller fullstendige agonister av en Ai-adenosinreseptor. Slike tilstander inkluderer, men er ikke begrenset til, akutte og kroniske forstyrrelser av hjerterytme, spesielt de sykdommene som erkarakterisert vedhurtig hjerterytme, der rytmen er fremkalt av abnormiteter i de sinoatrielle vev, atrielle vev og i AV-knutevev. Slike forstyrrelser inkluderer, men er ikke begrenset til, hjerteflimmer, supraventrikulær takykardi og atrieflutter, kongestiv hjertesvikt og plutselig død som skyldes arytmi, ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, hyperglycemi, epilepsi (antikrampefremkallende aktivitet) og kardio- og nevrobeskyttelse. Ai-agonistene ifølge oppfinnelsen har også antilipolytiske effekter som fører til minsket frigjøring av ikke-forestrede fettsyrer.

Tilsvarende er Aradenosinagonister nyttige i behandlingen av akutte og kroniske forstyrrelser av hjerterytme, spesielt de sykdommene som erkarakterisert vedhurtig hjerterytme, der rytmen er fremkalt av abnormiteter i de sinoatrielle, atrielle og i AV-knutevev. Slike forstyrrelser inkluderer, men er ikke begrenset til, hjerteflimmer, supraventrikulær takykardi og atrieflutter. Eksponering for Aragonister forårsaker en reduksjon i hjerterytmen og en regularisering av den unormale rytmen, noe som dermed forbedrer kardiovaskulær funksjon.

Ai-agonister minsker cellulært cAMP på grunn av sin evne til å hemme effekten av katekolaminer, og har dermed fordelaktige effekter på det sviktende hjertet der økt sympatetisk tonus øker cellulære cAMP-nivåer. Den siste tilstanden har blitt vist å være assosiert med økt sannsynlighet for ventrikulære arytmier og plutselig død. Se for eksempel B. Lerman og L. Belardinelli, Circulation, vol.83 (1991), s. 1799-1509 og J.C. Shyrock og L. Belardinelli, Am. J. Cardiology, vol.79 (1997) s.2-10.

Som et resultat av deres hemmende virkning på generering av syklisk AMP har Ai-agonister antilipolytiske effekter i adipocytter som fører til en økt frigjøring av ikke-forestrede fettsyrer (NEFA) (E.A. van Schaick et al., J. Pharmacokinetics and Bio-pharmaceutics, vol.25 (1997), s.673-694 og P. Strong, Clinical Science, vol.84 (1993), s.663-669). Ikke-insulinavhengig diabetes mellitus (NIDDM) erkarakterisert veden insulinresistens som fører til hyperglycemi. Faktorer som bidrar til den observerte hyper-glycemien er et fravær av normalt glukoseopptak og aktivering av glykogensyntase (GS) i skjelettmuskel. Forhøyede nivåer av NEFA har blitt vist å hemme insulinstimulert glukoseopptak og glykogensyntese (D. Thiebaud et al., Metab. Clin. Exp.. vol.31 (1982), s.l 128-1136 og G. Boden et al., J. Clin. Invest., vol.93 (1994), s.2438-2446). Hypotesen med en glukosefettsyresyklus ble foreslått av P.J. Randle så tidlig som i 1963 (P.J. Randle et al., Lancet (1963), s.785-789). Begrensing av tilgangen på fettsyrer til de perifere vevene fremmer dermed karbohydratutnyttelsen (P. Strong et al., Clinical Science, vol.84

(1993), s.663-669).

Fordelen med en Ai-agonist ved sentralnerveforstyrrelser har blitt gjennomgått (L.J.S. Knutsen og T.F. Murray i Purinergic Approaches in Experimental Therapeutics, red. K.A. Jacobson og M.F. Jarvis (1997) Wiley-Liss, N.Y., s.423-470). Løst basert på eksperimentelle modeller med epilepsi har en blandet A2A:At -agonist, metrifudil, blitt vist å være et sterkt antikrampefremkallende middel mot anfall som er indusert av det inverse benzodiazepinet mot metyl-6,7-dimetoksy-4-etyl-beta-karbolin-3-karboksylat (DMCM, H. Klitgaard, Eur. J. Pharmacol. (1993), vol.224, s.221-228). I andre undersøkelser, der A2A-agonisten CGS 21680 ble benyttet, ble det konkludert med at den antikrampefremkallende aktiviteten var knyttet til aktivering av Arreseptoren (G. Zhang et al., Eur. J. Pharmacol. vol. 255 (1994), s.239-243). Videre har Ai-adenosinselektive agonister blitt vist å ha antikrampefremkallende aktivitet i DMCM-modellen (LJ.S. Knutsen i Adenosine and Adenne Nucleotides: From Molecular Biology to Integrative Physiology, red. L. Belardinelli og A. Pelleg, Kluwer, Boston, 1995, s.479-487). Et annet område der en Ai-adenosinagonist har et fremtrinn er i dyremodeller med forhjerneiskemi som vist av Knutsen et al. (J. Med. Chem., vol.42 (1999), s.3463-3477). Fordelen ved nevro beskyttelse er antatt å delvis skyldes hemmingen av frigjøringen av eksitoriske aminosyrer (ibid).

Testing

Aktivitetstesting er utført som beskrevet i de ovenfor refererte patentene og litteraturhenvisningene, og som i eksemplene nedenfor, og ved hjelp av fremgangsmåter som er åpenbare for fagfolk på området.

Farmasøytiske preparater

Forbindelsene med formel I blir vanligvis administrert i form av farmasøytiske preparater. Denne oppfinnelsen tilveiebringer derfor farmasøytiske preparater som inneholder som aktiv ingrediens en forbindelse med formel I. Preparatene kan også inneholde én eller flere farmasøytisk akseptable eksipienser, bærere, inkludert inerte faste fortynnende midler, fortynningsmidler, inkludert steril vandig løsning og ulike organiske løsningsmidler, gjennomtrengingsfremmere, løseliggjørende midler og adjuvanser. Slike preparater blir fremstilt på en måte som er velkjent på det farmasøytiske fagområdet (se for eksempel Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Co., Philadelphia, PA, 17.utgave (1985) og "Moderen Pharmaceutics", Marcel Dekker, Inc. 3.utgave (G.S. Banker & C.T. Rhodes, red.).

Administrering

Forbindelsene med formel I kan bli administrert i enten enkle eller multiple doser på enhver akseptert administreringsmåte for midler som har liknende anvendelser, for eksempel som beskrevet i de patentene og patentsøknadene som er referert i denne beskrivelsen, inkludert rektalt, buccalt, intranasalt og transdermalt, ved intra-arteriell injeksjon, intravenøst, intraperitonalt, parenteralt, intramuskulært, subkutant, oralt, topisk som et inhalert middel, eller via en impregnert eller belagt innretning slik som for eksempel en stent, eller en arterieinnsatt sylindrisk polymer.

En administreringsmåte er parenteral, spesielt ved hjelp av injeksjon. Formene de nye forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bli inkorporert i for administrering ved injeksjon inkluderer vann- eller oljesuspensjoner, eller emulsjoner med sesamolje, maisolje, bomullsfrøolje eller peanøttolje, i tillegg til eliksirer, mannitol, dekstrose eller en steril vandig løsning, og liknende farmasøytiske vehikler. Vandige løsninger i fysiologisk saltvann er også konvensjonelt benyttet for injeksjon men mindre foretrukket i konteksten av foreliggende oppfinnelse. Etanol, glyserol, propylenglykol, flytende polyetylenglykol og liknende (og passende blandinger derav), syklodekstrinderivater og planteoljer kan også bli benyttet. Den hensiktsmessige fluiditeten kan bli opprettholdt ved for eksempel anvendelsen av en belegning slik som lecitin, ved opprettholdelsen av den påkrevde partikkelstørrelsen i tilfellet med dispersjon og ved anvendelsen av overflate- aktive stoffer. Forebyggingen av virkningen fra mikroorganismer kan bli sikret ved hjelp av ulike antibakterielle midler og antisoppmidler, for eksempel parabener, klorbutanol, fenol, sorbinsyre, timerosal og liknende.

Sterile injiserbare løsninger blir fremstilt ved å inkorporere forbindelsen med formel I i påkrevd mengde i det hensiktsmessige løsningsmiddelet med ulike andre ingredienser, som listet opp ovenfor, etter som det er påkrevd, etterfulgt av filtrerings-sterilisering. Generelt blir dispersjoner fremstilt ved å inkorporere de ulike steriliserte aktive ingrediensene i en steril vehikkel som inneholder basisdispersjonsmediumet og de påkrevde andre ingrediensene blant de som er listet opp ovenfor. I tilfellet med sterile pulvere for fremstilling av sterile injiserbare løsninger er de foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling vakuumtørkings- og frysetørkingsteknikker som gir et pulver av den aktive ingrediensen pluss enhver ytterligere ingrediens fra en tidligere sterilfiltrert løsning derav.

Oral administrering er en annen administreringsmåte for forbindelsene med formel I. Administrering kan foregå med kapsel- eller enteriskbelagte tabletter eller liknende. Ved tillagingen av de farmasøytiske preparatene som inkluderer minst én forbindelse med formel I blir den aktive ingrediensen vanligvis fortynnet med en eksipiens og/eller innesluttet i en slik bærer som kan foreligge i form av en kapsel, en porsjonspakke, papir eller annen beholder. Når eksipiensen tjener som fortynningsmiddel kan det være et fast, halvfast eller flytende materiale (se ovenfor) som virker som en vehikkel, bærer eller medium for den aktive ingrediensen. Preparatene kan derfor foreligge i form av tabletter, piller, pulvere, pastiller, liten pose, kapsler, eliksirer, suspensjoner, emulsjoner, løsninger, siruper, aerosoler (som et fast stoff eller i et flytende medium), salver som inneholder for eksempel opp til 10 vektprosent av den aktive forbindelsen, bløte eller harde gelatinkapsler, sterile injiserbare løsninger og sterilt forpakkede pulvere.

Noen eksempler på passende eksipienser inkluderer laktose, dekstrose, sukrose, sorbitol, mannitol, stivelser, arabisk gummi, kalsiumfosfat, alginater, tragant, gelatin, kalsiumsilikat, mikrokrystallinsk cellulose, polyvinylpyrrolidon, cellulose, sterilt vann, sirup og metylcellulose. Formuleringene kan ytterligere inkludere smørende midler slik som talkum, magnesiumstearat og mineralolje, fuktende midler, emulgerende og suspenderende midler, preserveringsmidler slik som metyl- og propylhydroksybenzoater, søtningsmidler og smakssettende midler.

Preparatene ifølge oppfinnelsen kan bli formulert slik at de tilveiebringer rask, opprettholdt eller forsinket frigjøring av den aktive ingrediensen etter administrering til pasienten ved å benytte prosedyrer som er kjent på fagområdet. Leveringssystemer med kontrollert frigjøring av legemidler for oral administrering inkluderer osmotiske pumpesystemer og oppløsningssystemer som inneholder polymerbelagte reservoarer eller formuleringer med legemiddelpolymermatriks. Eksempler på systemer med kontrollert frigivelse er gitt i U.S. patentene med nr. 3,845,770, 4,326,525, 4,902,515 og 5,616,345. En annen formulering til anvendelse i fremgangsmåtene ifølge foreliggende oppfinnelse benytter transdermale avleveringsinnretninger ("plastre"). Slike transdermale plastre kan bli benyttet for å tilveiebringe kontinuerlig eller diskontinuerlig infusjon av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse i kontrollerte mengder. Fremstillingen og anvendelsen av transdermale plastre for avlevering av farmasøytiske midler er velkjent på fagområdet. Se for eksempel U.S. patentskriftene 5,023,252, 4,992,445 og 5,001,139. Slike plastre kan bli fremstilt for kontinuerlig, pulserende eller fordret avlevering av farmasøytiske midler.

Preparatene er foretrukket formulert i en enhetsdoseringsform. Uttrykket "enhetsdoseringsform" refererer til fysisk avgrensede enheter som er passende til enhetsdoser for humane individer og andre pattedyr, der hver enhet inneholder en forhåndsbestemt mengde av aktivt materiale som det er beregnet vil fremkalle den ønskede terapeutiske effekten, sammen med en passende farmasøytisk eksipiens (for eksempel en tablett, kapsel, ampulle). Forbindelsene med formel I er effektive over et bredt doseringsområde og blir generelt administrert i en farmasøytisk effektiv mengde. For oral administrering inneholder hver doseringsenhet foretrukket fra 10 mg til 2 g av en forbindelse med formel I, mer foretrukket fra 10 til 700 mg, og for parenteral administrering foretrukket fra 10 til 700 mg av en forbindelse med formel I, mer foretrukket omtrent 50-200 mg. Det må likevel bli forstått at mengden av forbindelsen med formel I som faktisk blir administrert vil bli bestemt av en lege i lys av de relevante omstendighetene, inkludert tilstanden som skal bli behandlet, den valgte administreringsmåte, den faktiske forbindelsen som blir administrert og dens relative aktivitet, alderen, vekten og responsen til den individuelle pasient, alvorligheten av pasientens symptomer og liknende.

For å fremstille faste preparater slik som tabletter blir den aktive hovedin-grediensen blandet med en farmasøytisk eksipiens for å danne et fast preformulerings-preparat som inneholder en homogen blanding av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse. Når det refereres til disse preformuleringspreparatene som homogene er det ment at den aktive ingrediensen er dispergert jevnt i hele preparatet slik at preparatet lett kan bli delt opp i tilsvarende effektive enhetsdoseirngsformer slik som tabletter, piller og kapsler.

Tablettene eller pillene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være belagte eller på annen måte sammensatt for å tilveiebringe en doseringsform som gir fordelen med forlenget virkning, eller for å beskytte mot de sure forholdene i magen. Tabletten eller pillen kan for eksempel omfatte en indre og en ytre doseringskomponent der den siste foreligger i form av en kappe rundt den første. De to komponentene kan være skilt av et enterisk lag som hindrer oppløsning i magen og som gjør at den indre komponenten kan passere intakt inn i duodenum eller som forsinker frigivelse. En mengde materialer kan bli benyttet som slike enteriske lag eller belegninger, der slike materialer inkluderer flere polymere syrer og blandinger av polymere syrer med slike materialer som skjellakk, cetylalkohol og celluloseacetat.

Preparater til inhalering eller innpusting inkluderer løsninger og suspensjoner i farmasøytisk akseptable, vandige eller organiske løsningsmidler, eller blandinger derav og pulvere. De flytende eller faste preparatene kan inneholde passende farmasøytisk akseptable eksipienser som beskrevet ovenfor. Preparatene blir foretrukket administrert via den orale eller nasale respiratoriske ruten for lokal eller systemisk effekt. Preparater i fortrukne farmasøytisk akseptable løsningsmidler kan bli finfordelt ved å benytte inerte gasser. Finfordelte løsninger kan bli inhalert direkte fra finfordelingsinnretningen eller den finfordelende innretningen kan være festet på en ansiktsmaske eller på en inter-mitterende positivtrykkpustemaskin. Løsnings-, suspensjons- eller pulverpreparater kan bli administrert, helst oralt eller nasalt, fra innretninger som avleverer formuleringen på en hensiktsmessig måte.

De følgende eksemplene er tatt med for å demonstrere foretrukne utførelses-former av oppfinnelsen.

Eksempler

Eksempel 1: - Fremstilling av en forbindelse med formel ( 2)

A. Fremstilling av en forbindelse med formel (2) der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl.

(Referanseeksempel)

Forbindelsen med formel (2) der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl, R2 er hydrogen og X er en kovalent binding, nemlig 2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol, blir fremstilt som beskrevet i U.S. patentskrift nr. 5,789,416. For eksempel: 1) En blanding av 3-tetrahydrofuransyre (3,5 gm, 30 mmol), difenylfosforylazid (6,82 ml, 32 mmol), trietylamin (5 ml, 36 mmol) i dioksan (35 ml) ble rørt ved romtemperatur i 20 minutter, deretter varmet opp i et oljebad ved 100 °C under tørr nitrogen i 2 timer. Benzylalkohol (4,7 ml, 45 mmol) ble deretter tilsatt og oppvarming ble fortsatt ved 100 °C i 22 timer. Blandingen ble avkjølt, filtrert og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble løst i 2N HC1 og ekstrahert to ganger med etylacetat. Ekstraktene ble kombinert og vasket med vann, deretter med natriumbikarbonat og til slutt med saltlake og tørket over magnesiumsulfat. Produktet ble konsentrert til en olje under redusert trykk. Oljen ble kromatografert på silikagel, eluert med 30 % til 60 % etylacetat/heksaner for å gi 3,4 g med N-benzyloksykarbonyl-3-aminotetrahydrofuran som en olje. 2) N-benzyloksy-3-aminotetrahydrofuranet fremstilt (3,4 g, 15 mmol) ble løst i metanol (50 ml) og konsentrert saltsyre. Pd-C (10 %, 300 mg) ble tilsatt og blandingen ble hydrogenert ved 1 atmosfære i 18 timer ved romtemperatur. Blandingen ble filtrert gjennom en pute av kiselgur og filtratet ble konsentrert under redusert trykk. Resten ble ko-fordampet to ganger med en blanding av etylacetat og metanol og deretter rekrystallisert fra en blanding av etylacetat og metanol for å gi 1,9 g med 3-aminotetrahydrofuran som et gult fast stoff.

Hvis 3-tetrahydrofuransyren i utgangspunktet er kiralt så blir produktet (3-aminotetrahydrofuran) også kiralt, d.v.s., syntesen er stereospesifikk. 3) En blanding av 6-klorpurinribosid (0,5 gm, 1,74 mmol), 3-aminotetrahydrofuran (0,325 gm, 2,6 mmol) og trietylamin (0,73 ml, 5,22 mmol) i metanol (10 ml) ble varmet opp til 80 °C i 40 timer. Blandingen ble avkjølt og konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert på en kort kolonne med silikagel og eluert med metylenklorid/metanol/propylamin (90/10/1). Fraksjonene som inneholdt produktet ble kombinert og konsentrert under redusert trykk. Resten ble kromatografert på en chromatotron (2 mm plate, 92,5/7,5/1, metylen-klorid/metanol/propylamin). Det resulterende hvite faste stoffet ble rekrystallisert fra metanol/etylacetat for å gi 0,27 gm med (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3 -ylamino)-purin-9-yl] -tetrahydrofuran-3,4-diol som hvite krystaller (smeltepunkt 128 °C-130 °C).

B. Fremstilling av en forbindelse med formel (2) der R<1>er syklopentyl.

Ved å følge prosedyrene ovenfor på tilsvarende måte, men ved å bytte 3-aminotetrahydrofuran med syklopentylamin, ble (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(syklopentylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol fremstilt.

Tilsvarende ble de følgende forbindelsene med formel (2) fremstilt: (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(sykloheksylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol,

(4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(4-hydroksysykloheksylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol,

(4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(4-hydroksysykloheksylamino)-purin-9-y tetrahydrofuran-3,4-diol og

(4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(2-hydroksysyklopentylamino)-puirn-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol.

Eksempel 2: - Fremstilling av en forbindelse med formel ( 3)

A. Fremstilling av en forbindelse med formel (3) der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl.

(Referanseeksempel)

Til en løsning av (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol, en forbindelse med formel (2) (2,0 g, 6,0 mmol) og 2,2-dimetoksypropan (1,2 g, 11,8 mmol) i dimetylformamid (20 ml) ble p-toluensulfonsyre (50 mg, 0,26 mmol) tilsatt ved 70 °C. Etter 48 timer ved 70 °C ble reaksjonen konsentrert i vakuum for å gi et fast stoff. Det faste stoffet ble løst i metanol (3 ml), deretter triturert med etyleter (50 ml) for å gi (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid.

B. Fremstilling av en forbindelse med formel (3) der R<1>er syklopentyl.

Ved å følge prosedyrene ovenfor på tilsvarende måte, men ved å bytte ut 2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol med 2-hydroksymetyl-5-[6-(syldopentylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol ble 2-hydroksymetyl-5-[6-(syklopentylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid fremstilt.

Tilsvarende ble de følgende forbindelsene med formel (3) fremstilt: (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(sykloheksylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol,

(4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(4-hydroksysykloheksylamino)-purin-9-y tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid,

(4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(4-hydroksysykloheksylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid og

(4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(2-hydroksysyklopentylamino)-puirn-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid.

Eksempel 3: - Fremstilling av en forbindelse med formel I (Referanseeksempel)

Fremstilling av en forbindelse med formel I der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl, R<3>er 2-fluorfenyl, Y er oksygen og T er en kovalent binding.

Til en løsning av (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid (500 mg, 1,33 mmol), 2-fluorfenol (179,4 mg, 1,6 mmol) og trifenylfosfin (418,3 mg, 1,6 mmol) i vannfri tetrahydrofuran (20 ml) ble DIAD (diisopropylazodikarboksylat, 320 ul, 1,6 mmol) tilsatt og varmet til refluks i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og løsningsmiddelet ble dampet av. Resten ble renset med kolonnekromatografi (eluering med etylacetat:heksan 50:50) for å gi (4S,2R,3R,5R)-2-(2-fluorfenoksy)metyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid som et rent hvitt fast stoff.

Denne forbindelsen ble behandlet med 80 % eddiksyre/vann (6 ml) og varmet ved 85 °C i 16 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur og løsningsmiddelet dampet av. Resten ble løst i metanol og avkjølt for å gi produktet (4S,2R,3R,5R)-2-(2-fluorfenoksymetyl)-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol som hvite krystaller. MS 432,1 (M+l).

Eksempel 4: - Fremstilling av en forbindelse med formel ( 9)

Fremstilling av en forbindelse med formel (9) der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl.

Trinn 1 - fremstilling av formel (9)

Metansulfonylklorid (0,477 ml, 4,77 mmol) ble tilsatt dråpevis til en løsning av 2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (3) (1,5 g, 3,9 mmol) i tørr pyridin (15 ml) avkjølt til 0 °C. Reaksjonsblandingen ble rørt i 3 timer ved 0 °C. Løsningsmiddelet ble dampet av og resten ble løst i etylacetat (50 ml), vasket med vann, tørket med vannfri MgS04og fordampet for å gi forbindelsen med formel (9), (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid-2-metylsulfonat.

Eksempel 5: - Fremstilling av en forbindelse med formel ( 10)

Fremstilling av en forbindelse med formel (10) der R1 er 3-tetrahydrofuranyl.

Natriumazid (300 mg, 4,6 mmol) ble tilsatt til en løsning av (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid-2-metylsulfonat, en forbindelse med formel (9) (1,4 g, 3 mmol) i tørr dimetylformamid (10 ml), og blandingen ble varmet opp til 65 °C i 16 timer. Løsningsmiddelet ble fordampet og resten ble utsatt for vandig opparbeiding og renset på flash-kolonne (100 % etylacetat) for å få (4S,2R,3R,5R)-2-azidometyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (10).

Eksempel 6: - Fremstilling av en forbindelse med formel ( 11)

Fremstilling av en forbindelse med formel (11) der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl.

10 Pd/C (100 mg) ble tilsatt til en løsning av (4S,2R,3R,5R)-2-azidometyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (10) (314 mg), i etanol (20 ml) og rørt under en atmosfære av hydrogen ved romtemperatur i 16 timer. Katalysatoren ble fjernet ved filtrering og løsningsmiddelet fordampet fra filtratet for å gi (4S,2R,3R,5R)-2-aminometyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (11).

Eksempel 7: - Fremstilling av en forbindelse med formel ( 12)

Fremstilling av en forbindelse med formel (12) der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl, R<3>er benzoksazol-2-yl og T er en kovalent binding.

Til en løsning av (4S,2R,3R,5R)-2-aminometyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (11) (100 mg), i etanol (5 ml) ble det tilsatt trietylamin og 2-klorbenzoksazol, og blandingen ble refluksert i 16 timer. Løsningsmiddelet ble fordampet og resten renset med preparativ TLC (5 % MeOH/DCM) for å gi (4S,2R,3R,5R)-2-(benzoksazol-2-ylaminometyl)-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (12).

Eksempel 8: - Fremstilling av en forbindelse med formel I

A. Fremstilling av en forbindelse med formel I der R<1>er 3-tetrahydrofuranyl, R<3>er benzoksasol-2-yl, Y er -NH- og T er en kovalent binding. (Referanseeksempel)

En løsning av (4S,2R,3R,5R)-2-(benzoksazol-2-ylaminometyl)-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-pvurin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid, en forbindelse med formel (12), i 80 % eddiksyre i vann (10 ml) ble varmet opp til 80 °C i 16 timer. Løsningsmiddelet ble fordampet fra reaksjonsproduktet og resten ble renset med preparativ TLC (5 % MeOH/DCM) for å gi (4S,2R,3R,5R)-2-(benzoksazol-2-ylaminometyl)-5-[6-(tetrahydrofuran-3-yl)-purin-9-yl]-tetrahydrofvjran-3,4-diol som et hvitt skum. MS (M+l).

B. Fremstilling av en forbindelse med formel I der R1 er syklopentyl, R<3>er 3-metylisoksasol-5-yl, Y er -NH- og T er en kovalent binding.

Ved å følge prosedyrene i eksemplene 4, 5, 6 og 7, og ved å bytte ut (4S,2R,3R,5R)-2-hydroksymetyl-5-[6-(tetrahydrofuran-3-ylamino)-purin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diolacetonid med en annen forbindelse med formel (12), ble likeledes den følgende forbindelse med formel I der Y er -NH- fremstilt: 2-(3-metylisoksazol-5-ylaminometyl)-5-[6-syklopentylaminopurin-9-yl]-tetrahydrofuran-3,4-diol.

Eksempel 9:

Harde gelatinkapsler inneholdende følgende ingredienser blir fremstilt:

Ingrediensene ovenfor blir blandet og fylt i harde gelatinkapsler.

Eksempel 10:

En tablettformulering blir fremstilt ved å benytte ingrediensene nedenfor:

Komponentene blir blandet og komprimert for å danne tabletter.

Eksempel 11:

En inhaleringsformulering av et tørt pulver blir fremstilt som inneholder de følgende komponentene:

Den aktive ingrediensen blir blandet med laktosen og blandingen blir tilsatt i en inhaleringsinnretning for tørt pulver.

Eksempel 12:

Tabletter som hver inneholder 30 mg med aktiv ingrediens blir fremstilt på følgende måte:

Den aktive ingrediensen, stivelsen og cellulosen blir ført gjennom en No. 20 masket US-sikt og blandet godt. Løsningen av polyvinylpyrrolidon blir blandet med de resulterende pulverne som deretter blir ført gjennom an 16-maske US-sikt. Granulene som blir fremstilt på denne måten blir tørket ved 50 °C til 60 °C og siktet på en 16-maske US-sikt. Natriumkarboksymetylstivelsen, magnesiumstearatet og talkumet, som tidligere var siktet gjennom en no. 30 masket US-sikt, blir deretter tilsatt til granulene som etter blanding blir komprimert på en tablettmaskin for å få tabletter som hver veier 120 mg.

Eksempel 13:

Stikkpiller som hver inneholder 25 mg med aktiv ingrediens blir fremstilt på følgende måte:

Den aktive ingrediensen blir siktet gjennom en No. 60 masket US-sikt og suspendert i fettsyreglyseridene som var smeltet i forkant ved å benytte den minste nødvendige varmen. Blandingen blir deretter helt over i en stikkpilleform med 2,0 gram kapasitet og tillatt å avkjøles.

Eksempel 14:

Suspensjoner som hver inneholder 50 mg med aktiv ingrediens per 5,0 ml dose blir fremstilt på følgende måte:

Den aktive ingrediensen, sukrose og xantangummi blir blandet, siktet gjennom en No. 10 masket US-sikt og deretter blandet med en forhåndstillaget løsning av mikro krystallinsk cellulose og natriumkarboksymetylcellulose i vann. Natriumbenzoat, smaks-og fargestoffet blir fortynnet med noe av vannet og tilsatt under røring. Tilstrekkelig med vann blir deretter tilsatt for å få det nødvendige volumet.

Eksempel 15:

En subkutan formulering kan bli fremstilt på følgende måte:

Eksempel 16:

Et injiserbart preparat med følgende sammensetning blir fremstilt:

Eksempel 17:

Et topisk preparat med følgende sammensetning blir fremstilt:

Alle ingrediensene ovenfor, bortsett fra vann, blir kombinert og varmet opp til 60 °C under røring. En tilstrekkelig mengde med vann ved 60 °C blir deretter tilsatt under kraftig røring for å emulgere ingrediensene, og vann blir deretter tilsatt i tilstrekkelig mengde til 100 g.

Eksempel 18:

Preparat med oppretthold frigivelse.

Formuleringene med opprettholdt frigivelse ifølge denne oppfinnelsen blir fremstilt på følgende måte: forbindelse og pH-avhengig bindingsmiddel og enhver eventuell eksipiens blir blandet godt (tørrblandet). Den tørrblandede blandingen blir deretter granulert i nærvær av en vandig løsning av en sterk base som blir sprayet inn i det blandede pulveret. Granulatet blir tørket, screenet, blandet med eventuelle smøremidler (slik som talkum eller magnesiumstearat) og komprimert til tabletter. Foretrukne vandige løsninger av sterke baser er løsninger av alkalimetallhydroksider, slik som natrium- eller kaliumhydroksid, helst natriumhydroksid, i vann (eventuelt inneholdende opp til 25 % vannblandbare løsningsmidler slik som lavere alkoholer).

De resulterende tablettene kan bli belagte med et eventuelt filmdannende middel for identifisering, smaksmaskerende hensikter og for å forbedre svelgbarhet. Det filmdannende middelet vil typisk være til stede i en mengde som ligger i området fra mellom 2 % og 4 % av tablettvekten. Hensiktsmessige filmdannende midler er velkjente på fagområdet og inkluderer hydroksypropyl, metylcellulose, kationisk metakrylatko-polymerer (dimetylaminoetylmetakrylat/metyl-butylmetakrylatkopolymerer - Eudragit-E - Rohm. Pharma), og liknende. Disse filmdannende midlene kan eventuelt inneholde fargestoffer, plastiseringsmidler og andre tilleggsingredienser.

De komprimerte tablettene har foretrukket en hardhet som er tilstrekkelig til å motstå et trykk på 8 Kp. Tablettstørrelsen vil primært avhenge av mengden av forbindelse i tabletten. Tablettene vil inkludere fra 300 til 1000 mg av fri base forbindelse. Fore trukket vil tablettene inkludere mengder av fri base forbindelse som ligger i området fra 400-600 mg, 650-850 mg og 900-1100 mg.

For å kunne påvirke oppløsningshastigheten blir tiden da det forbindelses-inneholdende pulveret blir våtblandet kontrollert. Foretrukket vil den totale pulver-blandingstiden, d.v.s., tiden pulveret er eksponert for natriumhydroksidløsning, variere fra 1 til 10 minutter og foretrukket fra 2 til 5 minutter. Etter granulering blir partiklene fjernet fra granulatoren og plassert i en fluidtørker for tørking ved omtrent 60 °C.

Eksempel 19:

Materialer

Ai-adenosinantagonistene 8-syklopentyl-l,3-dipropylxantin (CPX) og 8-syklopentyl-l,3-dimetylxantin (CPT), Ai-adenosinagonistene N6-syklopentyladenosin (CPA), 2-klor-N6-syklopentyladenosin (CCPA) og N6-sykloheksyladenosin (CHA), adenosindeaminasehemmeren erytro-9-(2-hydroksy-3-nonyl)adenin (EHNA), adenosin-kinasehemmeren jodtubericidin og forskolin ble kjøpt fra Research Biochemicals (Natick, MA). {[(5{6-[(3R)oksolan-3-yl]amino}purin-9-yl)(3S,2R,4R)-3,4-di-hydroksyoksolan-2-yl]-metoksy}-N-metylkarboksamid, molekylvekt 394,38, er et derivat av den selektive Aradenosinreseptor fullstendige agonisten CVT-510 og ble syntetisert ved CV Therapeutics av medforfatterne J.A. Zablocki og V. Palle. Adenosin ble kjøpt fra Sigma Chemicals (St. Louis, MO). Radioliganden 8-syklopentyl-l,3-dipropyl-[2,3-<3>H(N)]xantin([<3>H]CPX) ble kjøpt fra New England Nuclear (Boston, MA). Konsentrerte stokkløsninger (10-100 mM) av CVT-2759, CPX, CPT, CPA, CCPA, CHA og forskolin ble løst i dimetylsulfoksid, lagret som like volumer ved -80 °C og fortynnet i fysiologisk saltvann til bruk i eksperimenter. Sluttinnholdet av dimetylsulfoksid i saltvann under eksperimenter var ikke på mer enn 0,1 %. Adenosin og EHNA ble løst i saltvann straks før anvendelse.

Bindingsanalyser - DTT^- celler

Cellekultur

DDT-celler (hamster vas deferens glattmuskelcellelinje) ble dyrket i petriskåler ved å benytte Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) inneholdende 2,5 ug/ml amfotericin-B, 100 U/ml penicillin-G, 0,1 mg/ml streptomycinsulfat og 5 % føtaltbovint serum i en fuktet atmosfære med 95 % luft og 5 % CO2. Celler ble videredyrket to ganger ukentlig ved dispergering i Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) uten de divalente kationene og inneholdende 1 mM EDTA. Cellene ble deretter sådd ut i vekstmedium ved en tetthet på l,2xl0<5>celler per plate og eksperimenter ble utført 4 dager senere ved omtrent 1 dag prekonfluens.

Membranpreparater

Cellelag ble vasket to ganger med HBSS (2x10 ml), skrapet vekk fra platen med hjelp av en gummiskrape i 5 ml 50 mM Tris-HCl-buffer pH 7,4 ved 4 °C og suspensjonen ble homogenisert i 10 sekunder. Homogenatet ble sentrifugert ved 27 000 x g i 10 minutter, resuspendert i buffer og sentrifugert igjen, som beskrevet ovenfor. Protein-innholdet ble bestemt ved hjelp av et Biorad Protein Assay Kit (Richmond, CA) ved å benytte bovint serumalbumin som standard. Denne membransuspensjonen ble lagret i dimetylsulfoksid (DMSO) i He-buffer (10 mM HEPES, 1 uM EDTA ved pH 7,4) og lagret i flytende nitrogen ved -80 °C.

Kompetitiv bindingsanalyse

Forbindelser med formel I ble analysert for å bestemme deres affinitet for Ai-adenosinreseptorsetene på membranene til DDT-celler. Kort beskrevet ble 50-70 ug membranprotein inkubert i en blanding inneholdende 2U/ml adenosindeaminase, 10 mM GTP-yS i 5 mM HE-buffer inneholdende 5 mM MgCl2 i glassrør. Stokkløsninger av forbindelsene ifølge oppfinnelsen ble seriefortynnet (10"<10>M til lO^M) i HE-buffer eller HE-buffer alene (kontroll for å bestemme uspesifikk binding) og tilsatt til inkuberings-blandingen. Til slutt ble tritiumbehandlet 8-syklopentyladenosin (<3>H-CPX) tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1,5 nM. Etter inkubering ved 23 °C i 90 minutter ble reaksjonen stoppet ved hjelp av filtrering på en Brandel MR24-cellehøster og vasking med iskald Tris-EDTA-buffer (tre ganger, omtrentlig volum 10 ml/vask) over Whatman GF/B-filtre (fuktet 1 time i 0,3 % polyetylenimin for å redusere uspesifikk binding). Filtre ble overført til scintillasjonsrør og 5 ml Scintisafe (VWR, Brisbane, CA) ble tilsatt. Mengden av tilbakeholdt radioaktivitet på filtrene ble bestemt ved hjelp av flytende scintillasjons-spektrometri. Proteinbestemmelser ble utført i henhold til fremgangsmåten til Bradford (1976. Anal. Biochem. 72:248) ved å benytte bovint serumalbumin som standard. Resultater er presentert som gjennomsnitt av triplikater + SEM etter at mengde av radioaktivitet som skyldes uspesifikk binding er trukket fra.

Eksempel 20:

r35S1GTPyS- bindingsanalyser

Agonisters evne til å aktivere G-proteiner ble bestemt ved å benytte radiomerket GTP ([35S]GTPyS). Kort forklart ble membranproteiner (30-50 ug/analyserør) plassert i glassrør inneholdende 50 mM Tris-HCl-buffer pH 7,4, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 1 mM ditiotreitol, o,2 enheter/ml adenosindeaminase, 0,5 % BSA, 1 mM EDTA, 10 mM GDP og 0,3 nM [ S]GTPyS. Ulike konsentrasjoner av forbindelsene ifølge oppfinnelsen (antatte Ai-adenosinreseptoragonister), en kjent Ai-adenosinreseptor fullstendig agonist N-syklopentyladenosin (CPA) eller et kontrollrør inneholdende 10 uM GTPyS men ikke agonist (for å bestemme uspesifikk binding) ble tilsatt i forskjellige rør. Analyserørene ble inkubert i 90 minutter ved 37 °C. Agoniststimulert binding ble undersøkt ved å bestemme forskjellen mellom total binding i nærvær av antatte agonister og basalbinding bestemt i fravær av CPA. Resultater ble uttrykt som prosentandelen stimulering av de antatte agonistene relativt i forhold til den fullstendige agonisten CPA etter å ha trukket fra uspesifikk binding.

Marsvinisolerte gjennomskylte hjerter

Marsvin (Hartley) av begge kjønn med en vekt på 300-350 g ble bedøvd med metoksyfluran og avlivet ved halshugging. Brystet ble åpnet og hjertet ble raskt fjernet og skylt i iskald modifisert Krebs-Henseleit (K-H)-løsning. Bestanddelene i den modifiserte K-H-løsningen var (1 mM) 117,9 NaCl, 4,8 KC1, 2,5 CaCl2, 1,18 MgS02, 1,2 KH2P04, 0,5 Na2EDTA, 0,14 askorbinsyre, 5,5 dekstrose, 2,0 pyruvatsyre (natriumsalt) og 25 NaHC03. K-H-løsningen ble kontinuerlig gasset med 95 % 02, og pH ble justert til en verdi på 7,4. For å skylle gjennom hjertet ved hjelp av Langendorff-fremgangsmåten ble den avskårede aorta trædd på en glasskanyle og sikret med en ligatur. Retrograd-gjennomskylling av aorta ble startet umiddelbart med en konstant hastighet på 10 ml/min med modifisert K-H-løsning varmet til 36,0 ±0,5 °C. En sideventil på kanylen ble benyttet for å forbinde gjennomskyllingssystemet med en Gould-trykkomformer for måling av koronart gjennomskyllingstrykk. Koronart gjennomskyllingstrykk ble konstant overvåket på et rulleark (Gould RS3400, Cleveland, OH) gjennom hvert eksperiment. Koronar ledeevne (i ml min"<1>mmHg-1) ble beregnet som forholdet mellom koronar gjennom-strømning (10 ml/min) og gjennomstrømningstrykk (i mmHg). For å lette utgangen av væske fra venstre ventrikkel ble mitralklaffene trimmet med små fjærhånderte sakser. Når det var hensiktsmessig ble rytmen på hjertene holdt konstant ved å benytte eksterne elektroder. Etter at disseksjon og instrumentering var ferdig ble stimulus-til-His-knute (S-H)-intervall og koronar gjennomskyllingstrykk overvåket kontinuerlig, og hvert hjerte ble brakt i balanse i 20-40 minutter før administrering av legemiddelet. Eksperimentelle intervensjoner ble alltid innledet og etterfulgt av kontrollmålinger. Kriterier for utelukkelse av hjerter fra undersøkelsen var 1) et koronart gjennomskyllingstrykk på <50 mmHg, 2) fravær av stabilt koronart gjennomstrømningstrykk under balanseringsperioden og 3) manglende evne til å påføre en konstant hjerterytme gjennom eksperimentet.

Til elektrisk opprettholdelse av hjerter ble en bipolar Teflonbelagt elektrode plassert i veggen i det intra-atrielle septum. Deler av de venstre og høyre atrielle vev, inkludert regionen med den sinoatrielle knuten, ble fjernet, både for å minske den spontane hjerterytmen og for å blottlegge det atriale septum for innsetting av elektrode. Hjerter ble elektrisk stimulert til en fastsatt rytme på 3,2 HZ. Stimuli ble tilveiebrakt ved hjelp av en intervallgenerator (modell 1830, WPI, Sarasota, FL) og overført gjennom en stimulusisoleringsenhet (modell 1880, WPI) som kvadratiske bølgepulser med en varighet på 3 ms og med minst det dobbelte av terskelintensiteten.

S-Hintervall. Prolongering av S-H-intervallet ble benyttet som et mål på den negative dromotropiske effekten til Ai-adenosinagonister på AV-knuteledning. His-knute-elektrogrammet ble tatt opp fra en unipolar elektrode plassert i den høyre siden av det interatrielle septum tilgrensende til AV-knutepunktet. Signalet ble vist kontinuerlig i reell tid på en oscilloskopskjerm med en forflytning på 10 ms/cm. Varigheten i tid fra den første hjerterytmestimuleringsartefakten til den maksimale oppadgående defleksjonen av His-knuten ble benyttet som S-H-intervallet.

Hjerter ble balansert inntil S-H-intervallet og CCP forble konstant. Legemidler ble benyttet i gjennomskyllingssystemet i en sluttkonsentrasjon på 0,3, 3,10 og i noen hjerter opp til 30 uM. Hvis annengrads-AV-blokkering forekom ved enhver konsentrasjon før 30 uM ble legemiddelet fjernet ved utvasking. Etter utvasking av den første forbindelsen kunne bare den andre forbindelsen bli benyttet i samme hjerte hvis ikke SH-intervallet og CPP kom tilbake til kontrollen eller S-H-intervallet prolongerte mindre enn 2 ms sammenlignet med kontrollen. Opp til tre forbindelser kunne bli benyttet i samme hjerte.

Claims (8)

1. Forbindelse, karakterisert vedat den har formelen I:

der: R<1>er syklopentyl eller sykloheksyl som begge eventuelt kan være substituert med hydroksy eller -C02CH2CH3, R<2>er hydrogen, R<3>er fenyl, isoksazolyl, tiofenyl eller tiazolyl, idet enhver av disse eventuelt kan være substituert med én eller flere substituenter valgt blant metyl, metoksy, fluor og klor, R<4>og R<5>er hydrogen, T er en kovalent binding eller metylen, X er en kovalent binding, Y er -O-, -S-, -NH- eller en kovalent binding, og Z er metylen.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedatYer-0-.

3. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert vedat R<3>er eventuelt substituert fenyl og T er en kovalent binding.

4. Forbindelse ifølge krav 2, karakterisert vedat R1 er syklopentyl.

5. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedatYer-NH-.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert vedatYer-S-.

7. Forbindelse ifølge krav 5, karakterisert vedat R<1>er eventuelt substituert syklopentyl.

8. Farmasøytisk preparat som kan anvendes til behandling av en sykdomstilstand hos et pattedyr, valgt blant hyperlipidemi, forkammerflimmer, supraventrikulær takykardi og forkammerflimmer, kongestiv hjertesvikt, epilepsi, slag, diabetes, overvekt, iskemi, stabil angina, ustabil angina, hjertetransplantasjon og hjerteinfarkt, karakterisert vedat det omfatter en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge krav 1.