NO329660B1 - cDNA, RNA, vektor, vertcelle, kimaert ikke-patogent akvatisk birnavirus, levende ikke-patogene IPNV, vaksine samt fremgangsmate for fremstilling - Google Patents
cDNA, RNA, vektor, vertcelle, kimaert ikke-patogent akvatisk birnavirus, levende ikke-patogene IPNV, vaksine samt fremgangsmate for fremstilling Download PDFInfo
- Publication number
- NO329660B1 NO329660B1 NO20004914A NO20004914A NO329660B1 NO 329660 B1 NO329660 B1 NO 329660B1 NO 20004914 A NO20004914 A NO 20004914A NO 20004914 A NO20004914 A NO 20004914A NO 329660 B1 NO329660 B1 NO 329660B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- virus
- cdna
- ipnv
- segment
- pathogenic
- Prior art date
Links
- 241000710921 Infectious pancreatic necrosis virus Species 0.000 title claims description 167
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims description 154
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 34
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 34
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 title claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 27
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 77
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 68
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 31
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 27
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 18
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 18
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 claims description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 claims description 17
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 15
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 13
- 101150076514 NS gene Proteins 0.000 claims description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 12
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 5
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims description 5
- 241000711804 Infectious hematopoietic necrosis virus Species 0.000 claims description 4
- 241000546112 Infectious salmon anemia virus Species 0.000 claims description 4
- 241001125819 Ameiurus nebulosus Species 0.000 claims description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 241000122170 Aliivibrio salmonicida Species 0.000 claims description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 2
- 241000604777 Flavobacterium columnare Species 0.000 claims description 2
- 241000382842 Flavobacterium psychrophilum Species 0.000 claims description 2
- 241000701372 Iridovirus Species 0.000 claims description 2
- 241000194040 Lactococcus garvieae Species 0.000 claims description 2
- 241000721654 Lepomis macrochirus Species 0.000 claims description 2
- 208000016222 Pancreatic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 241000295697 Pimephales promelas Species 0.000 claims description 2
- 241000192126 Piscirickettsia salmonis Species 0.000 claims description 2
- 241000186812 Renibacterium salmoninarum Species 0.000 claims description 2
- 241000607734 Yersinia <bacteria> Species 0.000 claims description 2
- 241000607534 Aeromonas Species 0.000 claims 1
- 208000032969 Hemorrhagic Septicemia Diseases 0.000 claims 1
- 241001600139 Moritella viscosa Species 0.000 claims 1
- 241001327682 Oncorhynchus mykiss irideus Species 0.000 claims 1
- 208000014645 Pasteurella hemorrhagic septicemia Diseases 0.000 claims 1
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 claims 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 85
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 68
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 57
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 47
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 45
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 41
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 37
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 29
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 20
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 18
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 17
- 239000000047 product Substances 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 16
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 description 15
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 13
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 13
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 12
- 241000277331 Salmonidae Species 0.000 description 12
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 11
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 11
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 11
- 101710108545 Viral protein 1 Proteins 0.000 description 11
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 11
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 11
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 10
- 108010087302 Viral Structural Proteins Proteins 0.000 description 10
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 10
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 9
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- 241000277263 Salmo Species 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 8
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 8
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 239000002585 base Substances 0.000 description 7
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 210000003020 exocrine pancreas Anatomy 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 7
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 6
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 6
- 239000010978 jasper Substances 0.000 description 6
- 108010074906 nuclear scaffold serine protease Proteins 0.000 description 6
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 5
- 108091092724 Noncoding DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 5
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 5
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 5
- 210000002907 exocrine cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 235000015170 shellfish Nutrition 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 4
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000009447 viral pathogenesis Effects 0.000 description 4
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 4
- 208000009663 Acute Necrotizing Pancreatitis Diseases 0.000 description 3
- 241000237502 Ostreidae Species 0.000 description 3
- 206010058096 Pancreatic necrosis Diseases 0.000 description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 3
- 230000000366 juvenile effect Effects 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 235000020636 oyster Nutrition 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241001533425 Aquabirnavirus Species 0.000 description 2
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 2
- FUTAPPOITCCWTH-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Asp Chemical group [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FUTAPPOITCCWTH-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001533440 Hypovirus Species 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000277284 Salvelinus fontinalis Species 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000656145 Thyrsites atun Species 0.000 description 2
- 101150024766 VP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000010530 Virus Neutralization Effects 0.000 description 2
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 description 2
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 208000010824 fish disease Diseases 0.000 description 2
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- -1 /or Species 0.000 description 1
- 101710154545 16 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000607525 Aeromonas salmonicida Species 0.000 description 1
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N Aziridine Chemical compound C1CN1 NOWKCMXCCJGMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000374455 Bhanja serogroup Species 0.000 description 1
- 241000282461 Canis lupus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000252498 Ictalurus punctatus Species 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 101800000268 Leader protease Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000277275 Oncorhynchus mykiss Species 0.000 description 1
- 241001280377 Oncorhynchus tshawytscha Species 0.000 description 1
- 241000702244 Orthoreovirus Species 0.000 description 1
- 108010067035 Pancrelipase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101150075200 S-2 gene Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000255588 Tephritidae Species 0.000 description 1
- 206010044565 Tremor Diseases 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 229910000318 alkali metal phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 150000008282 halocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- NIQQIJXGUZVEBB-UHFFFAOYSA-N methanol;propan-2-one Chemical compound OC.CC(C)=O NIQQIJXGUZVEBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N methanone Chemical compound O=[14CH2] WSFSSNUMVMOOMR-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000008807 pathological lesion Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000010773 plant oil Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2720/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/10011—Birnaviridae
- C12N2720/10061—Methods of inactivation or attenuation
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Akvatiske birnavirus slik som infeksiøs pancreatisk nekrosevirus (IPNV) er det forårsakende middel av en svært smittsom og destruktiv sykdom hos juvenil reinbue og "Brook" ørret og atlantisk laks (Wolf, K. 1988, Fish vimses and fish viral diseases. Canstock Publishing Associates, Cornell University Press, Itaca og London). Svært virulente stammer av IPNV kan forårsake mer en 90% mortalitet i et utklekningsanlegg fiskeyngel mindre enn fire måneder gamle og de som overlever infeksjon kan forbli livslange asymptomatiske bærere, og tjener som reservoarer for infeksjon (McAllister, P.E., W.J. Owens, og T.M. Ruppenthal, 1987, Detection of infectious pancreatic necrosis virus in pelleted cell and particulate components from ovarian fluid of Brook trout ( Salvilimus fontindis). Dis. Aquat. Org. 2:235-237). Hos de som overlever en IPNV epizotisk, vimser vedvarer og kan forårsake alvorlig vekstretardering i individuelle fisk som utviser viruspersistens (McKnigt and Roberts; Br. Ven. J. 132:76-86,1976). Hos ørret, produserer vimset betydelig nekrose eller inflammasjon i pankreat. Vimset er i stand til å infisere et antall av forskjellige verter og har en verdens-omspennende tilstedeværelse (Pilcher and Fryer, Crit. Rev. Microbial. 7:287-364, 1980).
IPNV tilhører en gruppe av vims som kalles Birnaviridae som inkluderer andre bisegmenterte RNA vims slik som infeksiøse bursal sykdomsvims (kyllinger), tellinavims og østersvirus (toskjellede bløtdyr) og drosofila X vims (fruktflue). Disse vimsene inneholder alle høymolekylærvekt (MW) dobbelttrådede RNA genomer. IPNV tilhører akvabirnavirusgenus (Dobos, P. 1995, The molecular biology of infectious pancreatic necrosis vims (IPNV). Ann. Rev. Fish Dis. 5:24-54). Akvabirnaviras infiserer marine og ferskvannsorganismer slik som fisk, reker og andre skalldyr, østers og andre bløtdyr.
IPNV i en "brook" ørret utklekningsannlegg ble først rapportert i 1941 (McGonigle Trans. Am. Fish Soc. 70, 297,1941). 1 1960 ble den virale egenskapen til sykdommen bekreftet (Wolf et al., Proe. Soc. Exp. Biol. Med. 104:105-110,1960). Siden den tid har isolasjoner av vims fra forskjellige fiskearter i hele verden inklusiv forskjellige ørret og laksearter, karpe, abbor, gjedde, og fjellørret, så vel som bløtdyr og skalldyr. Akutt sykdom har blitt rapportert fortrinnsvis i et begrenset antall av salmonide arter, slik som ørret og laks.
Unge fisk (to til fire måneder gamle) ser ut til å være mest følsomme for IPNV infeksjon, som resulterer i høy mortalitet (Wolf et al. U.S. Dept. Int. Bur. Sport Fish and Wildlife, Fish Disease Leaflet 1:14, 1966; Frantsi and Savan. J. WildlifeDis. 7:249-255, 1971). Hos ørret, angriper IPNV vanligvis unge fisk omtrent fem til seks uker etter deres første foring. De affiserte fiskene er mørkere enn vanlig, har alle uthulende øyne og ofte bulende mage. På begynnelsen av utbrudder, kan en se et stort antall av langsomme, mørke fisk opp mot vannutstrømningen, og man kan se fisk som "skjelver" nær overflaten. Skjelvingen er et resultat fra et karakteristisk symptom av sykdommen, en voldsom virvlende form for svømming hvor fisken roterer rundt sin egen akse. Hvis den affiserte fisken blir undersøkt, vil en finne et karakteristisk hvitt slim i magen. Pankreas ser ut til å være primærmålorganet for viruset, hvor pankreatiske fettceller eller de Langerhase øyene ikke er infisert (McKnigt and Roberts, Br. Vot. J. 132:76-86, 1976). Det eneste organet ved siden av pankreas hvor virale lesjoner kan finnes er i tarmene.
Etter et IPNV utbrudd, blir overlevende fisk vanligvis bærere av viruset. Ørret som er bærere av viruset er et alvorlig problem for akvakulturindustrien fordi bare kontrollmetoder som for tiden er tilgjengelig for å eliminere viruset i bærerfisk er destruksjon av disse fiskene. Flere faktorer, inklusiv alder, arter og vanntemperatur ser ut for å influere på alvorlighetsgraden av infeksjonen og etterfølgende etablering av bærertilstand. Overlevende bærere gir fra seg IPNV i resten av deres levetid (Billi and Wolf,J. Fish. Res. Bd. Can. 26:1459-1465, 1969; Yamamoto, Can. J. Micro. 21:1343-1347, 1975; Reno et al., J. Fish. Res. Bd. Can. 33:1451-1456, 1978) Derfor, er IPNV et patogen av stor økonomisk viktighet i akvakultuirndustrien.
Det har vært en stor interesse for å utvikle en vaksine for IPNV og forskjellige tilnærminger har blitt utprøvd. En tilnærming er anvendelse av drepte virus som vaksine. F.eks., hvis formalin-inaktiverte virus blir injisert intraperitonalt i yngel som er fire uker etter klekking, blir fisken immunisert (Dorson J. Virol 21:242-258,1977). Imidlertid, verken immersjon av fisk i en flytende suspensjon av drepte virus eller oral administrering derav var effektiv. Derfor er hovedproblemet med å bruke drepte virus mangel på en praktisk metode for å administrere vaksinen som injeksjon er upraktisk for et stort antall av umodne fisk. Noen forskere har foreslått at opptak av virale antigen ved immersjon kan bli forbedret hvis viruset ble delt opp i mindre, subvirale komponenter, men viral opdelingsmetodene har resultert i tap av antigenisitet. (Hill and Way, "Serological Classification of Fish and Shellfish Birnaviurses", Abstract, First International Conference of the European Association of Pathology, Plymouth, Enland, 1983).
Anvendelse av attenuerte virale stammer er også blitt utprøvd (Dorson, Abstract, International Conference on IPNV, Taloires, France, 1982). Imidlertid, tidligere attenuerte stammer enten mislykkedes i å infisere fisken eller mislykkedes i å infisere beskyttelse. Stammer med lav virulens har blitt testet som vaksiner for mer virulente stammer, men mortaliteten fra den vaksinerte stammen var enten for høy eller beskyttelsen var kun moderat (Hill et al., "Studies of the Immunization of Trout Against IPN", in Fish Diseases, Third COPRAQ Session (W. Ahne, ed.), NY, sidene 29-36, 1980).
Det er to distinkte seriegrupper av IPNV, kalt serogruppe A og B. Serogruppe A inneholder 9 serotyper, men serotype B inneholder en enkel serotype (Hill, B. J. and K. Way. 1995, Serological classifiction of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and other aquatic birnaviruses. Ann. Rev. Fish Dis. 5:55-77).
IPNV genomet består av to segmenter av dobbelttrådet RNA som er omgitt av en enkeltskall ikosahedralkapsid på 60 nm diameter (Dobos, P. 1976, Size and structure of the genome of infectious pancreatic necrosis virus. Nucl. Acids Res. 3:1903-1919). Den største av de to genomiske segmentene, segment A (3097 bp) koder for et 106-kDa polyprotein (NH2-pVP2-NS protease-VP3-COOH) som blir kotranslasjonelt kuttet av den virale protease for å danne modent VP2 og VP3 kapsidproteiner (Dobos, P. 1977. VIrus-specific protein synthesis in cells inflicted by infectious pancreatic necrosis virus. J. Virol. 21:242-258; Duncan, R., E. Nagy, P.J. Krell og P. Donbos. 1987, Synthesis of the infectious pancreatic necrosis virus polyprotein, detection of a virus-encoded protease, and fine structure mapping of genom segment A coding regions, J. Virol. 61:3655-3664). Segment A koder også for et 15-17 kDa argininrikt ikke strukturelt protein (NS) fra en liten åpen leseramme (ORF) som kommer foran og delvis overlapper hovedpolyproteinet ORF. Skjønt dette proteinet ikke er tilstede i vironet, er det detektert i IPNV-infiserte celler (Magyar, G., og P. Dobos. 1994 Ecidence for the detection of the infectious pancreatic necrosis virus polyprotein and the 15-17 kDa polypeptid in infected cells and of the NS protease in purified virus. Virology 204:580-589). Det genomiske segmentet B (2784 bp) koder for VP 1, et 94-kDa lite internt protein, som er virionassosiert RNA-avhengig RNA polymerase (Dobos, P. 1995, Protein-primes RNA synthesis in vitro by the viron associated RNA polymerase of infectious pancreativ necrosis virus, Virology 208:19-25; Duncan, R., CL. Mason, E. Nagy, J.A. Leong, og P. Dobos, 1991, Sequence analysis of infectious pancreatic necrosis virus genome segment B and its encoded VP1 protein: A putativ RNA-dependent RNA polymerase lacking the Gly-Asp-Asp motif. Virology 181:541-552). I virionene er VP1 til stede som et fritt polypeptid, så vel som et genomkoblet protein, VPg (Calvert, J.G., E. Nagy, M. Soler, og P. Dobos, 1991, Characterization of the VPg-dsRNA linkage of infectious pancreatic necrosis virus. J. Gen. Virol. 72:2563-2567).
Skjønt nukleotidsekvensene for genomsegmentene A og B av forskjellige IPNV stammer har blitt publisert, har den nøyaktige 5'- og 3'-ikke kodene sekvensene til disse stammene ikke blitt bestemt eller bekreftet (Duncan, R., og P. Dobos. 1986, The nucleotide sequence of infectious pancreas necrosis virus (IPNV) dsRNA segment A reveals one large ORF encoding a precursor polyprotein. Nucl. Acids Res. 14:5934; Duncan, R., CL. Mason, E. Nagy, J.A. Leong og P. Dobos, 1991, Sewuence analysis of infectious pancreatic necrosis virus genome segment B and its encoded VP 1 protein: A putative RNA-dependent RNA polymerase lacking the Gly-Asp-Asp motif. Virology 181:541-552; Håvarstein. L.S., K.H. Kalland, K.E. Christie, og C. Endresen, 1990, Sequence of large double-stranded RNA segment of the NI strain of infectious pancreatic necrosis virus: a comparison with other Birnaviridae. J. Gen. Virol. 71:299-3908). I motsetning IBDV er den utstrakt homologi mellom de ikke kodene sekvensene til IPNV segmentene A og B. F.eks., 32 av 50 nukleotider i den 5' ikke kodene regionen og 29 av 50 nukleotider av den 3'-ikke kodene regionen mellom de to segmentene er konservert. Disse terminale endene skulle inneholde sekvenser som er viktig i å pakke og replikasjon av IPNV genomet, som er vist for andre dobbelttrådede RNA virus slik som mammalske reovirus og rotavirus (Gorziglia, M.L. og P.L. Collins, 1992, Intracellular amplification and expression of a synthetic analog of rotavirus genomic RNA bearing a foreign marker gene: Mapping cis-acting nucletoides in the noncoding region. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89:5784-5788; Patton, J.T., M. Wentz, J. Xiaobo, og R.F. Ramig, 1996, cis-Acting signals that promote genome replication in rotavirus mRNA. J. Virol. 70:3961-3971; Wentz, M.J., J.T. Patton, og R.F. Ramig. 1996. The 3 - terminal consensus sequence of rotavirus mRNA is the minimal promoter of negative-strand RNA synthesis. J. Viro. 70:7833-7841; Zou, S., og E.G. Brown. 1992. Identification of sequence element containing signals for replication and encapsulation of the reovirus Ml genome segment. Virology 186:377-388).
I senere år, har et antall av dyre-RNA virus blitt gjenvunnet fra klonet cDNA, slik som poliovirus (en plusstrådet RNA virus), influensavirus (en segmentert negativ-trådet RNA virus), og rabiesvirus (en ikke segmentert negativ trådet RNA virus) (Enami, M., W. Luytjes. M. Krystal, og P. Palese. 1990. Introduction of site-specific mutations into the genome of influenza virus. Proe. Nati, Acad. Sei. USA 87:3802-3807; Racaniello, V.R., og D. Baltimore. 1981. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in marnmalian cells. Science 214:916-919; Schnell M.J. T. Mebatsion og K.K. Conzelmann. 1994, Infectious rabies viruses from cloned cDNA. EMBO J. 13:4195-4205). Imidlertid, til dags dato er det ikke rapportert om en gjenopprettet infeksiøs dobbelttrådet RNA virus for vandige arter.
En av de foreliggende oppfinnere gjenvant et virus av segmentert dobbelttrådet RNA genom fra kun syntetisk RNA. Reverse genetiske systemer til birnavirus ble utviklet av en av oppfinnerne som viste at syntetiske transkripter av infeksiøse bursale sykdomsvirus (IBDV) genom er infeksiøse (Mundt, E., og V.N. Vakharia. 1996, Synthetic transcripts of double-stranded birnavirus genome are infectious. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:11131 -11136).
For å utvikle et revers genetisk system for IPNV, ble fullengde cDNA kloner av segmentene A og B fra West Buxton og SP stammene konstruert. Fullstendige nukleotidsekvenser fra disse cDNA klonene ble bestemt, inklusiv 5'- og 3'-ikke kodene regioner. Dessuten, ble en av cDNA klonene modifisert ved seterettet mutagenese for å danne en merket sekvens i segment B. Syntetisk pluss-sens RNA transkripter av segmentene A og B ble produsert ved in vitro transkripsjonsreaskjoner på lineæriserte plasmider med T7 RNA polymerase, og brukt for å transfektere "chinook" lakseembryo (CHSE) celler. I denne søknaden, blir gjenvinning av IPNV fra CHSE celler transfektert med kombinerte RNA transkripter fra segmentene A og B beskrevet.
For å studere funksjonen til NS protein i viral patogenese, konstruerte oppfinnerene en cDNA klon fra IPNV segment A, hvor i initieringskodonet til NS genet ble mutert for å hindre ekspresjon av NS proteinet. Ved å bruke revers genetisk system, ble en villtype IPNV dannet, så vel som en mutant IPNV som manglet ekspresjon av NS proteinet. Egenskapene til det gjenvunnende villtype IPNV og mutant IPNV i cellekultur ble sammenlignet og deres patologisk funksjon i verten evaluert.
WO9809646 beskriver et system for fremstilling av levende birnavirus fra syntetiske transkripter fra klonet cDNA, samt bruk av modifiserte birnavirus i vaksinepreparater.
Videre er det i J. Virol. 1997 Jul;71(7):5647-51 beskrevet isolering av VP5 IBDV mutanter, hvor det fremkommer at VP5 (NS proteinet) ikke er essensiell for IBDV replikasjon. NS-proteinet er videre karakterisert i J. Gen. Virol. 1995 aug;76 (Pt8):2091-6.
Denne oppfinnelsen vedrører infeksiøs pancreatisk nekrosevirus (IPNV) som er assosiert med svært smittsom og destruktiv sykdom hos juvenil regnbue og "Brook" ørret og atlantisk laks. Mer spesielt, vedrører oppfinnelsen utviklingen av et revers genetisk system for infeksiøs pancreatisk nekrosevirus (IPNV), en prototypeviru av binraviridaefamilien, ved å bruke pluss-trådet RNA transkripter avledet fra klonet cDNA. Fullegnde cDNA kloner av IPNV genomet ble konstruert som inneholdt de fullstendig kodende og ikke kodende regioner til RNA segmentene A og B. Segment A koder for et 106 kDa forløperprotein som blir kuttet for å gi modent VP2, NS protease og VP3 proteinet, mens segment B koder for RNA avhengig RNA polymerase, VP1. Plussens RNA transkriptene i begge segmentene ble fremstilt ved in vitro transkripsjon i lineæriserte plasmider med T7 RNA polymerase. Transfeksjon av "chinnook" lakseembryo (CHSE) celler med kombinerte transkripter av segmentene A og B dannet levende IPNV etter 10 dager etter transfeksjonen. Videre, inneholdt en transfektantvirus en genetisk merket sekvens som også ble dannet for å bekrefte anvendbarheten av dette systemet. Tilstedeværelse og spesifisiteten av det gjennvunnende virus ble bekrefte ved immunofluoresensfarging av infiserte CHSE celler med kanin anti-IPNV serum, og ved nukleotidsekvensanalyse. Derfor, vil utviklingen av revers genetisk system for IPNV i stor grad lette studiene av viral replikasjon, patogenese og design av en ny generasjon av levende attenuerte vaksiner.
Som en første anvendelse av IPNV revers genetikk og for å studere funksjonen av NS proteinet in vivo, har en NS proteinmanglende virus blitt fremstilt og det har blitt vist at det mutante viruset kan replikere men vil ikke indusere lesjoner. Man tror at NS proteinet er direkte involvert i viral patogenese siden villtype IPNV som uttrykker NS proteinet, er i stand til å reise patologisk respons i den naturlige verten. Dessuten, mekanismen hvor ved NS proteinet vil utvise dets funksjon gjenstår å se.
De ikke strukturelle proteinene til dyrevirus har blitt vist å spille en viktig rolle i virus-replikasjon og patogenese. F.eks., i munn og klovsykeviruset, ble en 16-kDa NS protein (lederprotease) vist å attenuere viruset in vitro og in vivo, men var uunnværlig for viral replikasjon (Brown, C. C, et al., 1996, J. Virol. 70:5638-5641; Piccone M.E., et al. 1995, J. Virol. 69:5376-5382). I kyllinganemivirus (et immunosuppresivt virus), en basisk, cystein og prolinrik, 14-kDa NS protein (VP3) vist å forårsake apoptose i lymfoblastoide T celler, og var implisert i patogenesen (Noteborn, M.H.M., et al., 1994, A single chicken anemia virus protein induces apoptosis. J. Virol. 68, 346-351). Imidlertid, ble dette proteinet funnet å være essensiell for viral replikasjon. På samme måte, kodet også et infeksiøst bursal sykdomsvirus (IBDV) et annet medlem av bimaviridaefamilien, segment A også for et 17 kDa NS protein (fra en liten ORF) som er funnet i IBDV infiserte celler (Mundt, E., J. Beyer, og H. Muller. 1995, Identification of a novel viral protein in infectious bursal disease virus-infected cells. J. Gen. Virol. 76:437-4435). Nylig, er det blitt vist at dette NS proteinet fra IBDV ikke er påkrevet for viral replikasjon men spiller en viktig rolle i patogenesen (U.S. patent applikasjonsserie nummer 08/940,968). Oppfinnerne har vist at NS proteinet fra IBDV ikke er påkrevet for viral replikasjon in vitro eller in vivo. I tillegg, indikerer resultatene at IBDV indusert celledød blir signifikant redusert på grunn av fravær av NS proteinekspresjon. Ved fravær av NS proteinekspresjon, er det mutante virus forventet å være attenuert. Imidlertid, skulle dette ikke affisere immunresponsen til IPNV i den naturlige verten. Ved å bruke foreliggende oppfinnelse, er det mulig å fremstille, levende attenuerte vaksiner for IPNV, som er ikke patogene.
Syntetiske transkripter avledet fra klonet DNA korresponderende til det fullstendige genomet til et segmentert dobbelttrådet RNA dyrevirus har blitt vist å gi opphav til et replikerende virus. Gjenvinning av infeksiøse virus etter transfektering av celler med syntetisk pluss-sens RNA avledet fra klonet cDNA til et virus med en dobbelttrådet genom fullstendiggjør søken for å danne reverse infeksiøssystemer for RNA virus. Et antall av forskere har fremstilt infeksiøse dyre RNA virus fra klonet cDNA (Boyer, J.C., et al., Virology, 198,415-426 (1994)). Racaniello og Baltimore var de første til å utvinne poliovirus, et plusstrådet RNA virus, ved å bruke klonet cDNA (Racaniello, V.R. & Baltimore, D. (1981) Science 214, 916-919). Senere, fremstilte van der Werf et al. infeksiøse poliovirus ved å bruke syntetisk RNA produsert ved T7 RNA polymerase på en klonet cDNA templat ((van der Werf, S., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 83, 2330-2334 (1986)). Enami et al. fikk ut influensavirus, et segmenter negativt trådet RNA virus (Enami, M., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87, 3802-3805 (1990)); og Schnell et al. fremstilte rabiesvirus, et ikke segmentert negativttrådet RNA virus, fra klonet cDNA fra de respektive genomer (Schnell, M.J. et al., EMBO J., 13,4195-4205
(1994)). Chen et al. viste at elektroporering av fungale seroplaster med syntetisk pluss-sens RNA transkripter som korresponderer til den ikke segmenterte dobbelttrådede RNA hypovirus, og ukapslet fungalvirus, gav mycel som inneholdt cytoplasmatisk replikerende dobbelttrådet RNA (Chen, B. Choi, G. H. & Nuss, D. L. (1994) Science 264,1762-1764). Roner et al., utviklet et infeksiøst system for et segmentert dobbelttrådet RNA reovirus ved å transfektere celler med en kombinasjon av enkeltrådet RNA, dobbelttrådet RNA, in vitro translatert reovirusprodukter, og komplementerte med et hjelpevirus av forskjellig serotype (Roner, M. R., Sutphin, L.A. & Joklik, W. K. (1990) Virology 179, 845-852). Resulterende virus ble diskriminert fra hjelpeviruset ved plakkanalyse. Imidlertid, var i dette systemet nødvendig å bruke et hjelpevirus. I motsetning til, det beskrevne reverse genetiske systemet til IPNV som ikke krever et hjelpevirus eller andre virale proteiner. Transfeksjonen av celler med pluss-sens RNA fra begge segmenter var tilstrekkelig for å danne infeksiøse virus (IPNV). I denne sammenheng, var systemene sammenlignbare til andre "rescue" systmer av pluss-trådet polyvirud og dobbeltrådet hypovirus (van der Werf, S., et al (1986) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83, 2330-2334; Chen, B., et al. (1994) Science 264, 1762-1764).
Transfeksjon av pluss-sens RNA fra begge segmenter inn i samme celle var nødvendig for en vellykket gjenvinning av IPNV. Transfekterte RNA fra begge segmentene måtte translateres med cellulær translasjonsmaskineri. Polyproteinet til segment A er antagelig prosessert til NS protease og VP2 og VP3 proteinet, som danner det virale kapsidet. Det translaterte proteinet VP1 i segment B virker som et RNA avhengig RNA polymerase og transkriberer minustrådene fra syntetiske plusstråder fra begge segmenter, og reaksjonsproduktene danner dobbelttrådet RNA. Dobos rapporterte at in vitro transkripsjon av virion RNA avhengig RNA polymerase fra IPNV, er primet av VP1 og fortsetter deretter via en asymmetrisk semikonservativ, tråderstatningsmekanisme for å syntetisere bare plusstrådene under replikasjon av det virale genomet (Dobos, P. (1995) Virology 208,10-25). Oppfinnernes system viste at syntese av minusstrådene må fortsette på plusstrådene. Om det resulterende transkriberte minustråd RNA tjener som et templat for transkripsjon av plusstrådene eller ikke forblir et området for ytterligere undersøkelser.
For å bevise at det infeksiøse viruset (IPNV) som var i supernatantene til de transfekterte cellene faktisk var avledet fra de syntetiske transkriptene, ble en rekombinant virus dannet som inneholdt sekvensmerker i segment B. Restriksjons-enzymkuttende av RT-PCR produktene og sekvensanalyse av de klonede DNA fragmentene ble brukt for å verifisere tilstedeværelse av disse sekvensmerkene i de genomiske RNA segmentene.
Gjenvinningen av infeksiøse virus (IPNV) viser at bare plusstrådet RNA i begge segmenter er tilstrekkelig for å initiere replikasjon av dobbelttrådet RNA. Derfor, er resultatene i overenstemmelse med generelle trekk av reovirus og rotavirusreplikasjon, hvor plusstrådet RNA tjener som et templat for syntese av avkomst minustråder for å gi dobbelttrådet RNA (Schonberg, M., Et al. (1971) Proe. Nati. Acad. Sei. USA 68, 505-508; Patton, J. T. (1986) Virus Res. 6, 217-233; Chen, D., et al., (1994) J. Virol. 68, 7030-7039). Imidlertid, den semikonservative tråden erstattningsmekanismer foreslått av Spies et al. og Dobos kunne ikke ekskluderes (Spies, U., et al. (1987) Virus Res. 8, 127-140; Dobos, P. (1995) Virology 208,10-25). Utviklingen av reverst genetisk system for IPNV vil i stor grad lette fremtidige studier av genekspresjon, patogenese, og være en hjelp i å designe en ny generasjon av levende IPNV vaksiner.
For å studere funksjonen til 15-17 kDa ikke strukturelt (NS) protein i viral vekst og patogenese, blir en cDNA klon av IPNV segmentet A konstruert, hvor i NS proteinet blir mutert for å hindre ekspresjon. Segment A blir fortrinnsvis mutert i mer enn en region for å hindre ekspresjon av NS proteinet. Mutasjon i mer enn en region av NS proteinet er foretrekkbart for å minske sjansene til en reversjon tilbake til villtypestammen.
Transfeksjon av celler med kombinerte transkripter fra enten modifisert eller umodifisert segment A sammen med segment B vil produsere viable IPNC virus. Når transfektante virus er kjennetegnet ved immunofluoresensanalyser ved å bruke NS spesifikt antiserum, er en mangel av NS proteinekspresjon karakteristisk ved tap av fluoresenssignal. Videre, kan replikasjonskinetikk og cytotoksiske effekter fra det mutante viruset bli sammenlignet med den fra villtype (WT) virus in vitro. Mutante virus vil utvise forminskede cytotoksiske effekter i cellekulturen.
For å evaluere karakteristika av det gjenvunnende virus in vivo, ble "chinook" laks inokulert med villtype eler mutantvirus og analysert for histopatologiske lesjoner. Villtypevirus kan forårsake mikroskopiske lesjoner i pancreas mens mutante virus mislykkes i å vise noen patologiske lesjoner eller kliniske tegn på sykdommen. I begge tilfeller kan viruset gjenvinnes fra pancreas og tilstedeværelse eller fravær av mutasjon i de gjenvinnende virus bekreftes ved nukleotidsekvensanalyse av NS genet.
En mutant cDNA klon fra segment A fra SP stammen av IPNV ble konstruert hvor i første initieringskodonet til NS genet ble mutert for å hindre ekspresjon av NS proteinet og for å studere rollen til NS proteinet i IPNV. Derfor, koder det resulterende plasmidet bare for forløperen til de strukturelle proteinene (VP2, NS protease og VP3). I tillegg, blir en fullengde cDNA klon av segment B fra SP stammen fra IPNV konstruert, som koder for VP1 proteinet.
"Chinook" lakseembryo (CHSE) celler ble transfektert med kombinerte transkripter fra segmentene A og B for å studere funksjonen av NS proteinet i viral replikasjon. For å verifisere mutasjonen i det resulterende virus, ble genomisk RNA isolert og analysert
ved revers transkriptasepolymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ved å bruke et primerpar som er spesifikke for segment A. Sekvensanalyse av det klonede PCR produktet ble brukt for å bekrefte de forventede nukleotidemutasjonene i NS genet fra det mutante viruset.
CHSE celler kan infiseres med de gjenvunnende virusene og analyseres ved immunofluoresensanalyse ved å bruke NS-spesifikk antiserum for å detektere ekspresjon av NS proteinet. Celler som uttrykker NS proteinet gir et positivt immunofluoresenssignal. Imidlertid, gir celler hvor i ekspresjon av NS proteinet er forhindret ingen fluoresenssignal. NS proteinet er ikke påkrevet for replikasjon i cellekultur.
For å bestemme replikasjonskietikken til viruset, blir CHSE celler infisert med umodifisert og NS manglende virus og deres titere blir bestemt ved plakkanalyse. Videre blir transfektantvirusene renset ved Cesiumkloirdgradient, og deres proteiner ble analysert ved Western blottanalyse ved å bruke IPNV antiserum. Kvalitativt, skulle virale strukturelle proteiner (VP2) og (VP3) produsert av det mutante virus være identisk proteinet syntetisert av det umodifiserte viruset.
Virusene ble dyrket i CHSE celler, helcellenukleinsyre blir isolert og NS genet amplifisert ved RT-PCR for å bestemme den genetiske stabiliteten til transfektantvirusene in vitro. Sekvensanalyse av det klonede PCR produktet blir brukt for å bekrefte forventede nukleotidmutasjoner i NS genet til det mutante viruset. På samme måte, for å bestemme den genetiske stabiliteten til disse virusene in vivo, kan "chinnok" laks bli innokulert med transfektante virus, og deres pancreatiske vev samlet inn og på forskjellige dager etter infeksjon. Total nukleinsyre blir ekstrahert fra pancreatisk vev, og NS genet amplifisert ved RT-PCR ved å bruke en primer spesifikk for segment A. Denne analysen viser at mutante viruser kan replikere i pancreas til "chinook" laks men reverterer ikke til villtype IPNV.
"Chinook" laks kan inokuleres med modifisert og umodifisert IPNV for å sammenligne replikasjonsoppførselen til de gjenvunnende virusene in vivo. Virustiterene i pancreatisk vev fra hver gruppe på forskjellige tidspunkt blir bestemt ved plakkanalyse på CHSE celler. Indirekte IFA kan utføres på pancreatisk vev og lakse infisert med mutant IPNV, ved å bruke NS-spesifikt antiserum for å bekrefte mangel på NS proteinekspresjon. Dette vil vise at et mutante viruset, som mangler ekspresjon av NS proteinet, effektivt replikerer i pancreatisk vev hos laks.
For å sammenligne immunresponsen indusert av umodifisert og mutert IPNV kan laks innokuleres med den mutante og de umodifiserte virus, det kan tas en blodprøve, og deres sera analysert ved virusnøytralisering (VN) test. Denne analysen vil vise at det mutante viruset, som ikke produserer NS proteient, ikke innvirker på immunresponsen til IPNV i den naturlige verten.
Som anvendt i den foreliggende søknad betyr betegnelsen "syntetisk", som anvendt på nukleinsyrer, at det er et menneskefremstilt nukleinsyre i motsetning til naturlig forekommende nukleinsyre. Betegnelsen omfatter ingen begrensning i forhold til metoden for fremstilling, som kan være kjemisk eller biologisk så lenge metoden for fremstilling involverer entervensjon fra mennesket.
Betegnelsen "cDNA" har intensjon å omfatte et hvilket som helst cDNA som omfatter segmentene A og B og en 5' og 3' ikke kodende regione til segmentene A og B.
Betegnelsen "infeksiøs" som anvendt på virus indikerer at viruset har evnen til å reprodusere. Viruset kan være patogent eller ikke patogent og fortsatt være infeksiøst.
Betegnelsen "akvatisk birnavirus" har til hensikt å omfatte et hvilket som helst birnavirus som infiserer marine eller ferskvannsorganismer slik som fisk, reker og andre skalldyr, østers og andre bløtdyr.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører cDNA, kjennetegnet ved at det inneholder minst en del av det infeksiøse pankreatisknekrosevirusgenomet valgt fra gruppen bestående av segment A og segmentene A og B, hvori nevnte cDNA inkluderer 5' og 3' terminale ender fra nevnte segmenter og hvori segment A er modifisert for å hindre ekspresjon av NS proteinet.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører syntetisk RNA som er transkribert fra cDNA ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen.
Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en rekombinant vektor som omfatter cDNA ifølge det andre aspekt ved den foreliggende oppfinnelse. Den rekombinante vektoren omfatter også andre nødvendige sekvenser slik som ekspresjonskontrollsekvenser, markører, amplifiseirngsgener, signalsekvenser, promotere og dets like, som kjent innen fagfeltet. Nyttige vektorer for dette formålet er plasmider, og virus slik som baculovirus, herpesvirus fra fisk ("channel catfish" virus) og dets like.
Et fjerde aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vertcelle som er transformert med syntetisk RNA ifølge det andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse eller med den rekombinante vektor ifølge det tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse. Vertscellen kan være en eukaryot eller prokaryot vertscelle. Egnede eksempler er E. coli, insektcellelinjer slik som Sf-9, "Chinook" lakseembryo (CHSE) celler, regnbueørretkjønns (RTG-2) celler, "Bluegill" fisk (BF-2) celler, "Brown Bullhead (BB) celler, "Fathead Minnow" (FHM) celler, og dets like.
Et femte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører kimært ikke-patogent akvatisk birnavirus, kjennetegnet ved at nevnte virus er NS proteindefekt og inneholder epitopiske determinanter fra minst to forskjellige birnavirusstammer, hvor det akvatiske bimaviruset er infeksiøst pankreatisknekrosevirus og hvori IPNV er oppnådd fra et cDNA omfattende en segment A-modifikasjon som er effektiv for å forhindre ekspresjon av NS protein.
Et sjette aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vaksine, kjennetegnet ved at den omfatter kimær ikke-patogen akvatisk birnavirus ifølge det femte aspekt ved foreliggende oppfinnelse, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Et syvende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåte for fremstilling av ikke-patogene, infeksiøse pankreatisknekrosevirus, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: fremstilling av et cDNA som inneholder infeksiøse pankreatisknekrosevirusgenom-segmenter A og B, hvori cDNA i segment A er modifisert slik at ekspresjon av NS protein er forhindret;
transkribering av nevnte cDNA for produksjon av syntetiske RNA transkripter; transfektering av vertsceller med nevnte syntetiske RNA transkripter;
inkubering av nevnte vertsceller i et kulturmedium; og
isolering av levende, ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus fra nevnte kulturmedium.
Et åttende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører levende, ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus, kjennetegnet ved at nevnte virus er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge det syvende aspekt ved foreliggende oppfinnelse.
Et niende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en vaksine, kjennetegnet ved at den omfatter ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus ifølge det åttende aspekt ved foreliggende oppfinnelse, hvori segment A fra nevnte virus er modifisert i minst to regioner for å hindre ekspresjon av NS proteinet.
Et tiende aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en levende, ikke-patogen infeksiøs pankreatisknekrosevirusvaksine, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: fremstilling av en fullengde cDNA som inneholder infeksiøs pankreatisknekrose-virusgenomsegmenter A og B, hvori segment A har blitt modifisert for å forhindre ekspresjon av NS proteinet;
transkribering av nevnte cDNA for produksjon av syntetiske RNA transkript; transfektering av vertsceller med nevnte RNA transkripter;
inkubering av nevnte vertsceller i et dyrkningsmedium;
isolering av levende ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus fra nevnte kulturmedium; og
kombinering av nevnte levende ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus med en farmasøytisk akseptabel bærer for produksjon av en levende, ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirusvaksine.
Et ellevte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av ikke-patogene, kimære virus, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: fremstilling av et cDNA som inneholder infeksiøse pankreatisknekrosevirusgenom-segmenter A og B, hvori cDNA i segment A er modifisert for å hindre ekspresjon av NS protein, og hvor nevnte cDNA fra segment A koder for epitopiske determinanter fra minst to forskjellige infeksiøse pankreatisknekrosevirusstammer;
transkribering av nevnte cDNA for produksjon av syntetiske RNA transkripter; transfektering av vertsceller med nevnte syntetiske RNA transkripter;
inkubering av nevnte vertsceller i et kulturmedium; og
isolering av levende, ikke-patogene, kimære infeksiøse pankreatisknekrosevirus fra nevnte kulturmedium.
Viruset nevnt ovenfor kan ytterligere modifiseres eller inaktivres ved kjemiske eller fysiske metoder. Kjemisk inaktivering kan oppnås ved å behandle viruset med, f.eks., enzymer, formaldehyd, B-propiolaceton, etylenimin eller et derivat derav, et organisk løsenings-middel (f.eks. halogenert hydrokarbon) og eller et detergen. Hvis nødvendig, kan den inaktiverende substansen nøytraliseres etter at viruset har blitt inaktivert. Fysisk inaktivering kan utføres ved å utsette viruset for stråling slik som UV lys, X stråling, eller y stråling.
Viruset kan også modifiseres ved kjente metoder som inkluderer seriepassasje, ved å deletere ytterligere sekvenser av nukleinsyrer og setedirigert mutagenese enten før eller etter produksjon av de infeksiøse virus.
Viruset kan være et kimært rekombinant virus som inneholder epitopiske determinanter fra flere enn en stamme av IPNV. Epitopiske determinanter, som som diskutert i det foreliggende dokumentet, er aminosyrer eller aminosyresekvenser som korresponderer til epitoper som gjenkjennes av en eller flere monoklonale antistoffer. Siden VP2 proteinet er hovedvertsbeskyttende immunogene til IPNV, kan det kimære viruset inkludere en del av VP2 immunogenene for minst to forskjellige IPNV stammer i tillegg til det modifiserte NS genet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. Metoder for å produsere et kimært virus er beskrevet i Vakharia, Biotechnology Annual Review bind 3, 151-168,1997; Snyder et al., Avian Diseases, 38: 701-707,1994; og WO 95/26196. Stammer som er egnet for anvendelse i å produsere kimært IPN virus inkluderer men er ikke begrenset til West Buxton, Jasper, SP, NI, DRT, Ab, HE og TE stammer.
Fysiologiske akseptable bærere for vaksinering av fisk er kjent innen fagfeltet og behøver ikke å bli ytterligere beskrevet heri. I tillegg til å være fysiologisk akseptable for fisken må bærerene ikke interfere med den immunologiske responsen som reises av vaksinen og/eller ved ekspresjonen av et polypeptidprodukt.
Andre tilsetninger, slik som adjuvanter og stabilisatorer, blant andre, kan også inneholdes i vaksinen i mengder som er kjent innen fagfeltet. Fortrinnsvis, blir adjuvanter slik som aluminumhydroksid, aluminiumfosfat, planter og dyreoljer, og dets like, administrert med vaksinen i mengder som er tilstrekkelig for å øke immunresponsen til IPNV. Mengden av adjuvant tilsatt til vaksinen vil variere avhengig av egenskapen til adjuvanten, som generelt er i området fra 0,1 til omtrent 100 ganger vekten av IPNV, fortrinnsvis fra omtrent 1 til 10 ganger vekten av IPNV.
Vaksinen fra den foreliggende oppfinnelse kan også inneholde forskjellige stabilistatorer. Et hvilket som helt egnet stabilisator kan bli brukt inklusiv karbohydrater slik som sorbitol, mannitol, stivelse, sukrose, dekstrin eller glukose; proteiner slik som albumin eller casein; og buffere slik som alkalisk metallfosfat og dets like. En stabilisator er spesielt fordelaktig når en tørr vaksinefremstilling blir fremstilt ved lyofiliseirng.
Vaksinen kan administreres med en hvilken som helst egnet kjent metode for inokulering av fisk, inklusiv men ikke begrenset til immersjon, oral administrering, spraying og injeksjon. Fortrinnsvis blir vaksinen administrert ved masseadministrerings-teknikker slik som immersjon. Når den blir administrert ved injeksjon, blir vaksinen fortrinnsvis administrert parenteralt. Parenteral administrering som brukt heri betyr administrering ved intravenøs, subkutan, intramuskulær, eller intraperitoneal injeksjon.
Vaksinen fra den foreliggende oppfinnelse blir administrert til fisk for å hindre IPNV før eller etter klekking. Betegnelsen "fisk" er definert for å inkludere men ikke begrense til fiskearter inklusive ørret, laks, karper, abbor, gjedde, ål, og fjellørret så vel som bløtdyr og skalldyr.
Vaksinen kan tilveiebringes i en steril beholder i en enhetsform eller i andre mengder. Den blir fortrinnsvis lagret frossen, under -20°C, og mer foretrekkbart under -70°C. Den blir tint forut for anvendelse, og kan fryses igjen umiddelbart deretter.
For administrering til fisk, kan den rekombinante produserte virus bli suspendert i en bærer i en mengde på omtrent IO<2> til IO7 pfu/ml, og mer foretrekkbart omtrent IO<5> til IO6 pfu/ml i en bærer slik som en saltløsning. Den inaktiverte vaksinen kan inneholde antigenisk ekvivalent på IO<4> til IO7 pfu/ml suspendert i en bærer. Andre bærere kan også utnyttes som det er kjent innen fagfeltet. Eksempler på farmasøytiske akseptable bærere er diluenter og ureagerbare farmasøytiske bærere kjent innen fagfeltet. Fortrinnsvis, er bærere eller diluenten en som er kompatibel med administrering av vaksinen ved masse-administreringsteknikker, imidlertid, kan bæreren eller diluenten også være kompatibel med andre administreirngsmetoder, slik som injeksjon og dets like.
Oppfinnelsen kan også bli brukt for å produsere kombinasjonsvaksiner med IPNV materialer. IPNV materialer kan kombineres med antigenmaterialet fra andre relevante fiskepatogener og/eller bakterielle antigener. Eksempler på relevante fiskepatogener inkluderer men er ikke begrenset til infeksiøse hematopoetiske nekrosevirus (IHNV), virale "hemorrhagic speticemia" virus (VHSV), ISAV (infeksiøse lakseanemivirus), PDV (pancreas sykdomsvirus), iridovirus og nodavirus. Eksempler på relevante bakterielle antigener inkluderer men er ikke begrenset til antigener fra gram positive bakterier slik som men ikke begrenset til Lactococcus garvieae og gram negative bakterier slik som men ikke begrenset til Aeromonas salmonicida. Andre relevante bakterielle antigener inkluderer men er ikke begrenset til antigener fra Vibrio anguellarum, Vibrio salmonicida, Vibro, viscosus, Yersinia ruckri, Piscirickettsia salmonis, Renibacterium salmoninarum, Pasturella piscicida, Flavobacterium columnare og Flavobacterium psychrophilum.
De foregående utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse blir ytterligere beskrevet i følgende eksempler.
Kort beskrivelse av tegningene
Figur 1. Konstruksjon av fullengde cDNA klonen til IPNV segment A for dannelse av pluss-sens RNA transkripter med T7 RNA polymerase. Genstrukturen til IPNV segment A og dets kodede proteiner er vist på toppen. Overlappene cDNA segmenter av IPNV
ble dannet ved RT-PCR og klonet inn i en pCR2.1 vektor for å erverve forskjellige pCR kloner som indikert. Disse plasmidene ble kuttet med egnede restriksjonsenzymer, og de resulterende segmentene ble deretter klonet inn i en pUC19 vektor for å erverve plasmid pUC19SpA. Dette plasmidet inneholder en T7 RNA polymerasepromotersekvens og
dens 5'-ende. Restriksjonsenzymene brukt for konstruksjon eller lineærisering av fullengdeklonen er indikert.
Figur 2. Konstruksjon av fullengde cDNA klonen av IPNV segment B for syntese av pluss-sens RNA transkriptet med T7 RNA polymerase. Genomsegment B av IPNV koder for RNA-avhengig RNA polymerase, VP1, som er vist på toppen. Overlappende cDNA segmenter fra IPNV ble klonet inn i en pCR2.1 vektor for å erverve forskjellige pCR kloner, som vist. Til slutt, ble et fullengde plasmid pUC18SpB ervervet fra disse klonene, som inneholdt en T7 RNA polymerase promotersekvens ved dets 5-ende. Restriksjonsenzymene som ble brukt for konstruksjon av de ovenfor nevnte plasmider eller linearisering av fullengde klonen er indikert. Figurene 3a og 3b. Nukleotidsekvenssammenligning av 5'- og 3'-ikke kodene regioner av segmentene A (A) og (B) fra IPNV stammene Jasper (JAS), SP, og West Buxton (WB). Start og stoppkodonene for segmentene A og B hovedåpneleserammer for begge stammer er uthevet. Nukleotidforskjellene mellom de to stammene er markert og nukleotididentitenten er markert ved (-). Nukleotiddelesj onene i WB og Sp stammene er markert, og i tillegg er C residien i den 3'-enden til WB og Sp segment A indikert. Inverte terminale repetisjoner i segment A og B hos begge stammer er blokkert og satt i kursiv. Figurene 4a-4f. Immunofluoresensfarging av IPNV infiserte celler for infeksjon av virusspesifikke proteiner. CHSE celler ble infisert med supernatanten og gjenvunnet IPNV ble høstet ved forskjellige tidsintervaller. Cellene ble fiksert ved 24 timer (b), 36 timer (c), 48 timer (d), 72 timer (e) etterinfeksjon, og analysert ved immunofluorensens-analyse for å bruke kanin anti-IPNV polyklonalt serum. Uinfiserte CHSE celler ved 24 timer (a) og 72 timer (f) ble brukt som negative kontroller. (Forstørrelsen er x 200). Figur 5. Analyse av RT-PCR produkter for å identifisere den merkede sekvensen i segment B av gjenvunnende virus. Genomisk RNA isolert fra gjenvunnende virus ble amplifisert ved RT-PCR ved å bruke segment B-spesifikke primere B-BstR (som binder til nukleotidposisjonene 2285-2305; se tabell 1) og B-SacF (som binder til posisjonene 1351-1371; se tabell 1), og produktene ble analysert på 1% agarose. Et 954-bp fragment ble ervervet fra gjenvunnende virus (spor 5 og 6), men ikke fra CHSE celler (spor 4) eller kontrollen(e) hvor i revers transkriptase ble utelatt fra reaksjonen (sproene 1-3). Gelrenset RT-PCR produkter ble kuttet med Smal, som indikert (sporene 7 og 8). Bare DNA avledet fra parentalvirus (gjenvunnet West Buxton, rWB) ble kuttet for å gi fragmentene på 403 og 551 bp (spor 8) mens DNA til det mutante virus ble utkuttet fordi en eliminering av dette Smal setet ved setedirigert mutagenese (spor 7). En 123 bp stige (venstre spor M) og lambda DNA kuttet med Hidnlll/EcoRI (høyre spor M) ble brukt som markører. Figur 6. Konstruksjon av fullengde cDNA klonen til IPNV segment A for dannelse av pluss-sens RNA transkript med T7 RNA polymerase. Genstrukturen til IPNV segment A og dets kodene proteiner er vist på toppen. Overlappende cDNA segmenter fra IPNV ble dannet ved RT-PCR og klonet inn i en pCR2.1 vektor for å erverve forskjellige pCR kloner, som indikert. Disse plasmidene ble kuttet med egnede restriksjonsenzymer, og de resulterende segmentene ble deretter klonet inn i en pUC19 vektor for å erverve plasmid pUC19WBA. Dette plasmidet inneholder en T7 RNA polymerasepromotersekvens og det 5'-ende. Restriksjonsenzymet brukt for konstruksjonen eller linearisering av fullengde klonen er indikert. Forkortelser: A. Apal: E. EcoRl: K. AspllS: S. Sali. Figur 7. Konstruksjon av fullengde cDNA klonen til IPNV segment B for syntese og pluss-sens RNA transkriptet med T7 RNA polymerase. Genomsegment B fra IPNV koder for RNA avhengig RNA polymerase, VP1, som er vist på toppen. Overlappende cDNA segmenter fra IPNV ble klonet inn i en pCR2.1 vektor for å erverve forskjellige pCR kloner, som vist. Disse plasmidene ble kuttet med egnede restriksjonsenzymer, og de resulterende segmentene ble klonet inn i en pUC19 vektor for å erverve plasmidene pUC19B5'#2 og pUC19B3'#3. Til slutt, ble en fullengde plasmid pUC18WBB ervervet fra disse to klonene, som inneholder en T7 RNA polymerasepromotersekvens og ved dets 5'-ende. Restriksjonsenzymene brukt for konstruksjon av de ovenfor nevnte plasmider eller linearisering av fullengde klonen er indikert. Forkortelser: B. BamHl: E. EcoRl: H. Hindlll: K. AspllS: P. Pstl. Figur 8. Atlantiske lakseyngel, eksokrin pancreas, infisert med en 2. passage av en virulent isolat av IPNV (serotype Sp), 8 dager etter infeksjon. Polyrisk "caecae" nederst til venstre. Eksokrint vev har nesten forsvunnet med bare få eksokrine celler som gjenværende. Moderat inflammatorisk reaksjon. Figur 9. Atlantisk lakseyngel, eksokrin pancrease, infisert med en andre passage av et virulent fra IPNV (serotype Sp), 8 dager etter infeksjon. Nærbilde av figur 8 viser få gjenværende eksokrine celler (EC), udistinkt cellekant (degenererte celler) med frigitte zymogen granuler (pil). Mindre inflammatorisk reaksjon. Figur 10. Atlantiske lakseyngel, eksokrin pancreas, infisert med IPNV mutant (serotype Sp), 8 dager etter infeksjon. Tverrgående snittet pyloric "caecae" med eksokrine pancreas lokalisert mellom "caecae". Ingen histomorfologiske endringer er observert i eksokrine vev. Figur 11. Atlantiske lakseyngel, eksokrin pancreas, infisert med IPNV mutant (serotype Sp), 8 dager etter infeksjon. Høyere forstørrelse av figur 3 med tverrgående snitt av pylorisk "caecae". Eksokrin pancreas har et normalt utseende med ingen histomorfologiske tegn på degenerering.
EKSEMPLER
EKSEMPEL 1 - Fremstilling av infeksiøse virus fra syntetisk RNA
Celler og virus. CHSE-214 celler (ATCC, CRL-1681) ble opprettholdt ved romtemperatur i minimal essensielt medium som inneholdt Hanks salter, og tilsatt 10% føtalt bovin serum (FBS). Disse cellene ble brukt for dyrkning av IPNV, transfeksjons-eksperimenter, ytterligere propagering av gjenvunnende virus og immunofluoresens-studier i det vesentlig som beskrevet tidligere (Mundt, E., og V.N. Vakharia. 1996, Synthetic transcripts of double-stranded birnavirus genome are infectious. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:11131-11136). West Buxton (WB) stamme og IPNV (en referanse-serogruppe Al stamme) ble gitt av Frank M. Hetrick (Maryland Department of Agriculture, College Park, MD), og renset som beskrevet tidligere med en liten modifisering (Chang, N., R.D. MacDonald og T.Yamamoto, 1978, Purification of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and coparison of peptide composition of different isolates, Can. J. Microbiol. 24:19-27). I korthet, ble CHSE celler infisert med IPNV og etter at den cytopatiske effekten var tydelig, ble cellene skrapt i et medium og råekstraktvirus ble gjort klart ved sentrifugering ved 5000 X g 30 minutter ved 4°C. Pelleten ble resuspendert i 10 ml TNE buffer (0,1 M Tris-HCl, pH 7,4,0,1 M NaCl, 1 mM EDTA), blandet med 1 volum freon og homogenisert i 5 minutter. Etter sentrifugering ved 8000 X g i 20 minutter ved 4°C, ble det vandige laget aspirert og blandet med supernatanten til råekstraktvirusfremstillingen. Polyetylenglykol (PEG, 20.000 MW) ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 10% (vekt/volum) og blandingen ble inkubert over natten ved 4°C. Løsningen ble sentrifugert ved 8.000 X g i 30 minutter 4°C for å pelletere viruset som ble resuspendert i 10 ml TNE buffer. Etter freon-ekstraksjon, ble viruset pelletert ved 100.000 X g i 1,5 time ved 4°C og resuspender i 0,5 ml TNE buffer. Viruset ble lagt på toppen av en "cushion" av 30% sukrose (vekt/volum i TNE buffer) og sentrifugert ved 120.000 X g i 1 time ved 4°C. Til slutt, ble viruspelleten resuspendert i 100 ul TNE buffer og lagret ved -20°C inntil bruk.
Bestemmelse av 5' og 3' terminal ende fra IPNV genomet. Fullstendige nukleotidsekvenser av 5 - og 3-ikke kodene regioner fra begge genomsegmentene til IPNV ble bestemt ved to metoder som beskrevet for IBDV (Mundt, E., og H. Muller. 1995. Complete nucleotide sequences of 5'- and 3'-noncoding regions of both genome segment of different strains of infectious bursal disease virus. Virology 209:10-18). I korthet, ble viralt RNA isolert fra renset virus ved kutting med proteinase K (200 ug/ml sluttkonsentrasjon) i 6 timer ved 37°C med tilstedeværelse av natriumdodecylsulfat (1%) etterfulgt av fenol/kloroformekstraksjon og etanolpresipitering (Sambrook, J., E.F. Fritsch og T. Maiatis. 1989. Molecular Cloning a laboratory manual. 2. utgave Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N.Y.). For å bestemme den 3' terminale enden av begge tråder fra segmentene A og B ble viralt RNA polyadenylert, revers transkribert med enten A-A3T, A-A5'R, B-B'3F eller B-B5'-R primer (tabell 1), og det resulterende cDNA amplifisert med PCR ved å bruke en poly-dT primer (5-GCGGCCGCCCTTTTTTTTTTTTTTTT-3') (Cashdollar, L.W., J. Esparza, J.R. Hudson, R. Chmelo, P.W.K. Lee og W.K Joklik, 1982. Cloning of double-stranded RNA genes of reovirus. Sequences of the cloned S2 gene. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:7644-7648). Revers transkripsjon (RT)-PCR produkter ble separert ved agarosegel elektroforese, renset med QIAquick gelekstraksjonskit (Qiagen, Inc) og direkte sekvensert ved dideoksy kjedetermineirngsmetoden (Sanger, F., S. Nicklen og A.R. Coulson. 1977. DNA Sequencing with chainterminating inhibitor. Proe. Nati. Acad Sei USA 74:5463-5467), ved å bruke segment-spesifikke primere som beskrevet over. Den 5' terminale enden av segmentene A og B ble bestemt ved rask amplifisering av cDNA ender ved å bruke 5' RACE system (GIBCO/BRL) (Frohman, M.A., M.K. Dush, og G.R. Martin. 1988. Rapid production of full-length cDNA rare transcripts: Amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer. Proe. Nati. Acad. Sei USA 85:8998-9002). I korthet, ble cDNA segmentene A og B syntetisert med RT reaksjon ved å bruke de virus-spesifikke primerene A-ApaR og B-HindR (tabell 1), respektivt. cDNA ble renset ved kromatografi på GlassMAX kolonner og "tailed" med oligo-dC ved å bruke terminal deoksynukleotidyltransferase. Det "tailed" cDNA ble amplifisert ved PCR ved å bruke "nested" virusspesifikk primer A-A5'R eller B-B5'R (tabell 1) og en "bridged" ankerprimer, ifølge forhandlerens protokoll. PCR produktene blir gelrenset og direkte sekvensert ved å bruke segmentspesifikke primere, som beskrevet over.
Konstruksjon av fullengde genomisk cDNA kloner av IPNV. cDNA klonene som inneholdt de fullstendig kodene og ikke kodene regionene til IPNV-RNA segmentene A og B ble fremstilt ved å bruke standard kloningsprosedyrer og metoder som beskrevet for IBDV (Mundt, E., og V.N. Vakharia. 1996, Synthetic transcripts of double-stranded birnavirus genome are infectious. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:11131-11136). I tillegg, ble manipuleringen av DNA utført ifølge standardprotokoller (Sambrook, J., E.F. Fritsch og T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning a laboratory manual 2. utgave Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor. N.Y.). På basis av publiserte IPNV sekvenser til Jasperstammen og den bestemte 5'- og 3'-terminale sekvenser fra WB stammen, ble flere primerpar syntetisert og anvendt i RT-PCR amplifiseringer (se tabell 1).
For å danne cDNA kloner av segment A og WB stamme, ble tre primerpar (A-A5'NC pluss A-ApaR, A-ApaF pluss A-SalR og A-SalF pluss A-A3'NC) brukt for RT-PCR amplifisering (tabell 1). Ved å bruke genomisk RNA som et templat, ble ønsket overlappende cDNA fragmenter fra segment A syntetisert og amplifisert i følge forhandlerens protokoll (Perkin-Elmer). Amplifisert fragmenter ble klonet inn i EcoRI sete ti en pCR2.1 vektor (Invitrogen Corp.) for å erverve plasmidene pCR#8, pCR"l 1 og pCR#23, respektivt (figur 6). Det innsatte DNA i alle disse plasmidene ble sekvensert ved dideoksy kjedetermineirngsmetoden (Sanger, F., S. Nicklen og A.R. Coulson, 1977, DNA sequencing with chain-terminating inhibitor. Proe. Nati. Acad Sei USA 74:5463-5467), ved å bruke Applied Biosystem automatisert DNA sekvensator, og sekvensdataene ble analysert ved å bruke PC/GENE (Intelligenetics) software. For å konstruere en fullengde cDNA klon av segment A, ble plasmidene pCR#8, pCR#l 1 og pCR#23 dobbeltkuttet med restriksjonsenzymparene Asp 718 pluss Apal, Apal pluss Sali og Sali pluss EcoRI for å frigi 670,1520 og 904 baseparrfagmenter respektivt. Disse fragmentene ble deretter klonet mellom EcoRI og Asp 718 seter i pUC19 vektor for å erverve plasmid pUC19WBA. Dette plasmidet inneholder et fullengde kopi av segment A, som koder for alle de strukturelle og ikke strukturelle proteinene (figur 6). På samme måte, for å fremstille cDNA klonene fra segment B, ble tre primerpar (B-B5*NC pluss B-HindR, B-HindF pluss B-PstR og B-PstF pluss B-Bgl3'NC) brukt for å danne overlappende cDNA fragmenter av segment B ved RT-PCR amplifisering (tabell 1). Amplifiserte fragmenter blir klonet inn i pCR2.1 vektor som over for å erverve plasmidene pCR#4.1, pCR#3 og pCR#29 respektivt (Figur 7). DNA fra disse plasmidene ble sekvensert og analysert som beskrevet over. Siden sekvensanalyse av plasmid pCR#3 gav et intert Pstl sete, var det nødvendig å fremstille to ytterligere plasmider. For å konstruere disse klonene (pUC19B5'#2 og pUC19B3'#5), plasmidene pCR#4.1, pCR#3 og pCR#29 ble dobbeltkuttet med enzymparret EcoRI pluss Hindlll, Hindlll pluss Asp 718 eller Asp 718 pluss Pstl, og Pstl pluss BamHI. Etter disse kuttingene, ble respektive fragmenter på 361, 626 eller 293 og 1503 basepar frigitt. EcoRI - Hindlll og Hindlll - Asp 718 fragmenter ble først klonet mellom EcoRI - Asp718 setene i pUC 19 vektor for å erverve plasmid pUC 19B5'#2. Deretter ble Asp718 ;- Pstl og Pstl - BamHI fragmentene klonet mellom Asp 718 og BamHI setene i pUC19 vektor for å erverve plasmid pUC19B3'#5. Til slutt, for å konstruere fullengde cDNA klonen til segment B, ble plasmid pUC19B3'#5 kuttet med Asp 718 og BamHI og det resulterende fragmentet ble klonet inn i Asp 718 - BamHI kuttet pUC19B'#2 vektor. En ;representativ klon av segment B ble selektert og kalt pUC19WBB som koder for VP1 proteinet (figur 7). ;For å introdusere et sekvensmerke inn i IPNV segment B, ble plasmid pUC19WBB konstruert ved oligonukleotiddirigert mutagenese ved å bruke spesifikke primerparr og PCR amplifisering av foreldreplasmidet pUC19WBB. For å konstruere pUC19WBBmut ble to primerparr (B-SacF pluss B-Sma (R og B-Sma(F pluss B-BstR; se tabell 1) syntetisert og brukt for å amplifisere DNA fragmentene på 568 og 407 bp respektivt. Disse fragmentene ble kombinert og deretter amplifisert ved PCR ved å bruke flankerende primere (B-SacF pluss B-BstR) for å produsere et 954 baseparfragment. Dette fragmentet ble kuttet med SacII og BstEII enzymer og det resulterende fragmentet (798 bp) ble klonet til bake inn i SacII - BstEII kuttet foreldreplasmid pUC19WBB. Som et resultat av denne mutasjonen, ble et unikt internt Smal sete i dette plasmidet deletert. Et annet plasmin, pUC19WBB-Sma, ble konstruert hvor etter lineærisering av et Smal enzym og transkripsjonsreaksjon ville gi et RNA transkript med nøyaktig 3'-ende sekvenser som det genomiske RNA. For å konstruere dette plasmidet, ble primerparr (B-BstF pluss B-Sma3"NC; se tabell 1) syntetisert og brukt til å amplifisere et 723 bp fragment med PCR fra pUC19Wbmut templaten. Det amplifiserte fragmentet ble kuttet med BstEII og Bglll enzymer, og det resulterende fragmentet (584 bp) ble klonet tilbake inn i samme seter i dette plasmidet. Til slutt, ble en representativ klon fra segment B selektert og kaldt pUC19WBB-Sma, som manglet det interne Smal setet. ;Integriteten av fullengdekonstruksjonen, pUC19WBA, pUC19WBB og pUC19WBB-Sma, ble testet ved in vitro transkripsjon og translasjonkoblet retikulocyttlysatsystem ved å bruke T7 RNA polymerase (Promega Corp.). ;Transkripsjon og transfeksjon av syntetisk RNA. Transkripsjon og transfeksjonsanalyse ble utført som beskrevet i det detalj tidligere (Mundt, E., og V.N. Vakharia, 1996, Synthetic transcripts of double-stranded birnavirus genome are infectious. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:11131 -11136), med unntak av at CHSE celler ble brukt for transfeksjon. I korthet, ble plasmid pUC19WBA kuttet med Smal og plasmidene pUC19WBB og pUC19WBB-Sma ble kuttet med Bglll og Smal enzymer, respektivt (figurene 6 og 7). Disse lineæriserte plasmidene ble brukt som templater for in vitro transkripsjon med T7 RNA polymerase (Promega Corp.). CHSE celler ble transfektert med kombinerte pluss-senstranskripter avledet fra plasmidene pUC19WBA og pUC19WBB eller pUC19WBA og pUC19WBB-Sma, ved å bruke lipofektinreagens ;(GIBCO/BRL). Det resulterende virusavkommet ble kalt rekombinant WB (rWB) og rWB-Sma, respektivt. ;Karakterisering av gjenvunnet IPNV. For å bestemme spesifisiteten av de gjenvunnede virus, ble CHSE celler infisert med supernatantene til rWB eller rWB-Sma IPNV og infiserte celler ble analysert ved immunofluoresensanalyse (IFA) ved å bruke kanin anti-IPNV polyklonal serum. Anti-IPNV serum, fremstilt mot Jasperstammen med serogruppe A, ble tilveiebrakt av Ana Baya (VA-MD Regional College of Veterinary Medicine, College Park, MD). CHSE celler, som ble dyrket på "cover slips" til 80% konfluens, ble infisert med supernatantene rWB eller rWB-Sma IPNV og inkubert ved romtemperatur i et egnet tildsintervall. Cellene ble deretter høstet med fosfatbufferet saltvann, pH 7,4 (PBS), fiksert med iskald metanol-aceton (1:1) og behandlet med kanin anit-IPNV serum. Etter vask med PBS, ble cellene behandlet med fluoresinmerket geiteanti-kanin antistoff (Kirkegaard & Perry Laboratories) og undersøkt ved fluoresensmikroskopi. ;For å identifisere den merkede sekvensen i de gjenvunnende virus, ble total nukleinsyrer av uinfisert og IPNV-infisert CHSE celler isolert og analysert ved RT-PCR som beskrevet over. Segment B spesifikk primer B-BstR, som binder til nukleotidposisjonene 2285-2305 (tabell 1) ble brukt for RT av genomisk RNA. Etter RT, ble reaksjonsproduktene amplifisert med PCR ved å bruke et oppstrøms segment B-spesifikk primer B-SacF (som binder til nukleotidporisjonene 1351-1371; se tabell 1). De resulterende PCR fragmentene (954-bp) ble gelrenset og hver sekvensert som beskrevet tidligere, eller kuttet med Smal enzym for å bestemme merkesekvensen. ;Sekvensanalyse av IPNV genomet. Fullstendig nukleotidsekvens av IPNV genomsegmentene fra A og B, inklusiv den nøyaktige 5'- og 3'- terminale sekvenser ble bestemt. Segment A er 3097 basepar lang og inneholder to overlappende åpne leserammer (ORF). Hoved ORF koder for de strukturelle VP2 og VP3 proteiner og NS protease, mens det mindre ORF koder for det ikke strukturelle (NS) proteinet (figur 6). Segment B er 2783 basepar langt og det koder for VP1, som er RNA-avhengig RNA polymerase (figur 7). Sammenligning av 5' og 3' terminale sekvenser fra segmentene A og B fra WB stammen med Jasper stammen viste noen mindre forskjeller. F.eks., i segment A, en delesjon av et T residiet i nukleotidposisjon 106 og en tilføying av en serieside i posisjon 3097 ble funnet, mens i segment B, ble en delesjon av en C residie funnet i posisjon 2646. Sammenligning av nukleotiden og deduserte aminosyresekvenser i WB stammesegmentene A og B med den fra Jasper stammen viste 91,64% og 90,37% identitet på nukleotidnivået og 97,22% og 97,16% identitet på aminosyre-nivået, respektivt. Dette indikerer at disse to nordamerikanske stammene av IPNV er nært beslektet. ;Konstruksjon av fullengde cDNA kloner. For å utvikle et revers genetisk system for IPNV, konstruerte vi fullengde cDNA kloner fra segmentene A og B fra IPNV stammen WB. Plasmid pUC19WBA ved kutting med Smal og transkripsjon in vitro med T7 RNA polymerase, gav RNA med nøyaktig 5' og 3' ender og det kodet for alle de strukturelle og ikke strukturelle proteinene (figur 6). Imidlertid, gav plasmid pUC19WBB etter linearisering med Bg/II og transkripsjon RNA med korrekt 5' ende men med ytterligere 5 nukleotider i 3' ende, og det kodet for VP1 proteinet (figur 7). Et plasmid pUC19WBB-Sma med et genetisk merke (eliminering av et internt Smal sete) ble også konstruert for å identifisere virus som var av rekombinant opprinnelse. Linearisering av dette plasmidet med Smal og transkripsjon in vitro gav RNA med nøyaktig 5' og 3' ender. Koblet transkripsjon og translasjon av de ovenfor nevnte plasmidene i kaninretikulocyttsystem gav proteinprodukter som, som komigrerte med markør IPNV proteinene etter fraksjonering på en natriumdodecylsulfat-12,5% polyakrylamidgel og autorediografl. ;Transfeksjon og gjenvinning av IPNV. Pluss-sens transkriptene fra IPNV segmentene A og B ble syntetisert separat in vitro med T7 RNA polymerase ved å bruke de lineariserte plasmidene pUC19WBA, pUC19WBB og pUC19WBB-Sma som templater. Syntetiske RNA transkript(er) avledet fra disse klonene ble deretter brukt for å transfektere CHSE celler, som vist i tabell 2. Disse resultater indikerer at transkriptene avledet fra plasmidene pUC19WBA og pUC19WBB var i stand til å danne infeksiøse virus etter 12 dager etter transfeksjon, som ble bevist ved tilstedeværelse av cytopatisk effekt (CPE). På samme måte, gav transkriptene avledet fra plasmidne pUC19WBA og pUC19WBB-Sma, enten ubehandlet eller behandlet med DNase, opphav til infeksiøse virus etter 10 dager etter transfeksjon. Ingen CPE ble detektert når CHSE celler ble transfektert med enten RNAse behandlede transkripter fra plasmidene pUC19WBA og pUC19WBB-Sma eller "uncapped" RNA fra disse plasmidene eller individuelle RNA fra hvert plasmid eller lipofektinreagens. Disse resultatene indikerer at pluss-sens RNA transkripter fra segmentene A og B er påkrevd for dannelse av IPNV, i overensstem-melse med tidligere funn på IBDV rapportert fra vårt laboratorie (Mundt, E., og V.N. Vakharia. 1996. Synthetic transcripts of double-stranded birnavirus genome are infectious. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 93:11131-11136). ;For å verifisere infektiviteten av de gjenvunnende virus, ble transfekterte CHSE celler frysetørret, og cellefrie supernatanter ble brukt for å infisere ferske CHSE celler. Etter tredje passasje, ble virus "stocks" fra rWB og rWB-Sma fremstilt. Titerene til disse gjenvunnende virusene var sammenlignbare til de fra parenteralstammen WB. For å bestemme spesifisiteten av de gjenvunnende virus, ble CHSE cellene infisert med supernatanter fra enten rWB eller rWB-Sma virus. På forskjellige tidsintervaller, ble cellene høstet og analysert ved IFA ved å bruke anti-IPNV polyklonalt serum. Figur 4 viser resultatene fra immunofluoresensfarging fra IPNV-infiserte celler. CHSE celler infisert med gjenvunnet IPNV gav et positivt grønt immunofluoresenssignal, som indikerer ekspresjon av virus-spesifikke proteiner (figur 4 b-e). Imidlertid, ble ingen fluoresens detektert i mock-infiserte celler ved 24 timer og 72 timer (figur 4a og f). ;Identifisering av merket sekvens. For å vise utnyttelsen av det reverse genetiske system, ble to rekombinante IPNV fremstilt. For å introdusere en merket sekvens inn i segment B, ble plasmid pUC19WBB-SmaI konstruert hvor i et unikt internt Smal sete i VP1 genet ble eliminert ved setedirigert mutagenese. Syntetiske transkripter fra dette plasmidet eller pUC19WBB og pUC19WBA ble deretter brukt for å transfektere CHSE celler. For å verifisere tilstedeværelse eller fravær av mutasjon i gjenvunnende virus, ble genomisk RNA isolert og analysert ved RT-PCR ved å bruke et primerpar som er spesifikt for segment B. Figur 5 viser analysen av RT-PCR produktene og Smal kuttede produkter av gjenvunnende virus. Et 954-bp fragment ervervet fra både rWB og rWB-Sma virus (sporene 5 og 6), men ikke fra CHSE celler (spor 4). Dessuten, ble ikke noe PCR produkt detektert i mock-infiserte eller IPNV-infiserte celler når revers transkriptase ble utelatt fra reaksjonen før PCR (sporene 1-3). Dette indikerer at PCR produktet var avledet fra RNA og ikke kontaminerende DNA. Kutting av PCR produktene med Smal gav de forventede fragmentene på 403 og 551 bp for rWB virus (spor 8), men forble ukuttet for rWB-Sma virus (spor 7). Dessuten, bekreftet sekvensanalyse av dette PCR produktet den forventede nukleotidmutasjonen (eliminering av Smal sete) i VP1 genet. Disse resultatene viste at den merkede sekvensen er tilstede i den genomiske RNA av de gjenvunnende virus. ;EKSEMPEL 2 - Konstruksjon av fullen<g>de cDNA kloner fra IPNV stammen SP ;cDNA klonene som inneholdt de fullstendige kodene og ikke kodene regioner til IPNV-RNA segmentene A og B ble fremstilt ved å bruke standard kloningsprosedyrer og metoder, som beskrevet over for IPNV stammen WB (K. Yao og V.N. Vakharia, J. Virol. 72:8913-8920,1998). Basert på tilgjengelig sekvens av WB stammen, inklusiv 5'- ;og 3'- terminale sekvenser, flere primerpar ble syntetisert og anvendt i RT-PCR amplifisering. ;For å fremstille cDNA kloner fra segment A fra SP stammen, ble to primerpar (A-A5TCC pluss SpA-KpnR, SpA-KpnF pluss SpA-PstR) brukt for RT-PCR amplifisering. Sekvensene til disse primerene er: ;1. A-A5TCC, 5'-TAATACGACTCACTATAGGAAAGAGAGTTTCAACG-3' ;2. Spa-KpnR, <5->GGCCATGGAGTGGTACCTTC-3' ;3. Spa-KpnF, 5'-GAAGGTACCACTCCATGGCC-3' ;4. SpA-PstR, 5-AAAGCTTCTGCAGGGGGCCCCCTGGGGGGC-3' ;Ved å bruke genomisk RNA som et templat, ble ønsket overlapping av cDNA fragmenter fra segment A syntetisert og amplifisert i samsvar med forhandlerens protokoll (Perkin-Elmer). Amplifiserte fragmenter blir klonet inn i EcoRI sete til en pCR2.1 vektor (invitrogen Corp.) for å erverve plasmidene pCRSpA5'#l og Spa3'#6 (figur 1). Det innskutte DNA i alle disse plasmidene ble sekvensert ved dideoksy kjedetermineringsmetoden, ved å bruke et Applied Biosystem automatisert DNA sekvensator, og sekvensdata ble analysert ved å bruke PC/GENE (Intelligenetics) software. For å konstruere fullengde cDNA klon fra segment A, ble plasmidene pCRSpA5'#l og SpA3'#6 dobbeltkuttet med restriksjonsenzymparene BamHI pluss Kpnl og Kpnl pluss Hindlll som frigav 1495 og 1602 baseparfragmenter, respektivt. Disse fragmentene ble deretter klonet mellom BamHI og Kpnl setene fra pUC19 vektor for å erverve plasmid pUC19SpA. Dette plasmidet inneholder et fullengdekopi av segment A som koder for alle de strukturelle og ikke strukturelle proteinene (figur 1). ;På samme måte, for å fremstille cDNA kloner til segment B, ble to primerpar (B-B5-NC pluss SpBIR og SpBIF pluss B-Bgl3TSfC) brukt for å danne overlappende cDNA fragmenter fra segment B ved RT-PCR amplifisering. Sekvensene til disse primerene er: ;1) B-BSTCC, 5-TAATACGACTCACTATAGGAAACAGTGGGTCAACG-3' ;2) SpBIR, 5 '-GTTGATCCCCGTCTTTGCTTCG-3' ;3) SpBIF, <S>^CTTCCTCAACAACCATCTCATG-S' ;4) B-Bgl3'NC, 5'-AGATCTGGGGTCCCTGGCGGAAC-3' ;Amplifiserte fragmenter ble klonet inn i pCR2.1 vektorer for å erverve plasmidene pCRSpB5'#2 og pCRSpB3'#4, respektivt (figur 2). Plasmid pCRSpB5'#2 kuttet med ;EcoRI og subklonet i defosforylert EcoRI-kuttet pUC18 vektor for å erverve plasmid pUCSpB5'#7. For å konstruere en fullengdeklon fra segment B, ble DNA fra plasmid pCRSpB3'#4 dobbeltkuttet med Mfel pluss SphI enzymer og det resulterende 1230 baseparfragmentet ble klonet inn i Mfel-SphI kuttet pUC18SpB5'#7 vektor. En representativ klon fra segment B ble selektert og kalt pUC18SpB, som kodet for VP1 proteinet (figur 2). ;For å introdusere en mutasjon som kan fjerne ekspresjon av 16-kDa ikke strukturell protein i segment A hos SP stammen, ble plasmid pUCSpANSdelta konstruert ved oligonukleotidrettet mutagenese ved å bruke spesifikke primerpar og PCR amplifisering av foreldreplasmidet pUC19SpA. For å konstruere pUCSpANSdelta, ble to primerpar (SPNSdeltaF pluss BstER og SPNdeltaR pluss pUCNdeF) syntetisert og brukt for å amplifisere DNA fragmentene. Sekvensene til disse primerene er: ;1) SPNSdeltaF, 5'-CAATCTATATGCTAGCAAGATGAA-3' ;2) SPNSdeltaR, 5 '-GTTCATCTTGCTAGCATATAGATTG-3' ;3) BstER, 5'-CTCCTTTGGTCACCAGCT-3*
4) PUCNdeF, 5 '-CCATATGCGGTGTGAAATACCG-3'
Amplifiserte DNA fragmenter ble separert ved agarosegelelektroforese, gelrenset, kombinert og deretter amplifisert ved PCR ved å bruke flankerende primere (pUCNdeF og BstER) for å danne et 800 baseparfragment. Dette fragmentet ble klonet inn i en pCR2.1 vektor for å erverve plasmidet pCRSPNSdelta. Dette plasmidet ble kuttet med Ndel og BstEII, og det resulterende fragmentet ble klonet tilbake inn i Ndel - BstEII-kuttet foreldreplasmid pUC19SpA for å erverve plasmid pUCSpANSdelta. Som et resultat av denne seterettede mutagenesen, ble initieringskodonet for 16-kDa proteinet mutert for å hindre ekspresjon av dette ikke strukturelle proteinet.
Integriteten av disse fullengdekonstruksjonene ble testet ved in vitro transkripsjon og translasjon koblet retikulocyttlysatsystem ved å bruke T7 RNA polymerase (Promega Corp.). Fremstilling av RNA transkripter, transfeksjonsprosedyrer og gjenvinning av IPNV ble utført essenielt som beskrevet over for IPNV stammen WB (K. Yao og V.N. Vakharia, J. Virol. 72:8913-8920,1998).
EKSEMPEL 3 - Fremstilling av et ikke strukturelt proteindefekt mutant IPNV
Celler og virus. Se eksempel 1
Konstruksjon av fullegnde cDNA kloner. Alle manipuleringer av DNA ble utført som ifølge standardprotokoller (Sambrook, J., et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utgave, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.). Konstruksjonen av fullengde cDNA klonen fra IPNV genom segment A fra stamme Sp er beskrevet over. Den koder for alle de strukturelle proteinene (VP2, NS protease, og VP3), så vel som NS proteinet (figur 1). En mutant cDNA klon fra segment A som mangler initieringskodonet til NS genet ble konstruert ved setedirigert mutagenese som beskrevet i eksempel 2. En mutant klon fra segment A er ervervet hvor i ATG fra NS genet er mutert til ATT.
En cDNA klon fra segment B fra IPNV blir konstruert som diskutert i eksempel 2.
DNA fra plasmidene produsert over ble sekvensert ved dideoksykjedeterminerings-metoden (Sanger, F., et al., 1977. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5463-5467) ved å bruke en automatisk DNA sekvensator (Applied Biosystem) og sekvensdataene ble analysert ved å bruke PC/Gene (Intelligenetics) software. Integriteten av fullengdekonstruksjonen blir testet ved in vitro transkripsjon og translasjonskoblet retikulocyttlysatsystem ved å bruke T7 RNA polymerase (Promega Corp.).
Transkripsjon og transfeksjon av syntetiske RNA.
Transkripsjon og transfeksjonsanalyse ble utført som beskrevet i detalj over. CHSE celler ble transfektert med kombinerte transkripter fra mutant segment A og segment B ved å bruke lipfektinreagens (GIBCO/BRL).
Vekstkurve for IPNV. For å analysere vekstkarakteristika hos IPNV, ble CHSE celler (i T-25 flasker) infisert med foreldrestammen eller med transkriptavledet umodifisert eller NS svekket virus "stocks" ved en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 0,1. Infiserte cellekulturer ble høstet på forskjellige tidsintervaller og titeren til infeksiøse virus tilstede i kulturen ble bestemt ved plakkanalyse på CHSE celler.
Analyser for celleviabilitet. For en celleviabilitetanalyse, blir CHSE celler infisert med foreldrestammen eller med transkriptavledet umodifisert eller NS manglende virus "stocks" ved en multiplisitet for infeksjon (MOI) på 1. Celleviabiliteten ble målt med trypan blå eksklusjon eller ved kolorimetrisk MTT (tetrazolium) analyse (Mosmann, T., 1983, J. Immuno. Methods 65:1170-1174).
Lakseinokulering og serologi. Atlantisk lakseyngel kan blir brukt for vaksineforsøk. Yngelen blir delt i to grupper på 10 - 20 fisk og hver gruppe blir holdt i akvarium gjennom eksperimentet.
Det NS defekte viruset ble brukt for vaksinering av Atlantisk lakseyngel ved immersjon. Vannivået i tankene blir senket og 2 X 10<5> pfu/ml av NS defekte virus blir tilsatt. Eksponering til vaksinen er 3 timer ved denne konsentrasjonen, og deretter blir vannivået økt og deretter blir vannstrømning gjenopprettet.
Tjue dager etter vaksinasjon, blir yngelen provosert med SP stammen av IPNV. Virus blir tilsatt i tankene med en konsentrasjon på 2 X 10<5> pfu/ml. Symptomatiske fisk blir samlet opp og på en daglig basis undersøkt for å bekrefte tilstedeværelse av viruset.
Karakterisering av gjenvunnende virus in vivo. For å detektere og isolere virus fra laks inokulert med det transfektante viruset, blir pankrease fra hver prøvefisk malt i PBS for å fremstille en 10% pancreatisk suspensjon. En halv ml pancreatisk homogenat ble blandet med 4,5 ml Ml99 medium og får passere gjennom en 0,45 um sprøytefilter. Filtratet blir brukt for å infisere CHSE celler i en T-75 flaske. Cellene blir undersøkt daglig (opptil 5 dager) for tilstedeværelse eller fravær av IPNV spesifikk cytopatisk effekt. I tillegg, blir titeren til virus tilstede i disse kulturene bestemt ved plakkanalyser på CHSE celler.
Identifisering av gjenvunnende virus ved RT-PCR. Totalnukleinsyrer av uinfiserte og IPNV-infiserte CHSE celler eller pancreatisk homogenater blir isolert og analysert ved RT-PCR, respektivt. RT-PCR reaksjoner kan utføres i det vesentlige som beskrevet tidligere, reaksjonsproduktene blir separart på 1% agaroseelektroforese, og renset ved anvendelse av QIAquick gel ekstraksjonskitt (QIAGEN Inc.). PCR fragmentet, som omfatter NS genet og den 5'-ikke kodene regionen til segment A, blir klonet inn i en pCR2.1 vektor, og sekvensert som beskrevet over.
Fiskeinokulering og serologi. Fisken ble inokulert som følger.
Produserings dose
Provosering. Fiskene fikk lov å akklimatisere og normal oppførsel ble observert forut for provoseringen. Fisken ble tatt av for en dag før provoseringen. Ferskt fremstilt kultursupernatanter fra CHSE-214 celler infisert med to provoseringsstammer ble brukt for provosering. Titerene fra supernatantene ble bestemt ved titrering på CHSE-214 celler ved standard prosedyre.
1. De to gruppene med yngel (gruppe I og gruppe II) ble provosert ved immersjon ved følgende prosedyre. Vannivået i tankene ble redusert til 1 liter og vannsuppleringer ble skrudd av i 3 timer. 23 ml av Sp mutanten ble tilsatt til gruppe I, som gav en provoseringsdose på 2 x IO<5> PFU/ml. 18 ml av Sp-villtype ble tilsatt til gruppe II, som gir en provoseringsdose på 10 x IO<5> PFU/ml. Luftingen ble forsterket under 3 timers badet. Etter 3 timer, ble vannstrømming
og volumet i hver tank returnert til det normale.
2. De to gruppene med unglaks (gruppe III og IV) ble provosert ved intraperitoneal injeksjon på 0,2 ml (ca. 2 x IO6 PFU) av Sp mutant og en Sp villtype respektivt.
Prøvetaking. 6, 8 og 10 dager etter provoseringen, ble fire yngel fra hver av gruppe I og gruppe II samlet inn, åpnet og overført umiddelbart til rør med 4% fosfat-bufferet formaldehyd. På samme tid, ble pancreatisk vev fjernet fra 3 fisk fra hver av gruppene III og IV og overført til rør som inneholdt 4% fosfat-bufferet formaldehyd. Prøvene fra hver ubehandlet fisk fra samme beholdning av fisk brukt for vaksinering, ble samlet inn og brukt som negative kontroller. Alle prøvene ble innstøpt i parafin, kuttet i 5-6 mikrometer tykke skiver, og plassert på limdekkede slidesplater. Prøvene ble farget med hematoksylin og eosin, undersøkt for degenerering og nekrose i eksokrin pancreas. 8 dager etter infeksjon viste kontrollfisken infisert med et virulent isolat av IPNV en moderat inflammasjonsreaksjon, eksokrint ved hadde nesten forsvunnet med kun få eksokrine celler igjen. De få gjenværende eksokrine cellene hadde distinkte cellegrenser (degenererte celler) med frigitt zymogene granula. Ved 8 dager etter infeksjon viste fisken infisert med IPNV mutanten ingen histopatologiske endringer i eksokrint vev. Den eksokrine pancreas har et normalt utseende med ingen histomorfologiske tegn på degenerering.
Claims (21)
1.
cDNA, karakterisert ved at det inneholder minst en del av det infeksiøse pankreatisknekrosevirusgenomet valgt fra gruppen bestående av segment A og segmentene A og B, hvori nevnte cDNA inkluderer 5' og 3' terminale ender fra nevnte segmenter og hvori segment A er modifisert for å hindre ekspresjon av NS proteinet.
2.
cDNA ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte cDNA er avledet fra fler enn en stamme av infeksiøse pankreatisknekrosevirus.
3.
Syntetisk RNA, karakterisert ved at det er transkribert fra cDNA ifølge krav 1.
4.
Rekombinant vektor, karakterisert ved at den omfatter cDNAet ifølge krav 1.
5.
Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med den rekombinante vektoren ifølge krav 4.
6.
Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med et syntetisk RNA ifølge krav 3.
7.
Kimært ikke-patogent akvatisk birnavirus, karakterisert v e d at nevnte virus er NS proteindefekt og inneholder epitopiske determinanter fra minst to forskjellige birnavirusstammer, hvor det akvatiske birnaviruset er infeksiøst pankreatisknekrosevirus og hvori IPNV er oppnådd fra et cDNA omfattende en segment A-modifikasjon som er effektiv for å forhindre ekspresjon av NS protein.
8.
Virus ifølge krav 7, karakterisert ved at nevnte infeksiøse pankreatisknekrosevirusstammer er valgt fra gruppen bestående av West Buxton, Jasper, NI og SP.
9.
Vaksine, karakterisert ved at den omfatter kimser ikke-patogen akvatisk birnavirus ifølge krav 7, i kombinasjon med en farmasøytisk akseptabel bærer.
10.
Vaksine ifølge krav 9, karakterisert ved at den ytterligere omfatter antigener fra akvatiske virus andre enn birnavirus, bakterielle antigener eller antigener fra akvatiske virus andre enn birnavirus i kombinasjon med bakterielle antigener.
11.
Vaksine ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte antigener fra akvatiske virus andre enn birnavirus er valgt fra gruppen bestående av infeksiøse hematopoetiske nekrosevirus (IHNV), virale "hemorrhagic septicemia" virus (VHSV), ISAV (infeksiøse lakseanemivirus), PDV (pancreas syksdomsvirus), iridovirus og nodavirus.
12.
Vaksine ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte bakterielle antigener er antigener fra gram negative bakterier.
13.
Vaksine ifølge krav 10, karakterisert ved at nevnte bakterielle antigener er fra bakterier valgt fra grupper bestående av Aeromonas salmonicda, Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida, Vibrio viscosus, Yersinia ruckri, Piscirickettsia salmonis, Renibacterium salmoninarum, Pasturella piscicida, Flavobacterium columnare, Flavobacterium psychrophilum og Lactococcus garvieae.
14.
Fremgangsmåte for fremstilling av ikke-patogene, infeksiøse pankreatisknekrosevirus, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: fremstilling av et cDNA som inneholder infeksiøse pankreatisknekrosevirusgenom-segmenter A og B, hvori cDNA i segment A er modifisert slik at ekspresjon av NS protein er forhindret, transkribering av nevnte cDNA for produksjon av syntetiske RNA transkripter, transfektering av vertsceller med nevnte syntetiske RNA transkripter, inkubering av nevnte vertsceller i et kulturmedium, og isolering av levende, ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus fra nevnte kulturmedium.
15.
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte vertscelle er valgt fra gruppen bestående av "chinook" lakseembryo (CHSE) celler, regnbue ørretgonade (RTG-2) celler, "Bluegill" fisk (BF-2) celler, Brown Bullhead" (BB) celler og "Fathead Minnow" (FHM) celler.
16.
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte cDNA er avledet fra fler enn en stamme av infeksiøse pankreatisknekrosevirus.
17.
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at cDNA for segment A er modifisert ved at initieringskodonet til NS genet er mutert til et stoppkodon.
18.
Levende, ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus, karakterisert ved at nevnte virus er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 14.
19.
Vaksine, karakterisert ved at den omfatter ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus ifølge krav 18, hvori segment A fra nevnte virus er modifisert i minst to regioner for å hindre ekspresjon av NS proteinet.
20.
Fremgangsmåte for fremstilling av en levende, ikke-patogen infeksiøs pankreatisknekrosevirusvaksine, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: fremstilling av en fullengde cDNA som inneholder infeksiøs pankreatisknekrose-virusgenomsegmenter A og B, hvori segment A har blitt modifisert for å forhindre ekspresjon av NS proteinet, transkribering av nevnte cDNA for produksjon av syntetiske RNA transkript, transfektering av vertsceller med nevnte RNA transkripter, inkubering av nevnte vertsceller i et dyrkningsmedium, isolering av levende ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus fra nevnte kulturmedium, og kombinering av nevnte levende ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirus med en farmasøytisk akseptabel bærer for produksjon av en levende, ikke-patogene infeksiøse pankreatisknekrosevirusvaksine.
21.
Fremgangsmåte for fremstilling av ikke-patogene, kimære virus, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: fremstilling av et cDNA som inneholder infeksiøse pankreatisknekrosevirusgenom-segmenter A og B, hvori cDNA i segment A er modifisert for å hindre ekspresjon av NS protein, og hvor nevnte cDNA fra segment A koder for epitopiske determinanter fra minst to forskjellige infeksiøse pankreatisknekrosevirusstammer, transkribering av nevnte cDNA for produksjon av syntetiske RNA transkripter, transfektering av vertsceller med nevnte syntetiske RNA transkripter, inkubering av nevnte vertsceller i et kulturmedium, og isolering av levende, ikke-patogene, kimære infeksiøse pankreatisknekrosevirus fra nevnte kulturmedium.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US8017898P | 1998-03-31 | 1998-03-31 | |
| PCT/US1999/004285 WO1999050419A2 (en) | 1998-03-31 | 1999-03-31 | A method for generating nonpathogenic, infectious pancreatic necrosis virus (ipnv) from synthetic rna transcripts |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20004914D0 NO20004914D0 (no) | 2000-09-29 |
| NO20004914L NO20004914L (no) | 2000-11-23 |
| NO329660B1 true NO329660B1 (no) | 2010-11-22 |
Family
ID=22155757
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20004914A NO329660B1 (no) | 1998-03-31 | 2000-09-29 | cDNA, RNA, vektor, vertcelle, kimaert ikke-patogent akvatisk birnavirus, levende ikke-patogene IPNV, vaksine samt fremgangsmate for fremstilling |
| NO20082682A NO20082682L (no) | 1998-03-31 | 2008-06-16 | En fremgangsmate for a fremstille ikke-patogene, infeksiose pancreatiske nekrosevirus (IPNC) fra syntetisk RNA-transkripter |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20082682A NO20082682L (no) | 1998-03-31 | 2008-06-16 | En fremgangsmate for a fremstille ikke-patogene, infeksiose pancreatiske nekrosevirus (IPNC) fra syntetisk RNA-transkripter |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6274147B1 (no) |
| AU (1) | AU3353599A (no) |
| CA (1) | CA2324478C (no) |
| DK (1) | DK200001374A (no) |
| NO (2) | NO329660B1 (no) |
| WO (1) | WO1999050419A2 (no) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6596280B1 (en) * | 1997-07-31 | 2003-07-22 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts |
| US20040001863A1 (en) * | 1998-12-03 | 2004-01-01 | Shau-Chi Chi | Immortal cell line derived from grouper Epinephelus coioides and its applications therein |
| US6630456B2 (en) * | 1999-11-23 | 2003-10-07 | Academia Sinica | Regulation of apoptosis in aquatic organisms by aquabirnavirus |
| CA2457349A1 (en) * | 2001-08-10 | 2003-02-20 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Sub-unit vaccine for infectious pancreatic necrosis virus |
| CA2490866A1 (en) * | 2002-06-26 | 2004-01-08 | Advanced Bionutrition Corporation | Viruses and virus-like particles for multiple antigen and target display |
| TWI347364B (en) | 2003-02-19 | 2011-08-21 | Novartis Ag | Inactivated nodavirus vaccine |
| ES2217967B1 (es) * | 2003-03-31 | 2006-01-01 | Consejo Sup. Investig. Cientificas | Procedimiento de produccion de particulas virales vacias (vlps) del virus inductor de la bursitis infecciosa (ibdv), composiciones necesarias para su puesta a punto y su uso en la elaboracion de vacunas frente al ibdv. |
| ES2307346B1 (es) * | 2004-01-21 | 2009-11-13 | Consejo Sup. Investig. Cientificas | Capsidas vacias (vlps(-vp4)) del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
| ES2307345B1 (es) * | 2004-01-21 | 2009-11-13 | Consejo Sup. Investig. Cientificas | Capsidas vacias quimericas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), su procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
| AU2005249450A1 (en) | 2004-05-27 | 2005-12-15 | Centocor, Inc. | Cynomolgus prostate specific antigen |
| WO2006101503A2 (en) * | 2004-06-15 | 2006-09-28 | Centocor, Inc. | Method for screening agents against human prostate disease |
| US7244432B2 (en) * | 2004-12-08 | 2007-07-17 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Infectious bursal disease virus (IBDV) variant from Georgia |
| DE102005010288A1 (de) * | 2005-03-02 | 2006-09-07 | Riemser Arzneimittel Ag | Pharmazeutisches, oral applizierbares Präparat zur Behandlung von Fischen, Herstellungsverfahren für dieses und seine Verwendung |
| ES2310062B1 (es) * | 2005-07-15 | 2009-11-13 | Bionostra, S.L. | Particulas pseudovirales vacias quimericas derivadas del virus causante de la enfermedad de la bursitis infecciosa (ibdv), procedimiento de obtencion y aplicaciones. |
| CN102666860B (zh) | 2009-07-31 | 2015-06-17 | 诺华股份有限公司 | 反向遗传系统 |
| NO332608B2 (no) * | 2011-03-16 | 2012-11-19 | Fish Vet Group Fvg | Levende avirulent IPNV og vaksine for profylakse eller behandling av IPN-sykdom hos fisk |
| CN103937912B (zh) * | 2014-05-13 | 2016-07-20 | 吴斌 | 用于检测传染性胰脏坏死病毒的lamp引物组合物及其应用 |
| WO2021030268A2 (en) | 2019-08-09 | 2021-02-18 | Nutcracker Therapeutics, Inc. | Microfluidic apparatus and methods of use thereof |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5788970A (en) * | 1994-03-29 | 1998-08-04 | The University Of Maryland College Park | Chimeric infectious bursal disease virus CDNA clones, expression products and vaccines based thereon |
| US5871744A (en) | 1996-09-05 | 1999-02-16 | University Of Maryland-Biotechnology Inst. | Method for generating birnavirus from synthetic RNA transcripts |
| EP0887412B1 (en) * | 1997-05-26 | 2003-10-15 | Akzo Nobel N.V. | Recombinant birnavirus vaccine |
| US6231868B1 (en) | 1997-09-30 | 2001-05-15 | University Of Maryland-Biotechnology Institute | Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts |
-
1999
- 1999-03-31 CA CA2324478A patent/CA2324478C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-31 WO PCT/US1999/004285 patent/WO1999050419A2/en active Application Filing
- 1999-03-31 US US09/282,147 patent/US6274147B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-31 AU AU33535/99A patent/AU3353599A/en not_active Abandoned
-
2000
- 2000-09-15 DK DK200001374A patent/DK200001374A/da not_active Application Discontinuation
- 2000-09-29 NO NO20004914A patent/NO329660B1/no not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-06-16 NO NO20082682A patent/NO20082682L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2324478A1 (en) | 1999-10-07 |
| WO1999050419A3 (en) | 1999-11-18 |
| WO1999050419A2 (en) | 1999-10-07 |
| AU3353599A (en) | 1999-10-18 |
| NO20004914D0 (no) | 2000-09-29 |
| NO20004914L (no) | 2000-11-23 |
| CA2324478C (en) | 2011-08-23 |
| NO20082682L (no) | 2000-11-23 |
| DK200001374A (da) | 2000-11-23 |
| US6274147B1 (en) | 2001-08-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO329660B1 (no) | cDNA, RNA, vektor, vertcelle, kimaert ikke-patogent akvatisk birnavirus, levende ikke-patogene IPNV, vaksine samt fremgangsmate for fremstilling | |
| McLoughlin et al. | Alphavirus infections in salmonids–a review | |
| CA2298956C (en) | Genetically engineered cell culture adapted infectious bursal diseases virus (ibdv) mutants | |
| Shivappa et al. | Molecular characterization of Sp serotype strains of infectious pancreatic necrosis virus exhibiting differences in virulence | |
| Allnutt et al. | Antigenicity of infectious pancreatic necrosis virus VP2 subviral particles expressed in yeast | |
| EP2295590A1 (en) | Nucleic acid sequences encoding proteins capable of associating into a virus-like particle | |
| CN104561049A (zh) | 一种表达猪细小病毒vp2蛋白的重组杆状病毒及制备方法与应用 | |
| Lopez-Doriga et al. | Isolation of salmon pancreas disease virus (SPDV) in cell culture and its ability to protect against infection by the ‘wild-type’agent | |
| CN100506989C (zh) | 镶嵌传染性腔上囊病病毒疫苗 | |
| Guo et al. | Recombinant infectious hematopoietic necrosis virus expressing infectious pancreatic necrosis virus VP2 protein induces immunity against both pathogens | |
| US6231868B1 (en) | Method for generating nonpathogenic infections birnavirus from synthetic RNA transcripts | |
| NO332608B1 (no) | Levende avirulent IPNV og vaksine for profylakse eller behandling av IPN-sykdom hos fisk | |
| Foster | Viruses as pathogens: animal viruses affecting wild and domesticated species | |
| US7022327B1 (en) | Recombinant birnavirus vaccine | |
| EP0887412B1 (en) | Recombinant birnavirus vaccine | |
| Stoute et al. | Viral infections of waterfowl | |
| Mundt et al. | Development of a vaccine for immunization against classical as well as variant strains of infectious bursal disease virus using reverse genetics | |
| Patel et al. | Immunoprophylaxis against important virus diseases of horses, farm animals and birds | |
| Rimstad | Vaccination against infectious pancreatic necrosis | |
| US9345760B2 (en) | IPNV-ISAV bivalent vaccine using a virus-like particle-based platform and methods of using the same | |
| KR102421249B1 (ko) | 국내 분리 미주형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물 | |
| KR102421251B1 (ko) | 국내 분리 중국형 항원변이형 닭전염성 f낭병 바이러스 및 이를 포함하는 백신조성물 | |
| Shivappa | Identification of molecular markers for virulence in infectious pancreatic necrosis virus and development of a subunit vaccine | |
| Harris | Characterization of infectious bursal disease viruses isolated from commercial chickens | |
| Graham et al. | Salmonid alphaviruses. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |