NO326399B1 - Fremgangsmate for a fremstille et immunogent hapatittprotein - Google Patents
Fremgangsmate for a fremstille et immunogent hapatittprotein Download PDFInfo
- Publication number
- NO326399B1 NO326399B1 NO19971529A NO971529A NO326399B1 NO 326399 B1 NO326399 B1 NO 326399B1 NO 19971529 A NO19971529 A NO 19971529A NO 971529 A NO971529 A NO 971529A NO 326399 B1 NO326399 B1 NO 326399B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- hev
- protein
- orf
- hepatitis
- proteins
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 162
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 145
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 35
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 16
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 claims abstract description 44
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 claims abstract description 44
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 20
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 108700006290 Hepatitis E virus ORF2 Proteins 0.000 claims description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 241000724675 Hepatitis E virus Species 0.000 abstract description 191
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 89
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 89
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 89
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 43
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 27
- 201000010284 hepatitis E Diseases 0.000 abstract description 18
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 17
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 17
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 abstract description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 133
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 99
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 57
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 52
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 47
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 46
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 42
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 33
- 241000282567 Macaca fascicularis Species 0.000 description 31
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 31
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 31
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 30
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 27
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 25
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 25
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 24
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 23
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 21
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 12
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 12
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 11
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 11
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 10
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 9
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000012808 pre-inoculation Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 101000787132 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 8.2 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000827262 Acidithiobacillus ferrooxidans Uncharacterized 18.9 kDa protein in mobE 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000811747 Antithamnion sp. UPF0051 protein in atpA 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000827607 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 8.5 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 5
- 101000961975 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 13.4 kDa protein Proteins 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 101000964407 Caldicellulosiruptor saccharolyticus Uncharacterized 10.7 kDa protein in xynB 3'region Proteins 0.000 description 5
- 101000768777 Haloferax lucentense (strain DSM 14919 / JCM 9276 / NCIMB 13854 / Aa 2.2) Uncharacterized 50.6 kDa protein in the 5'region of gyrA and gyrB Proteins 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 101000607404 Infectious laryngotracheitis virus (strain Thorne V882) Protein UL24 homolog Proteins 0.000 description 5
- 101000735632 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 8.8 kDa protein in aacA4 3'region Proteins 0.000 description 5
- 241000282561 Macaca nemestrina Species 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 101000818100 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 12.7 kDa protein in trpE 5'region Proteins 0.000 description 5
- 101001037658 Streptomyces coelicolor (strain ATCC BAA-471 / A3(2) / M145) Glucokinase Proteins 0.000 description 5
- 101001120268 Streptomyces griseus Protein Y Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 5
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000282709 Aotus trivirgatus Species 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000666833 Autographa californica nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 20.8 kDa protein in FGF-VUBI intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 241000201370 Autographa californica nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 3
- 101000977027 Azospirillum brasilense Uncharacterized protein in nodG 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101000933555 Bacillus subtilis (strain 168) Biofilm-surface layer protein A Proteins 0.000 description 3
- 101000962005 Bacillus thuringiensis Uncharacterized 23.6 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 3
- 101000785191 Drosophila melanogaster Uncharacterized 50 kDa protein in type I retrotransposable element R1DM Proteins 0.000 description 3
- 101000747704 Enterobacteria phage N4 Uncharacterized protein Gp1 Proteins 0.000 description 3
- 101000861206 Enterococcus faecalis (strain ATCC 700802 / V583) Uncharacterized protein EF_A0048 Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101000769180 Escherichia coli Uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 3
- 101000976301 Leptospira interrogans Uncharacterized 35 kDa protein in sph 3'region Proteins 0.000 description 3
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 3
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000658690 Neisseria meningitidis serogroup B Transposase for insertion sequence element IS1106 Proteins 0.000 description 3
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 3
- 101000748660 Pseudomonas savastanoi Uncharacterized 21 kDa protein in iaaL 5'region Proteins 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 101000584469 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P1 Proteins 0.000 description 3
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 3
- 101000773449 Sinorhizobium fredii (strain NBRC 101917 / NGR234) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator y4sM Proteins 0.000 description 3
- 101000818096 Spirochaeta aurantia Uncharacterized 15.5 kDa protein in trpE 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000766081 Streptomyces ambofaciens Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in unstable DNA locus Proteins 0.000 description 3
- 101000987243 Streptomyces griseus Probable cadicidin biosynthesis thioesterase Proteins 0.000 description 3
- 101000804403 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HIT-like protein Synpcc7942_1390 Proteins 0.000 description 3
- 101000750910 Synechococcus elongatus (strain PCC 7942 / FACHB-805) Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator Synpcc7942_2319 Proteins 0.000 description 3
- 101000644897 Synechococcus sp. (strain ATCC 27264 / PCC 7002 / PR-6) Uncharacterized protein SYNPCC7002_B0001 Proteins 0.000 description 3
- 101000916336 Xenopus laevis Transposon TX1 uncharacterized 82 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101001000760 Zea mays Putative Pol polyprotein from transposon element Bs1 Proteins 0.000 description 3
- 101000678262 Zymomonas mobilis subsp. mobilis (strain ATCC 10988 / DSM 424 / LMG 404 / NCIMB 8938 / NRRL B-806 / ZM1) 65 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003094 microcapsule Substances 0.000 description 3
- 230000003041 necroinflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 238000012809 post-inoculation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 3
- -1 0.1-2 Chemical compound 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 2
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012011 Isocitrate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010075869 Isocitrate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 2
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 2
- 241000288961 Saguinus imperator Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000011948 assay development Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 229940059904 light mineral oil Drugs 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000007392 microtiter assay Methods 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000002064 post-exposure prophylaxis Effects 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 230000007485 viral shedding Effects 0.000 description 2
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 20-hydroxyecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@](C)(O)[C@H](O)CCC(C)(O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 NKDFYOWSKOHCCO-YPVLXUMRSA-N 0.000 description 1
- OVSKGTONMLKNPZ-UHFFFAOYSA-N 3-(1-methylindol-3-yl)-4-(1-methyl-6-nitroindol-3-yl)pyrrole-2,5-dione Chemical compound C12=CC=CC=C2N(C)C=C1C1=C(C=2C3=CC=C(C=C3N(C)C=2)[N+]([O-])=O)C(=O)NC1=O OVSKGTONMLKNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 101000787133 Acidithiobacillus ferridurans Uncharacterized 12.3 kDa protein in mobL 3'region Proteins 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000282708 Aotus <primate> Species 0.000 description 1
- 101100274419 Arabidopsis thaliana CID5 gene Proteins 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DJIMLSXHXKWADV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000713838 Avian myeloblastosis virus Species 0.000 description 1
- 101000827603 Bacillus phage SPP1 Uncharacterized 10.2 kDa protein in GP2-GP6 intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 241001609030 Brosme brosme Species 0.000 description 1
- 241000714198 Caliciviridae Species 0.000 description 1
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 1
- 208000034657 Convalescence Diseases 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004206 Gamma-glutamyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 208000005331 Hepatitis D Diseases 0.000 description 1
- 238000012695 Interfacial polymerization Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101000977786 Lymantria dispar multicapsid nuclear polyhedrosis virus Uncharacterized 9.7 kDa protein in PE 3'region Proteins 0.000 description 1
- 101150044367 MKC1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004907 Macro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 201000005505 Measles Diseases 0.000 description 1
- 101710134502 Mgp-operon protein 3 Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 1
- 101001113905 Rice tungro bacilliform virus (isolate Philippines) Protein P4 Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000288956 Saguinus mystax Species 0.000 description 1
- 241000282696 Saimiri sciureus Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 238000001793 Wilcoxon signed-rank test Methods 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 125000004799 bromophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 239000000084 colloidal system Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003405 delayed action preparation Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 1
- 102000006640 gamma-Glutamyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000036732 histological change Effects 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 229920003063 hydroxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940031574 hydroxymethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- RCRODHONKLSMIF-UHFFFAOYSA-N isosuberenol Natural products O1C(=O)C=CC2=C1C=C(OC)C(CC(O)C(C)=C)=C2 RCRODHONKLSMIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000008141 laxative Substances 0.000 description 1
- 230000002475 laxative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012317 liver biopsy Methods 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 239000002088 nanocapsule Substances 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 101710135378 pH 6 antigen Proteins 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002861 polymer material Substances 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 229940016590 sarkosyl Drugs 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000007502 viral entry Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
- C07K14/08—RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/29—Hepatitis virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/28011—Hepeviridae
- C12N2770/28111—Hepevirus, e.g. hepatitis E virus
- C12N2770/28123—Virus like particles [VLP]
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Zoology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Tre-bokstav-forkortelsen følger de konvensjonelle ammosyreforkortelser for de tyve naturlige forekommende aminosyrer.
De foretrukne, rekombinante HEV-proteiner består av minst ett ORF-protein. Andre rekombinante proteiner som består av mer enn ett av det samme eller forskjellige ORF-proteiner kan fremstilles for å endre de biologiske egenskaper hos proteinet. Det tas stikte på at addisjoner, substitusjoner eller delesjoner av diskrete aminosyrer eller av diskrete sekvenser av aminosyrer kan øke den biologiske aktivitet for HEV-proteinene.
Nukleinsyresekvensene som er i stand til å styre produksjonen av de ovenfor beskreve HEV-protein, kalt SAR-55, er angitt nedenfor som SEQ ID No. 4 og er deponert hos "American Type Culture collection" (ATCC) den 17. September 1992 under ATCC aksess nr 75302.
Forkortelsene som benyttes for nucleotidene er de som benyttes i teknikken som standard.
Sekvensen i en retning er i henhold til konvensjonen designert som "pluss"-sekvensen fordi det er den proteinkodene tråd av RNA-viruset og dette er sekvensen som ovenfor vist somSEQIDNO.:4.
De deduserte aminosyresekvenser av de åpne leserammer av SAR-55 har SEQ ID NO.
1, SEQ ID NO. 2 og SEQ E> NO. 3. ORF-1 starter ved nucleotid 28 i SEQ ID NO. 4 og strekker seg over 5078 nucleotider; ORF-2 starter ved nucleotid 5147 av SEQ ID NO. 4 og strekker seg over 1979 nucleotider; og ORF-3 starter ved nucleotid 5106 av SEQ ID NO. 4 og strekker seg over 368 nucleotider.
Det tas sikte på variasjoner i DNA-sekvensene som vil resultere i en DNA-sekvens som er i stand til å styre produksjonen av analoger av ORF-2-proteinet. Med "analoger av ORF-2-proteinet" slik uttrykket benyttes her i beskrivelse og krav, er ment å bety et protein med en aminosyresekvens som i det vesentlige ér identisk med en sekvens spesifikt vist her der en eller flere av restene som er vist i den her presenterte sekvens er substituert med biologisk ekvivalent rest slik at det resulterende protein (dvs "analogen") er i stand til å danne virale partikler og er immunogent. Det skal påpekes at det DNA-sekvensen som er angitt ovenfor viser en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen. Pga en degenerasjon i den genetiske kode, skal det være klart at det tallrike valg av nucleotider kan foretas som allikevel vil føre til en DNA-sekvens som er i stand til å styre produksjonen av de herværende ORF-proteiner eller deres analoger. Som sådanne er DNA-sekvenser som funksjonelt er ekvivalente med sekvensene som er angitt ovenfor eller som er funksjonelt ekvivalente med sekvenser som ville styre produksjonen av analoger av ORF-proteinet, fremstilt som følge av aminosyresekvensen som angitt ovenfor, men å ligge innenfor oppfinnelsens ramme.
Vektorene det tas sikte på for anvendelse ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer en hvilken som helst vektor inn i hvilken man kan skyte en nukleinsyresekvens som
beskrevet ovenfor, sammen med hvilke som helst foretrukne eller krevede operasjonelle elementer, og hvilken vektor så deretter kan overføres til vertsorganismen og replikeres i en slik organisme. Foretrukne vektorer er de hvis restriksjonsseter er vel dokumentert og som inneholder de operasjonelle elementer som er foretrukket eller krevet for
transkripsjon av nukleinsyresekvensen.
De "operasjonelle elementer" slik de her beskrives inkluderer misnt en promoter, minst en operator, minst en ledersekvens og minst en terminatorkodon, og en hvilken som helst annen DNA-sekvens som er nødvendig eller foretrukket for hensiktsmessig transkripsjon og etterfølgende translasjon av vektornukleinsyren. Særlig tas det sikte på at slike vektorer vil inneholde minst en replikasjonsopprinnelse som erkjennes av vertsorganismen sammen med minst en selekterbar markør og minst en promotersekvens som er i stand til å initiere transkripsjon av nukleinsyresekvensen.
Ved konstruksjon av kloningsvektoren ifølge oppfinnelsen skal det i tillegg påpekes at multiple kopier av nukleinsyresekvensen og dens tilhørende operasjonelle elementer kan skytes inn i hver vektor. I en slik utførelsesform vil vertsorganismen produsere større mengder pr vektor av det ønskede HEV-protein. Antallet multiple kopier av DNA-sekvensen som kan skytes inn i vektoren er begrenset kun av evnene til den resulterende vektor pga størrelse, til å kunne transformers inn i og replikeres og transkriberes i en egnet vertsmikroorganisme.
I en andre utførelsesform kan restriksjonsfermenteringsfragmenter inneholdende en kodingssekvens for HEV-proteiner skytes inn i en egnet ekspresjonsvektor som funksjonerer i prokaryotiske eller eukaryotiske celler. Med egnet menes at vektoren er i stand til å bære og å uttrykke en fullstendig nukleinsyresekvens som koder for HEV-proteiner, fortrinnsvis minst ett fullstendig ORF-protein. Når det gjelder ORF-2 bør det uttrykte protein danne virallignende partikler. Foretrukne ekspresjonsvektorer er de som funksjonerer i en eukaryotisk celle. Eksempler på slike vektorer inkluderer, men er ikke begrenset til vektorer som kan benyttes for ekspresjon i gjær (f.eks. pPIC9-vektor-invotrogen), vaksine virus vektorer, adenoviruser eller herpesviruser, fortrinnsvis baculovirus overføringsvektoren, pBlueBac. Foretrukne vektorer er P63-2 som inneholder et fullstendig ORF-2-gen, og P59-4 som inneholder de fullstendige ORF-3-og ORF-4-gener. Disse vektorer er deponert ved "American Type Culture Collection", 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 USA den 10. September 1992 og har aksessnumrene 75299 (P63-2) og 75300 (P59-4).
Eksempel 1 viser kloningen av ORF-2-genet inn i pBlueBac for å produsere P63-2. Denne metode inkluderer fermentering av genomet av HEV-stammen SAR-55 med restriksjonsenzymene Nrul og Bgffl, innskyting av en polylinker inneholdende Blnl- og Bglll-setene inn i det unike Nhel-sete av vektorer og å skyte Nrul-Bglll ORF-2-fragmentet inn i Blnl.BglH pBlueBac ved bruk av en adepter.
I ytterligere en utførelsesform kan den valgte, rekombinante ekspresjonsvektor så transfekteres til et egnet, eukaryotisk cellesystem i den hensikt å uttrykke det rekombinante protein. Slike eukaryotiske cellesystemer inkluderer, men er ikke begrenset til gjær og cellelinjer som HeLa, MRC-5 eller Cv-1. Et foretrukket, eukaryotisk cellesystem er SF9 insektceller. En foretrukken metode involverer bruk av pBlueBac-ekspresjonsvektoren der insektecellelinjen SF9 kotransfekteres med rekombinant pBlueBac og AcMNPV baculovirus DNA ved Ca presipiteringsmetoden.
Det uttrykte rekombinante protein kan detekteres ved i og for seg kjente metoder som inkluderer komassiv blue-flekking og Western blot ved bruk av sera inneholdende anti-HEV-antistoffer som vist i Eksempel 2. En annen metode er detektering av viruslignende partikler ved immunoelektronmikroskopi som vist i Eksempel 3.
I nok en utførelsesform kan det rekombinante protein som uttrykkes av SF9-cellen oppnås som rålysat eller den kan renses ved standard proteinrenseprosedyrer som i og for seg kjent og som kan inkludere differensialpresepitering, molekylsiktkromatografi, ion-byttekromatografi, isoelektrisk fokusering, gelelektroforese, affinitet og immunoaffinitetskromatografi og lignende. Når det gjelder immunoaffinitetskromatografi kan det rekombinante protein renses ved føring gjennom en kolonne inneholdende en harpiks som til seg har bundet antistoffer som er spesifike for ORF-proteinet. Et eksempel på en protokoll for rensing av et rekombinant uttrykt HEV ORF-protein gis i Eksempel 10.
De rekombinante proteiner fremstilt ifølge oppfinnelsen benyttes ved immunoanalyser for diagnostisering eller prognosering av hepatitt E i pattedyr. Inkludert, men ikke begrenset til mennesker, sjimpanser, "Old World"-aper, "New World"-aper, andre primater og lignende. I en foretrukken utførelsesform er immunoanalysen brukbar for diagnostisering av hepatitt E-infeksjon hos mennesker. Immunoanalyser som benytter HEV-proteiner og særlig ORF-proteiner, spesielt ORF-2-proteiner, gir en meget spesifik, sensitiv og reproduserbar metode for diagnostisering av HEV-infeksjoner, i motsetning til immunoanalyser som benytter partielle ORF-proteiner. Immunoanalyser kan være radioimmunoanalyse, Western blot-analyse, immunofluoressensanalyse, enzymimmunoanalyse, kjemiluminessensanalyse, immunohistokjemisk analyse og lignende. Standardteknikker som er kjent i teknikken for ELISA er beskrevet i "Methods in Immunodiagnosis", 2nd Edition, Rose and Bigazzi, eds., John Wiley and Sons, 1980 og Campbell et al., "Methods of hnmunology", W.A. Benjamin, Inc., 1964. Slike analyser kan være direkte, indirekte, kompetitive eller ikke-kompetitive immunoanalyser som beskrevet i teknikken, (Oellerich, M. 1984. "J.Clin. Chem. Gin." BioChem. 22:895-904). Biologiske prøver som er hensiktsmessige for slike deteksjonsanalyser inkluderer, men er ikke begrenset til vevbiopsiekstrakter, helblod, plasma, serum, cerebrospinalfluid, pleuralfluid, urin og lignende.
Testsemm kan reageres med en fastfasereagens med overflatebunnet rekombinant HEV-protein som et antigen, fortrinnsvis et ORF-protein eller en kombinasjon av forskjellige ORF-proteiner, f.eks. ORF-2 og ORF-3, ORF-1 og ORF-3, og lignende. Fortrinnsvis er HEV-proteinet et ORF-2-protein som danner viruslignende partikler. Fastoverflatereagensen kan fremstilles ved kjente teknikker for å feste protein til en fast bærer. Disse festemetoder inkluderer ikke spesifik adsorpsjon av proteinet til bæreren eller kovalent festing av proteinet til en reaktiv gruppe på bærer. Etter omsetning av antigen med anti-HEV-antistoffet blir ikke-bundne serumkomponenter fjernet ved vasking og antigen-antistoffkomplekset omsatt med et sekundært antistoff, f.eks. et merket, antihuman-antistoff. Merkingen kan være et enzym som detekteres ved inkubering av den faste bærer i nærvær av en egnet fluorimetrisk eller colorimetrisk reagens. Andre detekterbare merkelapper kan også benyttes, f.eks. radiomerkelapper eller kolloidgull, og lignende.
Fortrinnsvis kan proteinet som uttrykkes av den rekombinante vektor pBlueBac inneholdende hele ORF-2-sekvensen av SAR-55 benyttet som spesifikt bindemiddel for å detektere anti-HEV-antistoffer, fortrinnsvis IgG eller IgM antistoffer. Eksemplene 4 og 5 viser resultatene av en ELISA der fastfasereagensen har rekombinant ORF-2 som overflate-antigen. Dette protein, kodet av hele ORF-2-nukleinsyresekvensen, er overlegen de partielle ORF-2-proteiner og den er reaktiv med flere antisera fra forskjellige primatspesier som er infisert med HEV, enn de partielle antigener av ORF-2. Proteniet ifølge oppfinnelsen er også i stand til å detektere antistoffer som er produsert som respons på forskjellige stammer av HEV, men som ikke detekterer antistoffer som er produsert som respons på hepatitt A, B, C eller hepatitt D.
HEV-protein og analoger kan fremstilles i form av en kit, alene eller i kombinasjon med andre reagenser som sekundære antistoffer, for bruk ved immunoanalyser.
De rekombinante HEV-proteiner og fortrinnsvis et ORF-protein, eller en kombinasjon av ORF-proteiner og aller helst et ORF-2-protein fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan benyttes som vaksine for å beskytte pattedyr mot hepatitt E-smitte. Vaksinen som virker som et immunogen, kan være en celle, et cellelysat fra celler som er transfektert med en rekombinant ekspresjons vekt, eller en kultursupernatant inneholdende de uttrykte proteiner. Alternativt er immunogenet et partielt eller i det vesentlige renset rekombinant protein. Mens det er mulig at immunogenet administreres i ren eller i det vesentlige ren form er det allikevel foretrukket å administrere det som et farmasøytisk preparat, en formulering eller en blanding.
Formuleringer inneholdende immunogene hepatittproteiner ifølge oppfinnelsen, både for veterinær- og humanmedisinsk bruk, omfatter et immunogen som beskrevet ovenfor sammen med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere og eventuelt andre terapeutiske bestanddeler. Den eller de benyttede bærere må være "aksepterbare" dithen at de er kompatible med de andre bestanddeler i formuleringen og ikke skadelige for mottakeren. Formuleringene kan hensiktsmessig presenteres i enhetsdoseform og kan fremstilles på en hvilken som helst kjent måte innenfor farmasien.
Alle metoder inkluderer et trinn der den aktive bestanddel bringes i forbindelse med bæreren som utgjør en eller flere støttebestanddeler. Generelt blir formuleringene fremstilt ved enhetlig og grundig å bringe den aktive bestanddel i kontakt med flytende bærere eller finoppdelte faste bærere eller begge deler og deretter, hvis nødvendig, å omforme produktet til ønsket formulering.
Formuleringer som er egnet for intravenøs, intramuskulær, subkutan eller intraperitonial administrering omfatter hensiktsmessig sterile, vanndige oppløsninger av den aktive bestanddel med oppløsninger som fortrinnsvis er isotoniske med resipientens blod. Slike formuleringer kan hensiktsmessig fremstilles ved å oppløse fast, aktiv bestanddel i vann inneholdende fysiologisk kompatible stoffer som natriumklorid (f.eks. 0,1-2, OM), glycin o.l., og med en buffret pH-verdi som er kompatibel med de fysiologiske tilstander for å gi en vanndig oppløsning, og å gjøre oppløsningen steril. Oppløsningene kan presenteres i enhets- eller multidosebeholdere, f.eks. forseglede ampuller eller lignende.
Formuleringene kan inneholde en stabilisator. Eksempler på stabilisatorer er polyetylenglykol, proteiner, sakkarider, eminosyrer, uorganiske syrer og organiske syrer som kan benyttes enten alene eller som blandinger. Disse stabilisatorer innarbeides fortrinnsvis i en mengde fra 0,11 - 10.000 vektdeler pr vektdel immunogen. Hvis det benyttes to eller flere stabilisatorer ligger deres totale mengde fortrinnsvis innenfor det ovenfor angitte området. Disse stabilisatorer benyttes i vanndige oppløsninger ved den egnede konsentrasjon og pH-verdi. Det spesifike, osmotiske trykk for slike vanndige oppløsninger ligger generelt i området 0,1-3,0 osmoler, fortrinnsvis i området 0,8-1,2. PH verdien for den vanndige oppløsningen justeres til området 5,0-9,0 og fortrinnsvis til området 6-8. Ved formulering av immunogenet ifølge oppfinnelsen kan det benyttes antiadsorpsj onsmidler.
Ytterligere farmasøytiske metoder kan benyttes for å kontrollere virkningsvarigheten. Preparater med kontrollert frigivning kan oppnås ved bruk av en polymer for å kompleksdanne eller absorbere proteinene eller deres derivater. Den kontrollerte avlevering kan oppnås ved selektering av egnede makromolekyler (f.eks. polyester, polyaminosyre, polyvinul, pyrrolidon, etylenvinylacetat, metylcellulose, carboksymetylcellulose eller protaminsulfat) og konsentrasjonen av makromolekylene, såvel som metoden for innarbeiding for å kontrollere frigivningen. En annen mulig metode for å kontrollere virkningsvarigheten ved preparater med kontrollert frigivning er å innarbeide proteinene, proteinanalogene eller deres funksjonelle derivater, i partikler av et polymermateriale som polyester, polyaminosyre, hydrogel, poly(melkesyre) eller etylenvinylacetatkopolymerr. Alternativt og i stedet for å innarbeide disse midlene i polymerpartikler er det mulig å fange materialene i mikrokapsler som f.eks. fremstilles ved koaserveringsteknikker eller ved interflatepolymerisering, f.eks. hydroksymetylcellulose eller gelatinmikrokapsler respektivt polymetylmetakrylat-mikrokapsler, eller i kolliodmedikamentavleveringssystemer, f.eks. liposomer, albuminmikrosfærer, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler eller i makroemulsjoner.
Når det er ønskelig med orale preparater kan blandingene kombineres med typiske bærere som laktose, sukrose, stivelse, talkum, magnesiumstearat, krystallinsk cellulose, metylcellulose, karboksymetylcellulose, glyserol, natriumalginat eller gummiarabikum, for å nevne noen.
Proteinene ifølge oppfinnelsen kan leveres i form av en kit, alene eller i form av en farmasøytisk blanding som beskrevet ovenfor.
Vaksinasjon kan gjennomføres ved konvensjonelle metoder. F.eks. kan immunogenet benyttes i et egnet fortynningsmiddel som saltoppløsning eller vann, eller fullstendige eller ufullstendige adjuvanter. Videre kan immunogenet eventuelt bindes til en bærer for å gjøre proteiner immunogent. Eksempler på slike bærermolekyler er uten begrensning bovinserumalbumin (BSA), keyhole limpet hemocyanin (KLH), tetanustoksoid og lignende. Immunogenet kan administreres på en hvilken som helst hensiktsmessig måte for antistoffproduksjon, f.eks. intravenøst, intraperiotonialt, intramuskulært, subkutant og lignende. Immunogenet kan administreres en gang eller i periodiske intervaller inntil det er produsert en signifikant titer av anti-HEV-antistoff. Antistoffet kan detekteres i serum ved bruk av en immunoanalyse.
I immunogenet kan være en nukleinsyresekvens som er i stand til å styre vertsorganismesyntesen av et HEV ORF-protein. En slik nukleinsyresekvens kan skytes inn i en egnet ekspresjonsvektor på i og for seg kjent måte. Ekspresjonsvektorer som er egnet for å oppnå høy effektiv genoverføring "in vivo" omfatter, men er ikke begrenset til retroviral, adenoviral eller vaksineviralvektorer. Operasjonelle elementer for slike ekspresjonsvektorer er beskrevet tidligere og er kjent for fagmannen. Slike ekspresjonsvektorer kan administrers intravenøst, intramuskulært, subkutant, intraperitonialt eller oralt.
I en alternativ utførelsesform kan direkte genoverføring gjennomføres via intramuskulær injeksjon av f.eks. plasmidbaserte, eukariotiske ekspresjonsvektorer inneholdende en nucleidsyresekvens som er i stand til å styre vertsorganismens syntese av HEC ORF-protein. En slik vei er tidligere benyttet for å produsere hepatitt B overflateantigen "in vito" og resulterte i en antistoffrespons på overflateantigenet (Davis, H.L. et al. (1993) "Human Molecular Genetics" 2:1847-1851; se også Davis et al (1993 "Human Gene Therapy", 4:151-159 og 733-740).
Når immunogenet er et partielt eller i det vesentlige rensete, rekombinante HEV ORF-protein, ligger doser som bevirker utløsning av en beskyttende antistoffrespons mot HEV fra rundt 2 |ig til rundt 100 \ ig. Et mer foretrukket område er fra rundt 5 jig til rundt 70 (ig og det mest foretrukne området er fra rundt 10 jj.g til rundt 60 jig.
Doser av HEV ORF-protein som koder nukleinsyresekvenser som effektivt utløser en beskyttende antistoffrespons mot HEV ligger i området rundt 1 til rundt 5000 |ag og et mer foretrukket område ligger fra 300 til rundt 1000 u.g.
Ekspresjonsvektorene inneholdende en nukleinsyresekvens som er i stand til å styre vertsorganismesyntesen av ett eller flere HEV ORF-proteiner kan bringes tilveie i form av et sett, alene eller i form av en farmasøytisk blanding som beskrevet ovenfor.
Administrering av immunogenet ifølge oppfinnelsen kan være enten for profylaktisk eller for terapeutisk formål. For profylaktisk formål blir immunogenet tilveiebragt før enhver eksponering til HEV eller før ethvert symptom som skyldes HEV-infeksjon. Den profylaktiske administrering av immunogenet tjener til å forhindre eller redusere enhver etterfølgende infeksjon av HEV hos et pattedyr. Tilveiebragt terpeutisk tilveiebringes immunogenet ved (eller kort etter) begynnelsen av infeksjonen eller ved begynnelsen av ethvert symptom på infeksjon eller sykdom, forårsaket av HEV. Den terapeutiske administrering av immunogenet tjener til å svekke infeksjonen eller sykdommen.
En vaksine, fremstilt ved bruk av rekombinant ORF-2-protein, uttrykt av ORF-2-sekvensen av HEV-stammen SAR-55 og ekvivalenter derav er foretrukket. Fordi det rekombinante ORF-2-protein allerede har vært vist å være reaktivt med et antall HEV-positive sera, er deres brukbarhet ved beskyttelse mot et antall HEV-stammer, indikert.
I tillegg til anvendelse som en vaksine kan blandingene benyttes for å fremstille antistoffer mot HEV-viruslignende partikler. Antistoffene kan benyttes direkte som antivirale midler. For å fremstille antistoffer blir et vertsdyr immunisert ved bruk av viruspartiklene eller, etter ønske ikke-partikkelantigener som er native mot viruspartikkelen bindes til en bærer som beskrevet ovenfor for vaksiner. Vertsserum eller plasma samles etter et egnet tidsintervall for å gi en blanding omfattende antistoffer som er reaktive med viruspartikkelen. Gammaglobulinfr aksjonen eller IgG antistoffene kan oppnås f.eks. ved bruk av mettet ammoniumsulfat eller DEAE-sephadex, eller andre teknikker som er kjent for fagfolk. Antitoffene er i det vesentlige frie for mange av de ugunstige bivirkninger som kan forbindes med andre antivirale midler som medikamenter.
Antistoffblandingen kan gjøres ennå mer kompatible med vertssystemet ved å minimalisere potensielle ugunstige immunsystemresponser. Dette oppnås ved å fjerne alle eller en andel av Fc-delen av et fremmed spesieantistoff eller ved bruk av et antistoff fra samme spesie som vertsdyret, f.eks. bruk av antistoffer fra human/humanhypridomer. Humaniserte antistoffer (dvs ikke-immunogene hos mennesker) kan fremstilles f.eks. ved å erstatte en immunogen del av et antistoff med en tilsvarende, men ikke-immunogen del. Slike kimær antistoffer kan inneholde den reaktive eller antigenbindedelen av et antistoff fra en art og Fc-delen av antistoffet (ikke-immunogent) fra en annen art. Eksempler på kimer antistoffer omfatter, men er ikke begrenset til ikke-human-mammal-human kimeras, gnager-human kimære, murin-human- og rotte-human kimære (Robinson et al., International Patent Application 184, 187; Taniguchi M; European Patent Application 171,496; Morrison et al., European Patent Application 173,494; Neuberger et al., PCT Application WO 86/01533; Cabilly et al., 1987 Proe. Nati. Acad. Sei. USA 84:3439; Nishimura et al., 1987 Canc. Res.
47:999; Wood et al., 1985 Nature 314:446; Shaw et al., 1988 J. Nati. Cancer Inst. 80:15553).
Generelle overblikk over "humaniserte" kimære antistoffer gis av S. Morrison i 1985 Science 229:1202 og av Oi et al., 1986 BioTechniques 4:214.
Egnede "humaniserte" antistoffer kan alternativt fremstilles ved CDR eller CEA substitusjon (Jones et al., 1986 Nature 321:552; Verhoeyan et al., 1988 Science 239:1534; Biedler et al., 1988 J. Immunol. 141:4053).
Antistoffene eller antigenbmdingsfragmentene kan også fremstilles ved genteknikkmetoder. Teknologien for ekspresjon av både tunge og lette "cain"gener i "E.Coli" er gjenstand for PCT-søknader som publisert under numrene WO 901443, WO 901443 og WO 9014424 samt beskrevet av Huse et al. 1 1989 Science 246:1275-1281.
Antistoffene kan også benyttes som et middel for å forbedre immunresponsen. Antistoffene kan administreres i mengder tilsvarende de som benyttes for andre terapeutiske administreringer av antistoff. F.eks. kan sammenslåtte gammaglobulin administreres i en mengde av 0,02-0,01 ml pr pund kroppsvekt under en tidlig inkuberingsperiode av andre virale sykdommer som rabies, meslinger og hepatitt B for å interferere med viral inngang i cellene. Således kan antistoffer som er reaktive med HEV-viruspartikkelen passivt administreres alene eller i forbindelse med andre antivirale midler til en vert som er infisert med en HEV for å forbedre effektiviteten av et antiviralt medikament.
Alternativt kan anti-HEV-antistoffer induseres ved administrering av anti-idiotyp-antistoffer som immunogen. Hensiktsmessig blir et renset anti-HEV-antistoffpreparat fremstilt som beskrevet ovenfor, benyttet for å indusere anti-idiotyp-antistoff i et vertsdyr. Blandingen administreres til vertsdyret i et egnet drøyemiddel. Etter administreringen, vanligvis repetert administrering, produserer verten anti-idiotyp-antistoff. For å eliminere en immunogen respons til Fc-området kan man benytte antistoffer som er fremstilt av de samme spesier som vertsdyret eller man kan fjerne Fc-området av de administrerte antistoffer. Etter induksjon av anti-idiotyp-antistoff i vertsdyret blir serum eller plasma fjernet for å gi en antistoffblanding. Blandingen kan renses som beskrevet ovenfor for anti-HEV-antistoffer, eller ved affinitetskromatografi ved bruk av anti-HEV-antistoffer som er bundet til affinitetsmatriksen. Anti-idiotyp-antistoffene som fremstilles tilsvarer i konformasjon det autentiske HEV-antigen og kan benyttes for å fremstille en HEV-vaksine i stedet for å benytte et HEV-partikkel antigen.
Benyttet som et middel for å indusere anti-HEV-virus-antistoffer hos et dyr er injeksjonsmåten for antistoffet den samme som for vaksinasjonsformål, nemlig intramuskulært, intraperitonialt, subkutant eller lignende i en effektiv konsentrasjon i et fysiologisk egnet fortynningsmiddel, med eller uten adjuvans. Det kan være ønskelig med en eller flere boosterinjeksjoner. De HEV-avledede proteiner ifølge oppfinnelsen er også ment for bruk ved fremstilling av antiserum med en for pre- eller posteksponeringsprofylakse. Her blir et HEV-protein eller en blanding av proteiner formulert med et egnet hjelpemiddel og administrert ved injeksjon til frivillige mennesker i henhold til kjente metoder for fremstilling av human antisera. Antistoffresponsen på de injeserte proteiner overvåkes gjennom en flere uker lang periode etter immunisering, ved periodisk serumprøvetaking for å detektere nærværet av anti-HEV-serum-antistoffer, ved bruk av en immunoanalyse som her beskrevet.
Antiserum fra immuniserte individer kan administreres som et pre-eksponeringsprofylaktisk middel til individer som løper risiko for infeksjon. Antiserumet er også brukbart ved behandling av en individuell posteksponering analogt bruken av høytiter-antiserum mot hepatitt B-virus for posteksponeringsprofylakse. Selvfølgelig vil fagmannen lett forstå at immunglobulin (HEV-immunglobulin) som er renset fra antiserumet av immuniserte individer, ved bruk av standardteknikk kan benyttes som et pre-eksponeringsprofylaktisk middel eller ved behandling av individer etter eksponering.
For både "in vivo" bruk av antistoffene mot HEV-viruslignende partikler og proteiner og andre indiotyp-antistoffer og diagnostisk bruk, kan det være foretrukket å benytte monoklonale antistoffer. Monoklonale antiviruspartikkel-antistoffer eller antiidiotyp-antistoffer kan fremstilles som følger. Milt eller lymfocyter fra et immunisert dyr fjernes og immortaliseres eller benyttes for å fremstille hybridomer ved i og for seg kjente teknikker, se J.W. Goding 1983. Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Pladermic Press, Inc., NY, NY, pp. 56-97. For å produsere et human-humanhybridom velges en humanlymfocytdonor. En donor som er kjent for å være infisert med HEV (der infeksjonen er vist f.eks. ved nærvær av antivirus-ahtistoffer i blodet eller ved viruskultur) kan tjene som en egnet lymfocytdonor. Lymfocytter kan isoleres fra en perifer blodprøve eller miltceller kan benyttes hvis donoren er offer for splenektomi. Epstem-Barr-virus (EBV) kan benyttes for å immortalisere humanlymfocytter eller en humanfusjonspartner kan benyttes for å fremstille human-human-hybridomer. Primær "in vitro"-immunisering med peptider kan også benyttes ved dannelse av humane monoklonale antistoffer.
Antistoffer som er skilt ut av de immortaliserte celler screenes for å bestemme klonene som skiller ut antistoffer av ønsket spesifisitet. For monoklonale antiviruspartikkel-antistoffer må antistoffene binde til HEV-viruspartiklene. For monoklonale anti-idiotyp-antistoffer må antistoffene binde til antiviruspartikkel-antistoffer. Celler som produserer antistoffer av ønsket spesifisitet selekteres.
De ovenfor beskrevne antistoffer og antigenbindingsfragmenter derav kan leveres i kitform alene eller som en farmasøytisk blanding for "in vivo"-bruk. Antistoffene kan benyttes for terapeutiske anvendelser, diagnostisk anvendelse ved immunoanalyser eller som immunoaffinitetsmiddel for å rense ORF-proteiner som her beskrevet.
De materialer som ble benyttet i eksemplene var som følger:
Primater. Sjimpanser (Pan troglodytes). "Old world"-aper: cynomolgus-aper (Macaca fascicularis), resus-aper (M.mulatta), svinehale-aper ("M. nemestrina"), afrikanske grønn-aper (Cercopithecus aethiops). "New World"-aper: barttamariner (Saguinus mystax), ekorn-aper ("Saimiri sciureus") og ugle-aper (Aotus trivigatus). Primatene ble oppstallet enkeltvis under biorisikofire betingelser. Oppstalling, hold og stell av dyrene tilfredsstilte eller overskred alle krav for primathushold. De fleste dyr ble inokulert intravenøst med HEV stamme SAR-55 innholdt i 0,5 ml avføringssuspensjon fortynnet i fetalkalvserum som beskrevet av S.A. Tsaarev et al. 11992, "Proe. Nati. Acad. Sei USA", 89-559-563; og S. A. Tsarev, et al. 1 1993, "J. Infect. Dis." 167:1302-1306. Chimp-1313 og 1310 ble inokulert med et forråd av avføring samlet fra 7 pakistanske hepatitt E-pasienter.
Serumprøver ble samlet ca to ganger i uken før og etter inokulering. Nivåene for leverenzymserum-alanin-aminotranssferase (ALT) isositratdehydrogenase (ICD) og y-glutamyltransferase (GGT) ble analysert med kommersielt tilgjengelige prøver (Medpath Inc.- Rockville, MD). Serologiske prøver ble gjennomført som beskrevet ovenfor.
Eksempel 1.
Identifisering av DNA-sekvensen til genomet av HEV-stamme SAR-55.
Fremstilling av virus RNA-templat for PCR.
Galle fra en HEV-infisert cynomolgus-ape ( 10 ul), 20% vekt/volum SDS (til en sluttkonsentrasjon på 1%), proteinase K (10 mg(ml; til en sluttkkonsentrasjon på 1
mg/ml), 1 ul tRNA (10 mg/ml), og 3 uln av 0,5 M EDTA ble blandet i et sluttvolum på 250 ul og inkubert i 30 minutter ved 55°C. Totalnukleinsyre ble ekstrahert fra gallen to ganger med fenol:kloroform i volumforholdet 1:1 ved 65°C og en gang med kloroform, deretter presipitert med etanol, vasket med 95% etanol og benyttet for RT-PCR. RT-PCR forstrekning av HEV RNA fra fekes og særlig fra sera var mer effektiv når RNA ble renset i større grad. 100 ul serum eller 200 ul av 10% fekalsuspensjon ble behandlet som ovenfor med proteinase K. Etter en 30-minutters inkubering ble 300ul KAOS-buffer (4,2 M guanidin thiocyanat/0,5 N-lauroylsarokosin/0,025 M Tris-HCL, pH 8,0) tilsatt. Nukleinsyre ble ekstrahert to ganger med fenol:kloroform ved 65°C fulgt av kloroformekstrahering ved romtemperatur. Deretter ble 225 ul 7,5 ammoniumacetat satt til den øvre fase og nukleinsyren ble presipitert med 0,68 ml 2-propanol. Pelleten ble oppløst i 300 ul KAOS-buffer og 100 ul H2O ble tilsatt. Kloroformekstraheringen og 2-propanolpresipiteringen ble gjentatt. Nukleinsyrer ble oppløst i vann, presipitert med etanol, vasket med 95% etanol og benyttet for RT-PCR.
Primer. Nittifire primer, 21-40 nucleotider (nt) lange, og komplementære til pluss - eller minusstrådene av genomet av en stamme av HEV fra Burma (BUR-121) (Tam, A.W. et al. (1991), "Virology", 185:120-131 eller SAR-55-genomet, ble syntetisert ved bruk av en Applied Biosystems DNA-syntetisizer modell 391.
Sekvensene for disse 94 primer er vist nedenfor fra og med SEQ ID No. 5 til SEQ ID No. 98.
HEV primerliste
Forkortelsene til venstre for sekvensene representerer de følgende: R og D henviser til revers- og fremover-primer; B og S referer til sekvenser avledet fra Burma-121-stammen av hepatitt E og SAR-55-stammen av hepatitt E; 5'NC og 3'NC henviser til 5-merket og 3-merket ikke-kodende områder av HEV-genomet; og 1, 2 og 3 henviser til sekvens avledet fra åpen leserammerl, 2 henholdsvis 3. Symbolet () til høyre for noen sekvenser viser innskyting av et kunstig restriksjonssete i disse sekvenser.
For kloning av PCR-fragmenter ble EcoRI-, BamHI- eller BglU-restriksjonsseter som fulgte 3 - 7 nt, satt til 5' enden av primern.
RT-PCR. Den vanlige 100-ul RT-PCR-blanding inneholdt templat, 10 mM TrisHCL (ph8,4), 50 mM Kcl, 2,5 mM MgCl2, alle fire dNTP'r (hver ved 0,2 mM), 50 pmol direkte primer, 50 pmol reversprimer, 40 enheter Rnasin (Promega), 16 enheter avianmyeloblastose-virus-reverstranskriptrase (Promega), 4 enheter amplitak (Cetus) under IOOjj.1 lettmineralolje. Blandingen ble inkubert i 1 time ved 42^C og så forsterket ved 35 PCR-syklus; 1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 45°C og minutt ved 72°C. PCR-produktene ble analysert på 1% agarosegel.
Kloning av PCR-fragmenter.
PCR-fragmentene inneholder restriksjonssetene ved endene ble fermentert med EcoRI og BamHi- eller EcoRI og BglU-restriksjonsensymer og klonet i EcoRI/BamHI-feermentert pBR322 eller PGEM-3z (Promega). Alternativt ble PCR-fragmentene klonet inn i pCR-1000 (Invitrogen) ved bruk av en TA-kloningskit (Invitrogen).
Sekvensering av PCR-fragmenter og plasmider.
PCR-fragmenter ble skåret ut fra en 1% agarosegel og renset ved genclean (Bio 101, La Jolla, CA). Dobbeltrådede PCR-fragmenter ble sekvensert ved bruk av sekvenase (United States Biochemical) som beskrevet av P.R. Winship i 1984 "Nucleic Acids Rev." 17:1266. Dobbelttrådede plasmider som var renset gjennom CsC-gradienter ble sekvensert med en sekvensasekit (United States Biochemical).
Maskinalyse av sekvenser.
Nucleotidsekvensene av HEV-stammer ble sammenlignet ved bruk av Genetics Computer Group (Madison, WI) software-pakke (Deveereaux, J. Et al. (1984) se: "Nucleic Acids Rev.", 12:387-395, versjon 7,5, og en VAX 8650 computer (ved National Cancer Institute, Frederick, MD).
Eksempel 2.
Konstruksjon av en rekombinant ekspresjonsvektor P63-2.
Et plasmid inneholdende det fullstendige ORF-2 av genomet av HEV-stamme SAR-55, se S.A. Tsarev, et al. (1992), "Proe. Nati. Acad. Sei. USA" 89:559-563), ble benyttet for å oppnå et restriksjonsfagment Nrul-Bglll. Nrul cuttet HEV cDNA fem nucleotider oppstrøms ATG-initieringskodonet av ORF-2. Et kunstig Bgl JI-sete som på forhånd var plassert ved 3'-enden av HEV-genomet akkurat før poly-A-sekvensen (Tsarev, S.A. et al. (1992). "Proe. Nati. Acad. Sei. USA", 89-559-563). For å skyte inn dette fragment i pBlueBac-transfer-vektoren (Invitrogen) ble en syntetisk polylinker innført i det unike Nhel-sete av vektoren. Denne polylinker inneholdt Bin I- og Bgl U-seter som var fraværende både i HEV cDNA- og PBlueBac-sekvensene. Nrul-Bglll ORF-2-fragmentet ble skutt inn i Bin I-Bgl II ved bruk av en adapter som vist i figur 1.
Eksempel 3.
Ekspresjon av P63-2 i SF9 insektceller.
P63-2 og AcMNPV baculovirus DNA (Invitrogen) ble kotransfektert inn i SF9-celler (Invitrogen) ved Ca-presipiteringsmetoden i henhold til Invitrogen-protokollen.
Ved å følge denne protokoll kan AcMNPV-baculovirus DNA produsere en levende, intakt baculovirus som kan pakke P63-2 for å danne en rekombinant baculovirus. Denne rekombinante baculovirus ble plakkrenset 4 ganger. Den resulterende, rekombinante baculovirus 63-2-IV-2 ble benyttet for å infisere SF9-celler.
SDS-PAGE og Western blot.
Insektsceller ble resuspendert i oppfyllingsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 6,8,100 mM DTT, 2% SDS, 0,1% bromfenyl-blått og 10% glycerol) og SDS-polyakrylamidgel-elektroforese ble gjennomført som beskrevet, Se Laemmli, U.K. (1970), "Nature", 227-680. Gelene ble flekket med koomassivt-blått eller proteiner ble elektroblottet på BA-85 nitrocellulosefiltre (Schleicher & Schuell). Etter overføring ble nitrocellulosemembranene blokkert i PBS inneholdende 10% fetalkalveserum og 0,5% gelatin. Som primært antistoff benyttet man hyperimmunserum fra sjimpanse-1313, fortynnet i 1:1000. Det ble benyttet et sekundært antistoff, fosfatasemerket, affinitetsrenset gjeteantistoffer til human IgG (Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.), fortynnet i 1:2000. Filteret ble fremkalt i Western blue stabilisert substrat for alkalifosfatase (Promega). Alle inkuberinger ble gjennomført i blokkerende oppløsning og vaskingene skjedde med PBS med 0,05% Tween-20 (Sigman).
Ekspresjon av HEV ORF-2.
Hovedproteinet som ble syntetisert i SF9-celler infisert med rekombinant baculovirus 63-2-F/-2, var et protein i en tilsynelatende molekylvekt på 74 KD (Figur 2A, spor 3).
Denne størrelse er noe større enn den som ble forutsagt for hele ORF-2 (71 KD).
Størrelsesforskjellene kan skyldes glykosilering av proteinet fordi det minst er ett potensielt sete for glykosylering (Asn-Leu-Ser) i N-terminaldelen. Dette protein ble ikke detektert i ikke-infiserte celler (Figur 2A, spor 1) eller i celler som var infisert med villtype ikke-rekombinante baculovirus (Figur 2A, spor 2). I det sistnevnte tilfellet var det vesentlige detekterte protein et polyhedronprotein. Når de samme lysater ble analysert ved Western blot (Figure 2B) med serum av Chimp-1313 /hyperimmunisert med HEV), reagerte kun proteiner i det rekombinante cellelysat (spor 3) og hovedbåndet ble igjen representert ved et 74 KD-protein (Figur 2B). Mindre bånd på ca. 25,29, 35, 40-45 samt 55.70 kDa som var tilstede i den koomassi-fargede del (Figur 2A, spor 3) reagerte også med serum i Western blot (Figur 2B, spor 3). Noen av båndene med molekylvekter over 74 KD var et resultat av forskjellige grader av glykosilering, mens lavere molekylvektsbåndene kunne reflektere bearbeiding og/eller nedbrytning. Serum som var trukket fra Chimp-1313 før inokulering med HEV reagerte ikke med noen av proteinene i Western blot.
Eksempel 4.
Immunoelektronmikroskopi av rekombinante infiserte SF9-celler.
5x10^ rekombinante, infiserte SF9-celler ble sonikert i 1,30 g/ml CsCl inneholdende 10 mM tris-HCl, pH7,4, 0,3% sarkosyl og sentrifugert i 48 timer ved 40.000 rmp (SW60Ti). 50 av fraksjonen som hadde den høyste ELISA-respons og en tilsynelatende dinsitet på 1,30 g/ml ble fortynnet i 1 ml PBS og 5 ul Chimp-1313 hyperimmunserum ble tilsatt. Dette hyperimmunserum ble fremstilt ved nyutfordring av av en tidligere infisert sjimpanse med en andre stamme av hepatitt E (meksikansk HEV). Prøvene ble inkubert i el time ved romtemperatur og så over natten ved 4°C. Immunkomplekset ble presipitert ved bruk av en SW60Ti-rotor ved 30.000 omdreininger pr min, 4°C og i 2 timer. Pelletene ble resuspendert i destillert vann, flekket negativt med 3% PTA, anbragt på karbongittere og undersøkt ved en forstørrelse på 40.000 i et elektronmikroskop EM-10 fra Carl Zeiss, Oberkochen, Tyskland.
Detektering av VLP'r.
Cellelysater fra insektceller som var infisert med villtype- eller rekombinant baculovirus 63-2-IV-2 ble fraksjonert ved CsCl densitetsentrifugering. Når fraksjonene av CsCl gradienten fra rekombinantinfisert insektsceller ble inkubert med Chimp-1313 hyperimmunserum ble det observert to typer viruslignende partikler (VLP) som var dekket med antistoff, i fraksjonene med en oppdriftsdensitet på 1,30 g/ml: først (Figur 3A-3A'"), antistoff dekket med individuelle partikler som hadde en størrelse (30 nm) og morfologisk struktur som antydet HEV, for det andre (Figur 3B) antistoffbelagte aggregater av partikler mindre enn HEV (ca 20 nm) men som ellers lignet HEV. Direkte EM viste nærværet av en meget heterogenpopulasjon av gjenstander som inkluderte noen med diameter på 30 respektivt 30 nm, som så ut som viruspartikler, men som i fravær av bundet antistoff, ikke kunne bekreftes som HEV. Et antall IEM-forsøk antydet at i det minste noen av proteinene som var syntetisert fra ORF-2-området av HEV-genomet, hadde samlet seg til en partikkellignende struktur. Det ble observert at insektceller på et senere tidsrom av infeksjonen, når andelen av mindre proteiner var høyere, konsistent ga bedre resultater ved ELISA. Derfor ble ikke-fraksjonerte lysater av rekombinante insektceller fra et senere trinn av infeksjonen benyttet som antigen i ELISA i etterfølgende tester.
Eksempel 5.
Detektering av ELISA basert på antigen fra insektceller som uttrykker fullstendig ORF-2 av anti-HEV etter infeksjon ved forskjellige stammer av HEV.
5x10<6> SF9-celler som var infisert med 63-2-IV-2-virus ble resuspendert i 1 ml 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,15M NaCl og som frosset og tint 3 ganger. 10 ul av denne suspensjon ble oppløst i 10 ml karbonatbuffer (pH 9,6) og benyttet for å dekke en fleksibel mikrotiteranalyseplate.(Falcon). Serumprøver ble fortynnet 1:20,1:400 og 1:8000, eller 1:100,1:1000 og 1:10000. De samme blokkerings- og vaskeoppløsninger som beskrevet for Western blot ble benyttet i ELISA. Som et andre antistoff benyttet man peroksydasekonjugert geite-IgG-fraksjon til huma-IgG eller pepperrotperoksydasemerket gete-anti-gammel- eller anti-ny verden-ape immunoglobulin. Resultatene ble bestemt ved måling av den optiske densitet, O.D., ved 405 nm.
For å bestemme hvorvidt insektcelleavledet antigen som representerte en pakistanistamme av HEV kunne detektere anti-HEV-antistoff i cynomolgus-aper som var infisert med den meksikanske stamme av HEV undersøkte man tre aper (Figur 4). To aper cyno-80A82 og cyno-9A97, ble infisert med fekes inneholdende Meksiko'86-HEV-stammen (Ticehurst, J. Et al. (1992) "J. Infect. Dis., 165:835-845) og den tredje ape, cyno-83, ble infisert med en andre passasje av den samme stamme. Som en kontroll ble serumprøver fra cyno-374, infisert med pakistani-HEV-stamme SAR-55, prøvet i det samme forsøk. Alle tre aper som var infisert med den meksikanske stamme serokonverterte til anti-HEV. Dyr fra den første passasje serokonverterte i uke 15 og fra den andre passasje uke 5. Av interesse ble den høyeste anti-HEV-titer blant de fire dyr funnet i cyno-83, inokulert med den andre passasje av den meksikanske stamme. Cynoer som var inokulerte med den første passasje av den meksikanske stamme utviklet de laveste titere, mens de som var inokulert med den første passasje av pakistani-stammen utviklet mellomliggende titere.
Eksempel 6.
Spesifisiteten av anti-HEV-ELISA basert på antigen fra insektceller som uttrykker fullstendig ORF-2
For å bedømme hvorvidet ELISA som beskrevet her spesifikt detekterer anti-HEV til utelukkelse av enhver annen type av hepatittrelatert antistoff, analyserte man prøver fra sjimpanser, i sett på fire, infisert med andre kjente hepatittviruser (Garci, P. et al.
(1992), "J. Infect. Dis.", 165:1006-1011; Farci, P. et al. (1992), "Science" (in press); Ponzetto, A. et al. (1987) "J. Infect. Dis", 155:72-77, Rizzetto; m. et al. (1981) Hepatologi 1:567-574; referanse for sjimpansene - 1413,1373, 1442,1551 (HAV); og for sjimpansene 982,1442,1420,1410 (HBV); er upubliserte data fra Purcell et al)
(Tabell 1). Prøver av pre-inokulering og 5 uker- og 15 uker postinokuleringssera ble analysert i HEV ELISA ved serumfortynninger på 1:100,1:1000 og 1:10000. Ingen av de anvendte sera fra dyrene infisert med HAV, HBV, HCV og HD V, reagerte i ELISA-prøven fra HEV-antistoff, men alle fire sjimpanser som var inokulert med HEV utviklet IgM- og IgG-klassene av anti-HEV.
Chimp 1374 var positiv for IgM anti-HEV, tre og fire uker etter inokullering (se
Figur 5).
Chimp 1313 ble inokulert to ganger med HEV. Den første inokulering med sammenslåtte prøver av 7 pakistani-pasienter. Den andre inokulering 45 måneder senere med en meksikansk stamme av HEV.
Eksempel 7.
Bestemmelse av vertsområde til SAR-55-stammen av HEV i ikke-humane primater.
Forskjellige primate arter ble inokulert intravenøst med standard avføringssuspensjoner av HEV og serieserumprøver ble samlet for å overvåke infeksjon. Serum ALT-nivåene ble bestemt som en indikator på hepatitt, mens serokonversjonen ble definert som en stigning i anti-HEV. Resultatene ble sammenlignet med de som ble oppnådd hos cynomolgus-aper og sjimpanser.
Begge rhesus-aper som var inokulert med HEV (Tabell 2) viste meget prominente topper av alanin-aminotransferase-aktivitet såvel som sterk anti-HEV respons. Toppen av alanin-aminotransferase-aktiviteten ble observert dag 35 for begge dyr og serokonversjonen inntrådte dag 21. Den maksimale titer for anti-HEV ble nådd dag 29. Begge afrikanske grønn-aper som ble benyttet i denne studie (Tabell 2) utviklet øket alanin-aminotransferase-aktivitet og anti-HEV. Selv om den afrikanske grønn-ape 230 døde 7 uker etter inokulering ble bevis på infeksjon oppnådd før dette tidsrom. Topp alanin-aminotransferase-aktiviteten for ape 74 overskred middelverdien for pre-inokuleringssera med en faktor på ca. 3 og for ape 230 med en faktor ca. 5. Toppene for alanin-aminotransferase-aktiviteten og serokonversjonen opptrådte samtidig på dagens 28 og 21 i apene 74 respektivt 230. Svinehale-makak 99 viste en økning i alanin-aminotransferase-aktiviteten på > 3 SA over den midlere verdi for pre-inokuleringssera, mens svinehale-makak 98 ikke gjorde det. Imidlertid serokonverterte begge aper på dag 21 og anti-HEV-titrene var ekvivalente med de til sjimpanser og Old World-aper. På grunn av de lave topp alanino-aminotransferase-verdiene hos svinehale-makakene kan muligheten for immunisering i stedet for infeksjon med HEV ikke fullstendig utelukkes. Imidlertid er immunisering usannsynlig av flere grunner. For det første ble immunisering i noen av de to tamariner som kun var en fjerdel så store som svinehale-makakene, men som fikk den samme mengde inokulum, ikke observert. For det andre er det velkjent at mengden HEV som ble skilt ut i fekes vanligvis er meget liten og 0,5 ml av 10% suspensjonen av fekes som ble benyttet i denne studie inneholder sannsynligvis ikke noen mengde antigen som er tilstrekkelig til å immunisere et dyr, særlig ikke ved intravenøs inokulering.
Ingen tamarin som ble inokulert i denne studie hadde noen signifikant økning i alanin-aminotransferase-aktiviteten eller noen utvikling av anti-HEV (Tabell 2). Derfor syntes disse dyrene ikke å være infisert. Ekorn-apen utviklet anti-HEV, men ved et signifikant lavere nivå enn sjimpansene eller Old World-apene (Tabell 2). I tillegg inntrådte serokonversjonen senere i andre dyr. Ekorn-ape 868 serkonverterte på dag 41 og 869 på dag 35. Anti-HEV-titeren var ikke > 1:20 på noe tidsrom under de mer enn tre måneders overvåkning og var klart fallende hos begge dyr etter å ha nådd en toppverdi på dagene 47-54. Imidlertid var økningene i alanin-aminotransferase-aktiviteten heller prominent hos begge dyr og var tidsmessig relatert tidspunktet for serokonversjonen.
Ugle-apene responderte på HEV-infeksjonen omtrent like godt som Old World-ape-spesiene (Tabell 2). Begge ugle-aper serkonverterte på dag 21 og på dag 28 hadde anti-HEV-titeren nådd en verdi på 1:8000. Alanin-aminotransferase-aktivitetene Nådde en topp på dag 35 hos ugle-ape 924, men ikke før dag 49 hos 925.
Eksempel 8.
Detektering av IgM- og IgG-anti-HEV hos sjimpanser.
I begge sjimpanser øket serum ALT-nivåene ca 4 uker etter inokulering (Tabell 2, Figur 5). Begge sjimpaser serkonverterte på tidspunktet for ALT enzymelevasjonene eller tidligere (Figur 5A, 5C). Nivåene for IgM anti-HEV ble også bestemt for sjimpansene. I chimp-1374 var titeren for IgM anti-HEV (Figur 5 A) ikke så høy som IgG-titeren (figur 5 A) og ble svekket over to uker. Selv om både IgG- og IgM-antistoffene først ble detektert for dette dyr på dag 20 var titeren for IgM anti-HEV den høyeste, mens titeren for IgG var den laveste på denne dag, men steg så og forble omtrent på samme nivå i mer enn tre måneder. Hos chimp-1375 ble kun IgM anti-HEV detektert på dag 20 (Figur 5D). Titeren var høyere enn chimp-1374 og IgM anti-HEV ble detektert under hele perioden av overvåking. IgG anti-HEV ble først observert i dette dyr på dag 27 (Figur 5C) og forble på omtrent det samme nivå under hele forsøket.
Eksempel 9.
Sammenligning av ELISA basert på fullstendig ORF-2-protein, uttrykt i insektceller, med det som var basert på fragmenter av strukturelle proteiner uttrykt i E. Coli.
For å bedømme hvorvidt ekspresjonen av det fullstendige ORF-2-området av HEV-genomet i eukariotiske celler hadde noen fordel i forhold til ekspresjonen av fragmenter av strukturelle proteiner i E. Coli, benyttet man det tidligere antigen i ELISA for på ny å teste cynomolgus-ape-sera som var analysert tidligere (Tsarev, S.A. et al. (1992). "Proe. Nati. Acad. Sei USA", 89:559-563; og Tsarev, S.A. et al. (1993) "J. Infect. Dis."
(167:1302-1306)), ved bruk av antigenfragmentene som var uttrykt i bakterier (Tabell 3).
Disse sera ble også prøvet med mindre sensitivt ORF-3antigen.
Tsarev, S. A. Et al. (1993), "J. Infect. Dis." (167:1302-1306).
For 3 av 6 aper som ble undersøkt ved ELISA detekterte antigenet som ble uttryk in insektceller serokonversjon tidligere enn antigenet som var uttrykt i E. Coli. Ved bruk av insektcelleavledet-antigen var man i stand til å detektere anti-HEV antistoff i sera fra alle seks dager ved den høyeste prøvede fortynning (1:8000). Med E. Coli-celler som var avledet fra antigen (Burma-stamme) ble det ikke oppnådd noen informasjon om anti-HEV-titere fordi alle sera kun ble prøvet ved en fortynning på 1:100 (Tsarev, S.A. et. Al. (1992) "Proe. Nat. Acad. Sei. USA"; 89:559-563; Tsarev et. Al. (1993) "J. Infect. Dis." (167:1302-1306)).
I annen studie ble hepatitt E-virus, stamme SAR-55, seriefortynnet i 10"^ inkrementer og fortynningene 10~<*> til og med 10"^ ble inokulert i par av cynomolgus-apen for å titrere virusen. Serum-ALT-nivåene ble målt for å bestemme hepatitt og serumantistoff mot HEV ble bestemt ved ELISA-metoden ifølge oppfinnelsen (data i figurene) eller ved Genelab's ELISA (tre ELISA'er, hver basert på ett av antigenene kalt 4-2, 3-2 og 612 hos Yarbrough et al. ("J. Virol," (1991) 65:5790-5797) (data vist som positive (+) eller negative (-)-prøver ved bunnen av Figurene 6A - G). Alle prøver ble testet under kode.
ELISA-metoden ifølge oppfinnelsen detekterte serokonversjon til IgG anti-HEV i alle cyno'er som var inokulert og i alle virusfortynninger. I motsetning til dette Genlab's resultater slående variable, slik de er oppsummert nedenfor.
Fordi Cyni 385 (10 ) var positiv i ELISA-prøven både ved Genlab's og foreliggende oppfinnelsestest, skulle man vente at 10 -4 (ti ganger flere virus inokulert) og 10 <3> (100 ganger flere virus inokulert) også skulle vise seg å være positive. Foreliggende opppfinnelse bedømte dem som positive i motsetning til Genlab's ELISA-test som bommet på begge positiver ved 10" 3 og en ved 10" 4 selv om ALT-nivåene for Cyni 383 og 393 antydet aktiv hepatitt. Derfor støtter disse data fordelene ved foreliggende ELISA-metode i forhold til den kjente tekniske metode for detektering av antistoffer mot HEV.
Eksempel 10.
Sammenligning av ELISA'er basert rekombinant ORF-2 antigener bestående av enten A 55 kDa-protein uttrykt fra det fullstendige ORF-2-området av pakistani SAR-55 stammen av HEV eller av kortere områder av ORF-2 uttrykt som fusjonsproteiner i bakterier.
Som beskrevet i eksempel og vist i figurene 2A og 2B uttrykkes et antall proteiner med varierende molekylvekt i insektceller som er infiserte med den rekombinante baculuvirus inneholdende den fullstendige ORF-2. Et protein med en molekylvekt på ca. 55 kDa ble partielt renset fra 5x10 gSF-9-celler, høstet syv dager etter inokulering som følger: De infiserte celler ble sentrifugert, resuspendert i 10 ml 10 mM TrisHCl (pH 8,0), 50 mM NaCl, inneholdende 40 (ig/ml fenylmetylsulfonylfluorid (Sigman, St, Louis, Missouri), så sonikert for å bryte opp cellene hvoretter lysatet ble sentrifugert ved 90.000xg og 4°C i 30 minutter. Supernatanten ble lastet på en DEAE-sepharose CL-6B (Pharmacia, Uppsala, Sverige) kolonne som var akvilibrert med 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl. Kolonnen ble vasket med oppfyllingsbuffer og 55 kDa-proteinet ble eluert i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) 250 mM NaCl. Fraksjoner inneholdende 55 kDa-proteinet ble slått sammen og proteinet ble presipitert ved tilsetning av 3 gr (NH4)2S04 til 10 ml av proteinoppløsningen. Proteinpelleten ble oppløst i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 50 mM NaCl. 55 kDa-proteinet ble så benyttet som insektcelleuttrykt-HEV-antigen i ELISA i sammenligningsprøving mot ELISA'er basert på en av to HEV-antigener uttrykt i bakterier, (3-2 (Mexico) (Goldsmith et al., (1992) "Lancet", 339:328-331) eller SGSA3 (Burma) (Yarbough et al.; (1993) "Assay development of diagnostics tests for hepatitis E". I "International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Scientific program and abstract volume". Tokyo:VHFL, p 87, Abstract # 687. Disse bakterielle antigener var fusjonsproteiner av 26 kDa glutation-S-transferase (GST) og enten den antigeniske sekvens 3-2 (M) bestående av 42 aminosyrer lokalisert 6 aminosyrer oppstrøms av C-terminus av ORF-2 (Yarbough et al., (1191) "J. Virol" 65:5790-5797) eller de 327 C-terminal aminosyrer av ORF-2 (Yarborough et. al.,
(1193)). ELISA'ene ble gjennomført som følger.
Seksti ng pr brønn av 55 kDa-proteiner eller 200 ng pr brønn av fusjonsantigene i karbonatbuffer (pH 9.6) ble inkubert i brønner på en polyestyren-mikrotiter-analyseplate (Dynateck, S. Windham, ME) i 2 timer ved 37°C. Platene ble blokkert med PBS inneholdende 10% fetalkalvesyre og 0,5% gelatin. Serumprøver fra cynomolgus-aper, inokulert intravenøst (merk: cyno 387 og 392 ble inokulert oralt) med en fortynning av fekes inneholdende SAR-55-stammen av HEV i området 10 -1 t.o.m. 10 -8 som antydet i Tabell 5 og Figurene 7A-7J og 8A-8D, ble fortynnet 1:100 i blokkeringsoppløsning. Peroksydasekonjugert gjete-anti-human IgM (Zymed, San Francisco, CA) fortynnet 1:1000 eller 1:2000, eller peroksydasemerket geit-anti-human-immunoglobulin, fortynnet 1:1000, ble benyttet som detektor-antistoff.
I alle ELISA-prøvene bortsett fra for de to oralt inokulerte aper, cyno-387 og cyno-392, ble 55 kDa'et og fusjonsantigene testet samtidig i det samme laboratorium slik at den eneste variabel var den benyttede antigen. Kriterier for oppføring som positive reaksjoner i anti-HEV-ELISA 55 kDa antigenene var en optisk densitetsverdi > 0,2 og større enn to ganger den til en pre-inokulerings-serumprøve for det samme dyr. I tillegg og for de begge antigener uttrykt i bakterier var fusjonsproteinet med GST, måtte den optiske densitet for en prøve som ble testet med disse antigener, være 3 ganger større enn det som ble oppnådd med ikke-fuserte GST for å kunne anse som positive (Goldsmith et al., (1992)).
Resultater.
Begge cynomolgus-aper (377, 378) som var inokulert med 10"^fortynningen av standard HEV-fekalsuspensjonen hadde en utpreget økning i ALT-aktiviteten ved 4-5 uker etter post-inokulering, noe som indikerte hepatitt (Tabell 5, Figurene 7A og 7B).
I ALT middel og standard avvik (SA) for for-inokuleringssera.
t Forsøket ble avsluttet etter 15 uker
<*> OD-5-verdiene for for-inokuleringsera av cyno-380 etter testing ved ELISA med 55 kDa antigen, var to ganger så høy som middelverdien for for-
inokuleringssera for andre cynomolgus-aper.
t Alle ELISA-tester bortsett fra for-Cyno 387 og Cyno-392 ble gjennomført i de samme forsøk
- ikke påvist
IG ikke gjennomført
Alle tre antigener som ble prøvet detekterte IgM anti-HEV i prøver tatt fra cyno-377 3 uker etter inokulering (Tabell 5, figur 8A), men IgM anti-HEV ble ikke detektert i noen av prøvene fra det andre dyr, cyno-378. IgG anti-HEV ble detektert i begge dyr med 55 kDa-basert ELISA, men kun i cyno-377 med ELISA som var basert på fusjonsantigener. OD 50-verdien for IgG anti-HEV var signifikant høyere enn for de IgM anti-HEV. ELISA-verdier som ble oppnådd med 55 kDa antigenet var også signifikant høyere enn de som ble oppnådd med hvert av de to fusjonsantigener (Figurene 7A og 7B). Mønstrene for OD 50-verdiene som ble observert i ELISA med antigener fra de to kilder var altså signifikant forskjellige. For ELISA basert på fusjonsantigener nådde positive signaler etter maksimum kort etter serokonversjon og svant så iløpet av de 15 uker etter forsøket. I ELISA som var basert på 55 kDa antigenet nådde det positive signal et maksimum kort etter serokonversjonen og forble omtrent på samme høye nivå under hele forsøkets varighet i 15 uker.
En forhøyning av ALT-aktiviteten i begge aper (394 og 395) som var inokulert med en 10 fortynning av standard HEV-stol suspensjon var signifikant mindre utpreget ved det ventede tidsrom for hepatitt enn i dyrene som var inokulert med den ti-ganger høyere dose (Tabell 5, Figurene 7C og 7D). Cyno-395 hadde således høyere ALT-aktiviteter før inokulering såvel som 15 uker etter inokulering. Den sistnevnte var sannsynligvis ikke relatert noen HTV-infeksjon. Svakt positive IgM anti-HEV-verdier ble detektert kun i cyno-394 (Figur 8B) og kun med ELISA basert på 55 kDa-antigenet. Begge dyr var imidlertid ifisert fordi IgG anti-HEV-serokonversjonen ble detektert i begge dyr. I cyno-394 ble aniti-HEV IgG først detektert av 55 kDa-antigenet i uke 3 og en uke senere med 3-2 (M)-antigenet. SG3 (B)-antigenet detekterte ikke serokonversjon i cyno-395 og anti-HEV IgG ble detektert kun med 55 kD-anitgenet. Anti-HEV hadde en tendens til å
synke i titer med tiden i dette dyr.
Cyno-38o go cyno-383 ble inokulert med en 10 _3 fortynning av standard HEV fekalsuspensjonen (Tabell 5, Figurene 7E, 7F og 8C). Cyno-380 hadde fluktuerende ALT-aktiviteter før og etter inokulering, derfor kunne ALT-nivåene ikke benyttes for å dokumentere hepatitt E i dette dyr. I cyno-383 ble det observert en lett økning av ALT-aktiviteten (Figur 7F), noe som falt sammen med serokonversjonen og som derfor kan skyldes en mild hepatitt E. IgM anti-HEV ble ikke detektert i sera fra cyno-380, men noen av de tre antigener. Cyno-380 serokonverterte for IgG anti-HEV ved prøving med ELISA med SG3 (B), men ikke med 3-2 (M)-antigen. Dette dyr hadde et på forhånd eksisterende IgG anti-HEV ved prøving med 55 kDa-antigenet, men det var en stor økning i IgG anti-HEV fra uke 5 (Figur 7E). Identifisering av på forhånd eksisterende antistoff er rapportert tidligere i sera fra annen cynomolgus-ape [Ticehurst et al., (1992) "J. Infect Dis., 165:835-845; Tsarev et al.- (1993)". Infect. Dis"., 168:369-378]. Serokonversjon opptrådte på det ventede tidsrom, men nivåene av IgG anti-HEV i prøvene fra cyno-383 forble lave og detekterbare kun med 55 kDa-antigenet.
Cyno-389 og cyno 393 ble inokulert med en 10 fortynning av standard HEV fekalsuspensjonen (Figurene 7G, 7H, 8D, Tabell 5). Ingen av dyrene hadde noen signifikant økning av ALT-aktiviteten selv om tidspunktet for en liten, men distinkt ALT-topp i sera av cyno-393 ved uke 5 (Figur 7H) antydet grenselinjehepatitt. ELISA basert på SG3 (B)- eller 3-2 (M)-antigener bedømte begge dyr som negative for HEV-infeksjon. I motsetning til dette detekterte 55 kDa-antigenet IgM anti-HEV i sera av cyno-389 i ukene 6-8 etter inokulering (Figur 8D) og anti IgG anti-HEV fra uke 6 til uke 15 i begge dyr.
Ingen av dyrene som var inokulert med 10"^ fortynningen fra standard fekalsuspensjonen utviklet noen merkbar stigning i ALT-aktiviteten (Figur 71, 7J, Tabell 5), men i cyno-386 ble IgM- og IgG anti-HEV detektert ved ukene 8-13 henholdsvis 8-15 med 55 kDa -antigenet (Figur 7J, 8E). Cyno-385 anti-HEV IgG ble detektert med 55 kDa - og 3-2 (M)-antigenet, men ikke med SG3 (B)-antigenet. I motsetning til tidligere mønstre ble IgG anti-HEV detektert med et fusjonsantigen 4 uker tidligere og i høyere nivåer enn med 55 kDa-antigenet.
Ingen av dyrene som var inokulert med fortynninger av standard HEV fekalsuspensjonen i området 10" 6 -10" o utviklet antistoff mot noen av de tre HEV-antigener. Økede ALT-aktiviteter ble ikke observert i disse dyr, bortsett fra en heller prominent topp av ALT-aktivitet i uke 9 for cyno-400 (Tabell 5). Imidlertid indikerer fraværet av serokonversjonen i dette dyr at denne topp sannsynligvis ikke skyldes noen HEV-infeksjon.
Når det gjelder de to cynomolgus-aper 387 og 392 som var inokulert oralt med 10"<1 >fortynningen av den 10%-ige fekalsuspensjon, ble ingen av dyrene infisert fordi ALT-nivåene ikke steg og fordi ELISA gjennomført med 3-2 (M)- og 55 kDa-antigenene ikke detekterte noen serokonversjon til HEV (Tabell 5).
Til slutt ble serologiske bevis for HEV-infeksjon funnet i alle dyr som var inokulert med desimalfortynninger av fekalsuspensjonen til og med 10"^, ingen av dyrene som fikk høyere fortynninger hadde slike bevis. Prominent heptatitt, definert ved forhøyet ALT, ble observert kun for de to aper som var infisert med IO"1 fortynning. Signifikant lavere elevasjoner av ALT-aktiviteter ble observert i noen dyr som var inokulert med høyere fortynninger av fekalsuspensjonen, mens det i andre ikke ble funnet noe økning. Betraktet alene var disse lave ALT-økninger ikke diagnostiske for hepatitt. Imidlertid antyder sammenfallet av serokonversjon og opptreden av disse ALT-topper nærværet av en mild hepatitt i disse dyr. Anti-HEV-IgG-serokonversjon ble detektert i alle dyr som var inokulert med fortynninger av fekalsuspensjon i området IO"1-10"^. En tendens mot lavere nivåer av IgG anti-HEV og forsinket serokonversjon ble observert i dyr som var inokulert med høyere fortynninger av forrådet.
Som en oppsummering var 55 kDa Pakistani ORF-2 antigenet mer effektivt enn både 3-2 (M)- og SG3 (B)-antigenet for å detektere IgM- og IgG anti-HEV i cynomolgus-aper som var infisert med Pakistani-stammen av HEV. F.eks. var, for alle dyr sera bortsett fra de fra cyno-385, detekteringen av IgG- eller IgM anti-HEV ved ELISA, mer effektiv med 55 kDa-antigenet enn med noen av 3-2 (M)- eller SG3-antigenene. ELISA med 55 kDa-antigenet ga internt konsistent og reproduserbare resultater og detekterte i IgG anti-HEV i alle 10 dyr som var inokulert med en fekalfortynning på 10"^ eller lavere. Størrelsen av ELISA-signalet sank også etterhvert som inokulumet ble fortynnet. Fusjonsantigenene ga ikke konsistente resultater mellom dyreparene. Kun en i hvert par av dyr som var inokulert med en fortynning på 10 -1 ,102 ,10 , eller 10 viste serokonversjon til IgG anti-HEV og kun en enkelt serokonversjon for IgM anti-HEV ble detektert med disse antigener. Ingen av dyrene som var inokulert med 10 A fotrynningen av det opprinnelige inokulum serokonverterte til noen av de to fusjonsantigenene, selv ikke om serum fra ett dyr (cyno-393) hadde bibeholdt høye nivåer av anti-HEV IgG ved prøving med 55 kDa-antigen. Selv om, og som diskutert ovenfor, ELISA for IgM anti-HEV var signifikant mindre sensitiv enn ELISA for cynomolgus IgG anti-HEV var 55 kDa-antigenet i stand til å detektere anti-HEV IgM i flere dyr enn 3-2 (M)- eller SG3
(B)- antigen. Som en oppsummering kan man si at en definitiv konklusjon om den infektsiøse titer av Pakistani-viral-inokulum som benyttet i denne studie ikke kunne skje
med de kombinerte data fra 3-2 (M)- og SG3 (B)-baserte ELISA, men kan skje med data oppnådd fra kun 55 kDa-Pakistani-ELISA.
Når det gjelder cyno-385 var forskjellen i anti-HEV IgG-deteksjon mellom de to prøveresultater, 4 uker. Disse data antyder nærværet av en distinkt epitop i 3-2 (M)-antigenet som ble erkjent av dette dyr, men som er fraværende i de større 55 kDa- og SG3 (B)-antigenet. Ved anvendelse av totalt insektcellelysat som inneholder både fullstendig ORF-2 (75 kDa)- og 55 kDa-proteinene som antigen for å teste disse prøver igjen, var resultatene de samme som når 55 kDa ble benyttet alene. Dette funn antyder at 55 kDa-proteinet ikke nødvendigvis mangler 3-2 epitop aminosyrene, men heller at konformasjon av 3-2 epitopsekvensensen varierte blant de tre antigener som ble benyttet i denne studie. Tilslutt er det av interesse å merke seg at på tross av det faktum at antigen Sg3 (B) inneholdt en større del av ORF-2 og inkluderte hele sekvensen av epitop 3-2, detekterte det ikke mer positive sera enn 3-2 (M)-antigenet.
Eksempel 11.
Bestemmelse av infeksjonstiteren for HEV SAR-55 viralforråd ved RT-PCR.
Kjennskap til infeksjonstiteren for inokula er kritisk for bedømmelsen av mange av de data som oppnås ved eksperimentelle infeksjoner i dyremodeller. Til nu er det imidlertid ikke rapportert noen infeksjonstiter for et HEV-viralforråd. Ti-gangers fortynninger av fekalsuspensjonen inneholdende SAR-55-stammen av HEV ble ekstrahert og RT-PCR-forsterkning gjennomført som følger for å bestemme den høyeste fortynning hvori HEV-genomer kunne detekteres. 200 ul fekalsuspensjon ble blandet med 0,4 ml 1,5M NaCl pluss 15% polyetylenglykol (PEG) 8000 og satt hen over natten ved 4°C. Pellets ble samlet ved sentrifugering i 3 minutter i en mikrosentrifuge (Beckman, Palo Alto, CA) ved 16.000g og oppløst i 475 ul-oppløsning inneholdende 4,2M guanidin-tiocyanat, 0,5% N-lauroylsarkosin, 0,25M TRIS.HC1 (pH 8,0). 0,15 M ditiotreitol (DTT), og 1,0 u g og tRNA. 50uL TRIS-HC1 (pH 8,0), 100 mM EDTA, og 10% SDS ble så tilsatt. RNA ble ekstrahert to ganger fenol-kloroform (1:1) ved 65°C fulgt av kloroformekstraksjon ved romtemperatur. Til den øvre fase ble det satt 250 ul 7,5 M ammoniumacetat og nukleinsyrer ble presipitert med 0,5 mL 2-propanol, vasket med 75% etanol, vasket med 100% etanol og benyttet for reverstranskripsjon (RT) - PCR.
For detektering av HEV-genomet ble det benyttet to sett av nestede primer som representerte sekvenser fra 3' område (ORF-2) av SAR-55-genomet. Primer for reverstranskripsjon og den første PCR er vist som SEQ ID NO:99
GTATAACGGATCCACATCTCCCCTTACCTC og SEQ ID NO: 100
TACAGATCTATACAACTTAACAGTCGG. Primer for den andre PCR er vist som SEQ ID NO: 101: GCGGCAGATCTCACCGACACCATTAGTAC henholdsvis SEQ ID NO: 102: TAACCTGGATCCTTATGCCGCCCCTCTTAG. RNA-pelleten ble oppløst i 20 ul 0,05 M TRIS-HC1 (pH 7,6), 0,6 MKC1, 0,01 M MgCl2, 0,001 M DTT, 40 enheter Rnasin (Promega Biotec, Madison, WI), 16 enheter av avian myesto-blastosevirus-reverstranskriptase (Promega Biotec), og 10 pmol reverse primer, og inkubert i 1 time ved 42°C. Til 20 ul reverstranskriptase-blanding ble det satt 100 fil 0,01 M TRIS-HCL (pH 8,4), 0,05 M Kcl, 0,0025 M MgCl2, 0,0002 M hver dNTP, 50 pmol direkte primer, 50 pmol reversprimer og 4 enheter amplitak (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT) under 100 ul lett mineralolje. HEV cDNA ble forsterket ved 35 sykler PCR:1 minutt ved 94°C, 1 minutt ved 55°C, 1 minutt ved 72°C. PCR-produktene ble analysert på 1% agarosegel. Deretter ble 5 (il av blandingen benyttet for den andre runde av forsterkningen med de samme betingelser bortsett fra at ekstensjonstiden ble øket til 3 minutter.
RT-PCR-produktene som var fremstilt i alle fortynninger av standard-HEV-fekes i alle områder fra 10"<1> til 10"^ (Figur 9) ble separert på en 2% agarosegel og ble detektert med etidiumbromid-farving av gelen. En reduksjon av mengden av det spesifike PCR-produkt ved høyere fortynninger ble observert og den høyeste fortynning av 10% fekalsuspensjonen der HEV-genomet ble detektert, var 10"^. Derfor, og fortynningsfaktoren tatt i betraktning, var HEV-genomtiteren ca 10 f\ ' 7 pr gram fekes.
I tillegg var kun de fortynninger som ved RT-PCR ble påvist å inneholde HEV-genomet, infektsiøse for cynomolgus-aper. Derfor er infeksjonstiteren for standard fekalsuspensjonen og dens genomtiter, påvist ved RT-PCR, omtrent den samme. En tilsvarende korelasjon mellom RT.PCR og infeksjonstiter, ble funnet for en stamme av hepatitt C-virus (Cristiano et al., (1991) "Hepatology", 14:51-55; Farci et al., (119) "N. Engl. J. Med.", 25:98-104; Bukh et al., (1992); "Proe. Nati. Acad. Sei U.S.A., 89:187-191).
Eksempel 12.
Aktiv immunisering ved bruk av ORF-2-proteinet som vaksine og passiv immunisering med anti-HEV positivt konvalesentplasma.
Cynomolgus-aper (Macaca fascicularis) som var HEV-antistoff negativ (<1:10) i en ELISA basert på 55 kDa ORF-2-peroteinet ble individuelt huset under BL-2 biorisikoforhold og en suspensjon (i føtalt bovint serum) av feces inneholdende Pakistani-HEV-stamme SAR 55, fortrynnet til å inneholde 10.000 eller 1.000 CID50, ble benyttet for intravenøs inokulering av dyrene.
For aktive immuniseringsstudier ble bakuluvirus rekombinant-uttrykt 55 kDa ORF-2 - protein renset fra 5x10 gSF-9-celler, høstet 7 dager etter inokulering som beskrevet i Eksempel 10. Tre mg av det rensede 55 kDa-protein ble presipitert med alum og åtte cynomolgus-aper ble immunisert ved intramuskulær injeksjon med 0,5 ml vaksine inneholde 50 ug alum-presipitert 55 kDa-protein. Fire aper fikk en enkel dose og fire aper fikk to doser i fire ukers avstand. Primatene ble utfordret intravenøst med 1.000 - 10.000 CID50 av HEV fire uker etter den siste immunisering.
Fire cynomolgus-aper tjente som kontroller ved studiene på aktiv immunisering. Cyno-412 og 413 fikk en dose plasebo (0,5 ml fosfatbuffret saltoppløsning) og cyno-397 og 849 fikk to doser plasebo. Kontrolldyrene ble utfordret med 1.000 - 10.000 CID5+ av
HEV.
For studier på passiv immunitet ble cyno-384 infisert med 0,5ml av en 10%'ig stolforrådssuspensjon inneholdende to Kinesisk HEV-isolater, KS1-1987 og KS2-1987 og plasma ble reptert samlet fra dyrene under konvalesensen, Yin et al. (1993) "J. Med. Virol.", 41:230-241;) Ca 1% av blodet av cyno-396 og cyno-399 og 10% av blod av cyno-401 og cyno-402 ble erstattet med konvalesentplasma fra cyno-384 med en HEV-antistofftiter på 1:10.000. Den ble utfordret med 1.000 CID50 av HEV to dager etter infusjon av plasma. Som en kontroll ble 10% av blodet av cyno-405 erstattet med antihev-negativt plasma oppnådd fra cyno-384 før infeksjon med HEV. Cyno-405 ble så utfordret med 1.000 CID50 av HEV.
For både passive og aktive immuniseringsstudier ble perkutannålbiopsier av lever og prøver av serum og fekes samlet før inokulering og ukentlig i 15 uker etter inokulering. Sera ble analysert på nivåer av alaninaminotransferase (ALT) med kommersielt tilgjengelige tester (Metpath Inc., Rockville, MD) og biokjemiske tegn på hepatitt ble definert til å være to-ganger eller større økning av ALT-nivået. Leverbiopsiene ble undersøkt under kode og anti-HEV ELISA ble benyttet som beskrevet i Eksempel 10. RNA-ekstrahering og RT-PCR ble gjennomført som i Eksempel 11 bortsett fra at RNA fra 100 fil serum eller fra 100 ul 10%'ig fekalsuspensjon ble ekstrahert med TRIzol Reagent (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland) i henhold til produsentents protokoll. For kvantifisering ble PCR-posisitv serie-sera eller -fekes fra hvert dyr kombinert og seriefortynnet i 10-gangers inkrementer i kalveserum. 100 fil av hver fortynning ble benyttet for RNA-ekstrahering og RT-OCR sin beskrevet tidligere i dette eksempel. PCR-protokollen som ble benyttet for denne studie kunne detektere helt ned til 10 CID50 av HEV pr ml serum og helt ned til 100 CID50 pr gram fekes.
Peak-ALT-verdiene for ukentlige serumprøver i 5 uker før inokulering og for 15 uker etter inokulering ble uttrykt som forhold etterfor for hvert dyr. Det geometriske middel av forholdene fra kontrollgruppen av dyr ble sammenlignet med de fra de passivt eller aktivt immuniserte dyr ved bruk av Simes-testen (Simes, RJ. (1986) "Biometrika", 73:751-754.
Varigheten av viremi og virus-shedding i fekes og HEV-genomtitrene i kontrollgruppen av dyr ble sammenlignet med de i passivt og aktivt immuniserte dyr ved bruk av Wilcoxon-prøven (Noether, G. (1967) i "Elements of nonparametric statistics" (John Wiley & Sons Inc., New York), pp. 31.36). Den samme prøve ble benyttet for å sammenligne de ovenfor angitte parametre mellom passivt og aktivt immunisert dyr.
For statistisk analyse ble serumprøver som hadde < 10 HEV-genomer i 1 ml serum, gitt et titer på 1:1, og fekalprøver som hadde < 100 HEV-genomer i et 1 g fekes gitt en titer på 1:10.
Resultater.
Forløpet av hepatitt E-infeksjonen i ikke immuniserte dyr.
13 av 5 ikke-immuniserte dyr som var utfordret med HEV, ble biokjemisk bevis på hepatitt dokumentert ved minst en to-gangers økning av serum-ALT-verdiene. I to dyr ble det ikke funnet signifikant økning i ALT-aktiviteten. Imidlertid dokumenterte histopatologiske data hepatitt i alle 5 dyr som vist i Tabell 6.
*Nekro-inflammatoriske endringer i leveren ble bedømt som 1+, 2+, 3+. 4+ og de ukentlige bedømmelser ble summert.
+Immunoprofylaks
f Nekro-inflammatoriske endringer bedømt 1+ ble detektert i to uker i cyno-396, imidlertid ble de ansett konsistente med viralhepatitt kun under en uke.
Cyno 013 døde 9 uker etter utfordring
Nekro-inflammatoriske endringer lå mellom 1+ og 2+ på en skala fra 1+ til 4+ og ble temporært forbundet med økninger av ALT-aktivitetene i de dyr som hadde slik økning.
Alle kontrolldyrene konverterte til HEV 3 til 5 uker etter utfordring og utviklet maksimalt HEV-antistofftitere fra 1:1.000 fra 1:32.000. Det var en god korellasjon mellom infeksjonens alvor, hepatitt og nivået for anti-HEV-responsen. Cyno-405 som hadde den høyeste, kumulative bedømmelse for Hepatitt, hadde også den lengste periode av viremi og viral ekskresjon og det høyeste nivå av anti-HEV (Tabell 6). Varigheten av viral-sheddingen i fekes var den samme som, eller lengere enn, den til viremi en. For alle kontrolldyrene var titrene for HEV-genomet i serum lavere (10 - 10 -4 ) enn titeren i fekes (10 -5 '7 -10 -7). I alle fem av disse dyr ble viremi og virus shedding i fekes detektert 4-11 uker og gjennomsnittlig 4,2 uker etter serokonversjon (område 2-9 uker).
Passiv immunisering.
Cyno-396 og 399 der ca 1% av blodet var erstattet med anti-HEV-positivt konvalesentplasma, hadde en HEV-antistofftiter på 1:40 da den ble bestemt to dager etter transfusjon (på tidspunktet for utfordring) (Tabell 6). Et to-gangers fall i HEV-antistofftiteren ble observert i begge dyr en uke etter transfusjon og HEV-antistoffene fallt til under det detekterbare nivå (<1:10) 2 uker etter transfusjon. Anti-HEV ble igjen detektert 5 uker etter utfordring i cyno-396 og 4 uker etter utfordring i cyno-399, noe som antydet at det var inntrådt infeksjon med HEV. Den maksimale HEV-antistofftiter (1:8.000) ble nådd 9-10 uker etter utfordring. Ingen cynomolgus-ape viste noen signifikant økning av ALT-aktiviteten etter utfordring. Imidlertid ble histologiske bevis på hepatitt detektert i cyno-396 og HEV-genomet ble detektert i serum og fekes fra begge dyr (Tabell 6).
Cyno-401 og 402 hadde ca 10% av blodet erstattet med konvalesentplasma. To dager etter transfusjon, på utfordringstidspunktet, var HEV-antistofftiteren i begge cynomolgus-aper 1:200 (Tabell 7). Biokjemiske og histologiske analyser viste ikke hepatitt i noe dyr. Imidlertid ble, i begge dyr, HEV-viremi og fekal-shedding av virus observert, noe som indikerte at det var skjedd en infeksjon (Tabell 6). Således beskyttet passiv immunoprofylakse som ga en høyere titer av antistoff, cynomolgus-aper mot hepatitt etter utfordring med HEV.
Aktiv immunisering.
Fire primater som var immunisert med en 50 ug dose av 55 kDa-proteiner utviklet antistoff mot rekombinante protein som i titer lå i området 1:100 til 1:10.000 (Tabell 7). En (cyno-013) døde ved en anestesiulykke 9 uker etter utfordring og er inkludert i analysen (Tabell 6). De fire dyr som fikk to doser av antigenet utviklet HEV-antistoffer med titere på 1:10.000. To av de fire aper døde etter intravenøs utfordring med HEV. Dette kan også være resultatet av en anestesiulykke, men den nøyaktige etiologi kunne ikke bestemmes. Disse to aper ble utelukket fra ytterligere analyser. Ingen av de 6 gjenværende dyr utviklet abonormale ALT-nivåer eller histologiske tegn på hepatitt etter utfordring (Tabell 6). Cynomolgus-aper som var immunisert med enten 1 eller 2 doser av 55 kDa-proteinet utviklet ikke viremi. Imidlertid skilte 3 av 4 dyr som fikk en dose av immunigenet ut virus i fekes. I motsetning til dette ble virus-shedding ikke observert i noen av de to utfordrede dyr som fikk to doser av vaksinen.
De fleste av de aktivt immuniserte dyr utvikler høyere HEV-antistofftitere enn de passivt immuniserte dyr. Imidlertid hadde cyno-013 en HEV-antistofftitere på 1:100 på tidspunktet for utfordring, sammenlignet med en titer på 1:20 i de to dyr som ble immunisert passivt med anti-HEV-plasma. Cyno-013 viste imidlertid større beskyttelse mot HEV-infeksjon enn de passivt immuniserte dyr. Cyno-009 som hadde en HEV-antistofftiter på 1:1.000 på tidspunktet for utfordringen, var fullstendig beskyttet mot hepatitt og HEV-infeksjon (Tabell 6). I motsetning til dette var cyno-003 infisert og skilte ut HEV i fekes selv om den hadde en antistofftiter på 1:10.000 på tidspunktet for utfordring. Imidlertid ble hverken hepatitt eller viremi detektert i dette dyr eller i andre cynomolgus-aper som fikk en dose immunogen og som hadde HEV-antistofftitere på 1:10.000 eller større.
Sammenligning av forløpet av HEV-infeksjon i kontroll- og immuniserte dyr.
Som målt ved histopatologi var alle immuniserte dyr bortsett fra den ene av de passivt immuniserte aper, beskyttet mot hepatitt etter intravenøs utfordring med HEV. Sammenligning av middelverdiene for alvoret av hepatitten og nivået for viralreplikering mellom kontrollgruppen og de passivt og aktivt immuniserte dyr antydet at, generelt, infeksjonens alvor sto i omvendt forhold til HEV-antistofftiteren på tidspunktet for utfordringen og sank i rekkefølgen: ikke-immuniserte >passiv immunisering 1% >passiv-immunisering 10% >aktiv immunisering 1 dose >aktiv immuniseirng 2 doser (Tabell 6,8). Imidlertid var antallet dyr i hver av de to sub-grupper av passiv og aktiv immunisering ikke tilstrekkelig til å tillate statistisk analyse. Derfor ble det gjennomført statistisk analyse for kombinert passivt immunisert og kombinert aktivt immuniserte grupper respektivt sammenlignet med den kombinerte kontrollgruppe. Resultatene av denne analyse er gitt i Tabell 8, og de viser at de histopatologiske bedømmelser om varighet av histologiske endringer i kontrollgruppen og er statistisk forskjellige fra de for passivt eller aktivt immunserte dyr. De høyere etter-/før-inokuleringsforhold for peak ALT-verdiene i kontrollgruppen var statistisk signifikante ved sammenligning med de for de passivt eller aktivt immuniserte dyr, noe som antyder beskyttelse mot biokjemiske manifestasjoner av hepatitt i begge grupper av immuniserte dyr. Varigheten av viremi og titeren av HEV i fekes var signifikant lavere i begge grupper av immunserte dyr enn i kontrollgruppen. Forskjeller i varigheten av virusutskillelse og titer av HEV i serum var imidlertid ikke statistisk forskjellig mellom kontrollgruppen og den passivt immuniserte gruppe selv om disse parametre var signifikant forskjellige når kontrollgruppen ble sammenlignet med den aktivt immuniserte gruppe. Signifikante forskjeller blir også funnet mellom passivt og aktivt immuniserte grupper av dyr for varigheten av viremi og fekalutskillelse såvel som for HEV-titere.
Som oppsummering viser resultatene som angitt i Tabellene 6-8 at både passivt og aktivt ervervede HEV-antistoffer beskytter cynomolgus-aper mot hepatitt etter utfordring med virulent HEV. Selv om alle 5 ikke-immuniserte cynomolgus-aper utviklet histologiske tegn på hepatitt når de ble utfordret med 1.000 - 10.000 CTD50 av SAR-55, var begge dyr med passivt ervervede antistoff-titere på 1:200 beskyttet fra hepatitt og ett av to dyr med en antistofftiter helt ned til 1:40 utviklet heller ikke hepatitt.
Imidlertid skal det påpekes at aktivt immuniserte dyr viste fullstendig beskyttelse mot
hepatitt og mer effektiv motstandsevne mot HEV-infeksjon enn de passivt immuniserte dyr. F.eks. ble, i motsetning til de resultater som ble oppnådd fra de passivt immuniserte dyr, viremi ikke detektert i aktivt immuniserte dyr etter utfordring med HEV. En HEV-antistofftiter helt opp til 1:10.000 kunne oppnås i cynomolgus-aper etter en eller to
immuniseringer med det rekombinante 55 kDa-protein. Selv om en ape (013) utviklet en titer av 1:100 etter aktiv immunisering, forhindret dette nivå allikevel hepatitt og viremi.
Aktiv-immuniseringsstudiene viste også at mens en enkelt dose av vaksine forhindret HEV-viremi ble viralutskillelse i fekes fremdeles detektert. Imidlertid viste to doser vaksine seg å forhindre alle tegn på hepatitt og HEV-infeksjon. Disse resultater antyder således at en enkelt dose av vaksine, administrert f.eks. til individer før utelandsreiser, vil det kunne beskytte dem fra hepatitt E i høyrisiko-områder.
Til slutt skal det påpekes at resultatene som er presentert er meget like de resultater som rapporteres tidligere for passiv og aktiv immunoprofylakse av ikke-human-primater mot hepatitt A: passiv immunoprofylakse forhindret hepatitt, men ikke infeksjon, mens vaksinasjon forhindret ikke bare hepatitt, men infeksjon med HAV også (Prucell, R.H. et al. (1992) "Vaccine", 10:5148-5149). Det er av interesse at studie av immunoprofylaksen for HEV slik det her er gitt løper parallelt med den tidligere studie for immunoprofylakse mot HAV, både når det gjelder bestemmelse av titeren av antistoff som beskyttet (<1:100) og i resultatet etter den intravenøse utfordring med virulent virus. Fordi andre studier har vist effektivitet for sammenlignbare titere av passivt og aktivt ervervet anti-HAV i mennesker og har bekreftet den prediktive verdi for studier av primater i hepatittforskning (Stampleton, J., et al. (1985) "Gastroenterology" 89:637-642; Innis, B.L., et al. (1992) "Vaccine", 10:S159), er det derfor meget sannsynlig at disse resultater i cynomolgus-aper vil være predektive for beskyttelse av mennesker.
Eksempel 13.
Direkte ekspresjon i gjær av fullstendig ORF-2-protein og lavere molekylvektsfragmenter.
Fire cDNA ORF-2-fragmenter koder for:
1. fullstendig ORF-2-protein (aa 1-660, MW 70979), frament 1778-1703. (Der fragmentnummert henviser til primertallene som gitt nedenfor).
2. ORF-2-protein fra den 34. aa (aa 34-660, MV 67206), fragment 1779-1703.
3. ORF-2-protein fra den 96. aa (aa 96-660, MV 60782), fragment 1780-1703.
4. OFR-2-protein fra den 124. aa (aa 124-660, MV 58050), fragment 1781-1703, ble oppnådd pga PCR ved bruk av plasmid P63-2 som templat og de syntetiske oligonucleotider som vist nedenfor:
Alle sekvenser som vist i SEQ DD NO. 103 - 107 inneholder kunstig sekvens CCTAGG ved 5' endene etter 5 nucleotider. Den kunstige sekvens var et erkjennelsesete for Avr JJ (Bin I) restriksjonsensym. Sytetiserte PCR-fragmenter ble spaltet med Blnl og klonet inn i AvrU-sete av pPIC9-vektoren (Figur 10) (Invitrogen). Korrekt orientering av fragmentene ble bekreftet ved restriksjonsanalyse ved bruk av asymmetrisk EcoRI-sete som er til stede i ORF-2-sekvensene og i vektoren. Rensede rekombinante plasmider pPIC9-1778 (inneholdende fragment 1778-1703); pPIC9-1779 (inneholdende fragment 1779-1703); pPIC9-1780 (inneholdende ragment 1780-1703) og pPIC9-1781 (inneholdende fragment 1781-1730) ble benyttet for transformering av gjær-sferoplast (Picha-stammen) i henhold til invitrogen-protokollen. Screening av rekombinant klonene og analyse av ekspresjonen ble gjennomført ved bruk av samme protokoll. Disse uttrykte proteiner kan benyttes som immunogener i vaksiner og som antigener i immunoanalyser som beskrevet i immunoanalyser som beskrevet i foreliggende beskrivelse. Til slutt vil fagmannen kunne erkjenne at vektoren og gjærstammen som benyttes i eksemplet ovenfor kan erstattes av andre vektorer (f.eks. pHTL-Fl; invitrogen) eller gjærstammer (f.eks. Saccharomyces Cerisiae).
Eksempel 14.
Rensing og aminoterminalsekvens-analyse av HEV ORF-2-geneprodukter, syntetisert i SF-9 insektceller som er infisert ved rekombinant baculovirus 63-2-IV-2.
Som beskrevet i eksempel 10 ble SF-9-celler infisert med rekombinant baculovirus 63-2-IV-2 og høstet syv dager etter inokulering. Det predominante proteinbånd som var tilstede ved SDS-PAGE av insektcelle-lysat hadde en molekylvekt på ca. 55 kDa. Videre rensing av dette 55 kDa-bånd ble fullført ved jonebyttekolonnekromatografi ved bruk av DEAE-sefarose med 150.450 mM NaCl-gradient. DEAE-fraksjonene ble analysert på nærvær av 55 kDa-båndet ved SDS-PAGE fulgt av koomassi-blåfarving. Toppfraksjonen ble så oppløst ved polyakrylamid-gel-elektroforese i fravær av SDA til tre bånd på 55 kDa, 61 kDa og et bånd med mellomliggende molekylvekt. Analyse av hvert proteinbånd fra polyakrylamidgelen ved aminoterminal-mikroprotein-sekvensering viste at 55 og 61 kDa-proteinene delte en unik N-terminus ved Ala-112 av SEQ ID NO:2. Det antas at størrelsesforskjellen i de to ORF-2-spaltingsprodukter kan reflektere enten forskjellige glykosyleringsmønstre eller en COOH-terminalspalting av det større produkt.
Det tredje mellomliggende protein på polyakrylamidgelene ble vist og være et baculovirus-kitinaseprotein. 55 og 61 kDa ORF-2-proteinene ble oppløst til en enkelt symmetrisk peak-fraksjon fri for kitinase ved å underkaste peak DEAE-fraksjonene reversfase HPLC ved bruk av et mikropore-system med NaCl- og acetonitril-oppløsningsmidler.
Eksempel 15.
Direkte ekspresjon av 55 og 61 kDa-spaltingsprodukter.
Et cDNA ORF-2-fragment som koder for ORF-2-proteinet fra den 112. Aminosyre (aminsyrene 112-660 av ORF-21.
) ble oppnådd ved PCR ved bruk av plasmid p63-2 som templat. cDNA-fragmentet ble så skutt inn i en PBlueBac-3-transfervektor ved MarnFfl-Pstl-sete i vektoren. SF9-insektceller infiseres med den rekombinante baculuvirus som er dannet fra denne vektor og insektcellelysatene analyseres på nærvær av 55 og 61 kDa ORF-2-proteiner ved koomassi blåflekking av polakrylamidgeler. Det eller de direkte uttrykte proteiner kan benyttes som immunogener i vaksiner og som antigener i immunoanalyser som her beskrevet.
Foreliggende oppfinnelse angår hepatittvirologi. Mer spesielt angår oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent hepatittprotein.
Epidimier av hepatitt E, en enterisk transmitert ikke-A/ikke-B hepatitt, er rapportert i Asia, Afrika og Sentral-Amerika (Balayan, M.S. (1987), "Soviet Medical Reviews", Section E, "Virology Reviews", Zhdanov, 0-V.M. (ed), Chur, Switzerland: "Harwood Academic Publishers", vol. 2,235-261; Purcell, R.G., et al.(1988) i Zuckerman, AJ.
(ed), "Viral Hepatitis and Liver Disease", New York: Alan R. Liss, 131-137; Bradley, D.W. (1990), "British Medical Bulletin", 46:442-461; Ticehurst, J.R. (1991 i Hollinger, F.B., Lemon, S.M., Margolis, H.S. (eds): "Viral Hepatities and Liver Disease", Williams and Wilkins, Baltimore, 501-513). Tilfeller av sporadisk hepatitt, antatt å være hepatitt E, står for opp til 90% av rapportert hepatitt i land der hepatitt E virus (HEV) er endemisk. Behovet for utvikling av serologisk prøve for detektering av anti-HEV antistoffer i sera hos mfekterte individer er generelt erkjent på området, men den meget lave konsentrasjon av HEV som skilles ut fra infiserte mennesker eller dyr gjør det umulig å benytte slik HEV som kilde for et antigen for serologiske tester og selv om begrenset suksess ble rapportert ved propagering av HEV i cellekultur (Huang, R.T. et al. (1992), "J. Gen. Virol", 73:1143-1148), er cellekultur idag for ineffektiv til å produsere de mengder av antigen som er nødvendig for serologiske tester.
I den senere tid har store forsøk over hele verden på å identifisere virale, genomiske sekvenser som er assosiert med hepatitt E, resultert i kloning av genomene av et begrenset antall stammer av HEV (Tam, A. W. et al. (1991), "Virology, 185:120-131; Tsarev, S.A. et al. (1992), "Proe, Nati. Acad. Sei. USA" 89:559-563; Fry, K.E. et al.
(1992), "Virus Genes", 6:173-185). Analyser av DNA-sekvensene har ført forskerne til å anta at HEV-genomet er organisert i tre åpne leserammer(ORF'r), og å anta at disse ORF'r koder intakte HEV-proteiner.
En partiell DNA-sekvens av genomet av en HEV-stamme fra Burma (Myanmar) er beskrevet av Reyes et al., 1990, "Science", 247:1335-1339. Tam et al., 1991, and Reyes et al., PCT Patent Application WO91/15603 publisert 17. Oktober 1991, beskriver den fullstendige nucliotidsekvens og en dedusert aminosyresekvens av Burma-stammen av HEV. Disse forfattere hypotetiserte at tre fremover åpne leserammer, (OFR'r), inneholdes i sekvensen av denne stamme.
Ichikawa et al., 1991, "Microbiol. Immunol.", 35:535-543, beskriver isoleringen av en serie av kloner av 240-320 nucliotiders lengde ved screening av XgTl 1 ekspedisjonsbibliotek med sera fra HEV-infiserte cynomolgus aper. Det rekombinante protein som uttrykkes av en klon ble uttrykt i "E. Coli". Dette fusjonsprotein kodes av 3' område av ORF-2 av Myanmar-stammen av HEV.
Ekspresjonen av ytterligere proteiner som er kodet i 3' område av ORF-2 av en meksikansk stamme av HEV og av en Burma-stamme av HEV er beskrevet av Yarborough et al., 1991 "J. Virology", 65:5790-5797. Denne artikkel beskriver isoleringen av to DNA-kloner som er avledet fra HEV. Disse kloner koder proteinene i 3' merket område av ORF-2. Klonene ble uttrykt i "E. Coli" som fusjonsproteiner.
Purdy et al., 1992, "Archives of Virology", 123:335-349, og Favorov et al., 1992, "J. Of Medical Virology", 36:246-250, beskriver ekspresjonen av et større ORF-2-protein fragment fra Burma-stammen i "E. Coli". Disse referanser, såvel som de som er nevnt ovenfor, beskriver kun ekspresjonen av en del av ORF-2-genet ved bruk av bakterielle ekspresjonssystemer. Vellykket ekspresjon av full-lengde ORF-2-proteinet er ikke beskrevet før foreliggende oppfinnelse.
Sammenligning av genomorganiseringen og den morfologiske struktur for HEV med den til andre viruser viste at HEV er mest beslektet med calicivirusene. Av interesse er at de strukturelle proteiner av calicivirusene kodes av 3'-område av deres genom (Neil, J.D. et al. (1991) "J. Virol"., 65:5440-5447; og Carter, M.J. et al. (1992), "J. Arch. Virol.", 122:223-235) og selv om det ikke er noe direkte bevis for at den 3' terminaldelen av HEV-genomet også kodet i strukturelle proteiner resulterte ekspresjonen av visse små deler av 3' genomområde i bakterielle celler i produksjon av proteiner som er reaktive med anti-HEV-sera i ELISA og Western blots (Yarborough, et al., (1991); Ichikawa et al. (1991); Favorov et al. (1992) og Dawson, G.J. et al. (1992) "J. Virol. Meth"; 38:175-186). Imidlertid ble funksjonen for ORF-2-proteinet som strukturelt protein ikke bevist før foreliggende oppfinnelse.
De små proteiner som kodes av en del av ORF-2-genet er benyttet ved immunoanalyser for å detektere antistoffer mot HEV i animalske sera. Bruken av små bakterielt uttrykte proteiner som antigener i serologiske immunoanalyser har diverse potensielle mangler. For det første resulterer ekspresjonen av disse små proteiner i bakterieceller ofte i oppløselighetsproblemer og i ikke-spesifikk kryssreaktivitet for pasientens sera med "E. Coli"-proteiner når rå "E. Coli"-lysater benyttes som antigener i immunoanalyser (E. Purdy et al. (1992)). For det andre er bruken av Western blots som førstelinje serologisk test for anti-HEV antistoffer i rutine epidemiologi upraktisk pga tidsforbruk og omkostningsbegrensninger. En ELISA som benytter små-peptider avledet fra 3' terminalenden av HEV-genomet resulterte i detektering av kun 41% positiver fra kjente HEV-infiserte pasienter. For det tredje er det vist at for mange vimser inkludert også Picornaviridae som er den familie som er nærmest til Caliciviridae, er betydelig antigeniske og immunogeniske epitoper sterkt konformasjonelle (Lemon, S.M. et al.
(1991), i Hollinger, F.B., Lemon, S.M., Margolis, H.S. (eds): "Viral Hepatities and Liver Disease", Williams and Wilkings, Baltimoere, 2-24). Av denne grunn antas det at ekspresjonen i et eukariotisk system for et komplett ORF som koder et intakt HEV-gen ville resultere i produksjonen av et protein som kunne danne HEV-viruslignende partikler. Et slikt fullstendig ORF-protein ville ha en immunologisk struktur nærmer med den til native kapsidproteiner enn de ovenfor angitte mindre proteiner vil ha og som kun utgjør deler av de strukturelle proteiner av HEV. Derfor vil disse ORF-proteiner sannsynligvis tjene som et mer representativt antigen og et mer effektivt immunogen enn de idag benyttede mindre proteiner.
Foreliggene oppfinnelse angår en fremgangsmåte for å fremstille et immunogent hepatittprotein, kjennetegnet ved at den omfatter: dyrking av en verstcelle transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor, der ekspresjonsvektoren omfatter DNA, der nevnte DNA har en sekvens som består av nukleotidene som koder for aminosyrene 112 til 660 av et hepatitt E virus åpen leseramme 2 protein, ved betingelser som er hensiktsmessig for å frembringe produksjon av et 55 kD protein ved avspalting av COOH-terminalen.
En utførelsesform ifølge oppfinnelsen angår en fremgangsmåte, kjennetegnet ved at DNA sekvensen består av:
a) nukleotidene 5480 til 7126 ifølge SEQ JD NO: 4,
b) en DNA sekvens some er degenerert som et resultat av den genetiske kode for sekvensen under (a), eller c) en DNA sekvens ifølge (a) eller (b) der en eller flere rester av det resulterende protein er substituert med en biologisk ekvivalent rest.
En annen utførelsesform ifølge oppfinnelsen angår en fremgangsmåte, kjennetegnet ved at ekspresjonsvektoren er en baculovirus ekspresjonsvektor og vertscellen er en insektsvertscelle.
Oppfinnelsen skal illustreres ved hjelp av de vedlagte figurer der:
Figure 1 viser den rekombinante vektor som benyttes for å uttrykke det fullstendige ORF-2-protein av genomet av HEV-stamme SAR-55; Figurene 2A og 2 B viser natriumdodecylsulfat-polyacrylamid-geler og (SDS-PAGE) der cellelysater av insektceller som er infisert med vill-type baculovirus eller rekombinant baculovirus (innholdende genet som koder ORF-2). Enten ble flekket med comaasiv blått (A) eller underkastet Western-blott med serum av en HEV-infisert sjimpanse B. I både Figur 2A og 2B inneholder spor 1 totalcellelysat av ikke-infiserte SF-9-celler; spor 2 inneholder lysat av celler som er infisert med vill-type-baculovirus; spor 3 inneholder lysat av celler infisert med rekombinant baculovirus; og spor 4 inneholder molekulære vektmarkører: Figurene 3A-3A'" samt 3B viser immunoelektronmikrografer (IEM) av 30 og 20 nm viruslignende partikler som er dannet som et resultat av ekspresjonen av ORF-2-protein i rekombinante, infiserte insektceller; Figur 4 viser resultatene av en ELISA der det som antigen er brukt rekombinant ORF-2 som ble uttrykt fra insektceller inneholdende genet som koder det fullstendige ORF-2. Serum anti-HEV antistoffhivåene ble bestemt til forskjellige tidsrom etter inokulering av Cynomolgus-aper med enten den meksikanske (Cyn-80A82, Cyn-9A97 og Cyno 83) eller pakistanske (CynO-374) stamme av HEV; Figurene 5A-D viser resultatene av en ELISA der det som antigen ble benyttet rekombinant ORF-2 som ble uttrykt fra insektceller inneholdenden genet som koder den fullstendige ORF-2. Serum IgG eller IgM anti-HEV-nivåene ble bestemt over tid etter inokulering av to sjimpanser med HEV; Figurene 6A-J viser en sammenligning av ELISA-data der det som antigen ble benyttet det rekombinante, fullstendige ORF-2-protein som var avledet fra SAR-55 som antigen mot et rekombinant, partielt ORF-2-protein av ledet fra Burma-stammen av HEV og (Genelabs). Figurene 7A-J viser anti-HEV IgG ELISA- og alaninaminotransferase (ALT) verdier for cynomolgus-aper som var inokulert med ti-ganger seriefortynninger (indikert i parentes på toppen av hver plate) av en 10% fekalsuspensjon av SAR-55 HEV. Rekombinante antigener som ble benyttet i ELISA var: glutathione-S-transferase (GST); -2 (M), en fusjon av 3-2 epitopene (Yarbough et al.: (1991) "J. Virol", 65:5790-5797) ig GST; SG3 (B), en fusjon av 327 C-terminal-aminosyrer av ORF.2 og GST [Yarbough et al., (1993): Analyseutvikling av diagnostiske prøver for hepatitt E i "International Symposium on Viral Hepatitis and Liver Disease. Scientific Program and Abstract Volume" Tokyo;VHFL p. 87]; og et 55 kDa ORF-2-produkt som direkte var uttrykt i insektceller; Figurene 8A-E viser anti-HEV IgM ELISA og ALT-verdier for positive cynomolgus-aper som var inokulert med en ti-ganger serie fortynning (antydet i parentes ved toppen av hver plate) av den 10%-ige fekalsuspensjon av SAR-55 HEV. Rekombinante antigener som ble benyttet i ELISA var: glutathione-S-transferase (GST); 3-2 (M), en fusjon av 3-2 epitopen [Yarbough et al., 1991] og (GST); SG3 (B), en fusjon av 327 C-terminalaminosyrene av ORF-2 og GST [Yarbough et al., 1993]; og 55 kDa ORF-2-produkt som direkte var uttrykt i insektceller; Figur 9 viser en etidiuimbromid-merking av en 20% agarosegel hvorpå PCR-produkter som var produsert fra ekstrakter av serier ti-gangers fortynninger (indikert på toppen av hvert spor av gelen) av den 10%-ige fekale suspensjon av SAR-55 HEV var separert. De angitte lengder av PCR-produktene var ca 640 base-par og kolonnen som var markert med en (M) inneholdt DNA-størrelsesmarkører; Figur 10 viser pPIC9-vektoren som ble benyttet for å uttrykke det fullstendige ORF-protein eller lavere molekylvektsfragmenter i gjær.
Utgangspunktet for hepatittproteinene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er en i det vesentlige renset stamme av hepatitt E-virus (HEV) fra Pakistan, SAR-55.
HEV-proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen er i stand til å danne viral-lignende partikler og er immunogene. HEV-proteinene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også stimulere produksjonen av beskyttende antistoffer ved injeksjon i pattedyr, noe som vil tjene til å beskytte pattedyret mot utfordring fra vill-type HEV.
Foretrukne HEV-proteiner er de proteiner som kodes av ORF-genene. Av særlig interesse er proteiner som kodes av ORF-2-genet av HEV og mer spesielt proteiner som kodes av ORF-2-genet av SAR-55-stammen av HEV. De foretrukne proteiner ifølge oppfinnelsen, kodet av ORF-2-gen, danner viruslignende partikler. Aminosyresekvensene for ORF-1-, ORF-2- og ORF-3-proteinene er vist nedenfor som SEQ ID No. 1, SEQ JD No. 2, og SEQ ID No. 3:
Claims (3)
1.
Fremgangsmåte for å fremstille et immunogent hepatittprotein karakterisert v e d at den omfatter: dyrking av en verstcelle transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor, der ekspresjonsvektoren omfatter DNA, der nevnte DNA har en sekvens som består av nukleotidene som koder for aminosyrene 112 til 660 av et hepatitt E virus åpen leseramme 2 protein, ved betingelser som er hensiktsmessig for å frembringe produksjon av et 55 kD protein ved avspalting av COOH-terminalen.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at DNA sekvensen består av: d) nukleotidene 5480 til 7126 ifølge SEQ ID NO: 4, e) en DNA sekvens some er degenerert som et resultat av den genetiske kode for sekvensen under (a), eller f) en DNA sekvens ifølge (a) eller (b) der en eller flere rester av det resulterende protein er substituert med en biologisk ekvivalent rest.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at ekspresjonsvektoren er en baculovirus ekspresjonsvektor og vertscellen er en insektsvertscelle.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/316,765 US6706873B1 (en) | 1992-09-18 | 1994-10-03 | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
PCT/US1995/013102 WO1996010580A2 (en) | 1994-10-03 | 1995-10-03 | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis e and their use in diagnostic methods and vaccines |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO971529D0 NO971529D0 (no) | 1997-04-03 |
NO971529L NO971529L (no) | 1997-05-26 |
NO326399B1 true NO326399B1 (no) | 2008-11-24 |
Family
ID=23230582
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19971529A NO326399B1 (no) | 1994-10-03 | 1997-04-03 | Fremgangsmate for a fremstille et immunogent hapatittprotein |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0784631B1 (no) |
JP (1) | JP3889808B2 (no) |
KR (1) | KR100359526B1 (no) |
CN (1) | CN1148450C (no) |
AT (1) | ATE518879T1 (no) |
AU (1) | AU712901B2 (no) |
NO (1) | NO326399B1 (no) |
NZ (1) | NZ295056A (no) |
WO (1) | WO1996010580A2 (no) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6054567A (en) * | 1997-04-11 | 2000-04-25 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
WO1999004029A2 (en) * | 1997-07-18 | 1999-01-28 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | A swine hepatitis e virus and uses thereof |
US6458562B1 (en) | 1998-04-09 | 2002-10-01 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Health And Human Services | Recombinant proteins of a Pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines |
AU4451601A (en) * | 2000-02-07 | 2001-08-14 | All India Institute Of Medical Sciences | Genetically engineered clone of hepatitis e virus (hev) genome which is infectious, its production and uses |
CN1345775A (zh) * | 2000-09-30 | 2002-04-24 | 养生堂有限公司 | 用于预防、诊断及治疗戊型肝炎病毒的多肽,及它们作为诊断试剂和疫苗 |
CN100441684C (zh) * | 2001-06-25 | 2008-12-10 | 株式会社东芝 | 日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探针和引物,检测芯片、试剂盒,以及检测方法 |
CN100446813C (zh) * | 2005-06-24 | 2008-12-31 | 东南大学 | 甲型肝炎-戊型肝炎联合疫苗及其制备方法 |
CN112225783B (zh) * | 2020-09-16 | 2021-08-31 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | Hcv重组抗原及其突变体 |
CN114957411B (zh) * | 2022-05-25 | 2023-08-18 | 徐州医科大学 | 一种正戊型肝病毒属基因c1型病毒orf2重组蛋白及其制备方法和应用 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2336282T3 (es) * | 1992-09-18 | 2010-04-09 | The Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Proteinas recombinantes de una cepa paquistani de hepatitis e y su utilizacion en metodos de diagnostico y vacunas. |
CA2179609A1 (en) * | 1993-12-22 | 1995-06-29 | Deborah A. Paul | Monoclonal antibodies against hev orf-2 and methods for using same |
-
1995
- 1995-10-03 AU AU38309/95A patent/AU712901B2/en not_active Ceased
- 1995-10-03 AT AT95936312T patent/ATE518879T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-10-03 KR KR1019970702198A patent/KR100359526B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-10-03 JP JP51217096A patent/JP3889808B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-03 EP EP95936312A patent/EP0784631B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-10-03 WO PCT/US1995/013102 patent/WO1996010580A2/en not_active Application Discontinuation
- 1995-10-03 NZ NZ295056A patent/NZ295056A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-10-03 CN CNB951965484A patent/CN1148450C/zh not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-04-03 NO NO19971529A patent/NO326399B1/no not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR100359526B1 (ko) | 2003-02-25 |
KR970706300A (ko) | 1997-11-03 |
WO1996010580A3 (en) | 1996-05-23 |
CN1148450C (zh) | 2004-05-05 |
JP3889808B2 (ja) | 2007-03-07 |
CN1168698A (zh) | 1997-12-24 |
JPH11500001A (ja) | 1999-01-06 |
EP0784631A1 (en) | 1997-07-23 |
EP0784631B1 (en) | 2011-08-03 |
AU712901B2 (en) | 1999-11-18 |
NO971529L (no) | 1997-05-26 |
WO1996010580A2 (en) | 1996-04-11 |
ATE518879T1 (de) | 2011-08-15 |
NO971529D0 (no) | 1997-04-03 |
NZ295056A (en) | 1999-06-29 |
AU3830995A (en) | 1996-04-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP2006149393A (ja) | E型肝炎パキスタン株の組換えタンパク質ならびに診断法およびワクチンにおけるそれらの利用 | |
JP5829830B2 (ja) | E型肝炎ウイルスのポリペプチド断片、それを含むワクチン組成物及び診断キット、並びにその使用 | |
EP0784631B1 (en) | Method of producing a partial orf2 protein of hepatitis e virus | |
EP0972048B1 (en) | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis e and their use in diagnostic methods and vaccines | |
CA2147622A1 (en) | Methods and compositions for detecting anti-hepatitis e virus activity | |
US6458562B1 (en) | Recombinant proteins of a Pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines | |
WO2002089733A2 (en) | Recombinant orf2 proteins of the swine hepatitis e virus and their use as a vaccine and as a diagnostic reagent for medical and veterinary applications | |
US6207416B1 (en) | Recombinant proteins of a Pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines | |
US7070790B1 (en) | Nucleotide and deduced amino acid sequences of the envelope 1 and core genes of isolates of hepatitis C virus and the use of reagents derived from these sequences in diagnostic methods and vaccines | |
US6787145B1 (en) | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines | |
AU689447C (en) | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines | |
AU2010212374A1 (en) | Recombinant proteins of a Pakistani strain of hepatitis E and their use in diagnostic methods and vaccines | |
CA2201588A1 (en) | Recombinant proteins of a pakistani strain of hepatitis e and their use in diagnostic methods and vaccines |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |