NO321029B1 - Ny fremgangsmate for a fremskaffe overflatemodifikasjon samt overflatemodifisert substrat. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å fremskaffe overflatemodifikasjon samt overflatemodifisert substrat.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Når overflaten til et medisinsk apparat som for eksempel et kateter, en blodoksygenator, stent eller lignende plasseres i kroppen eller i kontakt med kroppsvæsker, settes det i gang en rekke ulike reaksjoner, og noen av disse fører til koagulering av blodet på apparatets overflate. For å motvirke denne alvorlige negative virkningen har man i dag i lang tid gitt pasienter systemisk den velkjente koagulerende sammensetningen heparin før medisinske apparater blir ført inn i kroppen deres eller kommer i kontakt med deres kroppsvæsker. På denne måten sikres en antitrombotisk virkning.

Systemisk behandling med høye doser heparin er imidlertid ofte forbundet med alvorlige bivirkninger, og blødning er den viktigste av disse. En annen sjelden men alvorlig komplikasjon av heparinterapi er utviklingen av en allergisk reaksjon som kalles heparinindusert trombocytopeni, som både kan føre til blødning og artehell trombose. Heparinbehandling krever også hyppig overvåking av plasmanivåer og påfølgende dosejusteringer. Heparin reversering med protamin er en annen komplikasjon.

Man har derfor lett etter løsninger der behovet for systemisk heparinisering av pasienten vil være unødvendig. Man har holdt det for sannsynlig at dette kunne oppnås ved hjelp av en overflatemodifikasjon der man bruker heparinets antikoagulerende egenskaper. Derfor har det vært utviklet ulike teknologier der et sjikt med heparin festes til overflaten på det medisinske apparatet for å gjøre overflaten ikke-trombogen. Heparin er en polysakkaridsammensetning med negativt ladete sulfatgrupper på sakkaridenhetene. lonebinding av heparin til polykationiske overflater ble derfor forsøkt, men disse overflatemodifikasjonene hadde for lav stabilitet som ga manglende funksjon fordi heparin lekket fra overflaten.

Senere er ulike overflatemodifikasjoner blitt fremstilt der heparinet er blitt kovalent bundet til grupper på overflaten.

Teknikkens stand

En av de mest vellykkete prosesser for å gjøre et medisinsk apparat ikke-trombogent er oppnådd ved å binde et heparinfragment kovalent til en modifisert overflate på det medisinske apparatet. Den generelle metoden og forbedringene av den er beskrevet i følgende europeiske patenter: EP-B-0086186, EP-B-0086187 og EP-B-0495820.

Disse patentene beskriver fremstilling av overflatemodifiserende substrater som fås først ved en selektiv spalting av heparin polysakkaridkjeden, mens aldehydgrupper tilføres ved oksidasjon med salpetersyrling. For det andre tilføres det en eller flere overflatemodifiserende sjikt med aminogrupper på overflaten av det medisinske apparatet. Deretter reageres aldehydgruppene på polysakkaridkjeden med primære aminogrupper på overflatemodifiserende sjikt, fulgt av en reduksjon av de intermediære Schiffs basene til stabile sekundære aminobindinger med for eksempel cyanoborhydrid.

Denne teknologien har gjort det mulig å fremstille stabile og veldefinerte antitrombogene overflatemodifikasjoner for medisinsk utstyr.

Det finnes mange andre kjente overflatemodifikasjoner som hevder å oppnå lignende - eller til og med bedre resultater, slik det for eksempel beskrives i EP-A-0200295 (US 4,600,652. US 6,642,242.). Disse er basert på substrater med et sjikt av polyuretan urea, og heparin som er modifisert for å inneholde aldehydgrupper ved oksidasjon med salpetersyrling eller periodat, kan bindes med kovelente bindinger.

En lignende teknologi er beskrevet i EP-A-0404515, der substratoverflaten belegges med aminrik fluorinert polyuretan urea før immobilisering av et antitrombogent middel, som et aldehyd-aktivert heparin.

En annen antitrombogen overflatemodifisering som kan nevnes, er beskrevet i EP-B-0309473. Overflaten til apparatet modifiseres ved å belegge den med et sjikt av lysozym eller et derivat av dette, som heparin festes til.

Ytterligere en overflatemodifisering for å fremstille antitrombogene gjenstander er beskrevete i US 4,326,532. I dette tilfellet omfatter den sjiktdelte antitrombogene overflaten et polymerisk substrat, et chitosan bundet til det polymeriske substrat og et antitrombogent middel bundet til chitosanbelegget. JP-04-92673 vedrører et antitrombogent hemofilter som også bruker et chitosansjikt for å binde heparin.

I EP-A-0481160 beskrives antitrombogene materialer som egner seg for å belegge gjenstander for medisinsk bruk, der materialet omfatter en antikoagulerende binding til prosessert kollagen.

En annen prosess for å fremstille antitrombogene overflater er beskrevet i WO97/07843 der heparinet blandes med tilstrekkelig periodat for å ikke reagere med flere enn to sukkerenheter pr. heparin molekyl og denne blandingen tilsettes et overflatemodrfisert substrat på et medisinsk apparat der overflatemodrfikasjonen inneholder aminogrupper.

Listen over kjente fremgangsmåter for å fremstille antitrombogene overflater er slett ikke fullstendig. Den gir en klar indikasjon på at det er vanskelig å fremstille slike belagte medisinske gjenstander med de egenskapene som trengs for vellykket bruk i pasienter. Slike egenskaper er tilstrekkelig sterk og langvarig antitrombogen virkning, beleggets stabilitet og ingen negativ endring av egenskaper hos substratet som belegges.

Derfor er det ennå behov for forbedringer av de allerede kjente fremgangsmåtene for antitrombogene belegg, slik at medisinske gjenstander som belegges med disse blir ikke-trombogene på en stabil, pålitelig og reproduserbar måte og med en sterk og vedvarende antitrombogen virkning.

Definisjon av oppfinnelsen

Et hovedformål med den foreliggende oppfinnelsen er å forbedre den antitrombogene virkningen av overflateimmobilisert heparin. Dette og andre formål med oppfinnelsen oppnås som definert i de vedlagte kravene.

Man har nå overraskende oppdaget at det er mulig å forbedre ytterligere den antitrombogene virkningen til slike overflatemodifikasjoner med en enkel og billig fremgangsmåte. Forbedringen kan måles som en høyere heparin bioaktivitet på overflaten.

Trombin er en av flere koaguleringsfaktorer, som alle virker sammen slik at det dannes en trombe på en ikke-selv overflate i kontakt med blodet. Antitrombin er den viktigste koaguleringsinhibitoren. Den nøytraliserer virkningen av trombin og andre koaguleringsfaktorer og begrenser dermed koagulering av blodet. Heparin øker dramatisk hastigheten til antitrombinet når det inhiberer koaguleringsfaktorer.

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en prosess for å fremstille overflatemodifikasjoner med en forbedret antitrombogen virkning, der forbedringen oppnås ved å behandle heparin med langvarig oppvarming, ved høy pH, under trykk eller i kontakt med nukleofiler, som aminer (NH4AC) eller immobiliserte aminogrupper, før det nevnte heparinet festes til overflaten som skal modifiseres.

Oppfinnerne er klar over at en rekke overflatemodifikasjoner kan brukes som grunnlag for å fremstille slike forbedrete antitrombogene overflatemodifikasjoner, og det er meningen at disse skal omfattes av den foreliggende oppfinnelsen.

Som det vil fremgå av de omtalte kjente fremgangsmåtene, finnes det mange ulike metoder for å fremstille et overflatemodifisert sjikt med aktive grupper som et heparin kan bindes eller festes til. Heparinet som fremstilles i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og som har overlegne antitrombogene egenskaper, kan brukes sammen med enhver allerede kjent metode for å fremstille sjikt som heparin kan bindes til ved hjelp av kjente fremgangsmåter.

Prosessen i denne oppfinnelsen kan beskrives mer generelt ved at den innbefatter ulike kjente metoder for å behandle overflaten slik at man danner tilgjengelige grupper som kan feste heparin til denne overflaten, fortrinnsvis med kovalente bindinger. Heparinet som brukes her kan eventuelt behandles for å inneholde for eksempel aldehyd, karboksylsyre eller aminogrupper.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for å fremskaffe en overflatemodifikasjon som har en forbedret ikke-trombogen aktivitet, omfattende minst følgende trinn:

reagering av:

a) funksjonelle grupper på en overflate som skal bli gjort ikke-trombogen, med b) heparin, modifisert til å inneholde komplementære funksjonelle grupper, for å danne kovalente bindinger, kjennetegnet ved aktivering av nevnte heparin for å forsterke dets aktivitet når det er overflatebundet, i et trinn før reagering av a) med b) gjennom en prosedyre valgt fra følgende gruppe av prosedyrer: (i) oppvarming i et område fra 40°C til koketemperaturen tit løsnings-midlet; (ii) behandling ved en forhøyet pH, dvs. i området pH 9-14;

(iii) behandling med minst en nukleofil katalysator.

De komplementære gruppene i trinn (b) ovenfor, skal relatere til de funksjonelle gruppene omtalt i trinn (a), slik at disse to gruppene skal være i stand til å danne bindinger, fortrinnsvis kovalente. Eksempler på grupper som danner kovalente bindinger, er amino og aldehydgrupper, og i dette tilfellet må reaksjonsskjemaet ovenfor følges av ett ekstra trinn for å stabilisere Schiff s basen som er blitt dannet.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte ifølge krav 2, som omfatter dannelse av et sjikt på overflaten ved: a) tilsetning av et sjikt av en polymer som omfatter aminogrupper på overflaten som skal modifiseres, b) eventuelt kryssbinde sjiktet i trinn a) med et bifunksjonelt kryssbinings-middel,

c) tilsetning av et sjikt av en anionisk polymer til sjiktet ifølge trinn b),

d) eventuell gjentagntng av trinnene a), b) og c) minst en gang,

e) fulgt av et siste trinn a), og

f) modifisering av heprain med salpetersyrling eller peroksydatoksydasjon for å omfatte aldehydgrupper,

kjennetegnet ved at

g) aktivering av aldehydinneholdende heparin i et ytterligere trinn for å forsterke dets aktivitet når overflatebundet, idet nevnte aktiveringstrinn g) er valgt fra følgende gruppe av prosedyren (i) oppvarming i området fra 40°C til koketemperaturen av løsnings-midlet; (ii) behandling ved en forhøyet pH, dvs. i området pH 9-14;

(iii) behandling med minst en nukleofil katalysator, og til slutt

h) reagering av sjiktet som er et resultat av trinn a) eller e) med ytterligere behandlet aldehydheparin fra trinn g).

Sjiktet i trinn (a) ovenfor kan dannes ved å bruke andre sammensetninger, eksempelvis polymeriske sammensetninger som polyuretanurea; polyamin, som polyetyleneimin, chitosan eller andre polysakkarider eller polymerer som inneholder reaktive funksjonelle grupper. Alternativt er det mulig å bruke andre sjikt av polymeriske sammensetninger, for eksempel to med motsatte ladninger, slik at man får et sjikt med en viss tykkelse og tekstur. I dette tilfellet må det endelige sjiktet har frie aktive grupper som kan reageres med de komplementære gruppene i heparinet. Polymerene kan eventuelt kryssbindes i de første sjiktene.

Ulike eksempler på fremgangsmåter der en overflate til et substrat kan modifiseres vil også fremgå av annen dokumentasjon av allerede kjente fremgangsmåter, og det vises til beskrivelsene og eksemplene i disse patentene og i andre publikasjoner for detaljerte arbeidsinstrukser for å fremstille slike overflatemodifikasjoner.

Substratene som mest sannsynlig vil dra fordel av heparin som er modifisert med prosessen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er medisinske apparater som oksygenatorer, blodfiltre og blodpumper, katetere og slanger og implantater, som stenter, vaskulære implantater og hjerteventiler.

Overflatene som behandles kan dermed være polymerer, glass, metall, naturlige fibermaterialer, keramisk- eller annet materiale som har de rette egenskapene for den tilsiktede bruken, slik fagmann på området er kjent med.

De overflatemodifiserte substratene som fremstilles i henhold til denne oppfinnelsen omfattes også av den foreliggende oppfinnelsen.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig et overflatemodifisert substrat, kjennetegnet ved at det er fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 2-7.

Fordeler

Med den foreliggende oppfinnelsen kan det oppnås følgende fordeler:

Forbedret ikke-trombogen virkning, og som følge av dette:

- kan det oppnås tilstrekkelig ikke-trombogenisitet med mindre mengder immobilisert heparin. Dette er spesielt viktig for materiale og apparater der det er vanskelig å immobilisere store mengder heparin. - kan det oppnås høyere ikke-trombogenisitet med den samme mengden immobilisert heparin. Dette er spesielt viktig på bruksområder med sterke trombogene stimuli for eksempel i situasjoner med svak bloldstrøm og på bruksområder som katetere og vaskulære implantater med trang lumen eller i tilfeller der pasienten ellers ville ha behov for ytterligere systemisk heparinisering.

Den foreliggende oppfinnelsen forklares nærmere i eksemplene nedenfor.

Eksempel 1

Heparin av farmakopoetisk kvalitet ble behandlet med salpetersyrling, vesentlig som beskrevet i EP B-0086186. Etter oksidering ble reaksjonsløsningen delt i fire deler (hver på 60 ml) som ble behandlet i henhold til ett av de følgende trinnene:

1. Nøytralisert med 4M NaOH til pH 7.

2. Justert til pH 2.5 med 2M HCI og holdt ved 40°C i 1 time, deretter nøytralisert med 4M NaOH til pH 7. 3. Justert til pH 10 med 4M NaOH og holdt i 1 time ved 40 °C. Deretter ble det nøytralisert til pH 7 med 4M HCI. 4. Nøytralisert med 4M NaOH til pH 7. Løsningen ble gjort 0.1 M i NH4AC og holdt ved 40 °C i 1 time. Løsningen ble deretter fordampet for å fjerne NH4AC. Destillasjonsresten ble løst i 60 ml vann og pH justert til 7.

Heparinpreparatene ble utsatt for prøving av antikoagulerende virkning (antitrombinmedierttrombininhibering):

Rør av polyetylen (2mm i.d.) ble heparinisert vesentlig i henhold til EP 0086186 og prøvet for binding av antitrombin.

Konklusjoner:

- Behandling av heparin oksidert med salpetersyrling i et alkalisk miljø ved pH 10 i henhold til den foreliggende oppfinnelsen fører til sterk økt (mer enn 3 ganger høyere) heparinaktivitet etter immobilisering på en overflate, sammenlignet med heparin oksidert med salpetersyrling behandlet ved pH 7 i henhold til de allerede kjente fremgangsmåtene. Virkningen av heparinet før immobilisering ble ikke påvirket. - Behandling av heparin oksidert med salpetersyrling med NH4AC fører til noe høyere virkning, mens behandling ved lav pH ikke har noen virkninger.

Eksempel 2

Heparin av farmakopoetisk kvalitet ble behandlet med salpetersyrling, vesentlig som beskrevet i EP B-0086186 og deretter nøytralisert til pH 7 med 4M NaOH og frysetørret.

Slanger av polyetylen ble heparinisert med løsninger av heparin oksidert med salpetersyrling som var blitt utsatt for en av de følgende behandlingene.

1. Ingen forbehandling.

2. Løst i vann og holdt ved 50 °C i 16 timer før bruk.

3. Løst i vann og sirkulert over en animert overflate (animert slange) ved 50 °C i 16 timer før bruk.

Heparinisering ble utført vesentlig som beskrevet i EP B-086186. Hepariniserte deler av slangene ble analysert for binding av antitrombin.

Konklusjon:

- I tillegg til virkningen som ble observert i Eksempel 1 fører behandling med heparin oksidert med salpetersyrling ved langvarig oppvarming eller ved kontakt med overflateimmobiliserte nukleofiler, som amino-grupper, til sterkt økt heparinaktivitet når heparinet immobiliseres på en overflate.

Eksempel 3

I dette Eksemplet vises det at oksidering av heparin med to ulike metoder som er velkjente for fagmann på området, begge fører til overraskende høy AT absorpsjon når det brukes et alkalibehandlet heparin.

PVC rør med en indre diameter på 3 med mer ble enten:

a) heparinisert med et heparin oksidert med salpetersyrling fremstilt i henhold til EP B-0086186 og ikke tilleggsbehandlet. b) heparinisert med et heparin oksidert med periodat fremstilt i henhold til EP B-086186 og deretter utsatt for alkalisk behandling (pH 10, ved 40 °C i 11), c) heparinisert med et heparin oksidert med periodat fremstilt i henhold til PCT WO97/07384 og ikke utsatt for viderebehandling, eller d) heparinisert med et heparin oksidert med periodat fremstilt i henhold til PCT WO97/07384 og deretter utsatt for alkalisk behandling (pH 10, ved 40 °C i 11).

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for å fremskaffe en overflatemodifikasjon som har en forbedret ikke-trombogen aktivitet, omfattende minst følgende trinn: reagering av: a) funksjonelle grupper på en overflate som skal bli gjort ikke-trombogen, med b) heparin, modifisert til å inneholde komplementære funksjonelle grupper, for å danne kovalente bindinger, karakterisert ved aktivering av nevnte heparin for å forsterke dets aktivitet når det er overflatebundet, i et trinn før reagering av a) med b) gjennom en prosedyre valgt fra følgende gruppe av prosedyrer: (i) oppvarming i et område fra 40°C til koketemperaturen til løsnings-midlet; (ii) behandling ved en forhøyet pH, dvs. i området pH 9-14; (iii) behandling med minst en nukleofil katalysator.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: behandling av overflaten som skal bli modifisert i ett eller flere trinn for å danne et lag omfattende funksjonelle grupper på overflaten.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pH er i området 9-11.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at pH er 10.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den nukleofile katalysatoren er en NH4AC.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den nukleofile katalysatoren inneholder immobiliserte aminogrupper.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 2, som omfatter dannelse av et sjikt på overflaten ved: a) tilsetning av et sjikt av en polymer som omfatter aminogrupper på overflaten som skal modifiseres, b) eventuelt kryssbinde sjiktet i trinn a) med et bifunksjonelt kryssbinings-middel, c) tilsetning av et sjikt av en anionisk polymer til sjiktet ifølge trinn b), d) eventuell gjentagning av trinnene a), b) og c) minst en gang, e) fulgt av et siste trinn a), og f) modifisering av heprain med salpetersyrling eller peroksydatoksydasjon for å omfatte aldehydgrupper, karakterisert ved at g) aktivering av aldehydinneholdende heparin i et ytterligere trinn for å forsterke dets aktivitet når overflatebundet, idet nevnte aktiveringstrinn g) er valgt fra følgende gruppe av prosedyrer: (i) oppvarming i området fra 40°C til koketemperaturen av løsnings-midlet; (ii) behandling ved en forhøyet pH, dvs. i området pH 9-14; (iii) behandling med minst en nukleofil katalysator, og til slutt h) reagering av sjiktet som er et resultat av trinn a) eller e) med ytterligere behandlet aldehydheparin fra trinn g).

8. Overflatemodifisert substrat, karakterisert ved at det er fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 2-7.