NO321029B1

NO321029B1 - New method for obtaining surface modification as well as surface modified substrate.

Info

Publication number: NO321029B1
Application number: NO20011182A
Authority: NO
Inventors: Elisabeth Scholander
Original assignee: Carmeda Ab
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2006-02-27
Also published as: NO20011182D0; NO20011182L

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for å fremskaffe overflatemodifikasjon samt overflatemodifisert substrat. The present invention relates to a method for producing surface modification and surface modified substrate.

Bakgrunn for oppfinnelsen Background for the invention

Når overflaten til et medisinsk apparat som for eksempel et kateter, en blodoksygenator, stent eller lignende plasseres i kroppen eller i kontakt med kroppsvæsker, settes det i gang en rekke ulike reaksjoner, og noen av disse fører til koagulering av blodet på apparatets overflate. For å motvirke denne alvorlige negative virkningen har man i dag i lang tid gitt pasienter systemisk den velkjente koagulerende sammensetningen heparin før medisinske apparater blir ført inn i kroppen deres eller kommer i kontakt med deres kroppsvæsker. På denne måten sikres en antitrombotisk virkning. When the surface of a medical device such as a catheter, a blood oxygenator, stent or the like is placed in the body or in contact with body fluids, a number of different reactions are initiated, some of which lead to coagulation of the blood on the surface of the device. In order to counteract this serious adverse effect, the well-known coagulating compound heparin has been given to patients systemically for a long time before medical devices are introduced into their bodies or come into contact with their body fluids. In this way, an antithrombotic effect is ensured.

Systemisk behandling med høye doser heparin er imidlertid ofte forbundet med alvorlige bivirkninger, og blødning er den viktigste av disse. En annen sjelden men alvorlig komplikasjon av heparinterapi er utviklingen av en allergisk reaksjon som kalles heparinindusert trombocytopeni, som både kan føre til blødning og artehell trombose. Heparinbehandling krever også hyppig overvåking av plasmanivåer og påfølgende dosejusteringer. Heparin reversering med protamin er en annen komplikasjon. However, systemic treatment with high doses of heparin is often associated with serious side effects, the most important of which is bleeding. Another rare but serious complication of heparin therapy is the development of an allergic reaction called heparin-induced thrombocytopenia, which can lead to both bleeding and arterhell thrombosis. Heparin treatment also requires frequent monitoring of plasma levels and subsequent dose adjustments. Heparin reversal with protamine is another complication.

Man har derfor lett etter løsninger der behovet for systemisk heparinisering av pasienten vil være unødvendig. Man har holdt det for sannsynlig at dette kunne oppnås ved hjelp av en overflatemodifikasjon der man bruker heparinets antikoagulerende egenskaper. Derfor har det vært utviklet ulike teknologier der et sjikt med heparin festes til overflaten på det medisinske apparatet for å gjøre overflaten ikke-trombogen. Heparin er en polysakkaridsammensetning med negativt ladete sulfatgrupper på sakkaridenhetene. lonebinding av heparin til polykationiske overflater ble derfor forsøkt, men disse overflatemodifikasjonene hadde for lav stabilitet som ga manglende funksjon fordi heparin lekket fra overflaten. Solutions have therefore been sought where the need for systemic heparinisation of the patient will be unnecessary. It has been considered likely that this could be achieved by means of a surface modification where the anticoagulant properties of heparin are used. Therefore, various technologies have been developed in which a layer of heparin is attached to the surface of the medical device to make the surface non-thrombogenic. Heparin is a polysaccharide composition with negatively charged sulfate groups on the saccharide units. ionic binding of heparin to polycationic surfaces was therefore attempted, but these surface modifications had too low stability which resulted in a lack of function because heparin leaked from the surface.

Senere er ulike overflatemodifikasjoner blitt fremstilt der heparinet er blitt kovalent bundet til grupper på overflaten. Later, various surface modifications have been produced where the heparin has been covalently bound to groups on the surface.

Teknikkens stand State of the art

En av de mest vellykkete prosesser for å gjøre et medisinsk apparat ikke-trombogent er oppnådd ved å binde et heparinfragment kovalent til en modifisert overflate på det medisinske apparatet. Den generelle metoden og forbedringene av den er beskrevet i følgende europeiske patenter: EP-B-0086186, EP-B-0086187 og EP-B-0495820. One of the most successful processes for rendering a medical device non-thrombogenic has been achieved by covalently binding a heparin fragment to a modified surface of the medical device. The general method and its improvements are described in the following European patents: EP-B-0086186, EP-B-0086187 and EP-B-0495820.

Disse patentene beskriver fremstilling av overflatemodifiserende substrater som fås først ved en selektiv spalting av heparin polysakkaridkjeden, mens aldehydgrupper tilføres ved oksidasjon med salpetersyrling. For det andre tilføres det en eller flere overflatemodifiserende sjikt med aminogrupper på overflaten av det medisinske apparatet. Deretter reageres aldehydgruppene på polysakkaridkjeden med primære aminogrupper på overflatemodifiserende sjikt, fulgt av en reduksjon av de intermediære Schiffs basene til stabile sekundære aminobindinger med for eksempel cyanoborhydrid. These patents describe the production of surface-modifying substrates that are first obtained by selective cleavage of the heparin polysaccharide chain, while aldehyde groups are added by oxidation with nitric acid. Secondly, one or more surface-modifying layers with amino groups are added to the surface of the medical device. The aldehyde groups on the polysaccharide chain are then reacted with primary amino groups on the surface modifying layer, followed by a reduction of the intermediate Schiff's bases to stable secondary amino bonds with, for example, cyanoborohydride.

Denne teknologien har gjort det mulig å fremstille stabile og veldefinerte antitrombogene overflatemodifikasjoner for medisinsk utstyr. This technology has made it possible to produce stable and well-defined antithrombogenic surface modifications for medical devices.

Det finnes mange andre kjente overflatemodifikasjoner som hevder å oppnå lignende - eller til og med bedre resultater, slik det for eksempel beskrives i EP-A-0200295 (US 4,600,652. US 6,642,242.). Disse er basert på substrater med et sjikt av polyuretan urea, og heparin som er modifisert for å inneholde aldehydgrupper ved oksidasjon med salpetersyrling eller periodat, kan bindes med kovelente bindinger. There are many other known surface modifications that claim to achieve similar - or even better - results, as described for example in EP-A-0200295 (US 4,600,652. US 6,642,242.). These are based on substrates with a layer of polyurethane urea, and heparin, which has been modified to contain aldehyde groups by oxidation with nitric acid or periodate, can be bound with covalent bonds.

En lignende teknologi er beskrevet i EP-A-0404515, der substratoverflaten belegges med aminrik fluorinert polyuretan urea før immobilisering av et antitrombogent middel, som et aldehyd-aktivert heparin. A similar technology is described in EP-A-0404515, where the substrate surface is coated with amine-rich fluorinated polyurethane urea prior to immobilization of an antithrombogenic agent, such as an aldehyde-activated heparin.

En annen antitrombogen overflatemodifisering som kan nevnes, er beskrevet i EP-B-0309473. Overflaten til apparatet modifiseres ved å belegge den med et sjikt av lysozym eller et derivat av dette, som heparin festes til. Another antithrombogenic surface modification that may be mentioned is described in EP-B-0309473. The surface of the device is modified by coating it with a layer of lysozyme or a derivative thereof, to which heparin attaches.

Ytterligere en overflatemodifisering for å fremstille antitrombogene gjenstander er beskrevete i US 4,326,532. I dette tilfellet omfatter den sjiktdelte antitrombogene overflaten et polymerisk substrat, et chitosan bundet til det polymeriske substrat og et antitrombogent middel bundet til chitosanbelegget. JP-04-92673 vedrører et antitrombogent hemofilter som også bruker et chitosansjikt for å binde heparin. Another surface modification to produce antithrombogenic articles is described in US 4,326,532. In this case, the layered antithrombogenic surface comprises a polymeric substrate, a chitosan bound to the polymeric substrate and an antithrombogenic agent bound to the chitosan coating. JP-04-92673 relates to an antithrombogenic hemofilter which also uses a chitosan layer to bind heparin.

I EP-A-0481160 beskrives antitrombogene materialer som egner seg for å belegge gjenstander for medisinsk bruk, der materialet omfatter en antikoagulerende binding til prosessert kollagen. EP-A-0481160 describes antithrombogenic materials which are suitable for coating objects for medical use, where the material comprises an anticoagulant bond to processed collagen.

En annen prosess for å fremstille antitrombogene overflater er beskrevet i WO97/07843 der heparinet blandes med tilstrekkelig periodat for å ikke reagere med flere enn to sukkerenheter pr. heparin molekyl og denne blandingen tilsettes et overflatemodrfisert substrat på et medisinsk apparat der overflatemodrfikasjonen inneholder aminogrupper. Another process for producing antithrombogenic surfaces is described in WO97/07843 where the heparin is mixed with sufficient periodate not to react with more than two sugar units per heparin molecule and this mixture is added to a surface modified substrate on a medical device where the surface modification contains amino groups.

Listen over kjente fremgangsmåter for å fremstille antitrombogene overflater er slett ikke fullstendig. Den gir en klar indikasjon på at det er vanskelig å fremstille slike belagte medisinske gjenstander med de egenskapene som trengs for vellykket bruk i pasienter. Slike egenskaper er tilstrekkelig sterk og langvarig antitrombogen virkning, beleggets stabilitet og ingen negativ endring av egenskaper hos substratet som belegges. The list of known methods for producing antithrombogenic surfaces is by no means complete. It gives a clear indication that it is difficult to produce such coated medical objects with the properties needed for successful use in patients. Such properties are a sufficiently strong and long-lasting antithrombogenic effect, the stability of the coating and no negative change in the properties of the substrate being coated.

Derfor er det ennå behov for forbedringer av de allerede kjente fremgangsmåtene for antitrombogene belegg, slik at medisinske gjenstander som belegges med disse blir ikke-trombogene på en stabil, pålitelig og reproduserbar måte og med en sterk og vedvarende antitrombogen virkning. Therefore, there is still a need for improvements to the already known methods for antithrombogenic coatings, so that medical objects which are coated with these become non-thrombogenic in a stable, reliable and reproducible manner and with a strong and persistent antithrombogenic effect.

Definisjon av oppfinnelsen Definition of the invention

Et hovedformål med den foreliggende oppfinnelsen er å forbedre den antitrombogene virkningen av overflateimmobilisert heparin. Dette og andre formål med oppfinnelsen oppnås som definert i de vedlagte kravene. A main object of the present invention is to improve the antithrombogenic effect of surface immobilized heparin. This and other objects of the invention are achieved as defined in the attached claims.

Man har nå overraskende oppdaget at det er mulig å forbedre ytterligere den antitrombogene virkningen til slike overflatemodifikasjoner med en enkel og billig fremgangsmåte. Forbedringen kan måles som en høyere heparin bioaktivitet på overflaten. It has now surprisingly been discovered that it is possible to further improve the antithrombogenic effect of such surface modifications with a simple and inexpensive method. The improvement can be measured as a higher heparin bioactivity on the surface.

Trombin er en av flere koaguleringsfaktorer, som alle virker sammen slik at det dannes en trombe på en ikke-selv overflate i kontakt med blodet. Antitrombin er den viktigste koaguleringsinhibitoren. Den nøytraliserer virkningen av trombin og andre koaguleringsfaktorer og begrenser dermed koagulering av blodet. Heparin øker dramatisk hastigheten til antitrombinet når det inhiberer koaguleringsfaktorer. Thrombin is one of several clotting factors, all of which work together to form a thrombus on a non-self surface in contact with the blood. Antithrombin is the most important coagulation inhibitor. It neutralizes the action of thrombin and other coagulation factors and thus limits coagulation of the blood. Heparin dramatically increases the rate of antithrombin when it inhibits clotting factors.

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en prosess for å fremstille overflatemodifikasjoner med en forbedret antitrombogen virkning, der forbedringen oppnås ved å behandle heparin med langvarig oppvarming, ved høy pH, under trykk eller i kontakt med nukleofiler, som aminer (NH4AC) eller immobiliserte aminogrupper, før det nevnte heparinet festes til overflaten som skal modifiseres. The present invention relates to a process for producing surface modifications with an improved antithrombogenic effect, where the improvement is achieved by treating heparin with prolonged heating, at high pH, under pressure or in contact with nucleophiles, such as amines (NH4AC) or immobilized amino groups, before said heparin is attached to the surface to be modified.

Oppfinnerne er klar over at en rekke overflatemodifikasjoner kan brukes som grunnlag for å fremstille slike forbedrete antitrombogene overflatemodifikasjoner, og det er meningen at disse skal omfattes av den foreliggende oppfinnelsen. The inventors are aware that a number of surface modifications can be used as a basis for producing such improved antithrombogenic surface modifications, and it is intended that these be encompassed by the present invention.

Som det vil fremgå av de omtalte kjente fremgangsmåtene, finnes det mange ulike metoder for å fremstille et overflatemodifisert sjikt med aktive grupper som et heparin kan bindes eller festes til. Heparinet som fremstilles i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, og som har overlegne antitrombogene egenskaper, kan brukes sammen med enhver allerede kjent metode for å fremstille sjikt som heparin kan bindes til ved hjelp av kjente fremgangsmåter. As will be apparent from the known methods discussed, there are many different methods for producing a surface-modified layer with active groups to which a heparin can be bound or attached. The heparin produced according to the present invention, which has superior antithrombogenic properties, can be used together with any already known method to produce layers to which heparin can be bound by means of known methods.

Prosessen i denne oppfinnelsen kan beskrives mer generelt ved at den innbefatter ulike kjente metoder for å behandle overflaten slik at man danner tilgjengelige grupper som kan feste heparin til denne overflaten, fortrinnsvis med kovalente bindinger. Heparinet som brukes her kan eventuelt behandles for å inneholde for eksempel aldehyd, karboksylsyre eller aminogrupper. The process in this invention can be described more generally in that it includes various known methods for treating the surface so that accessible groups are formed which can attach heparin to this surface, preferably with covalent bonds. The heparin used here can optionally be treated to contain, for example, aldehyde, carboxylic acid or amino groups.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en fremgangsmåte for å fremskaffe en overflatemodifikasjon som har en forbedret ikke-trombogen aktivitet, omfattende minst følgende trinn: The present invention therefore relates to a method for producing a surface modification which has an improved non-thrombogenic activity, comprising at least the following steps:

reagering av: reaction of:

a) funksjonelle grupper på en overflate som skal bli gjort ikke-trombogen, med b) heparin, modifisert til å inneholde komplementære funksjonelle grupper, for å danne kovalente bindinger, kjennetegnet ved aktivering av nevnte heparin for å forsterke dets aktivitet når det er overflatebundet, i et trinn før reagering av a) med b) gjennom en prosedyre valgt fra følgende gruppe av prosedyrer: (i) oppvarming i et område fra 40°C til koketemperaturen tit løsnings-midlet; (ii) behandling ved en forhøyet pH, dvs. i området pH 9-14; a) functional groups on a surface to be rendered non-thrombogenic, with b) heparin, modified to contain complementary functional groups, to form covalent bonds, characterized by activating said heparin to enhance its activity when surface-bound, in a step prior to reacting a) with b) through a procedure selected from the following group of procedures: (i) heating in a range from 40°C to the boiling temperature often the solvent; (ii) treatment at an elevated pH, i.e. in the range of pH 9-14;

(iii) behandling med minst en nukleofil katalysator. (iii) treatment with at least one nucleophilic catalyst.

De komplementære gruppene i trinn (b) ovenfor, skal relatere til de funksjonelle gruppene omtalt i trinn (a), slik at disse to gruppene skal være i stand til å danne bindinger, fortrinnsvis kovalente. Eksempler på grupper som danner kovalente bindinger, er amino og aldehydgrupper, og i dette tilfellet må reaksjonsskjemaet ovenfor følges av ett ekstra trinn for å stabilisere Schiff s basen som er blitt dannet. The complementary groups in step (b) above must relate to the functional groups discussed in step (a), so that these two groups must be able to form bonds, preferably covalent. Examples of groups that form covalent bonds are amino and aldehyde groups, and in this case the above reaction scheme must be followed by an additional step to stabilize the Schiff's base that has been formed.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre en fremgangsmåte ifølge krav 2, som omfatter dannelse av et sjikt på overflaten ved: a) tilsetning av et sjikt av en polymer som omfatter aminogrupper på overflaten som skal modifiseres, b) eventuelt kryssbinde sjiktet i trinn a) med et bifunksjonelt kryssbinings-middel, The present invention further relates to a method according to claim 2, which comprises the formation of a layer on the surface by: a) adding a layer of a polymer comprising amino groups on the surface to be modified, b) possibly cross-linking the layer in step a) with a bifunctional cross-linking agent,

c) tilsetning av et sjikt av en anionisk polymer til sjiktet ifølge trinn b), c) adding a layer of an anionic polymer to the layer according to step b),

d) eventuell gjentagntng av trinnene a), b) og c) minst en gang, d) possible repetition of steps a), b) and c) at least once,

e) fulgt av et siste trinn a), og e) followed by a final step a), and

f) modifisering av heprain med salpetersyrling eller peroksydatoksydasjon for å omfatte aldehydgrupper, f) modification of heprain by nitric acidification or peroxide oxidation to include aldehyde groups,

kjennetegnet ved at characterized by that

g) aktivering av aldehydinneholdende heparin i et ytterligere trinn for å forsterke dets aktivitet når overflatebundet, idet nevnte aktiveringstrinn g) er valgt fra følgende gruppe av prosedyren (i) oppvarming i området fra 40°C til koketemperaturen av løsnings-midlet; (ii) behandling ved en forhøyet pH, dvs. i området pH 9-14; g) activating the aldehyde-containing heparin in a further step to enhance its activity when surface-bound; said activation step g) being selected from the following group of the procedure (i) heating in the range from 40°C to the boiling temperature of the solvent; (ii) treatment at an elevated pH, i.e. in the range of pH 9-14;

(iii) behandling med minst en nukleofil katalysator, og til slutt (iii) treatment with at least one nucleophilic catalyst, and finally

h) reagering av sjiktet som er et resultat av trinn a) eller e) med ytterligere behandlet aldehydheparin fra trinn g). h) reacting the layer resulting from step a) or e) with further treated aldehyde heparin from step g).

Sjiktet i trinn (a) ovenfor kan dannes ved å bruke andre sammensetninger, eksempelvis polymeriske sammensetninger som polyuretanurea; polyamin, som polyetyleneimin, chitosan eller andre polysakkarider eller polymerer som inneholder reaktive funksjonelle grupper. Alternativt er det mulig å bruke andre sjikt av polymeriske sammensetninger, for eksempel to med motsatte ladninger, slik at man får et sjikt med en viss tykkelse og tekstur. I dette tilfellet må det endelige sjiktet har frie aktive grupper som kan reageres med de komplementære gruppene i heparinet. Polymerene kan eventuelt kryssbindes i de første sjiktene. The layer in step (a) above can be formed by using other compositions, for example polymeric compositions such as polyurethane urea; polyamine, such as polyethyleneimine, chitosan or other polysaccharides or polymers containing reactive functional groups. Alternatively, it is possible to use other layers of polymeric compositions, for example two with opposite charges, so that a layer with a certain thickness and texture is obtained. In this case, the final layer must have free active groups that can react with the complementary groups in the heparin. The polymers can optionally be cross-linked in the first layers.

Ulike eksempler på fremgangsmåter der en overflate til et substrat kan modifiseres vil også fremgå av annen dokumentasjon av allerede kjente fremgangsmåter, og det vises til beskrivelsene og eksemplene i disse patentene og i andre publikasjoner for detaljerte arbeidsinstrukser for å fremstille slike overflatemodifikasjoner. Various examples of methods in which a surface of a substrate can be modified will also appear from other documentation of already known methods, and reference is made to the descriptions and examples in these patents and in other publications for detailed work instructions for producing such surface modifications.

Substratene som mest sannsynlig vil dra fordel av heparin som er modifisert med prosessen i henhold til den foreliggende oppfinnelsen, er medisinske apparater som oksygenatorer, blodfiltre og blodpumper, katetere og slanger og implantater, som stenter, vaskulære implantater og hjerteventiler. The substrates most likely to benefit from heparin modified by the process of the present invention are medical devices such as oxygenators, blood filters and blood pumps, catheters and tubing, and implants, such as stents, vascular implants and heart valves.

Overflatene som behandles kan dermed være polymerer, glass, metall, naturlige fibermaterialer, keramisk- eller annet materiale som har de rette egenskapene for den tilsiktede bruken, slik fagmann på området er kjent med. The surfaces that are treated can thus be polymers, glass, metal, natural fiber materials, ceramic or other material that has the right properties for the intended use, as a person skilled in the field is familiar with.

De overflatemodifiserte substratene som fremstilles i henhold til denne oppfinnelsen omfattes også av den foreliggende oppfinnelsen. The surface-modified substrates produced according to this invention are also covered by the present invention.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig et overflatemodifisert substrat, kjennetegnet ved at det er fremstilt ifølge et hvilket som helst av kravene 2-7. The present invention therefore relates to a surface-modified substrate, characterized in that it is produced according to any one of claims 2-7.

Fordeler Benefits

Med den foreliggende oppfinnelsen kan det oppnås følgende fordeler: With the present invention, the following advantages can be achieved:

Forbedret ikke-trombogen virkning, og som følge av dette: Improved non-thrombogenic effect, and as a result:

- kan det oppnås tilstrekkelig ikke-trombogenisitet med mindre mengder immobilisert heparin. Dette er spesielt viktig for materiale og apparater der det er vanskelig å immobilisere store mengder heparin. - kan det oppnås høyere ikke-trombogenisitet med den samme mengden immobilisert heparin. Dette er spesielt viktig på bruksområder med sterke trombogene stimuli for eksempel i situasjoner med svak bloldstrøm og på bruksområder som katetere og vaskulære implantater med trang lumen eller i tilfeller der pasienten ellers ville ha behov for ytterligere systemisk heparinisering. - sufficient non-thrombogenicity can be achieved with smaller amounts of immobilized heparin. This is particularly important for materials and devices where it is difficult to immobilize large amounts of heparin. - higher non-thrombogenicity can be achieved with the same amount of immobilized heparin. This is particularly important in areas of use with strong thrombogenic stimuli, for example in situations with weak blood flow and in areas of use such as catheters and vascular implants with a narrow lumen or in cases where the patient would otherwise need additional systemic heparinisation.

Den foreliggende oppfinnelsen forklares nærmere i eksemplene nedenfor. The present invention is explained in more detail in the examples below.

Eksempel 1 Example 1

Heparin av farmakopoetisk kvalitet ble behandlet med salpetersyrling, vesentlig som beskrevet i EP B-0086186. Etter oksidering ble reaksjonsløsningen delt i fire deler (hver på 60 ml) som ble behandlet i henhold til ett av de følgende trinnene: Pharmacopoietic grade heparin was treated with nitric acid, essentially as described in EP B-0086186. After oxidation, the reaction solution was divided into four portions (each of 60 ml) which were treated according to one of the following steps:

1. Nøytralisert med 4M NaOH til pH 7. 1. Neutralized with 4M NaOH to pH 7.

2. Justert til pH 2.5 med 2M HCI og holdt ved 40°C i 1 time, deretter nøytralisert med 4M NaOH til pH 7. 3. Justert til pH 10 med 4M NaOH og holdt i 1 time ved 40 °C. Deretter ble det nøytralisert til pH 7 med 4M HCI. 4. Nøytralisert med 4M NaOH til pH 7. Løsningen ble gjort 0.1 M i NH4AC og holdt ved 40 °C i 1 time. Løsningen ble deretter fordampet for å fjerne NH4AC. Destillasjonsresten ble løst i 60 ml vann og pH justert til 7. 2. Adjusted to pH 2.5 with 2M HCI and held at 40°C for 1 hour, then neutralized with 4M NaOH to pH 7. 3. Adjusted to pH 10 with 4M NaOH and held for 1 hour at 40°C. It was then neutralized to pH 7 with 4M HCI. 4. Neutralized with 4M NaOH to pH 7. The solution was made 0.1 M in NH4AC and kept at 40 °C for 1 hour. The solution was then evaporated to remove NH4AC. The distillation residue was dissolved in 60 ml of water and the pH adjusted to 7.

Heparinpreparatene ble utsatt for prøving av antikoagulerende virkning (antitrombinmedierttrombininhibering): The heparin preparations were tested for anticoagulant effect (antithrombin-mediated thrombin inhibition):

Rør av polyetylen (2mm i.d.) ble heparinisert vesentlig i henhold til EP 0086186 og prøvet for binding av antitrombin. Polyethylene tubes (2 mm i.d.) were heparinized substantially according to EP 0086186 and tested for binding of antithrombin.

Konklusjoner: Conclusions:

- Behandling av heparin oksidert med salpetersyrling i et alkalisk miljø ved pH 10 i henhold til den foreliggende oppfinnelsen fører til sterk økt (mer enn 3 ganger høyere) heparinaktivitet etter immobilisering på en overflate, sammenlignet med heparin oksidert med salpetersyrling behandlet ved pH 7 i henhold til de allerede kjente fremgangsmåtene. Virkningen av heparinet før immobilisering ble ikke påvirket. - Behandling av heparin oksidert med salpetersyrling med NH4AC fører til noe høyere virkning, mens behandling ved lav pH ikke har noen virkninger. - Treatment of heparin oxidized with nitric acid in an alkaline environment at pH 10 according to the present invention leads to strongly increased (more than 3 times higher) heparin activity after immobilization on a surface, compared to heparin oxidized with nitric acid treated at pH 7 according to the already known methods. The effect of the heparin before immobilization was not affected. - Treatment of heparin oxidized with nitric acid with NH4AC leads to a somewhat higher effect, while treatment at low pH has no effect.

Eksempel 2 Example 2

Heparin av farmakopoetisk kvalitet ble behandlet med salpetersyrling, vesentlig som beskrevet i EP B-0086186 og deretter nøytralisert til pH 7 med 4M NaOH og frysetørret. Pharmacopoietic grade heparin was treated with nitric acid, essentially as described in EP B-0086186 and then neutralized to pH 7 with 4M NaOH and freeze-dried.

Slanger av polyetylen ble heparinisert med løsninger av heparin oksidert med salpetersyrling som var blitt utsatt for en av de følgende behandlingene. Polyethylene tubes were heparinized with solutions of heparin oxidized with nitric acid that had been subjected to one of the following treatments.

1. Ingen forbehandling. 1. No pretreatment.

2. Løst i vann og holdt ved 50 °C i 16 timer før bruk. 2. Dissolved in water and kept at 50 °C for 16 hours before use.

3. Løst i vann og sirkulert over en animert overflate (animert slange) ved 50 °C i 16 timer før bruk. 3. Dissolved in water and circulated over an animated surface (animated hose) at 50 °C for 16 hours before use.

Heparinisering ble utført vesentlig som beskrevet i EP B-086186. Hepariniserte deler av slangene ble analysert for binding av antitrombin. Heparinization was performed essentially as described in EP B-086186. Heparinized sections of the tubes were analyzed for binding of antithrombin.

Konklusjon: Conclusion:

- I tillegg til virkningen som ble observert i Eksempel 1 fører behandling med heparin oksidert med salpetersyrling ved langvarig oppvarming eller ved kontakt med overflateimmobiliserte nukleofiler, som amino-grupper, til sterkt økt heparinaktivitet når heparinet immobiliseres på en overflate. - In addition to the effect observed in Example 1, treatment with heparin oxidized with nitric acid by prolonged heating or by contact with surface-immobilized nucleophiles, such as amino groups, leads to greatly increased heparin activity when the heparin is immobilized on a surface.

Eksempel 3 Example 3

I dette Eksemplet vises det at oksidering av heparin med to ulike metoder som er velkjente for fagmann på området, begge fører til overraskende høy AT absorpsjon når det brukes et alkalibehandlet heparin. In this Example, it is shown that oxidation of heparin by two different methods, which are well known to those skilled in the art, both lead to surprisingly high AT absorption when an alkali-treated heparin is used.

PVC rør med en indre diameter på 3 med mer ble enten: PVC pipes with an inner diameter of 3 and more became either:

a) heparinisert med et heparin oksidert med salpetersyrling fremstilt i henhold til EP B-0086186 og ikke tilleggsbehandlet. b) heparinisert med et heparin oksidert med periodat fremstilt i henhold til EP B-086186 og deretter utsatt for alkalisk behandling (pH 10, ved 40 °C i 11), c) heparinisert med et heparin oksidert med periodat fremstilt i henhold til PCT WO97/07384 og ikke utsatt for viderebehandling, eller d) heparinisert med et heparin oksidert med periodat fremstilt i henhold til PCT WO97/07384 og deretter utsatt for alkalisk behandling (pH 10, ved 40 °C i 11). a) heparinized with a heparin oxidized with nitric acid prepared according to EP B-0086186 and not additionally treated. b) heparinized with a heparin oxidized with periodate prepared according to EP B-086186 and then subjected to alkaline treatment (pH 10, at 40 °C in 11), c) heparinized with a heparin oxidized with periodate prepared according to PCT WO97 /07384 and not subjected to further processing, or d) heparinized with a heparin oxidized with periodate prepared according to PCT WO97/07384 and then subjected to alkaline treatment (pH 10, at 40 °C in 11).

Claims

1. Process for obtaining a surface modification having an improved non-thrombogenic activity, comprising at least the following steps: reacting: a) functional groups on a surface to be rendered non-thrombogenic, with b) heparin, modified to contain complementary functional groups, to form covalent bonds, characterized by activating said heparin to enhance its activity when surface-bound, in a step prior to reacting a) with b) through a procedure selected from the following group of procedures: (i) heating in a range from 40°C to the boiling temperature to the solvent; (ii) treatment at an elevated pH, i.e. in the range of pH 9-14; (iii) treatment with at least one nucleophilic catalyst.

2. Method according to claim 1, characterized in that it comprises the following steps: treatment of the surface to be modified in one or more steps to form a layer comprising functional groups on the surface.

3. Method according to claim 1, characterized in that the pH is in the range 9-11.

4. Method according to claim 3, characterized in that the pH is 10.

5. Method according to claim 1, characterized in that the nucleophilic catalyst is an NH4AC.

6. Method according to claim 1, characterized in that the nucleophilic catalyst contains immobilized amino groups.

7. Method according to claim 2, which comprises forming a layer on the surface by: a) adding a layer of a polymer comprising amino groups on the surface to be modified, b) optionally cross-linking the layer in step a) with a bifunctional cross-linking agent , c) adding a layer of an anionic polymer to the layer according to step b), d) possibly repeating steps a), b) and c) at least once, e) followed by a final step a), and f) modification of heprain with nitric acidification or peroxide oxidation to include aldehyde groups, characterized in that g) activation of aldehyde-containing heparin in a further step to enhance its activity when surface-bound, said activation step g) being selected from the following group of procedures: (i) heating in the range from 40°C to the boiling temperature of the solvent; (ii) treatment at an elevated pH, i.e. in the range of pH 9-14; (iii) treatment with at least one nucleophilic catalyst, and finally h) reacting the layer resulting from step a) or e) with further treated aldehyde heparin from step g).

8. Surface-modified substrate, characterized in that it is produced according to any one of claims 2-7.