NO321372B1

NO321372B1 - Use of a composition comprising heparin for the preparation of a non-thrombogenic surface.

Info

Publication number: NO321372B1
Application number: NO20011181A
Authority: NO
Inventors: Erik Holmer
Original assignee: Carmeda Ab
Priority date: 1998-09-09
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2006-05-02
Also published as: NO20011181D0; NO20011181L

Abstract

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører en sammensetning som omfatter heparin til bruk som en ikke-trombogen overflate når den er i kontakt med arteriell blodstrøm. Den vedrører også et apparat hvis overflate er behandlet med en slik sammensetning.The present invention relates to a composition comprising heparin for use as a non-thrombogenic surface when in contact with arterial blood flow. It also relates to an apparatus whose surface has been treated with such a composition.

Description

Den foreliggende oppfinnelsen vedrører anvendelse av en sammensetning som omfatter heparin for fremstilling av en ikke-trombogen overflate. The present invention relates to the use of a composition comprising heparin for the production of a non-thrombogenic surface.

Bakgrunn for oppfinnelsen Background for the invention

Trombose er et stort helseproblem i den industrialiserte verden. Tromboserelaterte sykdommer forårsaker flere millioner dødsfall hvert år, og helsekostnadene for dem er beregnet til over 90 milliarder US dollar bare for USA. Thrombosis is a major health problem in the industrialized world. Thrombosis-related diseases cause several million deaths each year, and the health costs for them are estimated at over 90 billion US dollars for the United States alone.

Det finnes to ulike typer trombose, arteriell og venøs. Som navnet tilsier, dannes arteriell trombose i arteriene og venøs trombose i venene. Den arterielie tromben dannes ved sterk blodstrøm, og plater utgjør hovedkomponenten i denne. Plater er små celler med diameter på ca 2 um som sirkulerer i blodet. Deres viktigste funksjon er å bidra til hemostase. Når plater utsettes for kollagen eller endrete vegger i blodkar elter i sår, eller når de utsettes for fremmede overflater, fester de seg til overflatene og begynner å danne aggregater. Når dette inntreffer i en arterie, dannes det en trombe med aggregerte plater. Den arterielie tromben er også blitt kalt hvit trombe på grunn av sitt utseende som skyldes at den hovedsakelig inneholder plater og svært få erytocytter (røde blodlegemer).. There are two different types of thrombosis, arterial and venous. As the name suggests, arterial thrombosis forms in the arteries and venous thrombosis in the veins. The arterial thrombus is formed by strong blood flow, and plaques form the main component of this. Platelets are small cells with a diameter of about 2 µm that circulate in the blood. Their most important function is to contribute to hemostasis. When plaques are exposed to collagen or altered blood vessel walls knead in wounds, or when exposed to foreign surfaces, they attach to the surfaces and begin to form aggregates. When this occurs in an artery, a thrombus is formed with aggregated plaques. The arterial thrombus has also been called a white thrombus because of its appearance, which is due to the fact that it mainly contains platelets and very few erythrocytes (red blood cells).

Den venøse tromben dannes ved svak blodstrøm og blodkoaguleringen er hovedbestandelen i den. I plasma finnes det en rekke proenzymer og effektproteiner som til sammen danner koagulasjonssystemet. Systemet settes i gang på flere måter, og i en kaskadelignende prosess aktiverer ett enzym et prbenzym, og det nydannete enzymet aktiverer det neste proenzymet. Sluttenzymet som dannes er trombin som avspalter to peptider fra plasmaprotein fibrinogenet. Dette fører så til en hurtig aggregasjon av det modifiserte fibrinogenet slik at det dannes en gel, en fibrinklump eller en trombe. Den venøse tromben kalles den røde tromben fordi den inneholder erytocytter innkapslet i fibrin. The venous thrombus is formed by weak blood flow and blood coagulation is the main component in it. In plasma there are a number of proenzymes and effector proteins which together form the coagulation system. The system is set in motion in several ways, and in a cascade-like process, one enzyme activates a proenzyme, and the newly formed enzyme activates the next proenzyme. The final enzyme formed is thrombin, which cleaves two peptides from the plasma protein fibrinogen. This then leads to a rapid aggregation of the modified fibrinogen so that a gel, a fibrin clot or a thrombus is formed. The venous thrombus is called the red thrombus because it contains erythrocytes encased in fibrin.

Sykdommer relatert til arteriell trombose er: myokardisk infarkt, trombotisk slag og perifer arteriell lidelse. I myokardisk infarkt dannes det en trombe i en av kransarteriene, og blodtilførselen til den tilsvarende delen av hjertemuskelen stoppes eller reduseres kraftig, noe som fører til at denne delen av hjertemuskelen dør. I trombotisk slag blokkeres blodstrømmen i hjemearterien av en trombe som vanligvis er blitt dannet et annet sted i blodsirkulasjonen og har fulgt blodstrømmen til hjernen. Siden hjernen er svært følsom for oksygenmangel, vil den delen av hjernen som tilføres blod fra denne arterien bli skadet. Diseases related to arterial thrombosis are: myocardial infarction, thrombotic stroke and peripheral arterial disease. In myocardial infarction, a thrombus forms in one of the coronary arteries, and the blood supply to the corresponding part of the heart muscle is stopped or greatly reduced, which causes this part of the heart muscle to die. In thrombotic stroke, blood flow in the home artery is blocked by a thrombus that has usually formed elsewhere in the blood circulation and has followed the blood flow to the brain. Since the brain is very sensitive to lack of oxygen, the part of the brain supplied with blood from this artery will be damaged.

Myokardisk infarkt og trombotisk slag er svært alvorlige tilstander med høy dødelighet, og derfor anstrenger man seg i dag for å gi behandling som sikter mot å forebygge dem. Det mest brukte medikamentet er aspirin (acetylsalisyre), som inhiberer aktiveringen og aggregeringen av plater og dermed hindrer dannelsen av den arterielie tromben. Store kliniske studier har vist at en aspirin per dag kan redusere risikoen for myokardisk infarkt betydelig. For å forebygge trombotisk slag finnes det også et ånnet mye brukt medikament. Det er Ticlopedin som også inhiberer plateaggregasjon, men ved mekanismer som er noe ulike aspirin. Myocardial infarction and thrombotic stroke are very serious conditions with a high mortality rate, and therefore efforts are made today to provide treatment aimed at preventing them. The most commonly used drug is aspirin (acetylsalicylic acid), which inhibits the activation and aggregation of plaques and thus prevents the formation of the arterial thrombus. Large clinical studies have shown that one aspirin per day can significantly reduce the risk of myocardial infarction. To prevent thrombotic stroke, there is also another widely used drug. It is Ticlopedin that also inhibits platelet aggregation, but by mechanisms that are somewhat different from aspirin.

Sykdommer relatert til venøs trombose er dyp venøs trombose (DVT) og lungeembolisme. I dyp venøs trombose dannes en trombe i en av venene i ekstremitetene, vanligvis i bena. Denne tromben reduserer tilbakestrømmen av blod og fører til dårligere blodtilførsel i den delen av benet eller armen. Benet eller armen hovner opp og blir smertefull. Tilstanden er i seg selv ikke livstruende, men hvis den ikke behandles kan tromben vokse, utvide seg og deler av dén kan føres med tilbakestrømmen og sette seg fast i lungene. Denne tilstanden er livstruende og kalles lungeembolisme. Klinisk praksis for å behandle venøs trombose kan inndeles i forebygging og behandling. Medikamentene som brukes er imidlertid de samme, ulikheten består i dosering og behandlingstid. Diseases related to venous thrombosis are deep venous thrombosis (DVT) and pulmonary embolism. In deep venous thrombosis, a thrombus forms in one of the veins in the extremities, usually in the legs. This thrombus reduces the return flow of blood and leads to poorer blood supply in that part of the leg or arm. The leg or arm swells and becomes painful. The condition in itself is not life-threatening, but if it is not treated, the thrombus can grow, expand and parts of it can be carried with the backflow and become stuck in the lungs. This condition is life-threatening and is called pulmonary embolism. Clinical practice for treating venous thrombosis can be divided into prevention and treatment. However, the drugs used are the same, the difference is in dosage and treatment time.

Medikamentene som brukes er heparin, heparin med tav molekylvekt og dikumarol derivater. Allé disse virker ved å redusere koagulering og fibrindannelse, som er nøkkelprosessen i venøs trombose. Heparin er et sulfatholdig polysakkarid, som i stor skala isoleres fra intestinal mukus i svin. Den er brukt klinisk i mange tiår som et middel for å behandle og forebygge venøs trombose. Heparin er heterogent med en molekylvekt fra 5,000 til 30,000 Dalton og med en gjennomsnittlig molekylvekt på omtrent 12,000-15,000 Dalton. Heparin og heparin med lav molekylvekt virker antikoagulerende ved å drastisk redusere hastigheten til den fysiologiske koaguleringsinhibitoren trombin III (AT) når denne inaktiverer de aktiverte koaguleringsfaktorene. Bare en tredel av heparinmolekylene binder AT og virker sterkt antikoagulerende. Dette har å gjøre med at de inneholder en spesifikk pentasakkarid sekvens med sterk affinitet til AT. Denne fraksjonen av heparin kalles høyaffinrtet- eller HA-fraksjonen. Restdelen, lavaffinrtet (LA) fraksjonen, mangler i all vesentlighet koagulerende virkning. Hva angår den antitrombotiske aktiviteten in vivo, som er det viktigste, så er situasjonen mer kompleks, fordi ikke bare aktivering av AT er viktig. Andre mekanismer, som frigjøring av Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) bidrar til den antitrombotiske virkningen. LA-heparin frigjør TFPI og bidrar dermed til den antitrombotiske virkningen til heparin i sin helhet til tross for at det ikke har noen antikoagulerende virkning. The drugs used are heparin, low molecular weight heparin and dicoumarol derivatives. All of these work by reducing coagulation and fibrin formation, which is the key process in venous thrombosis. Heparin is a sulphate-containing polysaccharide, which is isolated on a large scale from intestinal mucus in pigs. It has been used clinically for many decades as a means of treating and preventing venous thrombosis. Heparin is heterogeneous with a molecular weight from 5,000 to 30,000 Daltons and with an average molecular weight of approximately 12,000-15,000 Daltons. Heparin and low molecular weight heparin act as anticoagulants by drastically reducing the rate of the physiological coagulation inhibitor thrombin III (AT) when it inactivates the activated coagulation factors. Only a third of the heparin molecules bind AT and have a strong anticoagulant effect. This has to do with the fact that they contain a specific pentasaccharide sequence with a strong affinity for AT. This fraction of heparin is called the high-affinity or HA fraction. The remainder, the low-affinity (LA) fraction, essentially lacks coagulating action. As regards the antithrombotic activity in vivo, which is the most important, the situation is more complex, because not only activation of AT is important. Other mechanisms, such as the release of Tissue Factor Pathway Inhibitor (TFPI) contribute to the antithrombotic effect. LA-heparin releases TFPI and thus contributes to the antithrombotic effect of heparin as a whole despite having no anticoagulant effect.

Heparin påvirker også plater, men den virker også som en svak stimulator på plate aggregasjon, og de potensierer også den plateaggregerende virkningen til adenosin difosfat. Det er ingen forskjell mellom HA- og LA-heparin når det gjelder deres evne til å påvirke plater på denne måten, som vist av Holmer et al., Thromb Res 1980; 18:861-69. Heparin also affects platelets, but it also acts as a weak stimulator of platelet aggregation, and they also potentiate the platelet-aggregating action of adenosine diphosphate. There is no difference between HA and LA heparin in their ability to affect plaques in this way, as shown by Holmer et al., Thromb Res 1980; 18:861-69.

Dikumularolderivater har antitrombotisk virkning ved å redusere syntesen av koaguleringsfaktorer i deres biologiske aktive former. Den prosessen tar noe tid og derfor kan ikke dikumarolderivater brukes for antitrombotisk behandling. Dicumularol derivatives have antithrombotic action by reducing the synthesis of coagulation factors in their biologically active forms. That process takes some time and therefore dicoumarol derivatives cannot be used for antithrombotic treatment.

De to siste tiårene er det gjort store fremskritt i å utvikle utstyr for ulike typer implantasjoner eller for bruk i maskiner der det er kontakt med blod. Dette har imidlertid også skapt en ny type tromboseproblem. Når blod kommer i kontakt med andre materialer enn den ferske naturlige veggen i blodkaret, begynner aktiveringen av koagutasjonssystemet og trombosering kan oppstå. Trombosene som dannes er av den arterielie typen med plater som det dominerende elementet der den fremmede overflaten utsettes for kontakt med arteriell blodstrøm (Hanson et al. Biomaterials 1982; 519-30). I venøs blodstrøm er situasjonen blandet og både plater og koagulasjon er involvert. In the last two decades, great progress has been made in developing equipment for various types of implantation or for use in machines where there is contact with blood. However, this has also created a new type of thrombosis problem. When blood comes into contact with materials other than the fresh natural wall of the blood vessel, activation of the coagulation system begins and thrombosis can occur. The thrombi that form are of the arterial type with plates as the dominant element where the foreign surface is exposed to contact with arterial blood flow (Hanson et al. Biomaterials 1982; 519-30). In venous blood flow, the situation is mixed and both plaques and coagulation are involved.

For å forhindre trombose i utstyr er det mulig å bruke antiplate- og antitrombotiske medikamenter. Dette er imidlertid ingen ideell løsning fordi det fører med seg en To prevent thrombosis in equipment, it is possible to use antiplatelet and antithrombotic drugs. However, this is not an ideal solution because it entails a

risiko for blødning og ytterligere medikamentell behandling må fortsette i lang tid, noe som er en ulempe. Derfor er det gjort store anstrengelser for å finne materialer med redusert tendens til å danne trombose. Forskjellige polymerer og plastmaterialer er blitt prøvet. Hydrofilisiteten/hydrofobisiteten til overflaten har vært varierende, men det er ikke funnet noen sammensetning som har gitt et gjennombrudd. Siden plater er negativt ladet ved fysiologisk pH-verdi, er det gjennomført studier med overflater som inneholder negative ladninger der man kunne forvente redusert adhesjon på grunn av elektrostatisk frastøting. Til nå er det mest vellykkete eksemplet på å fremstille mindre trombogene overflater ved å belegge den med et negativt ladet polymer å bruke heparin for å inhibere plateadhesjon. Fordelen med heparin sammenlignet med syntetiske polymerer er at det er en fysiologisk sammensetning. Det er også det sterkest negativt ladete molekylet som finnes i menneskekroppen. Det er ingen forskjell mellom HA- og LA-heparin når det gjelder dette. risk of bleeding and additional drug treatment must be continued for a long time, which is a disadvantage. Therefore, great efforts have been made to find materials with a reduced tendency to form thrombosis. Different polymers and plastic materials have been tried. The hydrophilicity/hydrophobicity of the surface has been variable, but no breakthrough composition has been found. Since plates are negatively charged at physiological pH values, studies have been carried out with surfaces containing negative charges where one would expect reduced adhesion due to electrostatic repulsion. To date, the most successful example of making less thrombogenic surfaces by coating them with a negatively charged polymer is to use heparin to inhibit platelet adhesion. The advantage of heparin compared to synthetic polymers is that it is a physiological composition. It is also the most strongly negatively charged molecule found in the human body. There is no difference between HA and LA heparin in this regard.

Ulike teknologier er blitt utviklet for å feste heparin til overflater slik at disse blir mindre trombogene. lonebinding av heparin til polykationiske overflater er forsøkt men har vært mindre vellykket fordi heparin har lekket fra overflaten, noe som fører til tap av antitrombotiske egenskaper. Various technologies have been developed to attach heparin to surfaces so that these become less thrombogenic. ionic binding of heparin to polycationic surfaces has been attempted but has been less successful because heparin has leaked from the surface, leading to loss of antithrombotic properties.

En av de mest vellykkete prosessene for å gjøre et medisinsk apparat ikke-trombogent er oppnådd ved å binde et heparinfragment kovalent til en modifisert overflate på det medisinske apparatet. Den generelle metoden og forbedringene av den er beskrevet i følgende europeiske patenter EP-B-0086187 og EP-B-0495820. One of the most successful processes for rendering a medical device non-thrombogenic has been achieved by covalently binding a heparin fragment to a modified surface of the medical device. The general method and its improvements are described in the following European patents EP-B-0086187 and EP-B-0495820.

Disse patentene beskriver fremstillingen av overflatemodifiserende substrater som fås først ved en selektiv spalting av heparin polysakkaridkjeden, mens aldehydgrupper tilføres ved oksidasjon med salpetersyrling. For det andre tilføres det en eller flere overflatemodifiserende sjikt med aminogrupper på overflaten av det medisinske apparatet. Deretter reageres aldehydgruppene på polysakkaridkjeden med primære aminogrupper på overflatemodifiserende sjikt, fulgt av en reduksjon av de intermediære Schiff s basene til stabile sekundære aminobindinger med for eksempel cyanoborhydrid. These patents describe the production of surface-modifying substrates that are first obtained by selective cleavage of the heparin polysaccharide chain, while aldehyde groups are added by oxidation with nitric acid. Secondly, one or more surface-modifying layers with amino groups are added to the surface of the medical device. The aldehyde groups on the polysaccharide chain are then reacted with primary amino groups on the surface modifying layer, followed by a reduction of the intermediate Schiff's bases to stable secondary amino bonds with, for example, cyanoborohydride.

Denne teknologien har gjort det mulig å fremstille stabile og veldefinerte antitrombogene overflalemodifikasjoner for medisinsk utstyr. This technology has made it possible to manufacture stable and well-defined antithrombogenic surface modifications for medical devices.

Det finnes mange andre kjente overflatemodifikasjoner som hevder å oppnå lignende - eller til og med bedre resultater, slik det for eksempel beskrives i EP-A-0200295 (US 4,600,652. US 6,642,242.). Disse er basert på substrater med et sjikt av polyuretan urea, og heparin som er modifisert for å inneholde aldehydgrupper ved oksidasjon med salpetersyrling eller periodat, kan bindes med kovalente bindinger. There are many other known surface modifications that claim to achieve similar - or even better - results, as described for example in EP-A-0200295 (US 4,600,652. US 6,642,242.). These are based on substrates with a layer of polyurethane urea, and heparin, which has been modified to contain aldehyde groups by oxidation with nitric acid or periodate, can be bound with covalent bonds.

En annen antitrombogen overflatemodifisering som kan nevnes, er beskrevet i EP-B-0309473. Overflaten tii apparatet modifiseres ved å belegge den med et sjikt av lysozym eller et derivat av dette, som heparin festes til. Another antithrombogenic surface modification that may be mentioned is described in EP-B-0309473. The surface of the apparatus is modified by coating it with a layer of lysozyme or a derivative thereof, to which heparin attaches.

Ytterligere en overflatemodifisering for å fremstille antitrombogene gjenstander er beskrevet i US 4,326,532. I dette tilfellet omfatter den sjiktdelte antitrombogene overflaten et polymerisk substrat, et chitosan bundet til det polymeriske substratet og et antitrombogent middel bundet til chitosanbelegget. JP 04-92673 vedrører et antitrombogent hemofilter som også bruker et chitosansjikt for å binde heparin. Another surface modification to produce antithrombogenic articles is described in US 4,326,532. In this case, the layered antithrombogenic surface comprises a polymeric substrate, a chitosan bonded to the polymeric substrate and an antithrombogenic agent bonded to the chitosan coating. JP 04-92673 relates to an antithrombogenic hemofilter which also uses a chitosan layer to bind heparin.

Listen over kjente fremgangsmåter for å fremstille antitrombogene overflater er slett ikke fullstendig. Den gir en klar indikasjon på at det er vanskelig å fremstille slike The list of known methods for producing antithrombogenic surfaces is by no means complete. It gives a clear indication that it is difficult to produce such

belagte medisinske gjenstander med de egenskapene som trengs for vellykket bruk i pasienter. Slike egenskaper er beleggets stabilitet, ingen negativ endring av egenskaper hos substratet som belegges og tilstrekkelig sterk og langvarig antitrombogen virkning. coated medical objects with the properties needed for successful use in patients. Such properties are the stability of the coating, no negative change in the properties of the substrate being coated and a sufficiently strong and long-lasting antithrombogenic effect.

Selv om belegging av overflater méd heparin har vært vellykket for å redusere trombogenisitet er det derfor ennå behov for forbedring. Og bruk av en heparinfraksjon med optimale egenskaper kunne bli et viktig skritt fremover. Although coating surfaces with heparin has been successful in reducing thrombogenicity, there is therefore still a need for improvement. And using a heparin fraction with optimal properties could be an important step forward.

Den foreliggende oppfinnelsen beskriver anvendelse av en sammensetning som omfatter heparin for fremstilling av en ikke-trombogen overflate. The present invention describes the use of a composition comprising heparin for the production of a non-thrombogenic surface.

Separasjon av HA- og LA-fraksjoner av heparin fulgt av kobling til overflate er utført tidligere av Yuan et al. (J.Biomed Mater Res 1993; 27:811-20 og J. Appl Biomater 1995; 6:259-66). I studien til Yuan et al. (1995) fant man at den LA-heparin belagte overflaten hadde en sterkere antikoagulerende virkning, målt i anti Faktor Xa aktivitet, enn den HA-heparinbelagte overflaten. Separation of HA and LA fractions of heparin followed by coupling to a surface has been performed previously by Yuan et al. (J. Biomed Mater Res 1993; 27:811-20 and J. Appl Biomater 1995; 6:259-66). In the study by Yuan et al. (1995) found that the LA-heparin-coated surface had a stronger anticoagulant effect, measured in anti-Factor Xa activity, than the HA-heparin-coated surface.

I den foreliggende oppfinnelsen studerte man et overflatebelagt vaskulært implantat (stent) i en eksperimentell dyremodell av trombose. Dyremodellen som ble brukt var en arterio-venøs shunt modell i bavianer. I denne modellen passeres blod fra en arterie gjennom en slange som inneholder materialet som skat studeres, og deretter til en vene. Trombosene som dannes i denne modellen er av den arterielie typen, og trombedannelsen overvåkes ved å måle akkumulasjonen av radiomerkete plater. In the present invention, a surface-coated vascular implant (stent) was studied in an experimental animal model of thrombosis. The animal model used was an arterio-venous shunt model in baboons. In this model, blood is passed from an artery through a tube containing the material being studied, and then to a vein. The thrombi formed in this model are of the arterial type, and thrombus formation is monitored by measuring the accumulation of radiolabeled plaques.

I motsetning til hva som kunne forventes ut fra det man vet om mekanismer for arteriell trombose med fremherskende medvirkning av plater, og fra det man vet om virkninger av HA- og LA-heparin på plater, fant man at HA fraksjonen, når den ble koblet til en overflate, var mye mer effektiv enn LA-fraksjonen i å forhindre dannelse av arteriell trombose. Contrary to what would be expected from what is known about the mechanisms of arterial thrombosis with predominant involvement of plaques, and from what is known about the effects of HA and LA heparin on plaques, it was found that the HA fraction, when coupled to a surface, was much more effective than the LA fraction in preventing the formation of arterial thrombosis.

Man kan følgelig få forbedret ikke-trombogen virkning og som et resultat av dette oppnå følgende fordeler: tilstrekkelig ikke-trombogenisitet kan oppnås med mindre mengder immobilisert heparin. Detter er spesielt viktig for materiale og apparater der Accordingly, one can obtain improved non-thrombogenic activity and as a result obtain the following advantages: sufficient non-thrombogenicity can be obtained with smaller amounts immobilized heparin. This is particularly important for materials and devices there

det er vanskelig å immobilisere store mengder heparin. it is difficult to immobilize large amounts of heparin.

høyere ikke-trombogenisitet kan oppnås med den samme mengden immobilisert heparin. Detter er spesielt viktig på bruksområder med sterke trombogene stimuli for eksempel i situasjoner med svak blodstrøm og på bruksområder som katetere og vaskulære implantater med trangt hulrom, eller higher non-thrombogenicity can be achieved with the same amount of immobilized heparin. This is particularly important in areas of use with strong thrombogenic stimuli, for example in situations with weak blood flow and in areas of use such as catheters and vascular implants with a narrow cavity, or

i tilfeller der pasienten ellers ville ha behov for ytterligere systemisk heparinisering. in cases where the patient would otherwise need further systemic heparinisation.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er anvendelse av en sammensetning omfattende heparin anriket med hensyn på høy affinitet, HA, heparin, koblet til en overflate, eventuelt sammen med en egnet bærer, for fremstilling av en ikke-trombogen overflate for forhindring av dannelse av arteriell trombose. An object of the present invention is the use of a composition comprising heparin enriched with regard to high affinity, HA, heparin, linked to a surface, optionally together with a suitable carrier, for the production of a non-thrombogenic surface for preventing the formation of arterial thrombosis .

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Detailed description of the invention

Et formål med oppfinnelsen er følgelig anvendelse av en sammensetning omfattende heparin anriket med hensyn på høy affinitet, HA, heparin, koblet til en overflate, eventuelt sammen med en egnet bærer, for fremstilling av en ikke-trombogen overflate for forhindring av dannelse av arteriell trombose. An object of the invention is therefore the use of a composition comprising heparin enriched with regard to high affinity, HA, heparin, linked to a surface, optionally together with a suitable carrier, for the production of a non-thrombogenic surface for preventing the formation of arterial thrombosis .

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse ifølge krav 1, ved at høy affinitet, HA, heparin blir renset. The present invention further relates to use according to claim 1, in that high affinity, HA, heparin is purified.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge krav 1, ved at høy affinitet, HA, heparin blir koblet til en overflate ved endepunkt-binding. Application according to claim 1 is further described, in that high affinity, HA, heparin is connected to a surface by end-point binding.

Sammensetningen kan eventuelt kombineres med en bærer for å fremkalle immobiliseringen av heparinet på overflaten til det medisinske apparatet. The composition may optionally be combined with a carrier to induce the immobilization of the heparin on the surface of the medical device.

Bæreren er utvalgt fra en gruppe av organiske forbindelser som bærer funksjonelle grupper som amino, aldehydo, hydroksyl, karboksylsyre, karbodiimido eller andre reaktive funksjonelle grupper som kan bli bundet til funksjonelle grupper tilstede i eller introdusert i heparin, hvori de funksjonelle forbindelsene kan være lav molekylvektforbindelser eller polymerer, hvori eksempler på lav molekylvektforbindelser som bærer funksjonelle grupper er tridodecylmetylaminoklorid, benzalkoniumklorid derivater, etyl dimetylaminopropyl karbodiimid og glutaraldehyd, og eksempel på polymerer er for eksempel polyaminer som polyetylenimin (PEI) eller polylysin, polykarboksylsyrer som polyakrylsyre, polyalkoholer som polyvinyl alkohol eller polysakkarider og andre funksjonelle polymerer eller kombinasjoner derav. The carrier is selected from a group of organic compounds bearing functional groups such as amino, aldehydo, hydroxyl, carboxylic acid, carbodiimido or other reactive functional groups that can be attached to functional groups present in or introduced into heparin, wherein the functional compounds can be low molecular weight compounds or polymers, in which examples of low molecular weight compounds bearing functional groups are tridodecylmethylaminochloride, benzalkonium chloride derivatives, ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide and glutaraldehyde, and examples of polymers are for example polyamines such as polyethyleneimine (PEI) or polylysine, polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polyalcohols such as polyvinyl alcohol or polysaccharides and other functional polymers or combinations thereof.

De funksjonelle gruppene finnes i slike mengder at en tilstrekkelig mengde HA-heparin kan bindes og en sterk antitrombogen virkning kan oppnås. The functional groups are present in such amounts that a sufficient amount of HA-heparin can be bound and a strong antithrombogenic effect can be achieved.

Det er videre beskrevet anvendelse ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, ved at høy affinitet, HA, heparin blir koblet til en overflate av en innretning. It is further described use according to any of the preceding claims, in that high affinity, HA, heparin is coupled to a surface of a device.

Ovennevnte innretninger er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av stenter, implantater, stent-implantater, katetere, hjerteventiler, filtre, slanger og innretninger med membraner. The above-mentioned devices are preferably selected from the group consisting of stents, implants, stent-implants, catheters, heart valves, filters, tubes and devices with membranes.

Mukøs heparin fra svin ble depolymerisert med salpetersyrling som beskrevet i Larm et al. EP-86186B1. Det resulterende depolymeriserte heparinet ble fraksjonert med affinitetkromatografi på matrisebundet antitrombin III i sine HA- og LA-fraksjoner (Andersson LO et al. Tromb Res 1979; 9: 575-83). Som forventet viste. HA-fraksjonen svært sterk antikoagulerende virkning mens LA-fraksjonen viste svært lav virkning. To grupper stenter av rustfritt stål (Palmaz-Schatz, PS153, Cordis, Warren, N.J. USA) ble så hver for seg belagt (Larm et al. EP-86186B1) méd de to fraksjonene. Stenter er en type rørformete nett som brukes for å støtte veggene i blodkar, og de brukes i forbindelse med kardiovaskulære inngrep. Bestemmelsen av graden av heparinbinding viste at all vesentlighet de samme mengdene av henholdsvis HA-fraksjonen og LA-fraksjonen, var blitt koblet til overflatene på de to gruppene stenter. Porcine mucosal heparin was depolymerized with nitric acid as described in Larm et al. EP-86186B1. The resulting depolymerized heparin was fractionated by affinity chromatography on matrix-bound antithrombin III into its HA and LA fractions (Andersson LO et al. Tromb Res 1979; 9: 575-83). As expected showed. The HA fraction showed a very strong anticoagulant effect, while the LA fraction showed a very low effect. Two groups of stainless steel stents (Palmaz-Schatz, PS153, Cordis, Warren, N.J. USA) were then separately coated (Larm et al. EP-86186B1) with the two fractions. Stents are a type of tubular mesh used to support the walls of blood vessels, and they are used in connection with cardiovascular procedures. The determination of the degree of heparin binding showed that essentially the same amounts of the HA fraction and the LA fraction, respectively, had been connected to the surfaces of the two groups of stents.

For å beregne de antitrombogene egenskapene til de to overflatene ble det brukt en etablert dyremodell. I denne modellen passerer blod fra en arterie gjennom en slange som inneholder materialet som skal studeres, og deretter til en vene. Trombosene som dannes i denne modellen er av den arterielie typen, og trombedannelsen overvåkes ved å måle akkumulasjonen av radiomerkete plater (Cadroy Y et al. J. Lab Clin Med 1989; 113:436-48). To calculate the antithrombogenic properties of the two surfaces, an established animal model was used. In this model, blood passes from an artery through a tube containing the material to be studied, and then to a vein. The thrombi formed in this model are of the arterial type, and thrombus formation is monitored by measuring the accumulation of radiolabeled plaques (Cadroy Y et al. J. Lab Clin Med 1989; 113:436-48).

Stenter ble plassert og ekspandert i den ex-vivo arterio-venøse shunten i en ikke-koagulert bavian som var blitt injisert med radiomerkete plater. Akkumulasjon av plater på stentoverflaten ble periodisk registrert av et gammakamera i periode på to timer. Ikke-belagte stenter ble brukt som kontroll. I kontrollstentene begynte platene umiddelbart og feste seg og fortsatte å akkumulere så lenge eksperimentet varte. Stenter belagt med LA-heparin fraksjonen viste i begynnelsen betydelig mindre plateakkumulasjon enn kontrollen. Men etter 40 minutter startet akkumulasjonen og etter 2 timer var det like mye plater der som på kontrollstentene. Derimot oppstod det ingen plateakkumulasjon på stentene belagt med HA-heparin fraksjonen. Selv etter to timer var det ingen tegn til plateakkumulasjon. Stenter belagt méd HA-heparin fraksjon har altså bedre ikke-trombogene egenskaper. Stents were placed and expanded in the ex-vivo arterio-venous shunt in a noncoagulated baboon that had been injected with radiolabeled plaques. Accumulation of plaques on the stent surface was periodically recorded by a gamma camera for periods of two hours. Uncoated stents were used as controls. In the control stents, the plaques immediately began to adhere and continued to accumulate for the duration of the experiment. Stents coated with the LA-heparin fraction initially showed significantly less plaque accumulation than the control. But after 40 minutes the accumulation started and after 2 hours there were as many plaques there as on the control stents. In contrast, no plaque accumulation occurred on the stents coated with the HA-heparin fraction. Even after two hours, there was no sign of plaque accumulation. Stents coated with HA-heparin fraction therefore have better non-thrombogenic properties.

Som ovenfor nevnt har belegging av overflater med heparin vært ganske vellykket for å redusere trombogenisitet. Likevel trengs det ennå forbedring og, siden HA-fraksjonen av heparin synes å stå for mesteparten av den antitrombotiske virkningen, ville det være en fordel å ha en overflate anriket med hensyn til denne fraksjonen. As mentioned above, coating surfaces with heparin has been quite successful in reducing thrombogenicity. Nevertheless, improvement is still needed and, since the HA fraction of heparin seems to account for most of the antithrombotic action, it would be advantageous to have a surface enriched with respect to this fraction.

I denne studien er stenter valgt som den apparattype og overflate som skal studeres. Grunnen til dette er at stenten egner seg godt for evaluering i denne dyremodellen for arteriell trombose. Imidlertid er ikke typen apparat, enten det er katetere, filtre, slanger, vaskuiære implantater eller stenter, viktige for trombogenisiteten til overflaten. Denne bestemmes av i større grad av overflatens egenskaper enn av apparatet selv eller materialet det er laget av. Konklusjonene om ikke-trombogenisitet på overflater vi har kommet frem til med stenter begrenses ikke til stenter men dekker alle typer overflater i kunstige apparater som kommer i kontakt med arteriell blod. In this study, stents have been chosen as the device type and surface to be studied. The reason for this is that the stent is well suited for evaluation in this animal model for arterial thrombosis. However, the type of device, whether catheters, filters, tubes, vascular implants or stents, is not important for the thrombogenicity of the surface. This is determined to a greater extent by the properties of the surface than by the device itself or the material it is made of. The conclusions about non-thrombogenicity of surfaces we have reached with stents are not limited to stents but cover all types of surfaces in artificial devices that come into contact with arterial blood.

Kort beskrivelse av tegningene Brief description of the drawings

Figur 1 er en kurve som viser adhesjon av plater til stenter belagt henholdsvis med HA- og LA-heparin fraksjonen og til kontrollstenter. Ubelagte PS 153 stenter ble brukt som kontroll. Tallene i parenteser viser til antallet eksperimenter og dyr brukt i hvert tilfelle. Figure 1 is a curve showing adhesion of plates to stents coated respectively with the HA- and LA-heparin fraction and to control stents. Uncoated PS 153 stents were used as controls. The numbers in parentheses refer to the number of experiments and animals used in each case.

Materialer oa metoder Materials and other methods

Mukøst heparin fra svin ble depolymerisert med salpetersyrling som beskrevet i Larm Porcine mucous heparin was depolymerized with nitric acid as described in Larm

et al. EP-0086186B1. Det resulterende depolymeriserte heparinet ble fraksjonert med affinitetkromatografi på matrisebundet AT i sine HA- og LA-fraksjoner (Andersson LO et al. Tromb Res 1976; 9; 575-83). Humant AT ble fremskaffet fra Pharmacia & Upjohn, Stockholm. Aktivert CH Sepharose 4B ble skaffet fra Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden. Coronary stenter, Palmaz-Schatz, PS 153, ble levert av Cordis, Warren, USA. Kromogene substrater S-2238 og S-2765 ble levert av Chromogenix AB, Molndal, Sweden. The 4th International Standard for Heparin activity ble skaffet fra the National Institute for Biological Standard og Control, Hertfordshire, United Kingdom. et al. EP-0086186B1. The resulting depolymerized heparin was fractionated by affinity chromatography on matrix-bound AT into its HA and LA fractions (Andersson LO et al. Tromb Res 1976; 9; 575-83). Human AT was obtained from Pharmacia & Upjohn, Stockholm. Activated CH Sepharose 4B was obtained from Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden. Coronary stents, Palmaz-Schatz, PS 153, were supplied by Cordis, Warren, USA. Chromogenic substrates S-2238 and S-2765 were supplied by Chromogenix AB, Molndal, Sweden. The 4th International Standard for Heparin activity was obtained from the National Institute for Biological Standard and Control, Hertfordshire, United Kingdom.

Fremstillingen av AT-Sepharose ble utført I henhold tit gelfabrikantens anvisninger. Den lyofiliiserte gelen (125 g) ble rekonstituert i buffer og ble deretter reagert med 4 g AT. Den resulterende AT-Sepharosen (400 ml) hadde kapasitet til å binde omtrent 100 mg av HA-heparin. De antikoagulerende virkningene til heparin fraksjoner ble bestemt ved hjelp av en trombininhiberingsprøve og med Faktor Xa-inhiberingsprøve vesentlig i henhold til the European Pharmacopeia methods for Low Molecular Mass Heparin med bruk av henholdsvis de kromogene substratene S-2238 og S-2765. Standard kurver ble konstruert med the 4th International Standard for Heparin, og den spesifikke aktiviteten ble benevnt i internasjonale enheter pr. mg (IU/mg). Heparininnholdet i heparinsubfraksjonene ble bestemt ved hjelp åv karbazol-H2S04-metoden. Mengden av heparin bundet til overflatene (heparintetthet) ble bestemt med en kjemisk metode og uttrykt som mengde heparin pr. overflateenhet {ug/cm2). The preparation of AT-Sepharose was carried out according to the gel manufacturer's instructions. The lyophilized gel (125 g) was reconstituted in buffer and then reacted with 4 g of AT. The resulting AT-Sepharose (400 ml) had the capacity to bind approximately 100 mg of HA-heparin. The anticoagulant effects of heparin fractions were determined using a thrombin inhibition test and with a Factor Xa inhibition test essentially in accordance with the European Pharmacopeia methods for Low Molecular Mass Heparin using the chromogenic substrates S-2238 and S-2765 respectively. Standard curves were constructed with the 4th International Standard for Heparin, and the specific activity was named in international units per mg (IU/mg). The heparin content in the heparin subfractions was determined using the carbazole-H2SO4 method. The amount of heparin bound to the surfaces (heparin density) was determined with a chemical method and expressed as the amount of heparin per surface unit {ug/cm2).

Oppfinnelsen belyses av de følgende eksemplene. The invention is illustrated by the following examples.

Alle publikasjoner som er nevnt her er oppført med sin referanse. Med uttrykket "som omfatter" forstår vi "som innbefatter men ikke er begrenset til". Andre stoffer eller tilsetninger som ikke er nevnt kan derfor også være til stede. All publications mentioned here are listed with their reference. By the expression "comprising" we mean "including but not limited to". Other substances or additives not mentioned may therefore also be present.

Eksempler Examples

Eksempel 1 Example 1

Heparin som er delvis depolymerisert med salpetersyrling ble separert i sine HA- og LA-fraksjoner med affinitetkromatografi på AT-Sepharose vesentlig i henhold til Andersson et al. 1976. Heparin mengder på 200 mg i 4 ml. 0,15 NaCI ble brukt i søylen og eluert med 500 ml 0,15M NaCI fulgt av 500 ml 2.0M NaCI. Eluatet ble samlet i slange i 10 ml porsjoner, og deres heparin ble analysert med karbozolmetoden. Rør som inneholder henholdsvis LA- og HA-heparin ble samlet opp. Hver kjøring ga omtrent 140 mg LA- og 50 mg HA-heparin. De resulterende HA- og LA-fraksjonene ble karakterisert med henblikk på antikoagulerende virkning. Resultater er gitt i Tabell 1. Heparin partially depolymerized with nitric acid was separated into its HA and LA fractions by affinity chromatography on AT-Sepharose essentially according to Andersson et al. 1976. Heparin amounts of 200 mg in 4 ml. 0.15 NaCl was used in the column and eluted with 500 ml of 0.15 M NaCl followed by 500 ml of 2.0 M NaCl. The eluate was collected in tubing in 10 ml portions, and their heparin was analyzed by the carbazole method. Tubes containing respectively LA and HA heparin were collected. Each run yielded approximately 140 mg of LA and 50 mg of HA heparin. The resulting HA and LA fractions were characterized for anticoagulant activity. Results are given in Table 1.

HA-fraksjonen hadde sterke antikoagulerende virkninger, 344 IU/mg og 318 IU/mg, i henholdsvis trombin- og faktor Xa-inhiberingsprøvene. LA-fraksjonen manglet i all vesentlighet antikoagulerende virknig (<5 IU/mg) for begge prøvene (Tabell 1). The HA fraction had strong anticoagulant effects, 344 IU/mg and 318 IU/mg, in the thrombin and factor Xa inhibition tests, respectively. The LA fraction essentially lacked anticoagulant activity (<5 IU/mg) for both samples (Table 1).

Eksempel 2 Example 2

Koronare stenter ble belagt med heparinfraksjonene ved hjelp av en teknologi som i vesentlighet er beskrevet (Larm et al. EP-86186B1). To batcher på 50 stenter ble belagt med henholdsvis HA-fraksjonen og LA-fraksjonen. De belagte stentene ble deretter sterilisert med etylenoksid (EO). Stentenes heparintetthet er vist i Tabell 2. Heparintettheten var vesentlig den samme, omtrent 5 ug/cm<2>, for begge preparatene. Coronary stents were coated with the heparin fractions using a technology substantially described (Larm et al. EP-86186B1). Two batches of 50 stents were coated with the HA fraction and the LA fraction, respectively. The coated stents were then sterilized with ethylene oxide (EO). The heparin density of the stents is shown in Table 2. The heparin density was essentially the same, approximately 5 ug/cm<2>, for both preparations.

De ikke-tormbogene egenskaper til de to ulike heparinbeleggene på stenter ble studert i en eksperimentell primat dyremodell. Stenter ble plassert og ekspandert i en ex-vivo AV shunt i en ikke-antikoagulert bavian som hadde blitt injisert med 111 In radiomerkete plater. Adhesjon av plater til stentoverflaten ble periodisk registrert med gammakamera over en periode på 2 timer. Ikke-belagte PS153 stenter ble brukt som kontroll. Resultatene ble presentert i Figur 1. Ingen plateadhesjon ble observert for HA-stenter. Derimot begynte plater umiddelbart å feste seg da den ikke-belagte kontrollstenten ble implantert. Adhesjon fortsatte under hele den undersøkte tidsperioden. LA-stentene viste litt mindre adhesjon enn kontrollstenten i inntil 1 time, men etter 2 timer var denne forskjellen forsvunnet, og LA-stenten oppførte seg vesentlig på samme måte som kontrollstentene. The non-tormographic properties of the two different heparin coatings on stents were studied in an experimental primate animal model. Stents were placed and expanded in an ex-vivo AV shunt in a non-anticoagulated baboon that had been injected with 111 In radiolabeled plates. Adhesion of plates to the stent surface was periodically recorded with a gamma camera over a period of 2 hours. Uncoated PS153 stents were used as controls. The results were presented in Figure 1. No plaque adhesion was observed for HA stents. In contrast, plaques immediately began to adhere when the uncoated control stent was implanted. Adhesion continued throughout the time period examined. The LA stents showed slightly less adhesion than the control stent for up to 1 hour, but after 2 hours this difference had disappeared, and the LA stent behaved essentially in the same way as the control stents.

Claims

1. Use of a composition comprising heparin enriched with respect to high affinity, HA, heparin, coupled to a surface, optionally together with a suitable carrier, for producing a non-thrombogenic surface for preventing the formation of arterial thrombosis.

2. Use according to claim 1, characterized in that high affinity, HA, heparin is purified.

3. Use according to claim 1, characterized in that high affinity, HA, heparin is linked to a surface by end-point binding.

4. Use according to claim 1, characterized in that the carrier is selected from the group of organic compounds that carry functional groups such as amino, aldehydo, hydroxyl, carboxylic acid, carbodiimido or other reactive functional groups that can be bound to functional groups present in or introduced into heparin , in which the functional compounds can be low molecular weight compounds or polymers, in which examples of low molecular weight compounds bearing functional groups are tridodecylmethylaminochloride, benzalkonium chloride derivatives, ethyl dimethylaminopropyl carbodiimide and glutaraldehyde, and examples of polymers are, for example, polyamines such as polyethyleneimine (PEI) or polylysine, polycarboxylic acids such as polyacrylic acid, polyalcohols such as polyvinyl alcohol or polysaccharides and other functional polymers or combinations thereof.

5. Use according to any one of the preceding claims, characterized in that high affinity, HA, heparin is connected to a surface of a device.

6. Application according to claim 5, characterized in that the device is selected from the group consisting of stents, implants, stent-implants, catheters, heart valves, filters, tubes and devices with membranes.