NO313686B1

NO313686B1 - Anvendelse av pentosanpolysulfat (PPS) for behandling av kroniske progressive vaskul¶re sykdommer

Info

Publication number: NO313686B1
Application number: NO19973081A
Authority: NO
Inventors: Gary E Striker; Liliane J Striker; Fred P Sherman
Original assignee: Us Health
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1997-07-02
Publication date: 2002-11-18
Also published as: CA2210351C; IL121217A0; AU699012B2; WO1996040158A1; TW434018B; EP0809505A1; NO973081D0; HUP9802431A3; ZA964247B; HUP9802431A2; NZ309991A; ES2115571T1; DE809505T1; EP0809505B1; IL121217A; US5643892A; EP0809505A4; CA2210351A1; BR9704114A; NO973081L

Abstract

Fremgangsmåte for behandling av en pattedyrpasient som lider av en kronisk progressiv -. vaskulær sykdom (CPVD)arrdannelse og/eller fibrose for å stoppe progresjonen til sykdommen og forårsake oppløsning av allerede dannede arr/flak eller fibrotiske lesesjoner. Fremgangsmåten består i å administrere til pasienten en farmasøytisk sammensetning inneholdende en effektiv mengde pentosanpolysulfat (PPS) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav. Oral administreringsvei er foretrukket. Totale daglige doser av PPS eller PPS salt varierer fra 50 til 1.200 mg pr dag.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av pentosanpolysulfat (PPS) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for å behandle kroniske progressive vaskulære sykdommer.

Kronisk progressiv vaskulær sykdom (CPVD) er en komplikasjon ved flere av de mest kjente sykdommer som påvirker den utviklede verden, inkludert diabetes mellitus, hypertensjon, forskjellige hyperlipidformer og lignende. Foreliggende terapeutiske moduler vedrørende CPVD har som mål å undersøke de underliggende årsakene. I de fleste tilfellene eksisterer det derimot ingen helbredelse. CPVD er i tilegg ofte ikke bare veletablert, men også langt fremskreden på det tidspunktet de underliggende årsakene får medisinsk oppmerksomhet. Dette resulterer i at man må behandle de sekundære komplikasjonene, CPVD er den mest alvorlige på grunn av at den fører til nyresvikt, slag, hjertesykdom og blindhet.

CPVD er karakterisert ved en forandring i vaskulære glatte muskelceller. En av hovedforandringene er en økning i mengden og endring av typer av bindevev som de syntetiserer. Dette resulterer i arr/sårdannelse ("scarring") og betydelige forandringer i funksjon. I blodårene fører dette til tap av elastisitet og dette resulterer i årer som ikke utvider og trekker seg sammen og som har fortykkede vegger og snevrere hulrom. Sluttresultatet er redusert blodstrømning eller fullstendig blokkering. Eksempler på vaskulære sykdommer kjennetegnet ved disse patofysiologiske prosessene innbefatter kronisk progressiv glomerulær sykdom, for eksempel diabetisk-indusert glomerulosklerose (skarring); progressiv nyresvikt etter nyretransplantasjon; okklusjon av shunter anvendt for å tilveiebringe vaskulær adgang i pasienter med nyresykdom i sluttstadiet som blir behandlet med hemodialyse; andre kroniske små blodåresykdommer (så som i noen pasienter med hypertensjon); tilbakevendelse av stenose i pasienter som har gjennomgått hjerte bypass kirurgi; og diabetisk retinopati.

Det terapeutiske målet ved en hvilken som helst behandling for CPVD må være å redusere det allerede dannede overskuddet av ekstracellulær matrix (skarring) for å gjenopprette normal årefunksjon. Det eksisterer derimot for tiden ingen direkte metode for å interferere med unormale tilstander i glatt muskelvevmetabolisme eller å modulere bindevevssyntesen til tross for deres viktighet i kronisk progressiv sykdom. Progresjon av disse sykdommene er blitt betraktet å være både uunngåelige og irreversible.

Heparin og visse analoger derav er blitt oppdaget å inhibere glatt muskelcelle proliferasjon (se for eksempel Castellot et al., J. Cell. Biol., 102: 1979-1984,1986). Disse runnene har derimot bare blitt anvendt for å forhindre vaskulære sykdommer, generelt gjennom parenteral administrering, men ikke for behandling og reversering av etablerte lesjoner. På grunn av at mindre enn 50% av pasientene med risiko utvikler CPVD og det ikke er mulig å forutsi nøyaktig hvem som vil utvikle disse sykdommene, eller hvor hurtig de vil forløpe, er en preventiv terapeutisk strategi upraktisk. Daglige injeksjoner er ikke akseptabelt for de fleste pasienter for annet enn levering av livsviktige medikamenter (så som insulin). Det er derfor spesielt viktig at et behandlingsregime blir utviklet for CPVD som fortrinnsvis innbefatter oral administrering av et farmasøytisk middel med lav toksisitet, som er effektiv for behandling og reversering av CPVD ved å forårsake regresjon og degradering av etablerte lesjoner.

Pentosanpolysulfat (PPS) er et meget sulfatert, semisyntetisk polysakkarid med en molekylvekt som varierer fra omtrent 1.500 til 6.000 Dalton, avhengig av isoleringsmetode. PPS kan være i den samme generelle klassen som hepariner og heparinoider, men det er et antall forskjeller i kjemisk struktur, derivasjonsmetoder og fysisk-kjemiske egenskaper mellom PPS og heparin. Heparin blir vanligvis isolert fra pattedyrvev, så som kjøtt og grisemuskler, lever og tarm, mens PPS er en semi-syntetisk forbindelse hvor polysakkaridskjelettet, xylan, blir ekstrahert fra barken til bøketrær eller andre plantekilder og deretter behandlet med sulfateringsmidler så som klorsulfonsyre eller sulfuryltriklorid og syre. Etter sulfatering blir PPS vanligvis behandlet med natriumhydroksid for å tilveiebringe natriumsaltet.

Som illustrert i følgende formler

HEPARIN PENTOSAN POLYSULFAT

er heparin et sulfatert polymer med gjentatte dobbelte sukkermonomerer, (D)-glukosamin og (D)-glukuronsyre (begge 6-karbon heksose sukkerforbindelser), med en

aminfunksjon på glukosaminer; PPS er en sulfatert lineær polymer med gjentatte enkelt monomerer av (D)-xylose, en 5-karbonpentose sukkerforbindelse i dets pyranoseringform. Mens heparin roterer planpolarisert lys i en dekstrorotasjonsretning roterer PPS lyset i en levorotatorisk retning.

Med hensyn på biologiske egenskaper forlenger PPS deltromboplastintiden og er blitt anvendt for å forhindre dyp venetrombose, men det har bare omtrent en femtende del av den antikoaguleringsmiddelpotensen til heparin (se generelt Wardle, J. Int. Med. Res., 20:361-370, 1992). PPS er allerede blitt beskrevet å være nyttig for behandling av urinveisinfeksjoner og interstitiell cystitt (US-PS 5.180.715) og, i kombinasjon med et angiostatisk steroid, for å stoppe angiogenese og kapillær, celle eller membranlekkasje (US-PS 4.820.693).

Noen forskere har demonstrert at PPS inhiberer proliferasjonen av glatte muskelceller og reduserer hyperlipedemi, og har på dette grunnlaget foreslått at PPS kan være nyttig profylaktisk for begrensning av aterosklerotisk plakkdannelse, inhibering av mesangial celleproliferasjon og forhindring av kollagendannelse og glomerulosklerose (Paul et al., Thromb. Res., 46: 793-801,1987; Wardle, ibid). Ingen har derimot tidligere betraktet at det var mulig å reversere vaskulær ansamling ("scarring"), dvs. PPS er ikke tidligere blitt betraktet i denne sammenhengen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av pentosanpolysulfat (PPS) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for behandling av kronisk progressiv vaskulær sykdom (CPVD), kjennetegnet ved avleiring ("scarring") og/eller fibrose i et angrepet organ eller vakulatur, for å stoppe forløpet av sykdommen og forårsake resolusjon av allerede dannede avleiringer eller fibrotiske lesjoner.

Oral administrering av PPS, for eksempel, i form av tabletter, kapsler eller lipider, kan anvendes som administreringsmetode.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 angir kvantifisering av oqlV kollagen mRNA ved konkurrerende PCR på en tiendedel av en glomerulus fra en normal 5 uker gammel mus (som beskrevet i eksempel 1, nedenfor), og angir:

a) i toppanelet, reaksjonsskjemaet og en tilsvarende etidiumbromid farvet gel etter PCR amplifikasjon; og b) i det lavere panelet, en graf som plotter forholdet av mutant kollagen cDNA pr glomerulus mot mengden av mutant cDNA plassert i hver av ni rør inneholdende

alle PCR reagenser.

Fig. 2 angir:

a) i A - B vises PAS-farvede nyresnitt fra to nefrektomiprøver med nyrecarcinom (A-normal glomerulær histologi; B-merket sklerose); b) i C - D angis immunflorescens mikroskopi, antistoff mot type IV kollagen i samme nyrer; og c) i E vises en søylegraf som reflekterer skleroseindeksen i de samme nyrene; o^IV kollagen cDNA ble bestemt ved konkurrerende PCR kvantifisering av blandinger av 50 mikrodissekterte glomeruli (verdiene er: 145 ± 22 vs. 1046 ± 74 x 10"<4 >attomo 1/glomerulus). Fig. 3 er en søylegraf som reflekterer skleroseindeksen i nyrene til fem humane pasienter uten glomerulær sklerose sammenlignet med 5 pasienter med sklerose, uttrykt i glomerulære relative celleantall og CC2IV kollagen cDNA nivåer. Fig. 4 er en søylegraf som reflekterer a2/a3lV kollagen mRNA forhold fra humane pasienter med membranholdig glomerulonefritt (MN) og diabetisk nefropati (DM) og fra nefrektomier med glomerulosklerose (NX GS) og uten glomerulosklerose (NX NI). Fig. 5 er en søylegraf som reflekterer effekten av PPS på DNA-syntesen i normale mesangialceller bestemt ved tritiert tymidininnkorporering (24 timers inkubasjon) og plottet som tritierte tellinger pr minutt pr 10^ celler vs. konsentrasjon av PPS i ug/ml. Fig. 6 er en søylegraf som reflekterer effekten av PPS på celleveksten i normale mesangial celler som plotter celleantall etter tre dager med inkubasjon vs. tilsatt konsentrasjon PPS i ug/ml. Fig. 7 er en søylegraf som reflekterer en sammenligning av effektene av PPS og heparin (med en ubehandlet kontrollgruppe) på celleveksten i normale mesangial celler etter tre og fem dager med inkubasjon. Fig. 8 er en graf som reflekterer normal mesangial celleproliferasjon over tid i celler inkubert med serum og PPS sammenlignet med kontrollcellene som bare er blitt inkubert med serum. Fig. 9 er en beskrivelse av mRNA verdier fra normale mesangial cellelag eksponert for PPS (100 ug/ml) i varierende perioder og revers-transkriberte, reflekterer økning, reduksjon eller mangel på forandringer i nivå av aj IV og aj I kollagen mRAN, kollagenaser (metalloproteinaser) 72KDa og 92KDa mRNA, vekstfaktor TGF-fl mRNA og celleprotein fl-aktin mRNA. Fig. 10 er en søylegraf som reflekterer glomerulær merkingsindeks (i prosentandel av merkede celler) i glomeruli av nyrer til GH transgene mus administrert PPS i drikkevannet sammenlignet med glomeruli fra kontrollmus som har mottatt ubehandlet vann. Fig. 11 angir resultatene av konkurrerende PCR analyser med forskjellige kollagen typer, kollagenaser og grunnmembran glykoproteiner i glomeruli til PPS-behandlede GH transgene mus analysert ved anvendelse av et laserdensitometer. Fig. 12 angir resultater av konkurrerende PCR analyser med forskjellige vekstfaktorer og aktinproteiner i glomeruli PPS-behandlede GH transgene mus analysert ved anvendelse av et laserdensitometer. Fig. 13 en søylegraf som reflekterer en sammenligning av de relative mengdene av cqlV kollagen mRNA oppnådd av glomeruli av GH transgene mus administrert PPS i drikkevannet med en kontrollgruppe av ubehandlede mus. Fig. 14 er en søylegraf som reflekterer en sammenligning av de relative mengdene av laminin B\ mRNA oppnådd av glomeruli ifølge (a) fire GH transgene mus administrert PPS i drikkevannet (2 i 2 uker og 2 i 4 uker), (b) en kontroll av ubehandlede mus og (c) to mus behandlet med PPS i fire uker. Fig. 15 er en søylegraf som reflekterer en sammenligning av de relative mengdene av blodplate-avledet vekstfaktor PDGF-B mRNA behandlet av glomeruli til GH transgene mus administrert PPS i drikkevannet med en gruppe av ubehandlede mus. Fig. 16 er en søylegraf som reflekterer en sammenligning av de relative mengdene av vekstfaktor TGF-|i mRNA dannet av glomeruli til GH transgene mus administrert PPS i drikkevannet med en gruppe av ubehandlede mus.

Foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av pentosanpolysulfat (PPS) eller et akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for behandling av en pattedyrpasient som lider av kronisk progressiv vaskulær sykdom (CPVD) kjennetegnet ved ansamlinger/arr og/eller fibrose i påvirkede organ eller vaskulatur for å stoppe progresjonen til sykdommen og forårsake oppløsning eller resolusjon av allerede dannede ansamlinger eller fibrotiske lesjoner. Nevnte medikament kan administreres til pasienten i en farmasøytisk sammensetning inneholdende en effektiv vaskulær sykdomsbehandlingsmengde pentosan polysulfat (PPS) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Sykdommene som kan behandles omfatter, men er ikke begrenset til, kronisk progressiv glomerulær sykdom, inkludert diabetisk-indusert glomerulosklerose (ansamlinger/arr); progressiv nyresvikt etter nyretransplantasjon; okklusjon av shunter anvendt for å produsere vaskulær adgang i pasienter med nyresykdom i endestadiet som blir behandlet med hemodialyse; andre kroniske små blodåresykdommer (så som i pasienter med hypertensjon); tilbakevendende stenose i pasienter som har gjennomgått coronar bypass kirurgi; og diabetisk retinopati.

Angivelsen "en effektiv vaskulær sykdomsbehandlende mengde" som anvendt heri refererer til en mengde PPS eller salt derav innkorporert i en farmasøytisk sammensetning som er effektiv når gitt en eller flere ganger daglig i en angitt tidsperiode for stopping av reversering av de progressive symptomene på ansamling-type CPVD. I humane pasienter er en total daglig dosering på omtrent 50 til omtrent 1200 mg, og fortrinnsvis fra omtrent 100 til omtrent 600 mg, PPS administrert i 1 til 4 likt inndelte doser effektiv for å oppnå det terapeutiske målet for behandling og reversering av SPVD. I mindre pattedyr kan doseringsområdet bli justert nedenfor i henhold til kroppsvekt, art og type tilstand. Oppfinnelsen er derimot ikke begrenset til et spesifikt daglig doseringsområde av PPS, men omfatter derimot administrering av PPS som et aktivt farmasøytisk middel for å behandle CPVD i pattedyr.

Den farmasøytiske sammensetning omfatter en effektiv mengde PPS og minst en farmasøytisk akseptabel inert ingrediens. Sammensetningen kan være i en hvilken som helst standard farmasøytisk doseringsform, men er fortrinnsvis en oralt administrert doseringsform.

Doseringsformer for oral levering kan innbefatte konvensjonelle tabletter, belagte

tabletter, kapsler eller piller, tabletter med forlenget frigjøring, pastiller, væsker, eliksirer eller en hvilke som helst annen oral doseringsform kjent innenfor det farmasøytiske området.

Som farmasøytiske akseptable inerte ingredienser kommer fyllstoffer, bindemidler, oppløsningsmidler osv. Som ikke interfererer med CPVD behandlingsaktiviteten av PPS også inn i bildet. Fyllstoff så som leire eller kiselholdig jord kan bli anvendt om ønskelig for å justere størrelsen på doseringsformen.

Andre ingredienser så som eksipienter og bærere kan være nædvendige for å tilveiebringe de ønskede fysiske egenskapene til doseringsformen. Slike fysiske egenskaper er for eksempel frigjøringsrate, tekstur og størrelse. Eksempler på mottagere og bærere som er nyttige i orale doseringsformer er voks så som bivoks, lakservoks, glykovoks og carnaubavoks, celluloseforbindelser så som metylcellulose, etylcellulose, karboksymetylcellulose, celluloseacetatftalat, hydroksypropylcellulose og hydroksypropylmetylcellulose, polyvinylklorid, polyvinylpyrrolidon, stearylalkohol, glycerinmonsterat, methakrylat forbindelser så som polymethakrylat, metylmethakrylat og etylenglykoldimethakrylat, polyetylenglykol og hydrofile gummier.

Anvendelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er den PPS aktive ingrediensen fortrinnsvis tilstede i en mengde mellom omtrent 50 og omtrent 300 mg pr doseringsenhet. Den nøyaktige dosen som blir administrert til hver pasient vil være en funksjon av tilstanden som blir behandlet og de fysiske karaktertrekkene til pasienten, så som alder og kroppsvekt.

Det aktive farmasøytiske ingredienset kan være PPS eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for eksempel natriumsalt. En oral doseringsform for anvendelse kan være Elmiron gelatinkapsler (Baker Norton Pharmaceuticals, Inc., Miami, Florida) som inneholder 100 mg PPS natrium og som eksipienter, mikrokrystallinsk cellulose og magnesium stearat.

Til tross for at oral administreringsvei er foretrukket omfatter foreliggende anvendelse også administrering av PPS eller et salt derav via parenterale, transdermale, transmukosale veier eller via en hvilke som helst annen administreringsvei som er kjent og som konvensjonelt blir anvendt i det medisinske og farmasøytiske området. Anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan innbefatte PPS i farmasøytiske akseptable parenterale, transdermale, transmukosale eller andre konvensjonelle bærere og doseringsformer sammen med egnede inerte oppløsningsmidler, eksipienter og additiver. Mange eksempler på slike farmasøytiske akseptable bærere kan finnes i Remington's Pharmaceutical Sciences (17th edition (1985)) og andre standardtekster. En hvilken som helst administreringsvei eller type farmasøytisk doseringsform blir anvendt og doseringsområdet for PPS aktivt ingrediens er fra omtrent 50 til omtrent 1200 mg/dag, og fortrinnsvis omtrent 100 til omtrent 600 mg/dag, til tross for at doseringsmengder mot den lave enden av det området vil fortrinnsvis bli anvendt ved parenteral administrering.

De farmasøytiske sammensetningene anvendt i anvendelsen ifølge oppfinnelsen kan innbefatte aktive ingredienser forskjellige fra PPS eller et PPS salt, for eksempel andre midler som kan være nyttige for administrering av CPVD.

Den nye anvendelsen muliggjør hensiktsmessig, trygg og effektiv behandling av pasienter som lider av forskjellige former for CPVD som i mange tilfeller kan være livs-eller organ truende. I foreliggende anvendelse kan et farmasøytisk middel som er blitt vist å ha lav toksisitet og lav forekomst av bivirkninger bli anvendt for ikke bare stoppe det som lenge har vært betraktet som uunngåelig forløp av kronisk vaskulær sykdom, men degradere de allerede dannede ansamlinger og lesjoner for å gjenopprettee normal karfunksjon.

De følgende eksemplene innbefatter (a) beskrivelse av eksperimenter som allerede er publisert i denne medisinske litteraturen som beskriver anvendelse av visse konkurrerende PCR (polymerasekjedereaksjons) teknikker for kvantifisering av ansamlings-type kollagen mRNA og beslektede faktorer i glomeruli, og som demonstrerer at relative glomerulære celleantall ikke korrelerer med produksjonsnivået av ansamlings-type kollagen, og (b) eksperimenter utført av eller under rettledning av oppfinnerene som demonstrerer in vitro og in vivo effektiviteten til PPS i ned-regulering av produksjonen til ansamlings-type kollagen og cellevekstfaktorer og oppregulerende kollagenaseaktivitete for å degradere eksisterende deponeringer av ansamlingskollagen.

EKSEMPEL 1

Kvantifisering av kollagen

Som beskrevet i Peten et al., Am. J. Physiol., 32: F951-957 (1992), kan cqlV og o^IV kollagen museglomeruli bli kvantifisert ifølge denne metoden: mengden av cDNA som representerer mRNA i en tiendedel av en glomerulus fra en normal 5 uker gammel mus og en standard mengde oq IV eller 0121V kollagenprimere ble tilsatt til hver av flere rør inneholdende alle PCR reagenser fra GeneAmp DNA Amplification Kit (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut). Seriefortynninger av muterte cDNA inneholdende enten et nytt restriksjonsenzymspaltningssete eller en delesjon ble tilsatt til denne blandingen før amplifikasjon (skjema vist i fig. 1, topp panel). Konsentrasjoner av mutanten ble bestemt i et tidligere eksperiment konstruert for å innbefatte ekvivalenspunktet (y=l).

Etter PCR amplifikasjon ble hele reaksjonsblandingen applisert direkte på en 4% NuSieve:Seakem (3:1) (FMC Bioproducts, Rockland, ME) agarosegel i et H5 Horizon gel apparatur (Life Technologies) og utsatt for elektroforese. DNA båndene ble visualisert med etidiumbromidfarving og ultrafiolett (UV) transilluminasjon. Fotografier ble tatt med positive/negative 55 Polaroidfilmer (Polaroid, Cambridge, MA) (se fig. 1), midtpanel). Gelnegativene ble scannet med endimensjonal laser densitometri, for konkurrerende PCR analyser (Shimadzu; Scientific Instruments, Columbia, MD).

Densitometriske verdier av test og mutant båndene ble beregnet, og deres forhold for hvert reaksjonsrør ble plottet som en funksjon av mengden tilsatt mutant templat (fig. 1, bunnpanel). For o^IV kollagenmutanten ble den målte densitometriske båndintensiteten korrigert med en faktor på 562/479 før plotting av mutant/testbåndforholdet. For cqlV mutante bånd ble deres densitometriske verdier tilsatt før deling med vill-type (test) båndverdien. En rett linje ble trukket ved lineær regresjonsanalyse. Mengden av cDNA i testprøven ble beregnet å være den mengden hvor mutant/testbånd tetthetsforholdet var lik 1. Konkurrerende PCR analyser ble utført i duplikat eller triplikat.

EKSEMPEL 2

Forandringer i sklerotiske glomeruli

Som beskrevet i Peten et al., J. Exp. Med. 176:1571-1576 (1992), ble unilaterale nefrektomi former med renale carcinomer oppnådd fra humane pasienter. Pasientene hadde ingen bakgrunn med diabetes, hypertensjon eller andre systemiske sykdommer assosiert med glomerulær sykdom. Prøver av kortikalt vev i avstand fra synlig tumor ble plassert i Carnoy's fikseringsvæske, nedsenket i methakrylat eller parafin, og snitt ble farvet med periodisk syre-Schiff (PAS). Tilstedeværelse av glomerulosklerose, definert som en ekspansjon av mesangialmatrise, ble uavhengig vurdert ved histologisk undersøkelse av PAS-farvet materiale (fig. 2, toppanel) og ved immunfluorescensmikroskopi av frossent snitt etter eksponering for et antistoff mot type IV kollagen (PHM-12, Silenus, Westbury, NY) (fig. 2, midtpanel).

Konkurrerende PCR analyse ble utført som beskrevet i eksempel 1 for kvantifisere mengden av ct2lV (scarring-type) ekstracellulær matrise kollagen. De relative konsentrasjonene av den kollagentypen i glomeruli tidligere funnet å være normal eller sklerotisk ble bestemt, som vist i det lavere panelet i fig. 2.

De relative celleantallene i glomeruli til 5 pasienter uten glomerulær sklerose (normal) ble sammenlignet med 5 pasienter med sklerose. Som vist i figur 3 var forskjellene mellom gruppene i glomerulært relativt celleantall ikke signifikant (p>0,8), mens for a 2lV kollagen cDNA nivåene, var forskjellen statistisk signifikant (0,01<p<0,025).

EKSEMPEL 3

Relative kollagen mRNA forhold i glomeruli fra

normale og syke nvrer

Ved anvendelse av metodologien beskrevet i eksemplene 1 og 2 ble de relative forholdene til o^/o^IV kollagen mRNA kvantifisert i glomeruli tatt fra diagnostiske biopsier av humane pasienter med membranholdig glomerulonefritt (MN) og diabetisk nefropati (DM) og fra nefrektomier med glomerulosklerose (NX GS) og uten glomerulosklerose (NX NI). Som vist i figur 4 var 012/013IV kollagen mRNA forholdene betydelig høyere i DM og i NS GS enn i NX NI. (<*>P=0,0002, <*>P=0,02).

EKSEMPEL 4

In vitro studier med PPS

Studie A

Eksperimentelt oppsett:

Normale mesangial celler (8) ble sådd ut i basalmedium pluss 20% føtalt bovint serum (Gibco, Grand Island, NY) i 24-brønn skåler (Nunc, PGC Scientific Corp., Gaithersburg, MD) i en tetthet på 2-2,5xl0<4> celler/brønn. Etter 24 timer ble mediet kastet, cellene ble vasket to ganger med PBS og inkubert i 24-72 timer i serum-fritt medium med 0,1% bovin serumalbumin (RIA kvalitet, Sigma). Mediet ble erstattet med friskt basalt medium pluss 20% føtalt bovint serum med eller uten (5-100 ug/ml PPS eller sammenlignet med standardheparin (100 ug/ml). Celler fra duplikate brønner ble trypsinert og opptelt i en Elzone celleteller (Particle Data Inc., Elmhurst, IL) på dager +3 og +5.1 parallelle brønner ble thymidin innkorporeringen bestemt ved tilsetning av 1 uCi/brønn av [<3>H] thymidin ([metyl-<3>H] thymidin); 2,0 Ci/mM; DuPont NEN, Boston, MA). Tellingene ble bestemt på dag 1 eller dag 3.

Resultater:

På dag 1 (24 timer) nådde den maksimale doseresponsen toppen ved 50 ug/ml (fig. 5), mens på dag 3 ble maksimal inhibitorisk respons registrert ved 25 ug/ml (fig. 6). Sammenligning mellom ingen tilsetning (kontroll) og heparin (100 ug/ml) og PPS (100 Hg/ml) viser at på et molart grunnlag er PPS rutinemessig to ganger så potent som nativt heparin (fig. 7). Responsene er meget reproduserbare (feilkolonnene er meget tette).

En oppsummeringsgraf (fig. 8) sammenligner effekten av PPS tilsatt til serum med kontrollceller som ble bare eksponert for serum.

Studie B

Normale mesangial cellelag ble eksponert for PPS (100 ug/ml) i varierende perioder, og revers-transkribert. mRNA nivåene ble målt for selekterte molekyler på dag 1 og sammenlignet med nivåene på dagene 3 og 5 (se fig. 9). Det var ingen foranringer i type IV kollagen mRNA og type I kollagen mRNA ble vesentlig redusert, TGF-B mRNA ble redusert med 50% og 92KDa enzymaktiviteten ble øket med mer enn 50%. Kontrollen var fl-aktin, som var uforandret, i samsvar med fravær av proliferasjon i behandlede celler.

EKSEMPEL 5

Dyrestudier med PPS

Eksperimentelt oppsett:

12-20 uker gamle GH transgene dyr ble identifisert ved PCR analyse av detergent-ekstrahert materiale fra hale biopsier ved anvendelse av spesifikke primere for bovint veksthormon cDNA som ikke kryss-reagerte med muse GH sekvensen. 4 GH mus ble behandlet (2 i 2 uker og i 4 uker) med oral PPS i drikkevannet og 4 alders-parrede GH mus mottok springvann i samme varighet. Mengen av PPS i drikkevannet (500 mg/ml) ble beregnet å gi hver mus tilsvarende 50 mg PPS pr dag.

Isolering av glomeruli og in situ revers transkripsjon:

Glomeruli ble isolert ved mikrodisseksjon i nærvær av RNase inhibitorer. Den venstre nyren ble perfusert med saltvann etterfulgt av en kollagenase oppløsning inneholdende oppløselige RNase inhibitorer. Den lavere polen ble fjernet før kollagenase perfusjonen og hurtigfrosset på tørris for zymografi. Etter kollagenasespaltningen ble 40-60 glomeruli isolert ved 4°C i nærvær av vanadyl ribonukleosidkompleks, for revers transkripsjon (RT). In situ RT ble utført som ovenfor med unntagelse av at glomeruli ble fryse-tint en gang i acetontørris og sonikert ved 2°C i 5 minutter i nærvær av 2% Triton og 4 enheter/ul human placental RNAse inhibitor (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), før tilsetning av RT komponenter. En Micro Ultrasonic Cell Disrupter (Kontes, Vineland, NJ) ble anvendt for å fryse prøvene i løpet av sonikeringen.

Standard og konkurrerende PCR analyser:

Primere for muse a\IV og cqI kollagen, glatt muskelcelle aktin, B-aktin, laminin Bl, tenascin, 92KDa metalloproteinase og 72KDa metalloproteinase mRNA, og for bovint veksthormon genomisk DNA ble syntetisert på en PCR-Mate (Applied Biosystems, Foster City, CA). Identiteten til hvert amplifiserte produkt ble verifisert ved størrelse og ved restriksjonsenzymanalyser. Primerspesifisiteten for mRNA ble bestemt ved å utelate revers transkriptase enzymet. PCR ble utført ved anvendelse av GeneAmp DNA amplifikasjonssett (Perkin Eimer Cetus, Norwalk, CT). cDNA avledet fra en blanding av 40-60 glomeruli/mus ble innledningsvis analysert ved standard PCR, ved anvendelse av logg-lineær del av PCR amplifikasjonen. Dette muliggjorde en hurtig, ikke-kvantitativ vurdering av mRNA nivåene. Deretter ble konkurrerende PCR analyser anvendt for å måle cqiV kollagen, PDGF-B, a glatt muskelcelle aktin, J3-aktin og laminin Bl cDNA ved konstruering av en cDNA mutant for hvert molekyl, med en liten indre delesjon eller et nytt restriksjonsenzymsete. Analyser av PCR produktene ble utført ved anvendelse av et PDI densitometer belastet med Quantity One® image analysis software. Konkurrerende PCR analyser ble utført i duplikat eller triplikat.

Statistiske analyser:

Uparret Student's t test, med Welch approksimasjonsmetoden, ble anvendt for sammenligninger mellom grupper og en P verdi på <0,05 ble betraktet å være signifikant. Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM.

Resultater:

Fig. 10 viser reduksjon i glomerulær merkingsindeks i PPS-behandlede mus (kontroll 0,97 ± 0,17%, PPS 0,64 ± 0,05%, p<0,05).

Gelene som viste resultatene av konkurrerende PCR analyser med forskjellige kollagentyper, metalloproteinaser, grunnmembranglykoproteiner, vekstfaktorer og aktinproteiner er vist i fig. 11 og 12. Fig. 13 viser at ajIV kollagen mRNA ble redusert ved PPS behandlingen (kontroll 982 ± 106, PPS 738 ± 75, p<0,01) (attomol/glomerulus). Fig. 14 viser at laminin B\ mRNA ble redusert ved PPS behandlingen (kontroll 1403 453, PPS 861,5 ± 18,3, p=0,05) (attomol/glomerulus). Fig. 15 viser at PDGF-B mRNA ble redusert ved PPS behandlingen (kontroll 53,97 ± 17,21, PPS 28,9 pp 17,21, PPS 28,9 ± 9,4, p<0,04). Fig. 16 viser at TGF-fl mRNA ble redusert ved PPS behandling (kontroll 181 ± 35,7, PPS 102,85 ± 21,61, p<0,05) (attomol/glomerulus).

fi-aktin nivåene var vesentlig stabile i PPS behandlede mus som verifiserer at reduksjonen i de andre faktorene ikke var et resultat av en redusert celleproliferasjon.

Ovennevnte data, dannet ifølge vitenskapelige gyldige eksperimentelle prosedyrer, demonstrerer effektiviteten til PPS når det gjelder å øke syntesen av overskudd ekstra-cellulært matrisekollagen og visse cellulære vekstfaktorer, mens aktiviteten til kollagen degraderingsenzymene er blitt økt. Disse effektene indikerer at PPS er meget effektiv for klinisk behandlig og reversering av "scarring"-type CPVD.

Det er følgelig blitt vist at det er beskrevet fremgangsmåter og sammensetninger som fører til oppnåelse av de forskjellige hensiktene ifølge oppfinnelsen og som er godt tilpasset for å oppfylle kravene for praktisk anvendelse.

Claims

1. Anvendelse av pentosanpolysulfat (PPS) eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for fremstilling av et medikament for behandling av kronisk progressiv vaskulær sykdom (CPVD), kjennetegnet ved avleiring ("scarring") og/eller fibrose i et angrepet organ eller vakulatur, for å stoppe forløpet av sykdommen og forårsake resolusjon av allerede dannede avleiringer eller fibrotiske lesjoner.

2. Anvendelsen av PPS ifølge krav 1, hvori nevnte sykdom blir selektert fra kronisk progressiv glomerulær sykdom som inkluderer diabetesindusert glomerulosclerose ("scarring"); progressiv nyresvikt etter nyretransplantasjon; okklusjon av "shunter" brukt for å tilveiebringe vaskulær adgang hos pasienter med endestadie-nyresykdom som behandles med hemodialyse; kroniske sykdommer i de små blodårene; tilbakevendende stenose hos pasienter som har gjennomgått koronar bypass-kirurgi; og diabetisk retinopati.

3. Anvendelsen av PPS ifølge krav 2, hvori nevnte sykdom er en kronisk progressiv glomerulær sykdom.

4. Anvendelsen ifølge krav 1, hvor nevnte sammensetning inneholder en tilstrekkelig mengde PPS for å tilveiebringe hele - eller en vesentlig del av - en total dose av PPS eller PPS-salt som er effektiv for behandling og reversering av pasientens sykdom.

5. Anvendelsen av PPS ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor den daglige dose av medikamentet er fra 50 til 1200 mg.

6. Anvendelsen av PPS ifølge krav 5, hvor den daglige dose av nevnte medikament er fra 100 til 600 mg.

7. Anvendelsen ifølge krav 4, hvor nevnte daglige dosering administreres i 1 til 4 likt inndelte doser.

8. Anvendelsen av PPS ifølge et hvilket som helst av de tidligere krav, hvor medikamentet blir administrert i en oral doseform.

9. Anvendelsen av PPS ifølge krav 8, hvor nevnte doseform blir valgt fra konvensjonelle eller vedvarende frigivelsestabletter, belagte tabletter, kapsler, piller, pastiller, væsker og eliksirer.

10. Anvendelsen av PPS ifølge krav 8 eller 9, hvor nevnte doseform inkluderer minst ett farmasøytisk akseptabelt inert ingrediens.

11. Anvendelsen av PPS ifølge krav 10, hvor nevnte inerte ingrediens er et fyllstoff, binde-middel, løsningsmiddel, eksipient eller bærer.

12. Anvendelsen av PPS ifølge hvilket som helst av kravene 8 til 11, hvor nevnte doseform inneholder fra 50 til 300 mg pr. enhet av PPS eller farmasøytisk akseptabelt salt derav.

13. Anvendelsen av PPS ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor nevnte farma-søytisk akseptable salt er natriumsalt.

14. Anvendelsen av PPS ifølge krav 13, hvor medikamentet er i form av en gelatinkapsel som inneholder PPS-natrium, mikrokrystallinsk cellulose og magnesiumstearat.

15. Anvendelsen av PPS ifølge hvilket som helst av de foregående krav, hvor nevnte medikament ytterligere omfatter en farmasøytisk aktiv ingrediens.