NO20210430A1 - PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS - Google Patents
PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS Download PDFInfo
- Publication number
- NO20210430A1 NO20210430A1 NO20210430A NO20210430A NO20210430A1 NO 20210430 A1 NO20210430 A1 NO 20210430A1 NO 20210430 A NO20210430 A NO 20210430A NO 20210430 A NO20210430 A NO 20210430A NO 20210430 A1 NO20210430 A1 NO 20210430A1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- microorganism
- sample
- reporter molecule
- sequence
- detecting
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 42
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 26
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 22
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 19
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 17
- 230000014616 translation Effects 0.000 claims description 17
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 15
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 claims description 14
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 12
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 12
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 25
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 15
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 108091005948 blue fluorescent proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 description 9
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 8
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 description 7
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 7
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 7
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 7
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 6
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 5
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 5
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N Guanine Natural products O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 3
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- IVSXFFJGASXYCL-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=NC=N[C]21 IVSXFFJGASXYCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 108091079001 CRISPR RNA Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 108091028113 Trans-activating crRNA Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- -1 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- Chemical group 0.000 description 1
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 108020000946 Bacterial DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 240000003243 Thuja occidentalis Species 0.000 description 1
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 1
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001320 aldopentoses Chemical class 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000266 alpha-aminoacyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 1
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N o-dihydroxy-benzene Natural products OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012123 point-of-care testing Methods 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004708 ribosome subunit Anatomy 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
BESKRIVELSE DESCRIPTION
1 FREMGANGSMÅTE FOR PÅVISNING AV MIKROORGANISMER ELLER GENFEIL 1 PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS
2 OPPFINNELSENS BAKGRUNN OG FORMÅL 2 BACKGROUND AND PURPOSE OF THE INVENTION
2.1 Innledning 2.1 Introduction
Oppfinnelsen er en ny fremgangsmåte for påvisning av en mikroorganisme (bakterie, virus, sopp mv.) i en organisk prøve, slik at diagnostisering av infeksjonssykdommer kan finne sted utenfor et laboratorium på en rask og kostnadseffektiv måte ved hjelp av på forhånd tilpasset testutstyr. The invention is a new method for detecting a microorganism (bacterium, virus, fungus, etc.) in an organic sample, so that the diagnosis of infectious diseases can take place outside a laboratory in a fast and cost-effective way using pre-adapted test equipment.
Fremgangsmåten kan også benyttes til påvisning av genfeil, for eksempel Huntingtons, ved at det tas biopsi og testes for korrekt genetisk sekvens. Negativt testresultat vil i så fall innebære påvisning av genfeil. The procedure can also be used to detect gene defects, for example Huntington's, by taking a biopsy and testing for the correct genetic sequence. In that case, a negative test result will mean detection of a gene defect.
CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) er en metode for genredigering, som gjør det mulig å foreta kutt i predefinerte deler av arvemateriale (DNA) (figur 1 og 2). Den mest utbredte anvendelsen av CRISPR benytter Cas9-enzymet og en RNA-sekvens (guide RNA) som gjenkjenner eller guider til det stedet hvor CRISPR skal kutte i DNAet. CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) is a method of gene editing, which makes it possible to make cuts in predefined parts of genetic material (DNA) (figures 1 and 2). The most widespread application of CRISPR uses the Cas9 enzyme and an RNA sequence (guide RNA) that recognizes or guides to the place where CRISPR should cut the DNA.
Det er kjent teknikk å benytte CRIPSR til diagnostisering av infeksjonssykdommer. En utfordring med kjent teknikk, er imidlertid at det er nødvendig med laboratoriekapasitet/spesialutstyr for å analysere prøver og diagnostisering. Det spesielle med oppfinnelsen, er at CRISPR kombineres med produksjonskapasiteten til CPFS (Cell Free Protein Synthesis). It is a known technique to use CRIPSR for the diagnosis of infectious diseases. A challenge with known technology, however, is that laboratory capacity/special equipment is needed to analyze samples and diagnosis. The special feature of the invention is that CRISPR is combined with the production capacity of CPFS (Cell Free Protein Synthesis).
Oppfinnelsen innebærer at det kan lages diagnostiseringsutstyr/testbeholdere for en eller flere pre-definerte mikroorganismer. Ved tilsetting av en organisk prøve (i praksis en kroppsvæske som spytt eller blod) til diagnostiseringsutstyret/testbeholderen, vil det raskere og mer effektivt enn med kjent teknikk kunne verifiseres hvorvidt mikroorganismen det testes for er til stede i prøven. The invention implies that diagnostic equipment/test containers can be made for one or more pre-defined microorganisms. By adding an organic sample (in practice a body fluid such as saliva or blood) to the diagnostic equipment/test container, it will be possible to verify faster and more efficiently than with known techniques whether the microorganism being tested for is present in the sample.
Verifikasjon skjer ved at den avkuttede delen av mikroorganismens DNA fosforyleres (figur 3) og deretter ligeres med DNA for et reportermolekyl (figur 4). Ligase metoden som benyttes er NHEJ (non homologues end joining). Verification takes place by phosphorylating the cut-off part of the microorganism's DNA (figure 3) and then ligating with DNA for a reporter molecule (figure 4). The ligase method used is NHEJ (non homologues end joining).
En spesifikk basesekvens på enden av hver DNA-streng vil etter ligering av de to DNA-delene danne et komplett startkodon. Den ligerte DNA sekvensen av virus/bakterie DNA og reporter molekyl DNA danner sammen en komplett promotor/TSS, som etterfølges av en reporter molekyl sekvens og til slutt et stoppkodon (figur 5). Dette resulterer igjen i amplifikasjon gjennom bruk av RNA polymerase, som produserer mRNA for videre proteinsyntese av et reportermolkyl (figur 6). A specific base sequence at the end of each DNA strand will, after ligation of the two DNA parts, form a complete start codon. The ligated DNA sequence of virus/bacterial DNA and reporter molecule DNA together form a complete promoter/TSS, which is followed by a reporter molecule sequence and finally a stop codon (figure 5). This in turn results in amplification through the use of RNA polymerase, which produces mRNA for further protein synthesis by a reporter molecule (figure 6).
Ribosomer kobles til mRNA sekvenser som koder for reportermolekyl (figur 7). Etter kobling vil ribosom produsere aminosyrekjeder, som enten alene eller ved hjelp av chaperoner vil folde seg til et funksjonelt protein (fig 8) Ribosomes are connected to mRNA sequences that code for reporter molecules (figure 7). After coupling, the ribosome will produce amino acid chains, which either alone or with the help of chaperones will fold into a functional protein (fig 8)
Hovedgrunnen til at oppfinnelsen vil fungere som deteksjonsmetode, er at amplifikasjonsprosessen ikke vil kunne starte med mindre den genetiske sekvensen det testes for er til stede i prøven. En falsk positiv test er svært lite sannsynlig da guide RNA (+/- 20 baser lang) må samstemme nøyaktig med sekvens for sykdom før prosedyren fortsetter. Sannsynligheten for at dette skjer tilfeldig er 5,8*10<-11 >% (matematisk beregnet med utgangspunkt 17 baser for guide RNA). Ettersom promotøren/TSS til sekvensen som koder for et reporter molekyl ikke er komplett før den ligeres med den genetiske sekvensen det testes for (som dermed gir matchende "overhang", jf. figur 4), vil ikke proteinsyntesen starte med mindre mikroorganismen det testes for et til stede i prøven. Dette betyr at dersom reportermolekyler har oppstått, er det med sikkerhet et positivt testresultat. The main reason why the invention will work as a detection method is that the amplification process will not be able to start unless the genetic sequence being tested for is present in the sample. A false positive test is very unlikely as the guide RNA (+/- 20 bases long) must match exactly with the sequence for disease before the procedure can proceed. The probability of this happening by chance is 5.8*10<-11 >% (mathematically calculated based on 17 bases for guide RNA). As the promoter/TSS of the sequence that codes for a reporter molecule is not complete before it is ligated with the genetic sequence it is being tested for (which thus gives a matching "overhang", cf. Figure 4), protein synthesis will not start unless the microorganism is being tested for a present in the sample. This means that if reporter molecules have occurred, there is certainty a positive test result.
Positivt testresultat vil avdekkes ved at det oppstår fargeforandring eller fluorescens i prøven, som et resultat av proteinsyntesen. Hvorvidt verifikasjon skjer ved fargeforandring eller fluorescens, vil bero på valget av reporter molekyl. A positive test result will be revealed by the occurrence of a color change or fluorescence in the sample, as a result of protein synthesis. Whether verification takes place by color change or fluorescence will depend on the choice of reporter molecule.
Denne oppfinnelsen og prosessen refereres heretter til som CAPS (Cas redigert proteinsyntese) This invention and process is hereinafter referred to as CAPS (Cas edited protein synthesis)
2.2 Nærmere beskrivelse av oppfinnelsen 2.2 Detailed description of the invention
Fremgangsmåten kan deles inn i tre distinkte består faser: sekvens match, amplifikasjon og observasjon. The procedure can be divided into three distinct phases: sequence match, amplification and observation.
I den første fasen blir prøven som skal testes for en spesifikk mikroorganisme (eller genfeil) tilsatt en beholder som inneholder selve testen. Prøven kan bestå av spytt, blod eller andre kroppsvæsker hvor mikroorganismene det testes for kan befinne seg. In the first phase, the sample to be tested for a specific microorganism (or gene defect) is added to a container containing the test itself. The sample can consist of saliva, blood or other body fluids where the microorganisms being tested for can be found.
Når prøven er tilført testbeholderen, vil først detergenten bryte ned cellemembranen (evt. kapsidet) og DNA-et blir sluppet fri. DNA sekvensen, som vil være unik for den mikroorganismene det testes for, kan bli plukket opp av et CRISPR-Cas kompleks, hvor sekvensen det skal matches med er valgt ut ved hjelp av et RNA-molekyl kalt sgRNA (single-guide RNA). Når en unik match har oppstått vil Cas-komplekset kløyve den spesifikke sykdoms sekvensen og etterlate en "overhang" som da kun vil matche en reporter molekyl DNA sekvens som er til stede i testen fra før. Dette vil derved fullføre en promotør sekvens. Det er fordi "overhangene" matcher at disse to sekvensene kan ligeres, og syntese kan starte. Lengden på sekvensen som skal matche kan variere mellom ulike Cas komplekser, men er ofte mellom 17-25 baser lang. Sannsynligheten for at 17 baser finnes tilfeldig i en prøve er tilnærmet null (5,8*10<-11 >%). CRISPR/Cas er derfor globalt anerkjent som et meget nøyaktig verktøy. When the sample has been added to the test container, the detergent will first break down the cell membrane (possibly the capsid) and the DNA will be released. The DNA sequence, which will be unique to the microorganisms being tested for, can be picked up by a CRISPR-Cas complex, where the sequence to be matched with is selected using an RNA molecule called sgRNA (single-guide RNA). When a unique match has occurred, the Cas complex will cleave the specific disease sequence and leave an "overhang" which will then only match a reporter molecule DNA sequence that is present in the test from before. This will thereby complete a promoter sequence. It is because the "overhangs" match that these two sequences can be ligated, and synthesis can begin. The length of the sequence to match can vary between different Cas complexes, but is often between 17-25 bases long. The probability that 17 bases are found by chance in a sample is close to zero (5.8*10<-11 >%). CRISPR/Cas is therefore globally recognized as a very accurate tool.
Det er to årsaker til at syntesen av reportermolekyl ikke kan forekomme uten sykdomssekvens tilstede: There are two reasons why the synthesis of the reporter molecule cannot occur without the disease sequence present:
● RNAPolymerase krever å koble seg til et hvis antall baser oppstrøm før promotør (før sekvens som koder for reportermolekyl) for å kunne produsere mRNA ● RNAPolymerase requires binding to a whose number of bases upstream before the promoter (before the sequence that codes for the reporter molecule) in order to produce mRNA
● Promotøren vil i seg selv ikke være komplett før ligering med sykdomssekvens (steg 6) ● The promoter itself will not be complete before ligation with the disease sequence (step 6)
Den neste hovedfasen er amplifikasjonen, som foregår i fire trinn. The next main phase is the amplification, which takes place in four stages.
Det første trinnet er via transkripsjon, hvor DNA oversettes til mRNA. The first step is via transcription, where DNA is translated into mRNA.
Amplifikasjon i dette trinnet utføres ved at man benytter seg av RNA polymerase (RNAP), som da leser av den spleisede virus/bakterie- reporter molekyl DNA sekvensen, og danner en mRNA for videre proteinsyntese. Amplification in this step is carried out by using RNA polymerase (RNAP), which then reads the spliced virus/bacterial reporter molecule DNA sequence, and forms an mRNA for further protein synthesis.
Denne amplifikasjonen kan kontrolleres /styres med gradienten /mengden tilsatt RNA polymerase. Med en høyere gradient øker sannsynligheten for at den samme DNA tråden gjennomgår prosedyren på nytt med en ny RNAP. This amplification can be controlled/directed with the gradient/amount of added RNA polymerase. With a higher gradient, the probability that the same DNA strand undergoes the procedure again with a new RNAP increases.
Neste amplifikasjonstrinn kan være nødvendig for overordnet funksjonalitet. Ved å benytte en DNA sekvens som inneholder flere av den samme sekvensen for reportermolekyl etter hverandre, kan det benyttes en annen versjon av Cas (Cas13) til å kutte opp den ene lange sekvensen til for eksempel 10 mRNA sekvenser som hver koder for ett reporter molekyl. Dermed har man 10 mRNA sekvenser på en runde med transkripsjon. Målsettingen er å øke konsentrasjonen av mRNA for reportermolekyl for å skape et sterkere signal som kan oppdages uten deteksjons utstyr. Next amplification step may be required for overall functionality. By using a DNA sequence that contains several of the same sequence for reporter molecule one after the other, another version of Cas (Cas13) can be used to cut up the one long sequence into, for example, 10 mRNA sequences that each code for one reporter molecule . Thus, one has 10 mRNA sequences in one round of transcription. The objective is to increase the concentration of mRNA for the reporter molecule to create a stronger signal that can be detected without detection equipment.
Neste amplifikasjonstrinn er ved selve proteinsyntesen, hvor hvert mRNA kan benyttes/transkriberes flere ganger av ribosomer. Ved å ha en høy gradient av ribosomer til stede vil det dermed la seg gjøre å kontrollere hastigheten til reaksjonen. The next amplification step is during protein synthesis itself, where each mRNA can be used/transcribed several times by ribosomes. By having a high gradient of ribosomes present, it will thus be possible to control the speed of the reaction.
Det siste amplifikasjonstrinnet knytter seg til valg av reporter molekyl. Man kan enten benytte et reporter molekyl som i seg selv kan detektere, ved at det gir en klar fargeforandring, eller man benytter et reporter molekyl som igjen utfører en kaskade reaksjon. Da vil man kunne få enda et trinn som kan reguleres etter behov. Prinsippet vil i siste amplifikasjonstrinn uansett være det samme, ved at man kan detektere tilstedeværelsen av reportermolekyl ved en fargeforandring i prøven. The last amplification step is linked to the choice of reporter molecule. You can either use a reporter molecule which can itself detect, as it produces a clear color change, or you use a reporter molecule which in turn carries out a cascade reaction. Then you will be able to get another step that can be regulated as needed. The principle will be the same in the final amplification step anyway, in that the presence of the reporter molecule can be detected by a color change in the sample.
Ett eksempel på et mulig reporter molekyl er ■-galactosidase kombinert med X-gal. ■-galactosidase, som kun produseres via CFPS hvis guideRNA matcher sykdomssekvens, vil kontinuerlig bryte opp båndene i X-gal ved enzym katalysert hydrolyse for å danne en sterk, blå farge. Dette amplifiserer signalet ytterligere. Andre mulige reportermolekyl her kan være GUS (betaglucoronidase) eller XylE (catechol dioxygenase). One example of a possible reporter molecule is β-galactosidase combined with X-gal. ■-galactosidase, which is only produced via CFPS if the guideRNA matches the disease sequence, will continuously break up the bonds in X-gal by enzyme catalyzed hydrolysis to form a strong blue color. This further amplifies the signal. Other possible reporter molecules here could be GUS (betaglucoronidase) or XylE (catechol dioxygenase).
Med firetrinnsamplifikasjon etter at de to DNA sekvensene blir ligert, kan man se resultatet uten å behøve instrumenter og man kan dermed gjennomføre testen utenfor et laboratorium. Siden alle trinnene skjer via Cas redigert proteinsyntese (CAPS) er det eneste som kreves fra personen som skal benytte testen å tilsette f.eks. spytt å vente en gitt tid. Testen kan dermed utføres uten fagfolk. With four-step amplification after the two DNA sequences are ligated, the result can be seen without the need for instruments and the test can thus be carried out outside a laboratory. Since all steps take place via Cas edited protein synthesis (CAPS), the only thing that is required from the person who will use the test is to add e.g. spit to wait a given time. The test can thus be carried out without professionals.
Det finnes flere patenter som bygger på CRISPR for deteksjon av mikroorganismer, blant annet "Sherlock" (WO2018170340A1). Det nye med oppfinnelsen er imidlertid kombinasjonen av CRISPR med matchingen med valgt sekvens fra reporter molekyl, som ligeres ved ligase og ATP, samt den ovenfor beskrevne amplifikasjonsprosessen. Forskjellene på oppfinnelsen og kjent teknikk, er illustrert i følgende tabell: There are several patents based on CRISPR for the detection of microorganisms, including "Sherlock" (WO2018170340A1). What is new about the invention, however, is the combination of CRISPR with the matching with the selected sequence from the reporter molecule, which is ligated by ligase and ATP, as well as the amplification process described above. The differences between the invention and prior art are illustrated in the following table:
2.3 Generelt om detergenter, CRISPR og protein syntese 2.3 General information about detergents, CRISPR and protein synthesis
2.3.1 Detergenter 2.3.1 Detergents
Detergenter er i biologisk forstand en substans som kan bryte opp cellemembraner. Dette gjøres ved at detergenten fester seg til fosfolipidmembraner, cellevegger, for deretter å erstatte og fortrenge membranens fosfolipider. Dette skjer som følge av at detergenten har høyere affinitet enn de originale fosfolipidene. Cellemembranens fosfolipider vil da forme miceller, som er en aggregering av lipider hvor fosfolipidcellene pakker seg sammen. Som en konsekvens av dette vil etter hvert cellemembranen sprekke eller danne hull som følge av mangel på fosfolipider. Celleveggen vil så brytes opp og cellens innhold, inkludert DNA som det testes for ved hjelp av oppfinnelsen, vil lekke ut og kan plukkes opp av CRISPR-Cas komplekset. Detergents are, in the biological sense, a substance that can break up cell membranes. This is done by the detergent attaching to phospholipid membranes, cell walls, and then replacing and displacing the membrane's phospholipids. This happens as a result of the detergent having a higher affinity than the original phospholipids. The cell membrane's phospholipids will then form micelles, which are an aggregation of lipids where the phospholipid cells pack together. As a consequence of this, the cell membrane will eventually burst or form holes as a result of a lack of phospholipids. The cell wall will then break open and the cell's contents, including DNA that is tested for using the invention, will leak out and can be picked up by the CRISPR-Cas complex.
Valg av detergent ved utførelsen av oppfinnelsen vil bero på hvilken type cellevegg, altså hvilken mikroorganisme, som er av interesse. Det vil videre være fordelaktig å velge en detergent som ikke er skadelig for andre komponenter som kreves for å syntetisere reportermolekylet. The choice of detergent when carrying out the invention will depend on which type of cell wall, i.e. which microorganism, is of interest. It would also be advantageous to choose a detergent that is not harmful to other components required to synthesize the reporter molecule.
Det kan påpekes at dette er kjent teknologi og at det her eksisterer en rekke muligheter. It can be pointed out that this is known technology and that there are a number of possibilities here.
2.3.2 CRISPR-Cas komplekset 2.3.2 The CRISPR-Cas complex
CRISPR-Cas systemet er originalt en del av immunforsvaret i bakterier og archea. Det er senere oppdaget at man kan programmere systemet til å fungere som en RNA-veiledet endonuklease. Endonuklease er en gruppe enzymer som kan kløyve fosfodiester bånd i polynukleotide kjeder. The CRISPR-Cas system is originally part of the immune system in bacteria and archaea. It has subsequently been discovered that the system can be programmed to function as an RNA-guided endonuclease. Endonuclease is a group of enzymes that can cleave phosphodiester bonds in polynucleotide chains.
Dette betyr at man i et system kan kutte DNA der man måtte ønske, samt redigere DNA ved å ligere med ønsket annen DNA sekvens for å kunne f.eks å kunne produsere et nytt produkt ( i vårt tilfelle en DNA sekvens for reportermolekyl) This means that in a system you can cut DNA wherever you want, as well as edit DNA by ligating with the desired other DNA sequence in order to be able to, for example, produce a new product (in our case a DNA sequence for a reporter molecule)
Det fins fem hovedgrupper i CRISPR familien. Her forklares type II/Cas9 som eksempel. CRISPR RNA (crRNA) interagerer med «trans-activating crRNA» (tracrRNA) og former et dupleks. Dette komplekset forteller hvor Cas9 skal kutte DNA heliksen. Dette komplekset kan erstattes med «single guide RNA», som da gjør det mulig å velge hvor Cas komplekset skal kutte. Sekvensen som velger lokasjon for kutting er vanligvis rundt 20 base par lang og må være i nærheten av en «protospacer adjacent motif» (PAM). Cas9 sin PAM er NGG (X/Guanine/Guanine) eller NAG (X/Adenosine/Guanine)- som er litt mindre effektiv), hvor N er hvilket som helst nukleotid. Selv om PAM må velges selektivt er det mange muligheter siden PAM ofte ikke er veldig spesifikke og man kan velge PAM ut ifra gRNA sekvensen. Sensitiviteten til CRISPR kommer fra lengden til gRNA, siden sekvensen må matche eksakt for at Cas-komplekset kutter og sjansen for at en matchende sekvens er til stede ved en tilfeldighet er ca 5,8*10<-11 >% (en sannsynlighetsberegning basert på 17 baser) There are five main groups in the CRISPR family. Type II/Cas9 is explained here as an example. CRISPR RNA (crRNA) interacts with "trans-activating crRNA" (tracrRNA) and forms a duplex. This complex tells where Cas9 should cut the DNA helix. This complex can be replaced with "single guide RNA", which then makes it possible to choose where the Cas complex should cut. The sequence that selects the location for cutting is usually about 20 base pairs long and must be close to a "protospacer adjacent motif" (PAM). Cas9's PAM is NGG (X/Guanine/Guanine) or NAG (X/Adenosine/Guanine) - which is slightly less effective), where N is any nucleotide. Although the PAM must be chosen selectively, there are many possibilities since the PAM is often not very specific and one can choose the PAM based on the gRNA sequence. The sensitivity of CRISPR comes from the length of the gRNA, since the sequence must match exactly for the Cas complex to cut and the chance that a matching sequence is present by chance is about 5.8*10<-11 >% (a probability calculation based on 17 bases)
Cas-komplekset som skal benyttes i denne metoden kalles Cpf1, valgt for dens kapasitet til å skape "overhang" når den kutter, men er ellers relativt lik Cas9. The Cas complex to be used in this method is called Cpf1, chosen for its capacity to create "overhangs" when it cuts, but is otherwise relatively similar to Cas9.
2.3.3 CFPS 2.3.3 CFPS
Cell free protein synthesis (CFPS) er en metode hvor et velfungerende «protein maskineri» blir tatt ut av en celle, renset og kan deretter brukes til å produsere proteinene vi måtte ønske. Dette kan gjøres ved å gi «maskineriet» DNA som koder for de ønskede proteinene. Maskineriet er komplett med transkripsjon og translasjon. Cell free protein synthesis (CFPS) is a method where a well-functioning "protein machinery" is taken out of a cell, purified and can then be used to produce the proteins we want. This can be done by giving the "machinery" DNA that codes for the desired proteins. The machinery is complete with transcription and translation.
CFPS er en relativ gammel teknologi som har skapt mange muligheter for å utrykke proteiner. Teknologien produserer proteiner ved å tilføre en DNA mal, energi (i form av ATP), salter, kofaktorer og substrater til et allerede isolert celleekstrakt som har blitt forberedt i et vekstmedium og deretter eksponert for cellelyseringsteknikker og prosessering. CFPS is a relatively old technology that has created many possibilities for expressing proteins. The technology produces proteins by adding a DNA template, energy (in the form of ATP), salts, cofactors and substrates to an already isolated cell extract that has been prepared in a growth medium and then exposed to cell lysis techniques and processing.
Fordelene med CFPS er at en ikke er avhengig av levende celler og kan derfor fokusere hele systemets energi på å produsere det ønskede proteinet. The advantages of CFPS are that one is not dependent on living cells and can therefore focus the entire system's energy on producing the desired protein.
Systemet kan ha høyere effektivitet enn transfekterte bakterier, siden bakterier vil fordele energien også til andre oppgaver enn proteinsyntese. The system can have a higher efficiency than transfected bacteria, since bacteria will distribute the energy also to tasks other than protein synthesis.
Muligheten til å justere produksjonskomponenter og miljøet vil være essensielt for optimal produksjon av reportermolekylet. Mange ulike versjoner av CFPS er utviklet over de siste seksti årene, der de mest brukte er: The ability to adjust production components and the environment will be essential for optimal production of the reporter molecule. Many different versions of CFPS have been developed over the last sixty years, the most commonly used being:
Escherichia coli, Spodoptera, Saccharomyces cerevisiae (gjær), kanin retikulocytt, hvetekim og HeLA celler. Siden det er mange kombinasjoner av proteinsyntese å velge mellom, kan en optimal løsning velges med tanke på reaksjonstid. Et alternativ til celleekstrakt CFPS er PURE (protein synthesis using recombinant elements). Dette systemet benytter individuelle rensede komponenter istedenfor celleekstrakt, men inneholder fortsatt alle komponenter som trengs, inkludert translasjonsfaktorer som via manipulasjon produseres i høyere grad enn normalt, og renses etter behov. Escherichia coli, Spodoptera, Saccharomyces cerevisiae (yeast), rabbit reticulocyte, wheat germ and HeLA cells. Since there are many combinations of protein synthesis to choose from, an optimal solution can be chosen in terms of reaction time. An alternative to cell extract CFPS is PURE (protein synthesis using recombinant elements). This system uses individual purified components instead of cell extract, but still contains all the components needed, including translation factors that are produced via manipulation to a higher degree than normal, and purified as needed.
Denne metoden er å foretrekke med tanke på at det gjør det mulig å kontrollere gradienten av de forskjellige komponentene og man unngår også problemer med proteaser (proteiner som bryter peptidbånd vha. hydrolyse). This method is preferable considering that it makes it possible to control the gradient of the different components and also avoids problems with proteases (proteins that break peptide bonds by hydrolysis).
2.4 En beskrivelse av prosessen som vil foregå i et CFPS/PURE system 2.4 A description of the process that will take place in a CFPS/PURE system
Prosessen hvor DNA oversettes til RNA via en RNA polymerase (ribonucleic acid) kalles for transkripsjon. Det som skiller RNA fra DNA er bl.a. en hydroksylgruppe på 2’ posisjon til aldopentosen, «ryggmargen» til DNA/RNA», og at den har uracil istedenfor thymine baser. Etter at RNA polymerase har oversatt DNA til mRNA (messenger RNA) vil ribosomer (som i dette tilfellet befinner seg i cytosolen) plukke opp sekvensen og steg for steg, matche den med rRNA (ribosomalt RNA) og deretter rekruttere de matchende aminosyrene ved hjelp av en tRNA (transfer RNA). tRNA består av antikodoner til mRNA som koder for en spesifikk aminosyre (heretter kalt AA). For eksempel så er mRNA koden til lysin «AAG» og tRNA som er koblet til lysin er da UUC og vil bli rekruttert hvis en match oppstår. Aminosyrer kobles til den eksisterende kjeden til et stoppkodon blir avlest. The process where DNA is translated into RNA via an RNA polymerase (ribonucleic acid) is called transcription. What distinguishes RNA from DNA is i.a. a hydroxyl group at the 2' position to the aldopentose, the "backbone" of DNA/RNA", and that it has uracil instead of thymine bases. After RNA polymerase has translated the DNA into mRNA (messenger RNA), ribosomes (which in this case are located in the cytosol) will pick up the sequence and step by step, match it with rRNA (ribosomal RNA) and then recruit the matching amino acids using a tRNA (transfer RNA). tRNA consists of anticodons to mRNA that code for a specific amino acid (hereafter called AA). For example, mRNA is the code for lysine "AAG" and tRNA that is connected to lysine is then UUC and will be recruited if a match occurs. Amino acids are added to the existing chain until a stop codon is read.
«Eksoner og introner» er ikke nødvending for CFPS/PURE og derfor ikke forklart. "Exons and introns" are not essential for CFPS/PURE and therefore not explained.
RNA transkripsjon kan deles i tre deler; innledning, forlengelse og avslutning. Innledningen skjer når RNA polymerase (RNAP) bindes til en region av DNA-et som kalles en promotør. RNAP vil, etter at den har funnet et start kodon, skille de to trådene til DNA heliksen fra hverandre og transkripsjon vil starte. Dette skjer ved å legge til nukleosid-5’-trifosfater (NTP) til 3’ enden av RNA kjeden. Transkripsjonen vil derfor kopiere 3-‘5 matchen til DNA. Forlengelse skjer ved at NTP kommer gjennom en egen NTP kanal til RNAP og 3’-OH gruppen til angriper alpha fosfatet og bruker bindingsenergien til å legge til basen. Gjennom denne prosessen vil RNAP danne en kort RNA/DNA-hybrid for å finne en matchende base og koble av de kommende 17 baseparene (bp) i DNA sekvensen. Avslutning skjer når RNAP avleser et stop kodon. Komplekset er her ikke forklart med henhold til alpha, beta, sigma og omega delene, men for enkelthets skyld beskrevet som et holo-kompleks. RNA transcription can be divided into three parts; introduction, extension and conclusion. Initiation occurs when RNA polymerase (RNAP) binds to a region of the DNA called a promoter. RNAP will, after it has found a start codon, separate the two strands of the DNA helix from each other and transcription will start. This happens by adding nucleoside-5'-triphosphates (NTP) to the 3' end of the RNA chain. The transcription will therefore copy the 3-'5 match to DNA. Elongation occurs when NTP comes through a separate NTP channel to RNAP and the 3'-OH group attacks the alpha phosphate and uses the binding energy to add the base. Through this process, RNAP will form a short RNA/DNA hybrid to find a matching base and disconnect the upcoming 17 base pairs (bp) in the DNA sequence. Termination occurs when RNAP reads a stop codon. The complex is not explained here according to the alpha, beta, sigma and omega parts, but for the sake of simplicity described as a holo-complex.
Ribosomal aktivitet, translasjon, kan deles i tre deler; innledning, forlengelse og avslutning. I innledningen vil karboksylgruppen til hver AA bli aktivert i cytosolen ved å koble den til en tRNA, en prosess som bruker ATP og er hjulpet av proteinet «aminoacyl tRNA synthase». Initieringen av syntese skjer ved at mRNA bindes til to ribosomale subenheter og den første tRNA som skal benyttes i syntesen. Det første aminoacyl-tRNA komplekset bindes til mRNA kodonet AUG som signaliserer begynnelsen av polypeptidet. Forlengelse foregår ved at tRNA-AA bringes til det komplette ribosomal komplekset, kobler sitt tRNA antikodon med mRNA sekvensen, plasseres ved siden av tRNA-AA som er til stede og kobler AA sammen før det originale tRNA forlater komplekset og prosedyren kan gjentas etter behov. Bindingen av aminoacyltRNA til ribosomet og bevegelsen av ribosomet langs mRNA sekvensen er drevet av hydrolyse av GTP og krever «elongation factors» koblet til ribosomet. Avslutning skjer når ribosomet kommer over et stopp kodon. Ribosomal activity, translation, can be divided into three parts; introduction, extension and conclusion. Initially, the carboxyl group of each AA will be activated in the cytosol by connecting it to a tRNA, a process that uses ATP and is assisted by the protein "aminoacyl tRNA synthase". The initiation of synthesis occurs when mRNA binds to two ribosomal subunits and the first tRNA to be used in synthesis. The first aminoacyl-tRNA complex binds to the mRNA codon AUG which signals the beginning of the polypeptide. Elongation takes place by bringing the tRNA-AA to the complete ribosomal complex, linking its tRNA anticodon with the mRNA sequence, placing next to the tRNA-AA that is present and linking the AA together before the original tRNA leaves the complex and the procedure can be repeated as needed. The binding of aminoacyltRNA to the ribosome and the movement of the ribosome along the mRNA sequence is driven by hydrolysis of GTP and requires "elongation factors" linked to the ribosome. Termination occurs when the ribosome comes across a stop codon.
Polypeptidet er da løslatt fra komplekset, hjulpet av proteiner kalt for «release factors», og ribosomet kan brukes igjen i neste runde. The polypeptide is then released from the complex, helped by proteins called "release factors", and the ribosome can be used again in the next round.
For at proteinet skal fungere etter design er det som regel behov for posttranskripsjonsmodifikasjon for å «brette seg» i riktig 3D modifikasjon. Dette inkluderer ofte å fjerne en eller flere aminosyrer, metylering, karboksylering, acetylering eller kløyving/addering av oligosakkarider. I dette patentet vil det hovedsakelig bli benyttet proteiner som er selvbrettende, det vil si at de ikke trenger ytterligere modifikasjoner. In order for the protein to function according to design, there is usually a need for post-transcriptional modification to "fold" into the correct 3D modification. This often includes removing one or more amino acids, methylation, carboxylation, acetylation or cleavage/addition of oligosaccharides. In this patent, proteins that are self-folding will mainly be used, i.e. they do not need further modifications.
2.5 Ulike typer reportermolekyler 2.5 Different types of reporter molecules
2.5.1 Innledning 2.5.1 Introduction
Valg av reporter molekyl vil variere etter behov. The choice of reporter molecule will vary according to need.
Om testen skal benyttes utenfor laboratorier og uten helsepersonell vil et reportermolekyl som forårsaker en fargeendring bli benyttet da dette er lettere å detektere for «det blotte øyet». If the test is to be used outside laboratories and without healthcare personnel, a reporter molecule that causes a color change will be used as this is easier to detect for the "naked eye".
Ved en «Point of care test» kan ꞵ-galactosidase benyttes, da en sterk blå farge vil oppstå. Det ekstra amplifikasjonstrinnet vil bidra til signal styrken In a "Point of care test" ꞵ-galactosidase can be used, as a strong blue color will appear. The extra amplification step will contribute to the signal strength
Hvis metoden skal benyttes ved laboratorier som skal teste mange prøver samtidig kan det være hensiktsmessig å benytte et fluoriserende reporter molekyl da dette kan minke kravet til protein konsentrasjonen om UV transmisjonsteknikker blir benyttet. If the method is to be used by laboratories that are to test many samples at the same time, it may be appropriate to use a fluorescent reporter molecule as this may reduce the requirement for protein concentration if UV transmission techniques are used.
2.5.2 BFP 2.5.2 BFP
Fluoriserende proteiner har i forskning over lang tid vært benyttet for å bekrefte en suksessfull transfeksjon av genetisk materiale ved å observere de distinkte selvlysende fargene som da oppstår. Eksempler på slike fluoriserende reportermolekyl kan være BFP (blue fluorescent protein), eller det beslektede GFP (green fluorescent protein). Fluorescent proteins have long been used in research to confirm a successful transfection of genetic material by observing the distinct fluorescent colors that then occur. Examples of such fluorescent reporter molecules can be BFP (blue fluorescent protein), or the related GFP (green fluorescent protein).
BFP har en høyere kapasitet til å renaturere en GFP (green fluorescent protein). Dette vil påvirke hvor lenge reaksjonen kan detekteres, noe som gjør BFP til en bedre kandidat som reportermolekyl. Det vil kreve noe flere ressurser i form av økte konsentrasjoner av reaksjonskomponenter (f.eks tRNA/ Aminosyrer/ATP) da BFP er 29 kDA, mens GFP er 28 kDA, men vil trolig likevel kunne være fordelaktig gitt at den har en mer stabil struktur 2.5.3 ꞵ-galactosidase kombinert med x-gal: BFP has a higher capacity to renature a GFP (green fluorescent protein). This will affect how long the reaction can be detected, making BFP a better candidate as a reporter molecule. It will require somewhat more resources in the form of increased concentrations of reaction components (e.g. tRNA/ Amino acids/ATP) as BFP is 29 kDA, while GFP is 28 kDA, but will probably still be beneficial given that it has a more stable structure 2.5.3 ꞵ-galactosidase combined with x-gal:
Disse to benyttes hovedsakelig for å detektere transgen utrykning hos forsøksdyr, men siden ꞵ-galactosidase har enzymatisk aktivitet kan den hjelpe med å øke sensitiveten til testen om vi skulle trenge ett ekstra amplifikasjons steg. ꞵ-galactosidase vil forårsake en kraftig amplifikasjon ved å kløyve substratet 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ꞵ-d-galactopyranoside, også kjent som X-gal. Etter kløyvingen vil X-gal produsere en sterk blå farge. These two are mainly used to detect transgenic expression in laboratory animals, but since ꞵ-galactosidase has enzymatic activity, it can help increase the sensitivity of the test if we need an extra amplification step. ꞵ-galactosidase will cause a strong amplification by cleaving the substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ꞵ-d-galactopyranoside, also known as X-gal. After cleavage, X-gal will produce a strong blue color.
Enzymet er avhengig av mange forskjellige chaperoner for å folde seg. Hvis en skulle velge å benytte PURE systemet vil dette være en ekstra kostnad. CFPS benytter derimot seg av komplette maskinerier som kan inneholde disse komponentene (chaperoner) fra før av. The enzyme relies on many different chaperones to fold. If one were to choose to use the PURE system, this would be an additional cost. CFPS, on the other hand, makes use of complete machinery that can already contain these components (chaperones).
2.6 Eksempler på anvendelse av oppfinnelsen for påvisning av genfeil 2.6 Examples of application of the invention for the detection of gene defects
Metoden kan også benyttes for å teste for genfeil, med sikte på å avdekke forekomst av genetisk sykdom, eksempelvis Huntingtons. Ved anvendelse av metoden til dette formålet, tas biopsi fra pasienten og det testes for korrekt/frisk gensekvens. The method can also be used to test for gene errors, with the aim of uncovering the occurrence of genetic disease, for example Huntington's. When using the method for this purpose, a biopsy is taken from the patient and it is tested for the correct/healthy gene sequence.
Det negative resultatet påviser forekomst av genfeil. The negative result indicates the presence of a gene defect.
2.7 Eksempler på anvendelse av oppfinnelsen for å diagnostisere ukjent infeksjonssykdom basert på deduksjon ut fra fylogenetisk tre 2.7 Examples of application of the invention to diagnose an unknown infectious disease based on deduction from a phylogenetic tree
2.7.1 Metode for diagnostisering av ukjent infeksjonssykdom 2.7.1 Method for diagnosing an unknown infectious disease
Om CAPS blir benyttet med to reportermolekyler som gir ulike farger/frekvens er det mulig å dedusere en ukjent sykdom ved å benytte databaser med genetisk informasjon. Eksempler på slike databaser er Genbank, Uniprot og If CAPS is used with two reporter molecules that give different colours/frequency, it is possible to deduce an unknown disease by using databases with genetic information. Examples of such databases are Genbank, Uniprot and
Ensembl. Genetisk informasjon for mikroorganismer er også blitt kategorisert ihht til et fylogenetiske tre. Eksempler her er Phylofacts og Tree of Life. Ensemble Genetic information for microorganisms has also been categorized according to a phylogenetic tree. Examples here are Phylofacts and Tree of Life.
Denne fremgangsmåten vil da innebærer å skille forskjellige sykdommer basert på konserverte DNA/RNA sekvenser som er unik for en forgrening av et mikroorganismes fylogenetiske tre. Ved å trinnvis velge to sekvenser som skiller en avgrening av et fylogenetisk tre vil man til slutt kunne identifisere sykdom-sekvensen uten å benytte symptomer for diagnosen. I praksis vil først en test, som inneholder X antall reportermolekyl sekvenser, identifisere hvilken hovedgruppe sykdommen befinner seg i (virus, bakteriell mv.). I neste steg vil en kunne dedusere hvilken undertype av mikroorganisme som forårsaker sykdommen, der prosessen gjentas etter behov frem til at man har kunnet bestemme eksakt mikroorganisme- gitt at man har reportermolekyl for eksakt denne mikroorganismen tilstede. This method will then involve differentiating different diseases based on conserved DNA/RNA sequences that are unique to a branch of a microorganism's phylogenetic tree. By gradually selecting two sequences that separate a branch of a phylogenetic tree, one will eventually be able to identify the disease sequence without using symptoms for the diagnosis. In practice, first a test, which contains X number of reporter molecule sequences, will identify which main group the disease is in (virus, bacterial, etc.). In the next step, you will be able to deduce which subtype of microorganism is causing the disease, where the process is repeated as needed until you have been able to determine the exact microorganism - given that you have a reporter molecule for this exact microorganism present.
To reportermolekyl sekvenser som kan benyttes er GFP og BFP (Green/blue fluorescent protein, punkt 2.5.1), testen vil eksempelvis kunne indikere en viral infeksjon ved å luminescere blått og en bakteriell infeksjon ved å luminescere grønt. Stegene videre vil benytte lignende metode. Two reporter molecule sequences that can be used are GFP and BFP (Green/blue fluorescent protein, point 2.5.1), the test will for example be able to indicate a viral infection by luminescing blue and a bacterial infection by luminescing green. The steps ahead will use a similar method.
BFP og GFP er eksempler på et fluoriserende er som kan benyttes til forgreningsmetoden. To fluoriserende reporter molekyler benyttes i samme prøve for å identifisere valg av forgrening til neste runde. BFP and GFP are examples of a fluorescent material that can be used for the branching method. Two fluorescent reporter molecules are used in the same sample to identify the choice of branching for the next round.
Ved maskinell avlesning vil det være mulig å diagnostisere flere sykdommer i samme prøve, gitt at reporter molekylene koblet opp mot CAPS har stor nok forskjell i absorbans frekvens til å kunne skilles ved for eksempel UV-spektroskopi. With machine reading, it will be possible to diagnose several diseases in the same sample, given that the reporter molecules connected to CAPS have a large enough difference in absorbance frequency to be able to be distinguished by, for example, UV spectroscopy.
Testmetoden er sammenfallende med metoden som beskrives ovenfor. The test method is identical to the method described above.
Rent praktisk vil denne prosessen kunne automatiseres, slik at det testes fortløpende nedover i det fylogentiske treet fra sammen opprinnelige prøve, basert på utfallet av de enkelte trinn. In practical terms, this process will be able to be automated, so that it is tested continuously down the phylogenetic tree from the original sample together, based on the outcome of the individual steps.
3 KORT SAMMENDRAG 3 SHORT SUMMARY
Metode for påvisning av en mikroorganisme i en organisk prøve i en beholder ved at et CRISPR/Cas-system kutter en predefinert del av mikroorganismens Method for detecting a microorganism in an organic sample in a container by a CRISPR/Cas system cutting a predefined part of the microorganism's
Claims (7)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20210430A NO347409B1 (en) | 2021-04-11 | 2021-04-11 | PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO20210430A NO347409B1 (en) | 2021-04-11 | 2021-04-11 | PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO20210430A1 true NO20210430A1 (en) | 2022-10-12 |
| NO347409B1 NO347409B1 (en) | 2023-10-23 |
Family
ID=85202310
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20210430A NO347409B1 (en) | 2021-04-11 | 2021-04-11 | PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| NO (1) | NO347409B1 (en) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2019126577A2 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based multiplex diagnostics |
| WO2020028729A1 (en) * | 2018-08-01 | 2020-02-06 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease compositions and methods of use thereof |
| WO2020056924A1 (en) * | 2018-09-20 | 2020-03-26 | 中国科学院动物研究所 | Method for detecting nucleic acid |
| EP3653722A1 (en) * | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited | Application of cas protein, method for detecting target nucleic acid molecule and kit |
-
2021
- 2021-04-11 NO NO20210430A patent/NO347409B1/en unknown
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3653722A1 (en) * | 2017-07-14 | 2020-05-20 | Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited | Application of cas protein, method for detecting target nucleic acid molecule and kit |
| WO2019126577A2 (en) * | 2017-12-22 | 2019-06-27 | The Broad Institute, Inc. | Crispr effector system based multiplex diagnostics |
| WO2020028729A1 (en) * | 2018-08-01 | 2020-02-06 | Mammoth Biosciences, Inc. | Programmable nuclease compositions and methods of use thereof |
| WO2020056924A1 (en) * | 2018-09-20 | 2020-03-26 | 中国科学院动物研究所 | Method for detecting nucleic acid |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO347409B1 (en) | 2023-10-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11697848B2 (en) | Reagent and method for fluorescence quantitative real-time PCR detection of RCL | |
| CN111254223A (en) | Reaction system and kit for detecting African swine fever virus nucleic acid and application of reaction system and kit | |
| Inoue et al. | Ccs1, a nuclear gene required for the post-translational assembly of chloroplast c-type cytochromes | |
| CN107988340B (en) | PCR amplification primer for rapidly detecting mycoplasma ovipneumoniae and application thereof | |
| CN102586438A (en) | LAMP-based (loop-mediated isothermal amplification-based) visual fluorogenic and chromogenic genetic testing method for microorganisms | |
| CN102864228A (en) | Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) kit for rapidly detecting vibrio parahaemolyticus | |
| CN111394515B (en) | LAMP primer group, fluorescence visualization rapid kit and method for detecting canine parvovirus | |
| CN109750124B (en) | Nucleic acid group for detecting lentivirus and detection method | |
| CN107227377B (en) | RPA-IAC primer and method for detecting vibrio vulnificus | |
| CN102851383A (en) | LAMP kit for rapid detection of Salmonella | |
| CN106987657B (en) | Primer combination for identifying bovine virus diarrhea virus and bovine rotavirus and application thereof | |
| CN102851382A (en) | LAMP kit for rapid detection of Shigella | |
| CN116410955B (en) | Two novel endonucleases and application thereof in nucleic acid detection | |
| NO20210430A1 (en) | PROCEDURE FOR THE DETECTION OF MICROORGANISMS OR GENE DEFECTS | |
| CN102851381A (en) | LAMP kit for rapid detection of Listeria monocytogenes | |
| CN110373502B (en) | Complete set of nucleic acid, kit and detection method for detecting Hantaan virus by RPA | |
| CN111471802A (en) | Porcine delta coronavirus rapid detection primer, kit and application thereof | |
| CN107385057B (en) | RPA-IAC primer and method for detecting vibrio cholerae | |
| CN113718061B (en) | Primer set, kit and method for simultaneously detecting double RT-PCR of rochu virus and viral nervous necrosis virus | |
| CN112695138A (en) | Triple PCR detection primer for avian leukosis virus A/B/J subgroup and application thereof | |
| CN113416797A (en) | Fluorescent quantitative PCR detection kit for simultaneously detecting 7 types of adenoviruses | |
| CN109338012B (en) | K subgroup avian leukosis virus RT-PCR detection primer and detection method | |
| US20200283741A1 (en) | Glycated hemoglobin oxidase variant and method for measurement | |
| US8017318B1 (en) | Method for detecting and/or quantifying a known function from a nucleic acid sample | |
| CN112410343B (en) | CRISPR-based kit and application thereof |