NO180755B - DNA-probe og fremgangsmåte for identifisering av bakterielle stammer av Lactobacillus helveticus arter - Google Patents
DNA-probe og fremgangsmåte for identifisering av bakterielle stammer av Lactobacillus helveticus arterInfo
- Publication number
- NO180755B NO180755B NO901437A NO901437A NO180755B NO 180755 B NO180755 B NO 180755B NO 901437 A NO901437 A NO 901437A NO 901437 A NO901437 A NO 901437A NO 180755 B NO180755 B NO 180755B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- strain
- helveticus
- species
- fragment
- Prior art date
Links
- 240000002605 Lactobacillus helveticus Species 0.000 title claims abstract description 29
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 title claims abstract description 20
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 9
- 241001616644 Lactobacillus helveticus DSM 20075 = CGMCC 1.1877 Species 0.000 claims description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 claims description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 4
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 4
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 2
- 108010060371 endo-N-acetylmuramidase Proteins 0.000 claims description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 abstract description 24
- 241000894007 species Species 0.000 description 11
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 8
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 4
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 4
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 4
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241000186673 Lactobacillus delbrueckii Species 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 2
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 244000199885 Lactobacillus bulgaricus Species 0.000 description 2
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 244000057717 Streptococcus lactis Species 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000206600 Carnobacterium maltaromaticum Species 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 240000001046 Lactobacillus acidophilus Species 0.000 description 1
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 description 1
- 241000186679 Lactobacillus buchneri Species 0.000 description 1
- 244000199866 Lactobacillus casei Species 0.000 description 1
- 241001134659 Lactobacillus curvatus Species 0.000 description 1
- 241000186840 Lactobacillus fermentum Species 0.000 description 1
- 235000013967 Lactobacillus helveticus Nutrition 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 241000186604 Lactobacillus reuteri Species 0.000 description 1
- 240000002129 Malva sylvestris Species 0.000 description 1
- 235000006770 Malva sylvestris Nutrition 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 108010059712 Pronase Proteins 0.000 description 1
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 1
- 241000607447 Yersinia enterocolitica Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000013095 identification testing Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940054346 lactobacillus helveticus Drugs 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010009719 mutanolysin Proteins 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 101150059159 proA2 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 229940098232 yersinia enterocolitica Drugs 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en DNA-probe for identifisering av bakterielle stammer fra Lactobacillus helveticus-arten, og en fremgangsmåte for identifisering av bakterielle stammer fra denne arten med denne DNA-proben.
Lactobacillus helveticus er en meget viktig bakterie for fermentering av mat. Den blir hovedsakelig brukt for fermentering av melkeprodukter og er funnet i oppstartings-kulturer for noen oster og i noen land, også for yoghurt-produksjon. Fermentering og modning av disse matproduktene er vanligvis et resultat av vekstassosiasjon og interaksjon mellom forskjellige bakterier, i de fleste tilfeller forskjellige Lactobacilli, Lactococci og andre bakterielle arter. Idet de fleste bakterielle artene har meget like næringsmessige krav og vokser under lignende miljøbetingel-ser, er en klar identifikasjon innenfor Lactobacillus-arten noen ganger meget vanskelig. Det kan spesielt være vanskelig å differensiere mellom de to yoghurt-bakteriene L. bul-garicus, som hører til L. delbrueckii-arten og L. helveticus (tidligere også kalt L. jugurti; 0. Kandler og N. Weiss, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, 1208-1260, 1986. Klassifisering av alle disse artene er så langt meget arbeidskrevende og omfatter upålitelige kriterier som sukker-fermenteringsmønstre og syreproduksjon. På grunn av disse forsøkene forblir en identifikasjon av disse forskjellige artene upålitelige og ofte vilkårlige.
DNA-hybridisasjonsteknikker, ved anvendelse av spesifikke DNA-prober, er et meget verdifullt redskap for identifikasjon av bakterielle og virale stammer, og er allerede blitt anvendt ved klinisk diagnostikk. Slike DNA-prober er blitt anvendt for identifikasjon av Yersinia enterocolitica (J.Jagow et al., Appl. Environ. Microbiol. 51, 441-443, 1986), Plasmodium falciparum (R.H. Barker et. al., Science 231, 1434-1436, 1986), Salmonella typhi (F.A. Ruben et al., J. Clin. Microbiol. 22, 600-605, 1985), Bacillus subtilis (J. Krauss et al., FEMS Microbiol. Lett. 33, 89-93, 1986), Haemophilus influenzae (F. Malouin et al., J. Clin. Microbiol. 26, 2132-2138, 1988) og andre bakterielle arter, DNA-virus (J. Brandsma et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77, 6851-6855; P. Stolhandske et al., J. Clin. Microbiol. 15, 744-747, 1982; P. Stolhandske et al., J. Med. Virol. 12, 213-218, 1985), samt RNA-virus (J. Flores etal., Lanceti, 555-559, 1983;M. Lin et al., J. Virol. 55, 509-512, 1985).
I Lactobacillus-arten omfatter DNA-prober for L.curvatus (H.A.R. Petrick et al., Appl. Environ. Micrbiol. 54, 405-408, 1988) som er spesifikt assosiert med ødeleggelse av vakuumpakket kjøtt og for L.delbrueckii-arter L.bulgaricus, L.lactis og L.delbrueckii (M. Delly et al., submitted) blitt isolert. Det ville være av stor betydning for meieriindu-strien å ikke bare kunne identifisere L-delbrueckii hurtig, som ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet i vår europeiske patentsøknad nr. 89106016.2, men også ha en hurtig og pålitelig fremgangsmåte for å detektere og klassifisere stammer hørende til L.helveticus-arten.
Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig en DNA probe for identifisering av bakterielle stammer av Lactobacillus helveticus-arter, kjennetegnet ved at den blir oppnådd ved en fremgangsmåte som omfatter preparering av en Hindlll klonbank fra stammen L. helveticus ATCC 15009 ved spaltning av DNA til denne stammen med Hindlll, ligering inn i plasmid pACYC184, og transformasjon av ligeringsblandingen inn i E. coli stamme HB101, og isolering derfra en klon hvorfra et Hindlll DNA fragment spesifikt kan hybridisere til DNA fra stammene til L. helveticus artene, i det dette DNA-fragmentet er fragmentet sLHl eller fragmentet sLH2, som definert i figurene 1 og 2.
Oppfinnelsen vedrører også en fremgangsmåte for å identifisere en bakteriell stamme av L. helveticus artene, kjennetegnet ved å preparere DNA fra en stamme som skal bli identifisert og undersøke om dette DNA hybridiseres til en probe.
En første hensikt med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe en spesifikk DNA-probe som kan bli anvendt i hybridi-seringsprosedyrer for spesifikt å identifisere stammer hørende til Lactobacillus helveticus-arten, enten i bakterielle kulturer, eller som bestanddeler i mat eller i løpet av fremstilling av mat, f.eks. i løpet av industriell fermentas;] on.
DNA-proben omfatter et DNA-fragment som kan hybridisere til DNA fra stammer av L. helveticus-arten. Dette DNA-fragmentet blir fortrinnsvis merket på en hvilken som helst egnet måte så som 32P,<35>S eller biotin.
Fremgangsmåten for identifisering av en bakteriell stamme av L- helveticus-arten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter preparering av DNA fra en stamme som skal identifiseres og undersøking om dette DNA hybridiseres til foreliggende probe eller til en probe produsert ved foreliggende fremgangsmåte. I en foretrukket utførelsesform av denne fremgangsmåten blir DNA preparert ved dyrking av celler fra stammen som skal identifiseres på et kulturmedium supplementert med en fermenterbar karbonkilde, inkubering av disse i nærvær av proteinaser, behandling av disse med en N-acetyl-muramidase, inkubere disse videre i nærvær av et emulgeringsmiddel, et chelateringsmiddel og en proteinase, fenolekstrahering av DNA derifra, etanolpresipitering av ekstrahert DNA, behandling av dette DNA med en RNase og kloroformekstrahering av RNase-behandlet DNA.
Figur 1 er et restriksjonskart av et klonet Hindlll DNA-fragment, sLHl, med opprinnelse fra L. helveticus ATCC 15009 og med en lengde på omtrent 1845 basepar.
Enzymer som ikke kutter innenfor dette fragmentet er:
Apal.Aval.BamHI, BglI, Bglll, BstBI.Cfol, Cfol, EcoRI.
Haell, Hindlll. Kpnl, Mlul, NarI, Ncol, Ndel, Nhel, Noti, NruI, Nsil, PstI, Pvul, SacI. SacII, Sali, Smal. SnaBI, SphI, Sspl og Stul.
Figur 2 er et restriksjonskart av et annet klonet Hindlll DNA-fragment, sLH2, med opprinnelse fra L.helveticus ATCC 15009 og en lengde på omtrent 1875 basepar.
Enmzymer som ikke kutter dette fragmentet er:
AccI, Åflll, Aval, Ball, Bglll. Pral.EcoRV.Kpnl.
NarI, Ncol. Nhel, Noti. Nrul, Nsil, PstI, Pvul. SacI,
SacII. Sali, Seal, Smal, SphI, Sspl og Stul.
I disse to figurer angir tallene I parentes den relative posisjonen til hensiktsmessige restriksjonsseter i basepar.
For å tilveiebringe DNA-prober som spesifikt identifiserer stammer hørende til L.helveticus-arter, var det mulig å klone Hindlll DNA-fragmenter med opprinnelse fra L.helveticus-stammer tilfeldig og å screene disse for arts-spesifikk hybridisasjon.
Foretrukket vektor for transformering av en klonbank av Hindlll DNA-fragmenter av L.helveticus var plasmid pACYC184, som kan bli transformert inn i en E. coli-stamme, f.eks. i den foretrukne E. coli-stamme HB101.
Spesielt spesifikke prober ble dannet av Hindlll DNA-fragmenter med opprinnelse fra stammen L.helveticus ATCC 15009, f.eks. fra to DNA-fra<g>menter sLHl og sLH2.
Bortsett fra ovennevnte foretrukne måte for preparering av DNA fra en stamme som skal identifiseres var det også mulig å preparere dette DNA ved enkel lysering av celler fra denne stammen, enten fra kulturer eller på faste bærere så som f.eks. filterpapir eller nitrocellulosepapir, og å utføre identifikasjonsforsøk på dette DNA med probene ifølge foreliggende oppfinnelse.
I screeningseksperimenter ved anvendelse av dotblot-hybridisasjon, ble over 50 forskjellige Lactobacillus-stammer med forskjellig opprinnelse undersøkt. Det kunne blitt vist at prober ifølge foreliggende oppfinnelse bare hybridiserte spesifikt til L.helveticus-artene og at de hadde meget høy sensitivitet.
Bakterie og plasmid
Melkesyrebakterier anvendt i eksemplet nedenfor er vist i tabell I. E. coli-stammen er HB101 (leuB6 proA2 recA13 thil ara!4 lacYl galK2 xy_15 mtll rpsL20 supE44 hsdS20). Plasmidet anvendt som vektor er pACYC184 (A.C.Y. Chang og S.N.Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141-1156, 1978).
Medium
For vekst av de forskjellige Lactobacilli, Lactococci og Propionibakteriene ble MRS-kraft (Difro Laboratories) anvendt, supplementert med 1% laktose. E. coli-stammen ble dyrket i LB-medium.
Preparering av DNA
i ) DNA fra Lactobacillus.Lactococcus og Propioni-bakterier
Celler ble fortynnet fra overnatt-kulturer inn i 10 ml MRS, supplementert med 1% laktose og dyrket til midtlogfase ved 43°C. Cellene ble deretter høstet ved sentrifugering, vasket én gang i kald IM NaCl og Inkubert i lt. ved 37°C i nærvær av proteinase K (250 pg/ml) og Pronase E (500 pg/ml). Cellene ble vasket i TE (10 mM Tris hydroklorid pH 7,4; 1 mM EDTA) og behandlet med mutanolysin (200 pg/ml) i nærvær av TE i 1 t. ved 37°C SDS. EDTA og proteinase K ble tilsatt til en final konsentrasjon på 0, 1%, 75 mM og 200 pg/ml, respektivt, og inkubert i 4 t. ved 65°C. DNA ble deretter fenolekstrahert, etanol presipitert og kveilet på en steril tannpirker. DNA'et ble resuspendert i TE i nærvær av RNase A (200 jjg/ml), kloroformekstrahert, represipitert i etanol og påny kveilet på en tannpirker. DNA ble deretter resuspendert i 100 pl TE og lagret ved 4°C.
ii) Plasmid DNA fra E. coli.
Plasmid DNA fra E. coli ble isolert og etter behov renset på CsCl-gradienter ifølge Maniatis et al.
(Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1982). Kjemikalier ble forhandlet fra E. Merck Chemicals Inc. og enzymer fra Sigma Chemical Co..
Preparering av en Hindlll klonbank fra en L. helveticus-stamme
DNA fra L. helveticus ATCC 15009 ble fullstendig spaltet med Hindlll og ligert inn i vektor pACYC184 som var lineærisert ved dets unike Hindlll-sete og behandlet med fosfatase. Ligeringsblandingen ble transformert inn i HB101, plassert på LB-skåler supplementert med 30 jjg/ml kloramfenikol og dyrket ved 37°C overnatt. Enkelte kolonier ble dyrket i LB supple mentert med kloramfenikol, plasmidene deres ekstrahert, spaltet med Hindlll og analysert ved agarosegelelektroforese. 90$ av de analyserte klonene inneholdt L.helveticus Hindlll DNA-fragmenter.
Merking av DNA- fragmenter
For radioaktiv merking av DNA ble en i-fyll-erstatnings-DNA-syntese eller nick-translasjonsreaksjon (Maniatis et al.) anvendt. Klenow-fragmentet av DNA polymerase I og E. coli DNA-polymerase I ble kjøpt fra Boehringer-Mannheim, [a_<32>p]dATPfra Amersham Co.
Dotblot- hvbridiseringsprosedyrer
Aliquoter av 200 ng kromosomalt DNA i TE ble denaturert ved oppvarming i 5 min. ved 95"C. SSC ble satt til aliquotene for å tilveiebringe en final konsentrasjon på 16X SSC og deretter ble blandingen applisert på lOXSSC-fuktet GeneScreen-papir og skylt én gang med 20XSSC. En Bio-Rad dotblot-apparatur ble anvendt. Filteret var deretter klart for DNA-hybridisasjon ved anvendelse av standard prosedyrer med hybridisasjon med 6XSSC ved 65 0 C og påfølgende vask med O.IXSSC ved 65"C (E. Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517, 1975). Som DNA-prober ble enten totale plasmider eller HindiII-fragment-DNA som var<32>P-merket anvendt. For detektering av hybridisasjonssignalene ble filtrene utsatt for røntgenfilm.
Restriksj onskartlegging
Restriksjonsenzymer ble kjøpt fra Boehringer-Mannheim Co. og New England Biolabs Co. og ble anvendt som foreslått av forhandleren.
EKSEMPEL
Isolering av L. helveticus DNA- prober
Hindlll spaltet kromosomalt DNA fra L.helveticus ATCC 15009, ble anvendt for å preparere en klonbank som beskrevet ovenfor. Flere kloner ble isolert og anvendt som DNA-prober i dotblot hybridisasjonseksperimenter ved anvendelse av filter inneholdende DNA-prøver av et valgt antall forskjellige melkesyrebakterier. Resultatene av hybridisasjonen viste at omtrent 70$ av undersøkte L.helveticus-kloner bare hybridiserte til de forskjellige L.helveticus-prøvene på dotblot-fUtrene. De andre 30$ av klonene som ble undersøkt, hybridiserte også til forskjellige andre ikke-beslektede arter og slekter av melkesyrebakterien. I følgende eksempler ble to DNA-prober valgt som var meget spesifikke for L.helveticus-arten. De blir betegnet "sLHl" og "sLH2" i foreliggende beskrivelse og krav.
Restriks. 1 onskartlegging av sLHl og sLH2
Et restriksjonskart av DNA-f ragmentene sLHl og sLH2 ble bestemt ved anvendelse av flere restriksjonsenzymer. Resultatene er vist i fig. 1 og 2 (se kort beskrivelse av tegningen ovenfor).
Spesifisitet og sensitivitet til DNA- probene sLHl og sLH2
De to DNA-probene sLHl og sLH2 ble undersøkt mot mange forskjellige representanter av Lactobacillus-slekten og andre melkesyrebakterier med dotblot hybridisasjoner. I disse hybridisasjonseksperimentene ble bare Hindlll DNA-fragmentene med opprinnelse fra L.helveticus isolert fra plasmidene anvendt som DNA-prober. Resultatene av dotblotene viste at begge DNA-probene bare hybridiserer til DNA avledet fra bakterielle arter av L.helveticus. Alle andre stammer undersøkt fra forskjellige Lactobacillus-arter, Lactococcus og Propionibacterier viste ingen hybridisasjon. De eneste unntakene som ble observert var to stammer av L.acidophilus, N21 og N22, som ga et svakt hybridiseringssignal med sLHl og sLH2. Disse svake signalene kan derimot klart bli differen-siert fra de mye sterkere hybridisasjonssignalene til stammer hørende til L.helveticus-arten. Fullstendige resultater er oppsummert i tabell I.
For å undersøke sensitiviteten til dotblottene ble det laget filtere med fortynninger i serie av DNA fra forskjellige Lactobacillus-stammer og anvendelse av disse for hybridisasjon med probene sLHl og sLH2. Resultatene kan summeres som følger: i) Positive hybridisasjonssignaler kunne bli detektert med letthet i alle forskjellige L.helveticus-stammene ved DNA-mengder som var så lave som 2 ng pr. flekk. ii) Alle andre undersøkte bakterielle stammer er oppført i tabell I, og viser ingen hybridisasjonssignaler ved DNA-mengder på 200 ng pr. flekk. iii) Ved en DNA-mengde mellom 200 ng og 1,6 jjg pr. flekk begynte mange stammer av L.acidofilus-arter å gi opphav til hybridisasjonssignaler. iv Følgende stammer er blitt undersøkt ved DNA-mengder på 1,6 >ig pr. flekk og viste ingen hybridisasjonssignaler: L. lactis N4 , L. fermentum N7, L. plantarum N24, L. buchneri N25, L. brevis N26, L. casei N27, L. bulgarticus N123, L. maltaromicus N207, L. reuteri N211 og E. coli HB101.
a) Kode fra Nestlé Research Centre
b) Anvendt probe for dotblot-hybridisasjon:
(+) angir hybridisasjon; (-) ingen hybridisasjon
Claims (5)
1.
DNA-probe for identifisering av bakterielle stammer av Lactobacillus helveticus-arter, karakterisert ved at den blir oppnådd ved en fremgangsmåte som omfatter preparering av en Hindlll klonbank fra stammen L. helveticus ATCC 15009 ved spaltning av DNA til denne stammen med Hindlll, ligering inn i plasmid pACYC184, og transformasjon av ligeringsblandingen inn i E. coli stamme HB101, og isolering derfra en klon hvorfra et Hindlll DNA fragment spesifikt kan hybridisere til DNA fra stammene til L. helveticus artene, i det dette DNA-fragmentet er fragmentet sLHl eller fragmentet sLH2, som definert i figurene 1 og 2.
2.
Fremgangsmåte for å identifisere en bakteriell stamme av L. helveticus artene, karakterisert ved å preparere DNA fra en stamme som skal bli identifisert og undersøke om dette DNA hybridiseres til en probe ifølge krav 1.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved å preparere nevnte DNA ved lysering av cellene til nevnte stamme som skal bli identifisert.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved å preparere nevnte DNA ved lysering av cellene til nevnte stamme som skal bli identifisert på en fast bærer.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved å preparere nevnte DNA ved dyrking av cellene til nevnte stammer som skal bli identifisert på et kulturmedium supplementert med en fermenterbar karbonkilde, inkubering av disse i nærvær av proteinaser, behandling av disse med en N-acetyl-muramidase, videre inkubering av disse i nærvær av et emulgeringsmiddel, et gelateringsmiddel og en proteinase, fenolekstrahering av DNA derfra, behandling av dette DNA med en RNase og kloroformekstrahering av RNase behandlet DNA.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP90102650A EP0441991B1 (en) | 1990-02-10 | 1990-02-10 | A DNA probe for Lactobacillus helveticus |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO901437D0 NO901437D0 (no) | 1990-03-29 |
| NO901437L NO901437L (no) | 1991-08-12 |
| NO180755B true NO180755B (no) | 1997-03-03 |
| NO180755C NO180755C (no) | 1997-06-11 |
Family
ID=8203632
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO901437A NO180755C (no) | 1990-02-10 | 1990-03-29 | DNA-probe og fremgangsmåte for identifisering av bakterielle stammer av Lactobacillus helveticus arter |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5412086A (no) |
| EP (1) | EP0441991B1 (no) |
| JP (1) | JPH03236799A (no) |
| AT (1) | ATE108209T1 (no) |
| AU (1) | AU625826B2 (no) |
| CA (1) | CA2012835C (no) |
| DE (1) | DE69010478T2 (no) |
| DK (1) | DK0441991T3 (no) |
| ES (1) | ES2056261T3 (no) |
| FI (1) | FI93744C (no) |
| IE (1) | IE64712B1 (no) |
| IL (1) | IL93735A (no) |
| NO (1) | NO180755C (no) |
| NZ (1) | NZ233005A (no) |
| SG (1) | SG13695G (no) |
| ZA (1) | ZA902061B (no) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0652291B1 (en) * | 1992-07-07 | 2003-05-28 | Fuso Pharmaceutical Industries Ltd. | Probe for diagnosing infectious disease |
| ATE253640T1 (de) * | 1998-06-17 | 2003-11-15 | Nestle Sa | Mobile genetische elemente als werkzeuge zur genetischen modifikation von l. delbrueckii oder l. helveticus |
-
1990
- 1990-02-10 ES ES90102650T patent/ES2056261T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-02-10 DK DK90102650.0T patent/DK0441991T3/da active
- 1990-02-10 DE DE69010478T patent/DE69010478T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-02-10 AT AT90102650T patent/ATE108209T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-02-10 EP EP90102650A patent/EP0441991B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-03-13 IL IL9373590A patent/IL93735A/en unknown
- 1990-03-13 IE IE89090A patent/IE64712B1/en not_active IP Right Cessation
- 1990-03-14 AU AU51306/90A patent/AU625826B2/en not_active Ceased
- 1990-03-16 ZA ZA902061A patent/ZA902061B/xx unknown
- 1990-03-20 NZ NZ233005A patent/NZ233005A/en unknown
- 1990-03-22 CA CA002012835A patent/CA2012835C/en not_active Expired - Fee Related
- 1990-03-29 NO NO901437A patent/NO180755C/no not_active IP Right Cessation
- 1990-04-05 JP JP2091321A patent/JPH03236799A/ja active Pending
- 1990-04-05 FI FI901726A patent/FI93744C/fi not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-05-28 US US07/892,403 patent/US5412086A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-01-26 SG SG13695A patent/SG13695G/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI93744B (fi) | 1995-02-15 |
| FI901726A (fi) | 1991-08-11 |
| JPH03236799A (ja) | 1991-10-22 |
| CA2012835A1 (en) | 1991-08-10 |
| ES2056261T3 (es) | 1994-10-01 |
| IE64712B1 (en) | 1995-08-23 |
| AU625826B2 (en) | 1992-07-16 |
| FI901726A0 (fi) | 1990-04-05 |
| FI93744C (fi) | 1995-05-26 |
| IL93735A (en) | 1995-05-26 |
| NO901437L (no) | 1991-08-12 |
| DE69010478T2 (de) | 1994-10-27 |
| AU5130690A (en) | 1991-08-15 |
| SG13695G (en) | 1995-06-16 |
| US5412086A (en) | 1995-05-02 |
| DE69010478D1 (de) | 1994-08-11 |
| NO180755C (no) | 1997-06-11 |
| DK0441991T3 (da) | 1994-09-26 |
| ATE108209T1 (de) | 1994-07-15 |
| NO901437D0 (no) | 1990-03-29 |
| EP0441991A1 (en) | 1991-08-21 |
| CA2012835C (en) | 1996-06-11 |
| NZ233005A (en) | 1992-02-25 |
| EP0441991B1 (en) | 1994-07-06 |
| IL93735A0 (en) | 1990-12-23 |
| IE900890A1 (en) | 1991-08-14 |
| ZA902061B (en) | 1990-12-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Delley et al. | DNA probe for Lactobacillus delbrueckii | |
| Blaiotta et al. | 16S–23S rDNA intergenic spacer region polymorphism of Lactococcus garvieae, Lactococcus raffinolactis and Lactococcus lactis as revealed by PCR and nucleotide sequence analysis | |
| Beimfohr et al. | Rapid genotypic differentiation of Lactococcus lactis subspecies and biovar | |
| Corroler et al. | Correlation between polymerase chain reaction analysis of the histidine biosynthesis operon, randomly amplified polymorphic DNA analysis and phenotypic characterization of dairy Lactococcus isolates | |
| JPH08103275A (ja) | 乳酸桿菌由来の新規なプラスミドｐＢＵＬ１ 及びその誘導体 | |
| Casey et al. | Characterization and classification of virulent lactococcal bacteriophages isolated from a Cheddar cheese plant | |
| Pilloud et al. | DNA probes for the detection of Lactobacillus helveticus | |
| NO180755B (no) | DNA-probe og fremgangsmåte for identifisering av bakterielle stammer av Lactobacillus helveticus arter | |
| US4883756A (en) | pTN1060, a conjugal plasmid and derivatives thereof that confer phage resistance to group N streptococci | |
| Hayes et al. | pAMβ1-Associated Mobilization of Proteinase Plasmids from Lactococcus lactis subsp. lactis UC317 and L. lactis subsp. cremoris UC205 | |
| AU696233B2 (en) | Method of eliminating genetic routes for bacteriophage evolution and products produced thereby | |
| EP0806483B1 (en) | Detection of bacterium belonging to the genus pectinatus | |
| CA2012838C (en) | Dna probe for lactobacillus delbrueckii | |
| AU664537B2 (en) | Phage defense rotation strategy | |
| EP0246909B1 (en) | Plasmids conferring phage insensitivity on bacteria | |
| Husson-Kao et al. | The autolysis of Streptococcus thermophilus DN-001065 is triggered by several food-grade environmental signals | |
| Coffey et al. | Traditional and molecular approaches to improving bacteriophage resistance of Cheddar and Mozzarella cheese starters | |
| Aprea et al. | Multiplex PCR to detect bacteriophages from natural whey cultures of buffalo milk and characterisation of two phages active against Lactococcus lactis, фApr-1 and фApr-2 | |
| Aprea et al. | Multiplex PCR to detect bacteriophages from natural whey cultures of | |
| Nomura et al. | Rapid PCR-Based Method Which Can | |
| Chen et al. | Genetic Characterization and Physiological Role of Endopeptidase O | |
| Woskow | Effect of proteolytic enzymes on transfection and transformation of Streptococcus lactis protoplasts and transformation of Streptococcus cremoris |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |