JPH03236799A - 地中梁の施工方法 - Google Patents
地中梁の施工方法Info
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- JPH03236799A JPH03236799A JP2091321A JP9132190A JPH03236799A JP H03236799 A JPH03236799 A JP H03236799A JP 2091321 A JP2091321 A JP 2091321A JP 9132190 A JP9132190 A JP 9132190A JP H03236799 A JPH03236799 A JP H03236799A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明はＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔ
ｉｃｕｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡブＯ−ブ
、このようなプローブの調製方法およびこのＤＮＡプＯ
−ブによるこの種の細ｙ４菌株の同定方法に関する。
ｉｃｕｉ種の細菌菌株を同定するためのＤＮＡブＯ−ブ
、このようなプローブの調製方法およびこのＤＮＡプＯ
−ブによるこの種の細ｙ４菌株の同定方法に関する。
従来の技術および発明が解決しようとする 題し非常に
重要な細菌である。主として乳製品の醸酵に使用され、
いくつかのチーズに対し、およびいくつかの国ではヨー
グルトの製造に対しスタータカルチャーに見出される。
重要な細菌である。主として乳製品の醸酵に使用され、
いくつかのチーズに対し、およびいくつかの国ではヨー
グルトの製造に対しスタータカルチャーに見出される。
これらの食品の１１醇および熟成は通例具る細菌、多く
の場合具るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ、 １．ａｃｔ
ｏｃｏｃｃｉｃおよび他の細菌種の連合生育および相互
作用の結果として生ずる。大部分のこれらの細菌種は非
常に似た栄！ｉ要求を有し、同じ環境条件下で生育する
ので、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種内の明白な同定は在住非
常に困難である。特に、２種のヨーグルト細菌、Ｌｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種に属するり、 ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓおよびり、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｉ （以前はり
、 ｊｔｕｇｕｒｔｉと称した；０、にａｎｄｌｅｒお
よびＮＪｅｉｓＳ、 ｅｅｒｏｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ、２ 巻、 １２０８〜１２６０．１９８６）間の
区別は困難である。従来これらのすべての種の分類はた
いくつであり、糖醗酵パターンおよび酸生産のように信
頼できない基準を含む。これらの試験のため、これらの
異る種の同定は疑わしく、しばしば独断的である。
の場合具るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ、 １．ａｃｔ
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作用の結果として生ずる。大部分のこれらの細菌種は非
常に似た栄！ｉ要求を有し、同じ環境条件下で生育する
ので、 Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ種内の明白な同定は在住非
常に困難である。特に、２種のヨーグルト細菌、Ｌｄｅ
ｌｂｒｕｅｃｋｉｉ種に属するり、 ｂｕｌｇａｒｉｃ
ｕｓおよびり、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｉ （以前はり
、 ｊｔｕｇｕｒｔｉと称した；０、にａｎｄｌｅｒお
よびＮＪｅｉｓＳ、 ｅｅｒｏｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ
ｏｆＳｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ、２ 巻、 １２０８〜１２６０．１９８６）間の
区別は困難である。従来これらのすべての種の分類はた
いくつであり、糖醗酵パターンおよび酸生産のように信
頼できない基準を含む。これらの試験のため、これらの
異る種の同定は疑わしく、しばしば独断的である。
特異的ＤＮＡプＯ−プを使用するＤＮＡハイブリド形成
技術は、細菌およびウィルス菌株の同定に対し非常に貴
重な手法であり、臨床診断学において既に応用を見出し
た。このようなりＮＡプローブは既にＹｅｒｓｉｎｉａ
ｅｎｔｅｒｏｃｏｌ１１ｉｃａ（Ｊ、 Ｊａｇｏｗ
ら、＾ｐｐ１． Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、 ５１ 、４４１〜４４３ 、１ ９ ８ ６
） 、 Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｓ ｆａｌｃｉｐａ
ｒｕｓ（Ｒ，Ｈ，Ｂａｒｋｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ
２３１．１４３４〜１４３６．１９８６ ） 、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｆ、＾、 Ｒｕｂｅｎ
ら、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２２
。
技術は、細菌およびウィルス菌株の同定に対し非常に貴
重な手法であり、臨床診断学において既に応用を見出し
た。このようなりＮＡプローブは既にＹｅｒｓｉｎｉａ
ｅｎｔｅｒｏｃｏｌ１１ｉｃａ（Ｊ、 Ｊａｇｏｗ
ら、＾ｐｐ１． Ｅｎｖｉｒｏｎ、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏ
ｌ、 ５１ 、４４１〜４４３ 、１ ９ ８ ６
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２３１．１４３４〜１４３６．１９８６ ） 、Ｓａｌ
ｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（Ｆ、＾、 Ｒｕｂｅｎ
ら、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２２
。
６００〜６０５．１９８５ ） 、ＢａｃｉｌｌｕｓＳ
ｕｂｔｉｌｉＳ （Ｊ、にｒａｕｓｓら、Ｆ Ｅ Ｍ
Ｓ Ｈｉｃｒｏｖｉｏｌｔｅｔｔ、３３．８９〜９３
．１９８６）、１１ａｅｌＯＥｌｈｉｌｔｌｓ １ｎ
４１ｕｅｎｚａｅ （Ｆ、 Ｈａｌｏｕｉｎら、Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２６．２１３２
〜２１３８．１９８８）および他の細胞種の同定、ＤＮ
Ａウィルス（Ｊ、 Ｂｒａｎｄｓｓａら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 ｓｃｔ。
ｕｂｔｉｌｉＳ （Ｊ、にｒａｕｓｓら、Ｆ Ｅ Ｍ
Ｓ Ｈｉｃｒｏｖｉｏｌｔｅｔｔ、３３．８９〜９３
．１９８６）、１１ａｅｌＯＥｌｈｉｌｔｌｓ １ｎ
４１ｕｅｎｚａｅ （Ｆ、 Ｈａｌｏｕｉｎら、Ｊ、
Ｃｌ１ｎ、 Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、 ２６．２１３２
〜２１３８．１９８８）および他の細胞種の同定、ＤＮ
Ａウィルス（Ｊ、 Ｂｒａｎｄｓｓａら、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、 ｓｃｔ。
ＵＳＡ、７７．６８５１〜６８５５：
Ｐ、 ５ｔｏｌｈａｎｄｓｋｅら、Ｊ、 Ｃｌ１ｎ
、 旧ｃｒｏｂｉｏ１． 上ｊ５．７４４〜７４７
．１９８２ ； Ｐ、 ５ｔｏｌｈａｎｄｓｋｅら、
Ｊ、Ｈｃｄ、 Ｖｉｒｏｌ、 １２． ２１３〜２
１８．１９８５）およびＲＮＡウィルス（Ｌ、 Ｆｌｏ
ｒｅｓら、ｔａｎｃｅｔ＋。
、 旧ｃｒｏｂｉｏ１． 上ｊ５．７４４〜７４７
．１９８２ ； Ｐ、 ５ｔｏｌｈａｎｄｓｋｅら、
Ｊ、Ｈｃｄ、 Ｖｉｒｏｌ、 １２． ２１３〜２
１８．１９８５）およびＲＮＡウィルス（Ｌ、 Ｆｌｏ
ｒｅｓら、ｔａｎｃｅｔ＋。
５５５〜５５９．１９８３ ：Ｈ，Ｌｉｎら、Ｊ、
Ｖｉｒｏｌ。
Ｖｉｒｏｌ。
ｉ亙、５０９〜５１２．１９８５）の同定に対し使用さ
れている。
れている。
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ 種では、真空包装向の
変敗と特異的に連合するり、ｃｕｕｒｖａｔｕｓ （
Ｈ，Ａ、 Ｒ。
変敗と特異的に連合するり、ｃｕｕｒｖａｔｕｓ （
Ｈ，Ａ、 Ｒ。
Ｐｅｔｒｉｃｋら、ＭＤＩ） Ｉ、Ｅｎｖｉｒｏｎ、
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４．４０５〜４０８．１９８
８）および り、 ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ 、 Ｌ、 Ｉａｃｔｉ
ｓ およびり、 ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ （Ｈ，Ｄ
ｅｌｌｃｙら、が提出）を含むり、 ｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋｉｉ種に対するＤＮＡＮＯ−２が単離されている。出
願人のヨーロッパ特許出願第８９１０６０１６．２号明
細書に記載の方法により行なうことができるように、Ｌ
、 ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを急速同定できるのみでな
く、Ｌ、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種に属する菌株を検知
する急速かつ信頼できる方法を有することは確かにＮｉ
農産業で有用である。
Ｈｉｃｒｏｂｉｏｌ、５４．４０５〜４０８．１９８
８）および り、 ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ 、 Ｌ、 Ｉａｃｔｉ
ｓ およびり、 ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ （Ｈ，Ｄ
ｅｌｌｃｙら、が提出）を含むり、 ｄｅｌｂｒｕｅｃ
ｋｉｉ種に対するＤＮＡＮＯ−２が単離されている。出
願人のヨーロッパ特許出願第８９１０６０１６．２号明
細書に記載の方法により行なうことができるように、Ｌ
、 ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉを急速同定できるのみでな
く、Ｌ、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種に属する菌株を検知
する急速かつ信頼できる方法を有することは確かにＮｉ
農産業で有用である。
従って、本発明の第１の目的は特異的ＤＮＡプ０−ブを
供することである。これは細菌カルチＶ−で、又は食品
成分として、又は食品製造中、例えば産業醗酵中Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種に属
する菌株を特異的に同定つるためにハイブリド形成方法
に使用することができる。
供することである。これは細菌カルチＶ−で、又は食品
成分として、又は食品製造中、例えば産業醗酵中Ｌａｃ
ｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種に属
する菌株を特異的に同定つるためにハイブリド形成方法
に使用することができる。
本発明の第２の目的はこのような特異的ＤＮＡプローブ
の調製方法を供することである。
の調製方法を供することである。
本発明の第３の目的はこのＤＮＡＮＯ−２によりり、ハ
ａｌｖｅｔｉｃｕｓ種に属する菌株を特異的に同定する
方法を供することである。
ａｌｖｅｔｉｃｕｓ種に属する菌株を特異的に同定する
方法を供することである。
このために、第一に、本発明によるＤＮＡプローブはり
、 ｈ０１Ｖｅｔｉｃｕｓ種菌株のＤＮＡに対しハイブ
リドを形成し得るＤＮＡ断片を含む。このＤＮＡ断片は
例えば３２，３５８又はビオチンのような任意の適当な
手段により標識することが好ましい。好ましくは、この
ＤＮＡ１片は り、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種の菌株からのＤＮＡのＨ
ｉｎｄ ｍ断片を含む。
、 ｈ０１Ｖｅｔｉｃｕｓ種菌株のＤＮＡに対しハイブ
リドを形成し得るＤＮＡ断片を含む。このＤＮＡ断片は
例えば３２，３５８又はビオチンのような任意の適当な
手段により標識することが好ましい。好ましくは、この
ＤＮＡ１片は り、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種の菌株からのＤＮＡのＨ
ｉｎｄ ｍ断片を含む。
第二に、本発明によるＤＮＡＮＯ−２の調製方法はり、
ｈｅｌＶｅｔｉｃＵｓ種の菌株から１ｌｉｎｄ ｌｌ
クローンバンクを製造し、旧ｎｄｌｌｌＤＮＡ断片がり
、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種菌株のＤＮＡに対しハイブ
リドを形成しうるクローンをそこから単離することを含
む。
ｈｅｌＶｅｔｉｃＵｓ種の菌株から１ｌｉｎｄ ｌｌ
クローンバンクを製造し、旧ｎｄｌｌｌＤＮＡ断片がり
、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種菌株のＤＮＡに対しハイブ
リドを形成しうるクローンをそこから単離することを含
む。
第三に、本発明によるり、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ種の
細菌菌株の同定方法は、同定すべき菌株のＤＮＡを３２
Ｐで標識することを含む、本プローブに対し、又は本方
法により製造したブＯ−プに対しハイブリドを形成する
かどうかをチェックすることを含む。この方法の好まし
い態様では、ＤＮＡは醗酵性炭素源を補足した培養基に
同定する菌株の細胞を生育させ、プロティナーゼの存在
でインキュベートし、Ｎ−アセチル−ムラミダーゼによ
り処理し、さらに乳化剤、キレート剤およびプロティナ
ーゼの存在でインキュベートし、ＤＮＡをそこからフェ
ノールにより抽出し、抽出ＤＮＡをエタノールにより沈
澱させ、このＤ Ｎ Ａ ｔ ＲＮａｓｅにより処理し
、ＲＨａＳｅ ｆｆｉ理ＤＮＡをクロロホルムにより抽
出することにより製造する。
細菌菌株の同定方法は、同定すべき菌株のＤＮＡを３２
Ｐで標識することを含む、本プローブに対し、又は本方
法により製造したブＯ−プに対しハイブリドを形成する
かどうかをチェックすることを含む。この方法の好まし
い態様では、ＤＮＡは醗酵性炭素源を補足した培養基に
同定する菌株の細胞を生育させ、プロティナーゼの存在
でインキュベートし、Ｎ−アセチル−ムラミダーゼによ
り処理し、さらに乳化剤、キレート剤およびプロティナ
ーゼの存在でインキュベートし、ＤＮＡをそこからフェ
ノールにより抽出し、抽出ＤＮＡをエタノールにより沈
澱させ、このＤ Ｎ Ａ ｔ ＲＮａｓｅにより処理し
、ＲＨａＳｅ ｆｆｉ理ＤＮＡをクロロホルムにより抽
出することにより製造する。
第１図Ｇ、ｔＬ、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕｓ Ａ Ｔ Ｃ
Ｃ１５００９に由来し、約１８４５塩基対の長さである
り０−ン化したｆｌｉｎｄ Ｍ Ｄ Ｎ Ａフラグメン
トの制限マツプである。
Ｃ１５００９に由来し、約１８４５塩基対の長さである
り０−ン化したｆｌｉｎｄ Ｍ Ｄ Ｎ Ａフラグメン
トの制限マツプである。
この断片内の切断しない酵素は：
知ａ Ｉ、醪虹Ｉ、吐Ｉ Ｈｌ、膝ＩＩ、飄ＩＩ。
特長Ｂ１．旺虹１．劃乞Ｒ１，吐Ｑ ｌ［、Ｈｉｎｄｌ
。
。
狂ｎＩ・Ｍｌ（Ｉ Ｉ・騒ｒ 工・β虹Ｉ・騒ｅＩ・肚
ｅＩ、ＮｏｔＩ、肛し■、騒辷■、囚ｔＩ。
ｅＩ、ＮｏｔＩ、肛し■、騒辷■、囚ｔＩ。
αｕ Ｉ、殖ｃＩ、昆ｃｌ、殖ＩＩ、幻ａＩ。
殖ａ ＢＩ、陸ｈＩ、銹ｐ１．および廷ｕＩである。
箒２図はり、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ Ａ Ｔ ＣＣ１
５００９に由来し、約１８７５塩基対の長さである別の
クローン旧ｎｄｌ［ＤＮＡ断片、ｓＬＨ２の制限マツプ
である。
５００９に由来し、約１８７５塩基対の長さである別の
クローン旧ｎｄｌ［ＤＮＡ断片、ｓＬＨ２の制限マツプ
である。
この断片を切断しない酵素は：
Ａｃｃｌ、＾ｆｌ Ｉｆ、 Ａｖａ Ｉ、舷Ｉ 工、陸
ＩＩ。
ＩＩ。
Ｂｏｌ Ｉｌ、 Ｄｒａ １． Ｅｃｏ ＲＶ、 Ｋｐ
ｎ １． Ｍａｒ Ｉ。
ｎ １． Ｍａｒ Ｉ。
Ｎｃｏ Ｉ、 Ｎｈｅ 工、 Ｎｏｔ Ｔ、 Ｎｒｕ
Ｉ、 Ｎｓｉ Ｉ。
Ｉ、 Ｎｓｉ Ｉ。
Ｐｓｔ Ｉ、 Ｐｖｕ Ｉ、 Ｓａｃ １． Ｓａｃ
ＩＩ、 Ｓａｌ Ｉ。
ＩＩ、 Ｓａｌ Ｉ。
Ｓｃａ １． Ｓｇ＋ａ Ｉ、 Ｓｐｈ Ｉ、 Ｓｓｐ
ＩおよびＳｔｕ Ｉである。
ＩおよびＳｔｕ Ｉである。
これらの２図では、かっこ内の数字は塩基対の適当な制
限部位の相対的位置を示す。
限部位の相対的位置を示す。
Ｌ、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ｌ！に属づる菌株を特異
的に同定するＤＮＡプローブを得るために、Ｌ、ｈｅｌ
ｖｅｔｉｃｕｓ菌株由来のＨｉｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片を
無作為にクローン化し、種特異的ハイブリッド形成に対
しそれらを選別することが可能であった。
的に同定するＤＮＡプローブを得るために、Ｌ、ｈｅｌ
ｖｅｔｉｃｕｓ菌株由来のＨｉｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片を
無作為にクローン化し、種特異的ハイブリッド形成に対
しそれらを選別することが可能であった。
Ｌ、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓの旧ｎｄｌＤＮＡ断片のク
ローンバンクの形質転換に対し好ましいベクターは、Ｅ
、 ｃｏｌｉ菌株、例えば好ましい［、ｃｏｌｉ菌株口
Ｂ１０１に形質転換しうるプラスミドＤＡＣＹＣ１８４
であった。
ローンバンクの形質転換に対し好ましいベクターは、Ｅ
、 ｃｏｌｉ菌株、例えば好ましい［、ｃｏｌｉ菌株口
Ｂ１０１に形質転換しうるプラスミドＤＡＣＹＣ１８４
であった。
特に特異的プローブは菌株１．、 ｈｃｌｖｅｔｉｃｕ
ｓＡｒＣＣ１５００９由来の旧ｎｄｌＤＮＡ断片、例え
ば２つのＤＮＡ断片Ｓ１口１および８１口２から成るも
のであった。
ｓＡｒＣＣ１５００９由来の旧ｎｄｌＤＮＡ断片、例え
ば２つのＤＮＡ断片Ｓ１口１および８１口２から成るも
のであった。
同定する菌株のＤＮＡを調製する上記の好ましい方法の
他に、カルチャーから、又は例えば濾紙又はニトロセル
ロース紙のような固体支持体、Ｌでこの菌株の細胞を単
に溶解することによりこのＤＮＡを製造し、本発明のブ
Ｏ−ブによりこのＤＮＡに対し同一性試験を好結果で実
施することもできた。
他に、カルチャーから、又は例えば濾紙又はニトロセル
ロース紙のような固体支持体、Ｌでこの菌株の細胞を単
に溶解することによりこのＤＮＡを製造し、本発明のブ
Ｏ−ブによりこのＤＮＡに対し同一性試験を好結果で実
施することもできた。
ドットプロットハイブリド形成を適用する選別試験では
、異る起源からの５０以七の異るＬａＣｔＯｂａＣｉｌ
ｌＵＳ菌株を試験した。本発明によるブ［］−ブは特異
的にり、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種に対してのみハイブ
リドを形成し、非常に高い感度を右することを示すこと
ができた。
、異る起源からの５０以七の異るＬａＣｔＯｂａＣｉｌ
ｌＵＳ菌株を試験した。本発明によるブ［］−ブは特異
的にり、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種に対してのみハイブ
リドを形成し、非常に高い感度を右することを示すこと
ができた。
例に使用した乳Ｆａ菌は第■表に示す。Ｅ、 ｃｏｌｉ
て使用したプラスミドは ｐＡＣＹＣＩ ８４（Ａ、
Ｃ，Ｙ、 Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅ
ｎ、 Ｊ。
て使用したプラスミドは ｐＡＣＹＣＩ ８４（Ａ、
Ｃ，Ｙ、 Ｃｈａｎｇ ａｎｄ Ｓ、 Ｎ、 Ｃｏｈｅ
ｎ、 Ｊ。
８ａｃｔｅｒｉｏｌ、１３４、１１４１〜１１５６．１
９７８〉である。
９７８〉である。
培地
異るＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ Ｌａｃｔｏｃｏｃｃ
ｉおよびＰｒ０ｐｉＯｎｉｂａＣｔｅｒｉａの生育に対
し１％乳糖を補足したＭＲＳプＯス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。Ｅ、 ｃｏｌｉ
１株はＬ８培地で生育させた。
ｉおよびＰｒ０ｐｉＯｎｉｂａＣｔｅｒｉａの生育に対
し１％乳糖を補足したＭＲＳプＯス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。Ｅ、 ｃｏｌｉ
１株はＬ８培地で生育させた。
ＤＮＡの製造
一夜カルチャーからの細胞は１％乳糖を補足した１０１
１のＭＲ８に稀釈し、４３℃の中間対数相まで生育させ
た。次に細胞は遠心分離により採集し、冷１Ｍ ＮａＣ
ｌで１回洗滌し、プ０テイナーゼＫ （２５０μｇ／ｌ
１１）およびプロナーゼＥ（５００μｇ／Ｍ１〉の存在
で３７℃で１時間インキュベートした。細胞はＴＥ（１
０鵬Ｈトリスａ！酸塩ｐＨ７，４： １ｇ＋ＨＥＤＴＡ
）中で洗滌し、１時ｍ１３７℃でＴＥの存在でミュータ
ノリシン（２００μｇ／Ｍ１）により逃腰した。ＳＤＳ
、ＥＤＴＡおよびプロティナーゼＫをそれぞれ０．１％
、７５■Ｈおよび２００μｇ／ｍｌの最終１度まで添加
し、６５℃で４時間インキュベートした。次にＤＮＡは
フェノールにより抽出し、エタノールにより沈澱させ、
無菌つまようじ上に巻いた。Ｉ） Ｎ ＡはＲＮａｓｅ
Ａ （２００μｇ／ａｔ）の存在でＴＥ中に再サスペ
ンドし、クロロホルムにより抽出し、エタノール中に再
沈澱させ、再度つまようじ上に巻いた。次にＤＮＡは１
００μｌのＴＥ中に再サスペンドし、４℃で貯蔵した。
１のＭＲ８に稀釈し、４３℃の中間対数相まで生育させ
た。次に細胞は遠心分離により採集し、冷１Ｍ ＮａＣ
ｌで１回洗滌し、プ０テイナーゼＫ （２５０μｇ／ｌ
１１）およびプロナーゼＥ（５００μｇ／Ｍ１〉の存在
で３７℃で１時間インキュベートした。細胞はＴＥ（１
０鵬Ｈトリスａ！酸塩ｐＨ７，４： １ｇ＋ＨＥＤＴＡ
）中で洗滌し、１時ｍ１３７℃でＴＥの存在でミュータ
ノリシン（２００μｇ／Ｍ１）により逃腰した。ＳＤＳ
、ＥＤＴＡおよびプロティナーゼＫをそれぞれ０．１％
、７５■Ｈおよび２００μｇ／ｍｌの最終１度まで添加
し、６５℃で４時間インキュベートした。次にＤＮＡは
フェノールにより抽出し、エタノールにより沈澱させ、
無菌つまようじ上に巻いた。Ｉ） Ｎ ＡはＲＮａｓｅ
Ａ （２００μｇ／ａｔ）の存在でＴＥ中に再サスペ
ンドし、クロロホルムにより抽出し、エタノール中に再
沈澱させ、再度つまようじ上に巻いた。次にＤＮＡは１
００μｌのＴＥ中に再サスペンドし、４℃で貯蔵した。
１ｉｉＩ Ｅ、 ｃｏｌｉからのプラスミドＤＮＡＥ
、 ｃｏａ＋からのプラス主ドＤＮＡを単離し、必要な
場合Ｈａｎｉａｔｉｓら０４ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｏ ：Ａ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ
、 Ｃ１１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
、 ｃｏａ＋からのプラス主ドＤＮＡを単離し、必要な
場合Ｈａｎｉａｔｉｓら０４ｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏ
ｎｉｎｏ ：Ａ １ａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ
、 Ｃ１１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒ
ａｔｏｒｙ、 Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
、 Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ。
１９８２）に従ってＣ３ＣＪ勾配により精製した。
化学品はＥ、 ＨＯｒＣｋ ＣｈｅｌｉＣａｌＳ Ｉｎ
Ｃ，および酵素はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｇｉｉｃａｌ Ｃ
ｏ、から購入した。
Ｃ，および酵素はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｇｉｉｃａｌ Ｃ
ｏ、から購入した。
Ｌ、 ｈｅｌＶｅｔｉｃｕｓの菌株からＨｉｎｄ ［１
クローン氏＞９見藁１ Ｌ、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１５００９のＤ
ＮＡは１ｌｉｎｄ ［１により完全に消化し、そのユニ
ークなＨｉｎｄ ｍ部位で線状化し、ホスファターゼ処
理したベクターｐＡＣＹＣ１８４に連結した。ベクター
は口Ｂ１０１に形質転換し、３０μｇ／＃！のクロラム
フェニコールを補足した１Ｂプレート上に薄く流し、−
夜３７℃で成育させた。１個のコロニーをクロラムフェ
ニコールを補足したＬＢに成育させ、そのプラスミドを
抽出し、Ｈｉｎｄ ｍにより消化し、アガロースゲル電
気泳動により分析した。分析したクローンの９０％は り、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ Ｈｉｎｄ ｍ Ｄ
ＮＡ断片を含有した。
クローン氏＞９見藁１ Ｌ、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１５００９のＤ
ＮＡは１ｌｉｎｄ ［１により完全に消化し、そのユニ
ークなＨｉｎｄ ｍ部位で線状化し、ホスファターゼ処
理したベクターｐＡＣＹＣ１８４に連結した。ベクター
は口Ｂ１０１に形質転換し、３０μｇ／＃！のクロラム
フェニコールを補足した１Ｂプレート上に薄く流し、−
夜３７℃で成育させた。１個のコロニーをクロラムフェ
ニコールを補足したＬＢに成育させ、そのプラスミドを
抽出し、Ｈｉｎｄ ｍにより消化し、アガロースゲル電
気泳動により分析した。分析したクローンの９０％は り、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ Ｈｉｎｄ ｍ Ｄ
ＮＡ断片を含有した。
ＤＮＡｌ１片）＊識
放射能によりＤＮＡを標識するためにフィルイン−リプ
レースメント（ｆｉｌｌ−ｉｎ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎ
ｔ ）ＤＮＡ合成又はニック−トランスレーション反応
（Ｈａｎｉａｔｉｓら）を使用した。ＤＮＡポリメラー
ゼ■およびＥ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ■の
フレノウフラグメントはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｈａｎ
ｎｈｅｉ−から［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰは＾ａｅｒｓｈ
ａｍ Ｃｏ、から購入した。
レースメント（ｆｉｌｌ−ｉｎ−ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎ
ｔ ）ＤＮＡ合成又はニック−トランスレーション反応
（Ｈａｎｉａｔｉｓら）を使用した。ＤＮＡポリメラー
ゼ■およびＥ、 ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼ■の
フレノウフラグメントはＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｈａｎ
ｎｈｅｉ−から［α−３２Ｐ］ｄＡＴＰは＾ａｅｒｓｈ
ａｍ Ｃｏ、から購入した。
ドットプロットハイブリド形成方法
ＴＥ中の２００ ｎｏの染色体ＤＮＡ試料を５分間９５
℃で加熱することにより変性した。ＳＳＣを試料に添加
し、１６ＸＳＳＣの最終１ｍを得、次に混合物は２０Ｘ
ＳＳＣ湿潤ジ工ネスクリーン紙上にスポットし、２０Ｘ
ＳＳＣで１回すすいだ。
℃で加熱することにより変性した。ＳＳＣを試料に添加
し、１６ＸＳＳＣの最終１ｍを得、次に混合物は２０Ｘ
ＳＳＣ湿潤ジ工ネスクリーン紙上にスポットし、２０Ｘ
ＳＳＣで１回すすいだ。
Ｂｉｏ−Ｒａｄドットブロッ］・装置を使用した。次に
フィルターは６５℃で６ＸＳＳＣ，次に６５℃で０、ｌ
Ｘ５ＳＣにより洗滌し、ハイブリド形成による標準方法
を適用するＤＮＡハイブリド形成の準備が整った（Ｅ、
５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｈｏｔ、 Ｂｉｏｌ、９
８．５０３〜５１７．１９７５）。ＤＮＡプローブとし
て３２ｐで標識した全体のプラスミド又はＨｉｎｄ ｍ
断片ＤＮＡを使用した。ハイブリド形成シグナルを検知
するために、フィルターはＸ−線フィルムに曝露するた
めに使用した。
フィルターは６５℃で６ＸＳＳＣ，次に６５℃で０、ｌ
Ｘ５ＳＣにより洗滌し、ハイブリド形成による標準方法
を適用するＤＮＡハイブリド形成の準備が整った（Ｅ、
５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｊ、 Ｈｏｔ、 Ｂｉｏｌ、９
８．５０３〜５１７．１９７５）。ＤＮＡプローブとし
て３２ｐで標識した全体のプラスミド又はＨｉｎｄ ｍ
断片ＤＮＡを使用した。ハイブリド形成シグナルを検知
するために、フィルターはＸ−線フィルムに曝露するた
めに使用した。
制限マツピング
制限酵素Ｇ、ｔ Ｂｏｃｈｒｉｎｇａｒ−Ｈａｎｎｈｅ
ｉｇｇ Ｃｏ、およびＮｅＷ Ｅｎｏｌａｎｄ ８ｉｏ
ｌａｂｓ Ｃｏ、から購入し、供給者が推せんするよう
に使用した。
ｉｇｇ Ｃｏ、およびＮｅＷ Ｅｎｏｌａｎｄ ８ｉｏ
ｌａｂｓ Ｃｏ、から購入し、供給者が推せんするよう
に使用した。
例
り、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＤＮＡＮＯ−２の単離り
、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１５００９の旧ｎ
ｄ Ｉ 消化染色体ＤＮＡは上記のようにクローンバ
ンクを製造するために使用した。数個のクローンを単離
し、異る乳酸菌選択数のＤＮＡ試料を含有するフィルタ
ーを使用してドツトプロットハイブリッド形成試験でＤ
ＮＡプローブとして使用した。ハイブリド形成結果から
約７０％の試験した１、 ｈｅｌＶｅｔｉｃｕｓクロー
ンはドツトプロットフィルター上の異るり、 ｈｏｌＶ
ｅｔｉｃｕｓ試料に対してのみハイブリドを形成するこ
とが判った。他の３０％の試験クローンは乳ｉ！！菌の
各種の他の無関係種および属に対してもハイブリドを形
成した。次側に対し、２つのＤＮＡプＯ−ブを選択し、
これはり、 ｈｅ＋ｖｅｔｔｃｕｓ種に対し非常に特異
的であった。
、 ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ ＡＴＣＣ１５００９の旧ｎ
ｄ Ｉ 消化染色体ＤＮＡは上記のようにクローンバ
ンクを製造するために使用した。数個のクローンを単離
し、異る乳酸菌選択数のＤＮＡ試料を含有するフィルタ
ーを使用してドツトプロットハイブリッド形成試験でＤ
ＮＡプローブとして使用した。ハイブリド形成結果から
約７０％の試験した１、 ｈｅｌＶｅｔｉｃｕｓクロー
ンはドツトプロットフィルター上の異るり、 ｈｏｌＶ
ｅｔｉｃｕｓ試料に対してのみハイブリドを形成するこ
とが判った。他の３０％の試験クローンは乳ｉ！！菌の
各種の他の無関係種および属に対してもハイブリドを形
成した。次側に対し、２つのＤＮＡプＯ−ブを選択し、
これはり、 ｈｅ＋ｖｅｔｔｃｕｓ種に対し非常に特異
的であった。
これらは本明細書および特許請求の範囲でｒｓＬＨＩＪ
およびｒ ｓ Ｌ Ｈ２Ｊとして引用する。
およびｒ ｓ Ｌ Ｈ２Ｊとして引用する。
ｓＬＨ１およびｓＬＨ２のｌ１１１ マツピンＤＮＡ
断面ｓＬＨＩおよびｓＬＨ２の制限マーラビングは数個
の制限酵素を使用して測定した。結果は第１図および第
２図に示す（上記図面に関する記載参照〉。
断面ｓＬＨＩおよびｓＬＨ２の制限マーラビングは数個
の制限酵素を使用して測定した。結果は第１図および第
２図に示す（上記図面に関する記載参照〉。
２つのＤＮＡプローブｓＬＨ１およびｓＬＨ２をドット
プロットハイブリド形成によりＬａＣｔＯｂＯＣｉｌｌ
ｔｌＳ属および他の乳酸菌の多数の異る代表に対し試験
した。これらのハイブリド形成試験に対し、Ｌ、 ｈ０
１ＶＯｔｉｃｔ１３由来で、プラスミドから単離した旧
ｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片のみをＤＮＡＮＯ−２として使用
した。ドツトプロットの結果から両者のＤＮＡＮＯ−２
のみが１゜ｈｏｌＶｅｔｉｃｔ１３細菌種由来のＤＮＡ
に対しハイブリドを形成することが判った。異るＬａＣ
ｔＯｂａＣｉｌｌＵＳ種、ｔａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
および Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａの試験した
すべての他の菌株１１ハイブリド形成を示さなＮ２１お
よびＮ２２の２菌株で、これらはｓＬＨ１およＵｓＬＨ
２により弱いハイブリド形成シグナルを示した。しかし
、これらの弱いシグナルはり、 ｈｅｌｖｃｔｉｃｕｓ
種に属する菌株のはるかに強いハイブリド形成シグナル
とは明確に区別できる。完全な結果はｆｆ１Ｉ表に要約
する。
プロットハイブリド形成によりＬａＣｔＯｂＯＣｉｌｌ
ｔｌＳ属および他の乳酸菌の多数の異る代表に対し試験
した。これらのハイブリド形成試験に対し、Ｌ、 ｈ０
１ＶＯｔｉｃｔ１３由来で、プラスミドから単離した旧
ｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片のみをＤＮＡＮＯ−２として使用
した。ドツトプロットの結果から両者のＤＮＡＮＯ−２
のみが１゜ｈｏｌＶｅｔｉｃｔ１３細菌種由来のＤＮＡ
に対しハイブリドを形成することが判った。異るＬａＣ
ｔＯｂａＣｉｌｌＵＳ種、ｔａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ
および Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａの試験した
すべての他の菌株１１ハイブリド形成を示さなＮ２１お
よびＮ２２の２菌株で、これらはｓＬＨ１およＵｓＬＨ
２により弱いハイブリド形成シグナルを示した。しかし
、これらの弱いシグナルはり、 ｈｅｌｖｃｔｉｃｕｓ
種に属する菌株のはるかに強いハイブリド形成シグナル
とは明確に区別できる。完全な結果はｆｆ１Ｉ表に要約
する。
ドツトプロットの感度を試験するために、異るＬａｃｔ
ｏｂａｃ ｉ ｌ ｌｕｓ′ｅａ株からＤＮＡの連続稀
釈物のフィルターを作成し、プロー７８１口１およびｓ
ＬＨ２によるハイブリド形成に対し使用した。
ｏｂａｃ ｉ ｌ ｌｕｓ′ｅａ株からＤＮＡの連続稀
釈物のフィルターを作成し、プロー７８１口１およびｓ
ＬＨ２によるハイブリド形成に対し使用した。
結果は次のように要約できる。
（１１ ２ ｎＱ／ スポットのような低いＤＮＡＩ
でり、 ｈｅｌｖｃｔｉｃｕｓのすべての異る菌株につ
いて陽性のハイブリド形成シグナルを容易に検知できた
。
でり、 ｈｅｌｖｃｔｉｃｕｓのすべての異る菌株につ
いて陽性のハイブリド形成シグナルを容易に検知できた
。
（ｉｉ） 第■表にリストしたすべての他の試験細菌
菌株は２００ ｎｏ／スポットのＤＮＡ量でハイブリド
形成シグナルを示さない。
菌株は２００ ｎｏ／スポットのＤＮＡ量でハイブリド
形成シグナルを示さない。
（１１ ２００ｎＯ〜１．６ｕｇ／スポット間の０Ｎ
ＡＩでり、 ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の多数）菌株ハ
ハイプリド形成シグナルを発し始めた。
ＡＩでり、 ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ種の多数）菌株ハ
ハイプリド形成シグナルを発し始めた。
（Ｍ 次の菌株は１．６μｇ／スポットのＤＮＡ量で試
験し、ハイブリド形成シグナルは示さなかった： Ｌ、
＋ａｃｔｔｓ Ｎ ４、Ｌ、 ｆｅｒ−ｅｎｔｕ
ｍ Ｎ ７、Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｓ Ｎ２
４ 、 Ｌ、 ｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｎ ２ ５
、Ｌ、 ｂｒｅｖｉｓ Ｎ ２６、Ｌ、 ｃａｓｅ
ｉ Ｎ ２７、Ｌ、 ｂｕｌａａｒｉｃｕｓ Ｎ １
２３、Ｌ、 ５ａｌｔａｒｏｓｉｃｕｓＮ２０７、Ｌ、
ｒｅｕｔｅｒｉ Ｎ ２１１およびＥ、 ｃｏｌｉ
Ｈ［’３１０１゜ ４、
験し、ハイブリド形成シグナルは示さなかった： Ｌ、
＋ａｃｔｔｓ Ｎ ４、Ｌ、 ｆｅｒ−ｅｎｔｕ
ｍ Ｎ ７、Ｌ、 ｐｌａｎｔａｒｕｓ Ｎ２
４ 、 Ｌ、 ｂｕｃｈｎｅｒｉ Ｎ ２ ５
、Ｌ、 ｂｒｅｖｉｓ Ｎ ２６、Ｌ、 ｃａｓｅ
ｉ Ｎ ２７、Ｌ、 ｂｕｌａａｒｉｃｕｓ Ｎ １
２３、Ｌ、 ５ａｌｔａｒｏｓｉｃｕｓＮ２０７、Ｌ、
ｒｅｕｔｅｒｉ Ｎ ２１１およびＥ、 ｃｏｌｉ
Ｈ［’３１０１゜ ４、
第１図はクローンの１ｌｉｎｄｌ［
Ｓ Ｌ Ｈ１の制限マツプである。
第２図は別のり０−ンの旧ｎｄ
ＳＬＨ２の制限マツプである。
ＤＮＡ断片、
■
ＤＮＡ断片、
Claims (20)
- （１）￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ￥種の菌株のＤＮＡ
に対しハイブリドを形成しうるＤＮＡ断片を含むことを
特徴とする、￥Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｈｅｌｖｅ
ｔｉｃｕｓ￥の細菌菌株を同定するためのＤＮＡプロー
ブ。 - （２）ＤＮＡ断片を標識する、請求項１記載のＤＮＡプ
ローブ。 - （３）ＤＮＡ断片は＾３＾２ｐで標識する、請求項２記
載のＤＮＡプローブ。 - （４）ＤＮＡ断片は￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ￥種の
菌株からのＤＮＡの￥Ｈｉｎｄ￥III断片である、請求
項２又は３記載のＤＮＡプローブ。 - （５）￥Ｈｉｎｄ￥III断片は断片ｓＬＨ１である、請
求項４記載のＤＮＡプローブ。 - （６）￥Ｈｉｎｄ￥III断片は断片ｓＬＨ２である、請
求項４から６のいずれか１項に記載のＤＮＡプローブ。 - （７）￥Ｈｉｎｄ￥III断片は￥Ｅ・ｃｏｌｉ￥菌株中
に形質転換しうるベクター中に連結する、請求項４から
６のいずれか１項に記載のＤＮＡプローブ。 - （８）￥Ｈｉｎｄ￥III断片はプラスミドｐＡＣＹＣ１
８４に連結する、請求項７記載のＤＮＡプローブ。 - （９）ＤＮＡ断片は菌株￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ￥
ＡＴＣＣ１５００９からのＤＮＡの￥Ｈｉｎｄ￥III断
片である、請求項４から８のいずれか１項に記載のＤＮ
Ａプローブ。 - （１０）￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種の菌株から￥Ｈ
ｉｎｄ￥IIIクローンバンクを製造し、￥Ｈｉｎｄ￥II
IＤＮＡ断片が￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ￥種の菌株
のＤＮＡに対しハイブリドを形成しうるクローンをそこ
から単離することを特徴とする、￥Ｌａｃｔｏｂａｃｉ
ｌｌｕｓｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ￥種の細菌菌株の同定用
ＤＮＡプローブの調製方法。 - （１１）￥Ｈｉｎｄ￥IIIクローンバンクは菌株￥Ｌ．
ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ￥ＡＴＣＣ１５００９から調製す
る、請求項１０記載の方法。 - （１２）￥Ｈｉｎｄ￥IIIクローンバンクは ￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ種の菌株のＤＮＡを￥Ｈｉ
ｎｄ￥IIIにより消化し、Ｅ．Ｃｏｌｉ菌株に形質転換
しうるベクターに連結し、連結混合物を￥Ｅ．ｃｏｌｉ
￥菌株に形質転換することにより調製する、請求項１０
又は１１記載の方法。 - （１３）ベクターはプラスミドｐＡＣＹＣ１８４である
、請求項１２記載の方法。 - （１４）連結混合物は￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥菌株ＨＢ１０１
に形質転換する、請求項１２又は１３記載の方法。 - （１５）さらに￥Ｈｉｎｄ￥IIIＤＮＡ断片を標識する
ことを含む、請求項１０から１４のいずれか１項に記載
の方法。 - （１６）さらに￥Ｈｉｎｄ￥IIIＤＮＡ断片を＾３＾２
Ｐで標識することを含む、請求項１５記載の方法。 - （１７）同定すべき菌株のＤＮＡを調製し、このＤＮＡ
が請求項１から９のいずれか１項に記載のプローブ又は
請求項１０から１６のいずれか１項に記載の方法により
調製したプローブに対しハイブリドを形成するかどうか
をチェックすることを特徴とする、￥Ｌ．ｈｅｌｖｅｔ
ｉｃｕｓ￥種の細菌菌株の同定方法。 - （１８）同定すべき菌株の細胞を溶解することによりＤ
ＮＡを製造する、請求項１７記載の方法。 - （１９）固体支持体上で同定すべき菌株の細胞を溶解す
ることによりＤＮＡを調製する、請求項１８記載の方法
。 - （２０）醗酵性炭素源を補足した培養基に同定すべき菌
株の細胞を生育させ、プロティナーゼの存在でインキュ
ベートし、Ｎ−アセチル−ムラミダーゼにより処理し、
さらに乳化剤、キレート剤およびプロティナーゼの存在
でインキュベートし、そこからＤＮＡをフェノールによ
り抽出し、このＤＮＡをＲＮａｓｅにより処理し、ＲＨ
ａｓｃ処理ＤＮＡをクロロホルムにより抽出することに
よりＤＮＡを調製する、請求項１７記載の方法。
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