FI93744C - DNA-koetin Lactobacillus helveticus:lle ja menetelmä sen identifioimiseksi - Google Patents

Description

93744 DNA-koetin Lactobacillus helveticus:Ile ja menetelmä sen identifioimiseksi - DNA-sond för Lactobacillus helveticus och förfarande för dess indentifiering

Esillä olevan keksinnön kohteena on DNA-koetin Lactobacillus delbrueckii-laiin bakteerikantojen identifioimista varten ja menetelmä, jolla tämän lajin bakteerikantoja tunnistetaan tällä DNA-koettimella.

Lactobacillus helveticus on hyvin tärkeä elintarvikkeiden fermentaatiobakteeri. Sitä käytetään pääasiallisesti maitotuotteiden fermentoinnissa, ja sitä on eräiden juustojen ja eräissä maissa myös jogurtin valmistuksen starttiviljelmissä. Näiden elintarviketuotteiden fermentoituminen ja kypsyminen on tavallisesti seuraus eri bakteereiden, useimmissa tapauksissa eri Laktobasilli, Lactococci ja muiden bakteerilajien kasvuista vuorovaikutuksesta. Koska useimmilla näistä bakteerilajeis-ta on hyvin samankaltaiset ravintotarpeet ja koska ne kasvavat samanlaisissa ympäristöolosuhteissa, selkeä tunnistaminen Lactobacillus-lajien sisällä on joskus erittäin vaikeaa. Erityisesti kahden jogurttibakteerin, L.bulgaricus-bakteerin, joka kuuluu L.delbrueckii-lai iin, ja L.helveticus-bakteerin (aikaisemmin käytettiin myös nimitys L.jogurtti: O. Kandler ja N. Weiss, Bergey's Manual of Systematic bacteriology, voi. 2, 1208-1260, 1986), välinen erottaminen voi olla vaikeaa. Tähän mennessä kaikkien näiden lajien luokittelu on aikaa vievää ja siihen liittyy epäluotettavia kriteerioita, kuten sokereiden fermentoitumiset ja hapontuotto. Näistä testeistä johtuen näiden eri lajien identifiointi on yhä edelleen epävarmaa ja usein mielivaltaista.

DNA-hybridisointimenetelmät, joissa käytetään spesifisiä DNA-koettimia, ovat erittäin arvokas keino bakteeri- ja viruskantojen identifioimiseen, ja niitä on jo sovellettu kliinisessä diagnostiikassa. Tällaisia DNA-koettimia on jo käytetty seu-raavien identifioimiseen: Yersinia enterocolitica (J. Jagow et ai., Appi. Environ. Microbiol. 51, 441-443, 1986), Plasmodium 93744 2 falciparum (R.H.Barker et al. Science 231. 1434-1436, 1986), Salmonella tvphi (F.A.Ruben et al., J. Clin.Microbiol. 22. 600-605, 1985), Bacillus subtilis (J.Krauss et al., FEMS Microbiol. Lett. 33., 89-93, 1986), Haemphilus influenzae (F.Malouin et al. , J. Clin. Microbiol. 26., 2132-2138, 1988) ja muut bakteerilajit, DNA-virukset (J.Brandsma et al., Proc.

Natl .Acad. Sci , USA 77., 6851-6855; P . Stolhandske et al. , J. Clin . Microbiol. 15., 744-747, 1983; P . Stolhandske et al. , M.Med.Virol. 12., 213-218, 1985), sekä RNA-virukset (J.Flores et al., Lanceti, 555-559, 1983; M.Lin et al., J.Virol, 55. 509-512, 1985) .

Maitohappobakteerilajeilla on eristetty DNA-koettimet L.curvatus-bakteerille (H.A.R.Petrick et al, Appi. Environ. Microbiol. 54., 405-408, 1988), joka erityisesti liittyy vakuu-mipakatun lihan pilaantumiseen, ja L-delbrueckii-lajeille. joihin kuuluvat L.bulqaricus. Llactis ja L-delbrueckii (M.Delley et al, jätetty). Meijeriteollisuudessa olisi varmastikin käyttöä sille, että kyetään nopeasti tunnistamaan L.del-brueckii. kuten voidaan tehdä eurooppalaisessa patenttihakemuksessamme nro. 89106016.s kuvatulla menetelmällä, ja myös sille, että käytettävissä olisi nopea ja luotettava menetelmä L.heiveticus-lajeihin kuuluvien kantojen detektoimiseen ja luokittamiseen.

·: Esillä olevan keksinnön ensimmäisenä tavoitteena on siten tuoda esiin spesifinen DNA-koetin, jota voidaan käyttää hybri-disointimenetelmissä tunnistamaan spesifisesti Lactobacillus helveticus-lajeihin kuuluvat kannat joko bakteeriviljelmissä tai elintarvikkeiden komponentteina tai elintarvikkeiden prosessoinnin aikana, esimerkiksi teollisen fermentoinnin aikana.

Esillä olevan keksinnön tavoite on myös tuoda esiin menetelmä, joilla voidaan spesifisesti tunnistaa tällä koettimella L-helveticus-lajeihin kuuluvat kannat.

93744 3 Tätä tarkoitusta varten esillä olevan keksinnön mukainen DNA-koetin on saatu menetelmällä, jossa L. helveticus-ATCC 15009 kannasta valmistetaan HindiII-kloonipankki pilkkomalla tämän kannan DNA Hindlll:11a. liittämällä plasmidiin pACYC184 ja ligatointiseos transformoidaan E. coli HB101 kantaan ja eristetään siitä klooni, jonka HindiII-DNA-fragmentti kykenee hybridisoitumaan L. helveticus-laiin kantojen DNA:n kanssa, joka fragmentti on fragmentti sLHl tai sLH2, kuvattu kuvissa 1 ja 2 .

Keksinnön mukaisessa menetelmässä, jolla L.helveticus-lai in bakteerikanta identifioidaan keksinnön mukaisesti, valmistetaan tunnistettavan kannan DNA ja tarkistetaan, hybridisoituu-ko tämä DNA tämän koettimen tai käsillä olevalla menetelmällä valmistetun koettimen kanssa. Tämän menetelmän eräässä hyvänä pidetyssä suoritusmuodossa valmistetaan DNA kasvattamalla tunnistettavan kannan soluja viljelyalustassa, joka on täydennetty fermentoituvalla hiililähteellä, inkuboimalla niitä proteinaasien läsnäollessa, käsittelemällä ne N-asetyylimura-midaasilla, edelleen inkuboimalla niitä emulgointiaineen, gelatointiaineen ja proteinaasin läsnäollessa, uuttamalla niistä DNA fenolilla, saostamalla uutettu DNA etanolilla, käsittelemällä tämä DNA RNaasilla ja uuttamalla kloroformilla RNaasilla ja käsitelty DNA.

Piirustuksissa:

Kuvio 1 on kloonatun HindiII-DNA-fragmentin. sLHl:n, joka on peräisin L.helveticus ATCC 15009-kannasta ja jonka pituus on noin 1845 emäsparia, restriktiokartta.

Entsyymit, jotka eivät pilko tämän fragmentin sisällä, ovat:

Apal. Aval. BamHi. Ball. Balll, BstBI. CfoI, EcoRI. HaeII,

HindiII, Kpnl. MluI, Narl. Ncol, Ndel. Nhel. Notl. NruI, Nsil.

PstI. PvuI, Sacl. SacII, Sali. Smal. SnaBI. Sphl, SspI ja Stul.

93744 4

Kuvio 2 on toisen kloonatun HindiII-DNA-fragmentin, sLH2:n joka on peräisin L.helveticus ATCC 15009-kannasta ja jonka pituus on noin 1875 emäsparia, restriktiokart-ta.

Entsyymit, jotka eivät pilko tämän fragmentin sisällä, ovat:

Accl. Af111, Aval. Ball. Ball. Bqlll, Dral. EcoRV, Koni. NarI, Ncol. Nhel. NotI, NruI, Nsil. PstI, PvuI, Sacl. SacII, Sali,

Seal. Smal. Sphl, Sspl ja Stul.

Suluissa olevat numerot näissä kahdessa kuviossa viittaavat kyseisten restriktiokohtien suhteelliseen asemaan emäspareis-sa.

Sellaisten DNA-koettimien saamiseksi, jotka spesifisesti tunnistavat L.helveticus-laiiin kuuluvat kannat, oli mahdollista kloonata satunnaisesti L.helveticus-kannoista saadut HindiII-DNA-fragmentit ja seuloa niistä lajispesifinen hybri-disoituminen.

Suositeltu vektori L.helveticus:n Hindlll-DNA-fraomenttien kloonipankin transformoimiseen oli plasmidi pACYC184, joka voidaan transformoida E.coli-kantaan, esimerkiksi suositeltuun E .coli-kantaan HB101.

Erityisen spesifisiä koettimia valmistettiin HindiII-DNA-fragmenteista, jotka oli saatu L.helveticus ATCC 15009-kannasta, esimerkiksi kahdesta DNA-fragmentista sLHl ja sLH2.

Edellä mainitun suositellun identifioitavan kannan DNA:n valmistustavan lisäksi tämä DNA oli mahdollista myös valmistaa yksinkertaisesti lyysaamalla tämän kannan solut, joko solut, jotka oli saatu viljelmistä tai kiinteiden tukiaineiden päälle, kuten esimerkiksi suodatinpaperilla tai nitroselluloosapa-perilla, ja suorittaa menestyksellisesti identifioimistestit tällä DNA:11a esillä olevan keksinnön mukaisten koettimien kanssa.

93744 5

Seulontakokeissa, joissa sovellettiin dotblot-hybridisointia, testattiin yli 50 eri lähteistä saatua erilaista Lactobacil-lus-kantaa. Kokeissa voitiin osoittaa, että esillä olevan keksinnön mukaiset koettimen hybridisoituvat spesifisesti vain L-helveticus-lai in kanssa, ja että niillä oli erittäin korkea herkkyys.

Materiaalit ia menetelmät Bakteerit ia plasmidi Jäljempänä annetussa esimerkissä käytetyt maitohappobakteerit on esitetty taulukossa I. E.coli-kanta on HB101 (leuB6 proA2 recA13 thil ara!4 IacYl galK2 xvl5 mtll rpsL20 supE44 hsdS20). Vektorina käytetty plasmidi on pACYC184 (A.C.Y. Chang ja S.N. Cohen, J. Bacteriol. 134: 1141 - 1156, 1978).

Alustat

Eri laktobasillien, laktokokkien ja propionihappobakteereiden kasvattamiseen käytettiin MRS-lientä (Difco Laboratories) täydennettynä 1 %:lla laktoosia. E.coli-kanta kasvatettiin LB-alustassa.

DNA:n valmistaminen i) DNA-laktobasillista, laktokokista ia propionihappobaktee-rista Yön yli vanhoista viljelmistä saadut solut laimennettiin 10 ml:aan MRS-lientä, täydennettiin 1 %:lla laktoosia ja kasvatettiin 43°C:ssa logaritmisen vaiheen keskelle. Sen jälkeen solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kerran kylmässä IM natriumkloridissa ja inkuboitiin 1 tunti 37°C:ssa pProteinase K:n (250 μg/ml) ja Pronase E:n (500 μg/ml) läsnäollessa. Solut pestiin TE:ssa (10 mM Tris hydrokloridi 93744 6 pH 7,40; 1 mM EDTA) ja käsiteltiin mutanolysiillä (200 μg/ml) TE:n läsnäollessa tunnin ajan 37°C:ssa SDS. EDTA:n ja Proteinase K:a lisättiin vastaavasti loppukonsentraatioon 0,1 %, 75 mM ja 200 μg/ml ja inkuboitiin 4 tuntia 65°C:ssa.

Sen jälkeen DNA uutettiin fenolilla, saostettiin etanolilla ja hierrettiin steriilin hammastikun ympärille. DNA suspendoitiin uudelleen TE-.aan RNase A:n (200 μ9/ιη1) läsnäollessa, uutettiin kloroformilla, saostettiin uudelleen etanolissa ja kierrettiin jälleen hammastikun ympärille. Sen jälkeen DNA suspendoitiin uudelleen noin 100 ^l:aan TE:a ja säilytettiin 4°C:ssa.

ii) Plasmidi-DNA E.coli'sta

Plasmidi-DNA eristettiin E.coli'sta ja puhdistettiin tarpeen mukaan CsCl-gradienteilla Maniatis'in et ai. mukaisesti (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Harbor, New York, 1982). Kemikaalit ostettiin E. Merck Chemicals Inc.-yhtiöltä ja entsyymit Sigma Chemical Co .-yhtiöltä .

Hindlll-kloonioankin valmistaminen L.helveticus-kannasta L.helveticus ATCC 15009:n DNA pilkottiin kokonaan Hindlll:11a ja liitettiin vektoriin pACYC184, joka oli linearisoitu ainoassa HindiII-kohdassaan ja käsitelty fosfataasilla. Ligatoin-tiseos transformoitiin HBlOl-kantaan, maljattiin LB-levyille, jotka oli täydennetty 30 μg/ml kloramfenikolilla ja kasvatettiin LB-alustassa, joka oli täydennetty kloramfenikolilla, niiden plasmidit eristettiin, pilkottiin Hindlll:11a ja analysoitiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Analysoiduista klooneista 90 % sisälsi L.helveticus HindiII-DNA-fragmentteja.

DNA-fragmenttien leimaus DNA leimattiin radioaktiivisesti käyttämällä fill-in-korvaus-DNA-synteesiä tai nick-translaatioreaktiota (Maniatis et ai.).

DNA polymeraasi I:n Klenow-fragmentti ja E.coli DNA-polymeraa- 93744 7 si I ostettiin Boehringer-Mannheim-yhtiöltä, [α-32ρ] dATP Amersham Co.sta.

Dotblot-hvbridisointimenetelmät 200 ng erät kromosomaalista DNA:a TE:ssa denaturoitiin kuumentamalla 5 minuuttia 95°C:ssa. Eriin lisättiin SSC:a niin, että loppukonsentraatioksi saatiin 16X SSC, ja sen jälkeen seos täplitettiin 10XSSC:lla kostutetulla GeneScreen-paperille ja huuhdeltiin kerran 20XSSC:lla. Käytetty laite oli Bio-Rad dotblot. Sen jälkeen suodatin oli valmis DNA:n hybridisoin-tiin, jossa käytettiin standardimenetelmiä hybridisoimalla 6XSSC:lla 60°C:ssa ja jälkeen pesemällä 0,lXSSC:lla 65°C:ssa (E. Southern, J.Mol.Biol. 98., 503 - 517, 1975). DNA-koettimina käytettiin joko plasmidia kokonaisena tai HindiII- fragmentin DNA:a, joka oli leimattu 32P:lla. Hybridisointisignaalien detektointia varten suodattimet valotettiin käyttämällä rönt-genfilmejä.

Restriktiokartoitus

Restriktioentsyymit ostettiin Boehringer-Mannheim Co.:lta ja New England Biolabs Co.:lta ja niitä käytettiin toimittajien suosittamalla tavalla.

ESIMERKKI

L.helveticus DNA-koettimen eristäminen L.helveticus ATCC 15009-kannan Hindlll:11a pilkottua kromosomaalista DNA:a on käytetty kloonipankin valmistamiseen edellä kuvatulla tavalla. Useita klooneja eristettiin käyttämällä suodattimia, jotka sisälsivät DNA-näytteitä valitusta määrästä erilaisia maitohappobakteereita. Hybridisointitulokset osoittivat, että noin 70 % testatusta L.helveticus-klooneista hyb-ridisoitui vain dotblot-suodattimien eri L-helveticus-näyttei -' den kanssa. Loput 30 % testatuista klooneista hybridisoitui 8 93744 myös monien muiden erilaisten maitohappobakteereiden ei-lähisukuisten lajien ja sukujen kanssa. Seuraavia esimerkkejä varten valittiin kaksi DNA-koetinta, jotka olivat hyvin spesifisiä L.helveticus-laiille. Niitä on kutsuttu tässä kuvauksessa ja patenttivaatimuksissa nimillä "sLHl" ja "sLH2".

sLHl:n ia sLH2:n restriktiokartoitus DNA-fragmenttien sLHl ja sLH2 restriktiokartta määritettiin käyttämällä useita restriktioentsyymejä. Tulokset on esitetty kuvioissa 1 ja 2 (kts. edellä oleva piirustusten lyhyt kuvaus) .

DNA-koettimen sLHl ~ia sLH2 spesifisyys ia herkkyys Nämä kaksi DNA-koetinta sLHl ja sLH2 testattiin dotblot-hybri-disointien avulla monia erilaisia Lactobacillus-suvun ja muiden maitohappobakteereiden edustajia vastaan. Näihin hybri-disointikokeisiin käytettiin DN-koettimina vain plasmideista eristettyjä, L.helveticus-laiista saatuja HindiII-DNA-fragmentteja. Dotblot-tulokset osoittivat, että molemmat DNA-koettimet hybridisoituivat vain DNA:n kanssa, joka oli saatu L.helveticus-bakteerilaieista. Millään muilla testatuilla eri Lactobacillus-lajeilla, Lactococcus-bakteereilla ja propioni-happobakteereilla ei esiintynyt mitään hybridisoitumista.

Ainoat havaitsemamme poikkeukset olivat kaksi L-acidophilus-kantaa, N21 j N22, jotka antoivat heikon hybridisointisignaa-lin sLHl:n ja sLH2:n kanssa. Nämä heikot signaalit voidaan kuitenkin selvästi erottaa L.helveticus-laiiin kuuluvien kantojen paljon voimakkaammista hybridisoitumissignaaleista. Täydelliset tulokset on koottu taulukkoon I.

Dotblot-määritystemme herkkyyden testaamiseksi valmistimme suodattimia eri Lactobacillus-kannoista saadun DNA:n sarja-laimennuksia ja käytimme näitä hybridisointiin sLHl- ja sLH2-koettimien kanssa. Tulokset voidaan vetää yhteen seuraavasti: tl 93744 9 i Saatoimme helposti havaita positiiviset hybridisoitumis-signaalit kaikkien eri L.heiveticus-kantoi en kanssa DNA-määritteiden ollessa niinkin alhaisia kuin 2 ng täplää kohti.

ii Mikään muu taulukossa I lueteltu ja testattu bakteerikanta ei osoittautunut hybridisoitumissignaaleja alle 200 ng/täplä DNA-määrillä.

iii DNA-määrien ollessa välillä 200 ng ja 1,6 μg/täplä monet L.acidophilus-laiin kannat alkoivat kehittää hybridisoitumissignaaleja.

iv Seuraavat kannat on testattu DNA-määrillä 1,6 μg/täplä, eivätkä ne antaneet mitään hybridisoitumissignaaleja: L.lactis N4, L.fermentum N7, L.plantarum N24, L.buchneri N25, L.brevis N26, L.casei N27, L.bulqaricus N123, L.maltaromicus N207, L.reuteri N211 ja E.coli HB101.

t 10 93744

Taulukko I: Bakteerikannat

Laji Lähde Kantaa) sLHlb) sLH2b) L.helveticus ATCC 15009 N2 + + L.lactis (type) ATCC 12315 N4 - L.helveticus NCDO 87 N6 + + L.fermentum NCDO 1750 N7 - L.delbrueckii (type) NCIB 8130 N8 L.lactis Liebefeld 125 N9 - L. acidophilus ATCC 4356 N12 L. acidophilus Piacenza D 179 N16 L. acidophilus Piacenza 188 S N17 L. acidophilus Piacenza 247 S N18 L. acidophilus Piacenza T 145 N21 + /- + /- L. acidophilus Piacenza T 145, 125 N22 + /- +/- L.plantarum ATCC 8041 N24 L.buchneri ATCC 4005 N25 L.brevis ATCC 14869 N26 L.casei (type) ATCC 393 N27 L.helveticus ATCC 7994 N47 + + L.helveticus ATCC 7995 N48 + + L.helveticus ATCC 12278 N50 + + L.helveticus ATCC 13866 N51 + + L.helveticus NCDO 1006 N52 L.helveticus NCDO 1373 N54 L.lactis NCDO 270 N62 L.lactis NCDO 297 N64 L.bulgaricus NCDO B 15 N95 L.bulgaricus NCDO B 19 N96 L.bulgaricus NCDO B 24 N99 L.bulgaricus NCDO 2395 N106 + + L.bulgaricus ATCC 11977 N122 + + L.bulgaricus (type) NCDO 1489 N123 L.bulgaricus ATCC 21815 N124 L.bulgaricus ATCC 27558 N125 + + L.bulgaricus ATCC 33409 N126 + + L.bulgaricus Piacenza CO 13 N139 L.bulgaricus Piacenza CO 14 N141

II

93744 11

Laji Lähde Kantaa) sLHlb) sLH2b) L.plantarum ATCC 14917 N186 L.delbrueckii ATCC 9649 N187 L.maltaromicus ATCC 27865 N207 L.reuteri (type) DSM 200016 N211 L.helveticus Piacenza b 50 N213 + + L.helveticus Zurich S 400 N217 + + L.helveticus meidän kokoelmamme N222 + + L.helveticus NCDO H 1 N254 + + L.helveticus NCDO H 2 N255 + + L.helveticus NCDO H 3 N256 + + L.helveticus NCDO H 6 N257 + + L.helveticus NCDO H 9 N258 + + L.helveticus NCDO H 10 N259 + + L.helveticus NCDO H 11 N260 + + L.helveticus NCDO H 13 N261 + + L.helveticus NCDO H 16 N262 + + L.helveticus NCDO H 17 N263 + + L.helveticus NCDO H 18 N264 + + L.helveticus NCDO H 19 N265 + + L.helveticus NCDO J 3 N266 + + L.helveticus NCDO J 4 N267 + + L.helveticus NCDO J 5 N268 + + L.helveticus NCDO J 6 N269 + + L.helveticus NCDO J 11 N270 + + L.helveticus NCDO J 14 N271 + + L.helveticus NCDO J 15 N272 + + L.helveticus NCDO J 17 N273 + + L.helveticus NCDO J 18 N274 + + L.helveticus NCDO J 19 N275 + + propionibacterium freudenreichii meidän kokoelmamme PP21 propionibacterium shermanii meidän kokoelmamme PP13

Lactococcus therm. meidän kokoelmamme ST1

Lactococcus lactis meidän kokoelmamme SL9 E.coli meidän kokoelmamme HB101 a) Nestle Research Center'in koodi b) dotblot-hybridisointiin käytetty koetin: (+) osoittaa hybridisoitumista; (-) ei hybridisoitumista

Claims (5)

93744

1. DNA-koetin Lactobacillus helveticus-laiin bakteerikantojen identifioimista varten, tunnettu siitä, että se on saatu menetelmällä, jossa L. helveticus-ATCC 15009 kannasta valmistetaan Hindlll-kloonipankki pilkkomalla tämän kannan DNA HindiI-I:lla, liittämällä plasmidiin pACYC184 ja ligatointiseos transformoidaan E. coli HB101 kantaan ja eristetään siitä klooni, jonka HindiII-DNA-fragmentti kykenee hybridisoitumaan L. helveticus-laiin kantojen DNA:n kanssa, joka fragmentti on fragmentti sLHl tai sLH2, kuvattu kuvissa 1 ja 2.

2. Menetelmä L. helveticus-laiin bakteerikannan identifioimiseksi, tunnettu siitä, että identifioitavasta kannasta valmistetaan DNA ja tarkistetaan, hybridisoituuko tämä DNA patenttivaatimuksen 1 mukaisen koettimen kanssa.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA valmistetaan lyysaamalla identifioitavan kannan solut.

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA valmistetaan lyysaamalla identifioitavan kannan solut kiinteällä tukiaineella. ψ

• 5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA valmistetaan kasvattamalla identifioitavien kantojen soluja kasvatusalustassa, joka on täydennetty fermen-toitavalla hiililähteellä, inkuboimalla niitä proteinaasien läsnäollessa, käsittelemällä ne N-asetyyli-muramidaasilla, inkuboimalla niitä edelleen emulgointiaineen, gelatointiaineen ja proteinaasin läsnäollessa, uuttamalla niistä DNA fenolilla, käsittelemällä tämä DNA RNase:lla ja uuttamalla RNase:lla käsitelty DNA kloroformilla. li 95744