NO177809B - Fremgangsmåte for hurtig blanding av små volumer for å forsterke biologiske reaksjoner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår fremgangsmåte for hurtig blanding av små volumer for å forsterke biologiske reaksjoner, og nærmere bestemt angår foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte av den art som angitt i innledningen til krav 1. Oppfinnelsen kan også være nyttig ved visse biokjemiske reaksjonsbestemmelser.

Immunologiske reaksjoner av den type som foreliggende oppfinnelse angår innbefatter antigen/antistoffreaksjoner ved hvilke en mikrosfære av enten magnetisk eller ikke-magnetisk art er f.eks. belagt med antistoff som ville bindes spesifikt med antigenet på en celleoverflate for å gjøre den ønskede bestemmelsen. En slik reaksjon kan innbefatte merking av antigenet for spesifikk binding eller kan innbefatte merking av en celle med hensyn til et antigen i cellen.

I den senere tid innebærer laboratoriepraksis slik blanding av merkede mikrosfærer som inneholder celleinvolverte inkubasjoner fra flere minutter til flere timer. En grunn for en slik forlenget tidsperiode er å føre tilbake til forskjel-lene blant fysiske og kjemiske egenskaper i populasjonen til tilgjengelige mikrosfærer for å belegges med valgt merke. Slike forlengede tidsperioder begrenser stort sett slike prosedyrer og forhindrer enhver hurtig analysetype og spesielt anvendelse ved automatiske teknikker.

Tidligere teknikker har forsøkt å optimalisere tidsperioden ved spesifikke reaksjoner ved å variere volumet og kon-sentrasjonen til reaktantene sammen med temperaturen ved hvilken reaksjonen utføres og den ønskede blandingen. Det er imidlertid nedre grenser på hvor lite et volum til en reaksjonsblanding kan være. Økning av temperaturen kan dessuten ødelegge immunologiske reaktanter og kraftig blanding kan også ødelegge cellene.

Forskjellige blandingssystemtyper og fremgangsmåter har blitt anvendt i tidligere teknikker for spesielle immunologiske reaksjoner. De tidligere kjente teknikkene antyder røring av blandingen i en utstrakt tidsperiode som er uønskelig for automatiske systemer. Slike automatiske systemer er konstru-ert spesielt for analysering av store antall prøver pr. tidsenhet.

Av tidligere kjent teknikk kan nevnes europeisk patentpublikasjon nr. 106 685, som benytter fluorescerende mikrosfærer til å type blod. Ved denne fremgangsmåten er det imidlertid nødvendig med en inkubasjonstid på 3 minutter. W0 82/03462 beskriver også en innretning som forutsetter en inkubasjonstid. Her anvendes det forøvrig ikke mikrosfærer.

US patentpublikasjon nr. 3 985 649 beskriver en innretning for å blande magnetiske partikler med væske ved å forflytte disse ved hjelp av en elektromagnet eller ved å filtrere partikler ved hjelp av elektromagneter istedenfor å anvende forskjellige metoder som sentrifugering, dekantering eller filtrering.

En ulempe med ovenfornevnte publikasjoner er at problemet med å øke reaksjonshastigheten ikke er mulig.

Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å unngå tidligere kjente ulemper, og dette tilveiebringes ved hjelp av en fremgangsmåte av den innledningsvis nevnte art hvis karakte-ristiske trekk fremgår av krav 1. Ytterligere trekk ved oppfinnelsen fremgår av de øvrige uselvstendige kravene.

Fremgangsmåten som utgjør oppfinnelsen tilveiebringer suksessive optimale resultater ved slike immunologiske reaksjoner ved hjelp av økede reaksjonshastigheter som er uventet og uvanlige innenfor dette området. Oppfinnelsen klargjør dessuten en kontinuerlig blandingsprosedyre som er spesielt brukbar ved automatiserte systemer. Oppfinnelsen kan dessuten bli anvendt for å akselerere blanding av reaktanter og dannede legemer slik som bakterier, viruser og sopp som har spesifikt interessante egenskaper utledet fra biokjemiske reaksj oner.

En forbedret fremgangsmåte for akselerering av reaksjonshastigheten til i det minste en immunologisk reaksjon innbefattende økning av nøyaktigheten ved å gjøre en kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse som involverer fluidsuspensjonsinneholdende celler eller formede legemer, slik som bakterier, viruser og sopp. Et lite volum med en prøve som inneholder celler og mikrosfærer merket for å bindes spesifikt til bestemte anførte celler eller dannede legemer blir hurtig blandet i en tidsperiode, som er tilstrekkelig redusert sammenlignet med tidligere praksis. Denne hurtige blandingen tillater fremdeles en optimal bestemmelse uten betydelig påvirkning av cellenes egenskaper eller de dannede legemenes egenskaper.

De hurtige blandingsresultatene tilveiebrakt ved oppfinnelsen er spesielt nyttige ved automatiske systemer på grunn av redusert reaksjonstid og muligheten for å blandes kontinuerlig ved et automatisk system. De anvendte mikrosfærene kan være magnetiske eller ikke-magnetiske.

I det påfølgende skal oppfinnelsen beskrives nærmere ved hjelp av foretrukne utførelsesformer og ved hjelp av eksempler med henvisning til tegningene, hvor: Fig. 1 viser et skjematisk blokkdiagram av en utførelsesform av oppfinnelsen. Fig. 2 viser et skjematisk diagram av en andre utførelsesform av oppfinnelsen. Fig. 3A og 3B viser sideriss av en blanderutførelsesform av oppfinnelsen henholdsvis i en fylle- og uttømningsposisjon. Fig. 4 viser en drivutførelsesform for blanderen på fig. 3A og 3B. Fig. 5 viser en andre drivutførelsesform av blanderen på fig. 3A og 3B. Fig. 6A, 6B og 6C viser sideriss av en andre blanderutførel-sesform av oppfinnelsen lignende blanderen på fig. 3A og 3B, som også viser en magnetisk fjerningsutførelsesform av oppf innelsen. Fig. 7 viser en kurve av et sett resultater som anvender en blander lignende den viste på henholdsvis 3A og 3B og fig. 6A-6C. Fig. 8 viser et perspektivriss av en annen blanderutførelses-form av oppfinnelsen.

Fig. 9 viser et sideriss av blanderen på fig. 8.

Fig. 10 viser et sideriss av blanderen på fig. 8, hvor det er vist en annen magnetisk fjernende utførelsesform av oppfinnelsen . Fig. 11 viser et toppriss av den magnetiske fjerneinnretnin-gen på fig. 10 langs linjen 11-11. Fig. 12 viser et sideriss av en detaljert utførelsesform av blanderen på fig. 8. Fig. 13 viser et topplanriss av blanderen på fig. 12, og

fig. 14 viser en kurve av et sett med resultater som anvender en blander lignende den viste på henholdsvis fig. 8-11.

Med henvisning til fig. 1 er det vist en utførelsesform av systemet betegnet generelt med henvisningstallet 10. Systemet 10 innbefatter en biologisk prøve 12 som inneholder celler (ikke vist), en reaktant 14 innbefattende materiale som selektivt reagerer med celler, slik som en væske eller fast fasebundet materiale og en blander 16. Prøven 12 kan innbefatte fullblod, menneskelig stoffluider inneholdende celler, eller andre fluider som inneholder dannede legemer, slik som bakterier, viruser og sopp.

Prøven 12 blir ført til blanderen 16 via en ledning 18. I det minste en reaktant 14 blir også tillagt blanderen 16 via en ledning 20. Reaktanten 14 kan være flere mikrosfærer belagt med et antistoff spesifikt for i det minste en celletype som ønskes bundet til mikrosfærene (ikke vist). Reaktanten 14 kan videre være en kombinasjon av en fortrinnsvis lysering og de belagte mikrosfærene.

En slik foretrukket lysering og en behandling kan bli anvendt slik som beskrevet i US-patentsøknad nr. 25303 med tittelen "Method and reagent system for isolation, identification and/or analysis of leukocytes from whole blood samples".

Blandingen til prøven 12 med celler deri og reaktanten 14 blir så hurtig omrørt i blanderen 16. Blandingen blir rørt i betydelig redusert tid, nemlig generelt større enn 2 sekunder og mindre enn 60 sekunder og fortrinnsvis for hele blodprøven i området for 5 til 15 sekunder. Den reduserte blandeperioden tillater tid for å fullføre reaksjonen uten merkbare skader på de cellemessige egenskapene av interesse.

En kritisk faktor ved prøveblandingen er valget av volumet til prøven 12 og den anvendte reaktanten 14. Dette volumet blir valgt til å være i området på 50 til 700 mikroliter og fortrinnsvis for en fullblodprøve i området av 100 til 200 mikroliter. Den akselererte reaksjonshastigheten blir tilveiebrakt uten noen økning i temperaturen. Blandingen kan bli utført ved romtemperatur som unngår enhver mulig ødeleggende effekt på de cellulare egenskapene av interesse.

Øket prøvevolum kan bli tilpasset innenfor oppfinnelsens parametere, slik som minst 1000 mikroliter, uten å øke merkbart tiden for blandingen.

Etter den korte blandeperioden kan blandingen bli tømt fra blanderen 16 via en ledning 22 for en kvantitativ og/eller kvalitativ analyse. Cellene av interesse kan f.eks. bli analysert eller bli ytterligere påvirket som vist på fig. 2.

Et andre blandesystem 24 er vist på fig. 2 (idet samme henvisningstall er anvendt for tilsvarende elementer ved hver av figurene). Den biologiske prøven 12 kan igjen bli tilført blanderen 16 via en ledning 18. Reaktanten er vist separat som en lysering 26 og flere mikrosfærer 28 med antistoffer bundet dertil generelt i en buffer tilført respektive ledninger 30 og 32 til blanderen 16.

Som beskrevet med henvisning til fig. 1 kan blandingen bli tømt fra blanderen 16 via ledningen 22 og tilført den første analysator 34, om ønskelig. Blandingen kan bli tømt fra analysatoren 34 via en ledning 36 for ytterligere analyse eller cellene kan bli ytterligere påvirket på en lignende måte som beskrevet her. Analysatoren 34 vil også kunne bli koblet ved hjelp av en ledning 36' med en annen blander med en annen forbindelse, som ikke er vist nærmere.

Blandingen kan også bli tømt ut via en ledning 38 til en magnetisk fjerneanordning 40. I det minste noen av mikrosfærene vil i dette tilfelle være dannet av et magnetisk materiale og cellene som er bundet til dem kan fanges opp i det magnetiske feltet til anordningen 40. De øvrige cellene av interesse blir så tømt ut via en ledning 42 til en andre analysator 44 for en ytterligere analyse.

Noen spesifikke analysesystemer, ved hvilke systemet 10 og blanderen 16 ifølge foreliggende oppfinnelse kan bli anvendt er beskrevet i norsk patentsøknad nr. 885041 Fig. 3A og 3B viser en første blanderutførelsesform 46 som kan bli anvendt som blanderen 16. Blanderen 46 innbefatter en U-formet konstruksjonstype 48, som for eksempelformål er vist som en U-rør konstruksjonstype med et par åpne ender 50 og 52. U-røret 48 har en sentral arm 54 som har en åpning 56 deri. U-røret 48 er delvis rotert eller vippet generelt rundt aksen til åpningen 56 for å tilveiebringe en hurtig, men forsiktig blanding av blandingen til prøven 12 og reaktanten 14. Som det fremgår av fig. 3A og 3B forblir åpningen 56 ved en relativt fast posisjon og kan følgelig bli anvendt på en enkel måte for å tilføre ytterligere væsker eller reaktanter om ønskelig mens blanderen 46 er i drift. Et beger 58 er vist anvendt for å fylle blanderen 46 og et beger 60 er vist for å samle den blandede og reagerte blandingen. Åpningen 56 må ikke nødvendigvis være en port for å motta komponenter. Når vippeblandingen blir avbrutt med portene 50 og 52 med posisjonen på fig. 3A så kunne åpningen 54 bli utelatt eller portene 50 og 52 kan bli koblet til et ledningsstrømnings-system. Fig. 4 viser en første utførelsesform av en drivmekanisme 62 som kan bli anvendt for å tilveiebringe den roterende bevegelsen eller vippebevegelsen til U-røret 48. Mekanismen 62 innbefatter et tannhjul 64 som er montert eller på annen måte festet til U-røret 48 ved hjelp av klebing eller klemming (ikke vist), med et rotasjonssenter aksialt innrettet med aksen til åpningen 56. Tannhjulet 64 og følgelig U-røret 48 roteres med en sagtannet akse 66, hvilke sagtenner eller tannhjulstenner passer med tennene til tannhjulet 64. U-røret 48 blir vippet som følge av bevegelsen av akselen 66 i en retning vist med pilen 68.

En andre drivmekanismeutførelsesform 70 er vist på fig. 5. Blanderen 46 og U-røret 48 er montert via den sentrale armen 54 med en monteringsklemme 72. Monteringsklemmen 72 er montert eller festet til akselen (ikke vist) til en drivmotor 74. Drivmekanismen 70 fullfører vippingen eller rotasjonen av blanderen 46 via motorakselen og klemmen 72, hvilken motor og aksel fortrinnsvis opereres reversibelt.

En blander 76 med en magnetisk separasjonsmekanisme er vist på fig. 6A-6C. U-røret 48 er montert eller festet til en monteringsplate 78, som igjen er montert på akselen (ikke vist) til en reversibel motor for å tilveiebringe vipping av U-røret 48. Et magnetisk fjernesystem 80 er også montert på monteringsplaten 78 for rotasjon dermed.

Systemet 80 innbefatter en pneumatisk sylinder 82 vist med heltrukne linjer i sin ikke-aktive posisjon på fig. 6A-6C. Sylinderen 82 er vist med prikkede linjer i sin aktiverte posisjon på fig. 6A. I ikke-aktivert posisjon holder sylinderen 82 en magnet 84 i tett nærhet av bunnen til U-røret 48, som vil fange opp enhver magnetisk mikrosfære når blandingen passeres av magneten 84. U-røret 84 kan så bli tømt inn i samlebegeret 60 uten cellene oppfanget eller fjernet av magneten 84 og de magnetiske mikrosfærene.

Magneten 84 er montert på en dreibar aksel eller arm 86, dreibar rundt et dreiepunkt 88. Sylinderen 82 aktiveres for å dreie akselen 86 og følgelig magneten 84 bort fra U-røret 48 for å tillate fri bevegelse av de magnetiske mikrosfærene. Sylinderen 82 aktiveres i startblandingen slik at mikrosfærene fritt kan blande og binde cellene dertil. Sylinderen 82 kunne igjen bli aktivert for å fjerne de magnetiske mikrosfærene fra U-røret 48. Et tilstrekkelig stort magnetisk felt kan bli anvendt slik at alle de magnetiske mikrosfærene vil bli oppfanget uten å vippe U-røret 48.

Fig. 7 viser et sett med resultater tilveiebrakt av en fullblodsprøve anvendt med en blandeanordning som bruker U-røret 48. Ved dette eksempelet ble 40 mikroliter med magnetiske mikrosfærer med et rødt blodcellespesifikt antilegeme bundet dertil kombinert med 150 mikroliter bufferoppløsning for å danne reaktanten 14. Ved dette eksempelet er det spesielle røde blodcellespesifikke antistoffet beskrevet i US-søknad nr. 799489 med tittelen "Monoclonal antibody for recovery of leukocytes in human peripheral blood and method of recovery employing said monoclonal antibody". Den biologiske prøven 12 var en 10 mikroliters prøve med fullblod som ble tillagt reaktanten 14. U-røret 48 ble rotert eller vippet i 5 sekunder utenfor et magnetisk felt for å binde antistoffet og følgelig mikrosfærene til de røde blodcellene. Magneten 84 ble så anbrakt tilliggende U-røret 48 og U-røret 48 ble vippet i ytterligere 10 sekunder.

Som nevnt ovenfor ville, dersom alle de magnetiske mikrosfærene ble anbrakt innenfor det magnetiske feltet, ville det ikke være nødvendig med noen ytterligere vipping. Den resulterende prøven ble tømt ut og analysert og resultatet var større enn 99,5$ med røde blodceller (A) var fjernet ved magnetiske mikrosfærer og magneten 84. Dette tillater en analyse av antall lymfocytter (B) og granulocytter og monocytter (C) i prøven. Det er velkjent at røde blodceller ellers ville blokkere detektering av lymfocytter, granulocytter og monocytter.

En annen utførelsesform av blanderen 90 er generelt vist på fig. 8-10. Blanderen 90 innbefatter en arm 92 eksentrisk montert og drevet av en roterende motordrivenhet 94. Armen 92 drives av en eksentrisk bevegelse som vist ved pilen 96. Denne bevegelsen tilveiebringer en hvirvelblandeeffekt idet blandingen av væske, celler og mikrosfærer forsøker å klatre opp veggene til et rør eller en beholder 98. Hvirveleffekten gir en svært effektiv og hurtig blanding av prøven 12 og reaktanten 14. Som før kan blanderen 90 bli drevet utenfor det magnetiske feltet (fig. 9) og så i det magnetiske feltet (fig. 10) for å tilveiebringe magnetisk separasjon. Den magnetiske separasjonen kan også bli gjort uten å bruke blanderen 90.

Ved denne utførelsesformen blir det magnetiske feltet tilveiebrakt ved hjelp av flere stavmagneter 100, som kan være bueformet (fig. 8) eller rette (ikke vist). Magnetene 100 kan bli beveget relativt røret 98 som beskrevet med henvisning til fig. 6A-6C eller røret 98 kan bli beveget relativt magnetene lOOsom vist på fig. 9 og 10.

En spesifikk utførelsesform av blanderen 90 er en blander 102 vist på fig. 12 og 13. Blanderen 102 er vist montert på en basis 104, som kan innbefatte et speil 106 ved sin ene ende 108. Speilet 106 kan bli anvendt for å betrakte blandingen eller fra fraværet derav i beholderen 98. Basisen 104, som kan være anbrakt på enhver bekvem overflate kan innbefatte en fot 110. Basisen 104 kan bli utelatt og blanderen 102 kan bli montert i system eller på enhver egnet overflate, om ønskelig.

En drivblandemotor 112 kan være montert på en motorblokk eller basis 114, som igjen er montert på et bæreelement 116. Elementet 116 kan innbefatte en arm 118 gjennom hvilken flere skruer 120 er skrudd inn i blokken 114.

Motoren 112 innbefatter en drivaksel 122, som er roterbar montert i blokken 114 og driver en trinse 124 via f.eks. et 0-ringdrivbelte 126. En eksentrisk stift 128 er montert i trinsen 124 og strekker seg inn i passasjen 130 i blokken 114. Stiften 128 samvirker med den første enden 132 til blanderarmen 92.

En andre ende 134 til blanderarmen 92 holder beholderen 98. Armen 92 har også en sliss 136 som samvirker glidende rundt en fast stift 138 montert i blokken 114. Når den eksentriske stiften 128 roteres, beveges den første enden 132 til armen 92 frem og tilbake (fig. 13) for å tilveiebringe den blandende svingingen til beholderen 98 montert på den andre enden 134.

Beholderen 98 kan være montert eller på annen måte festet til armen 92 ved hjelp av en holder 140 eller ved hjelp av en annen, fortrinnsvis f r iksjonsmessig holdemekanisme. Holderen 140 kan være montert på armenden 134 ved hjelp av flere skruer eller bolter 142. Holderen 140 kan innbefatte en fast holdeinnretning 144 på bunnen til beholderen, som kan bli fastholdt ved hjelp av flere bolter eller skruer 146. De spesielle valgte størrelser og materialer er ikke kritiske og kan variere etter ønske.

Resultatene av en fullblodprøve reagert i blanderen 90, 102 er vist på fig. 14. Førti mikroliter med rødt blod-cellespesif ikt antistoff belagt med magnetiske mikrosfærer ble kombinert med 150 mikroliter bufferoppløsning for å danne reaktanten 14. Det samme spesifikke antistoffet anvendt ved eksempler vist på fig. 7 ble anvendt ved dette eksempelet. Prøven 12 var 10 mikroliter med fullblodprøve som ble tillagt reaktanten 14 i beholderen 98. Beholderen 98 ble hvirvlet eller oscillert i 5 sekunder for å reagere blandingen. Det magnetiske feltet ble tilført i 10 sekunder uten operasjon av blanderen 90 for å separere de røde blodcellebundne magnetiske mikrosfærene fra den øvrige prøven. Den øvrige prøven ble så analysert og igjen ble totalt over 99, 5% av røde blodceller (A) fjernet. Med de røde blodceller (A) vesentlig fjernet var lymfocytter (B) og granulocytter og monocytter

(C) tilgjengelige for analyse.

Modifikasjoner og variasjoner av foreliggende oppfinnelse er

mulig i lys av ovenf ornevnte lære. Andre typer for antistoffer kan også bli anvendt, f.eks. spesielt neutrofil (N) spesifikt antistoff som kan bli anvendt er beskrevet i US-patentsøknad nr. 938864 med tittelen "Monoclonal antibody specific to neutrophils". Det magnetiske feltet kunne også bli tilført av elektromagnetiske anordninger. Blanderen kunne

bli aktivert i løpet av påføringen av det magnetiske feltet, om ønsket. Andre blandekonstruksjoner kan bli anvendt, f.eks. kunne den U-formede konstruksjonen 48 være en åpen konstruk-sjon lignende konstruksjonen av begrene 58, 60. Tillegget av fluider til hverandre kan utgjøre en del av forblandingsvirk-ningen for å hjelpe til med reaksjonshastigheten. Det er derfor klart at oppfinnelsen kan bli utført annerledes enn det beskrevet her i beskrivelsen innenfor rammen av oppfinnelsen .

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for å tilveiebringe for en prøve, som inneholder celler og inn i hvilken prøve det innføres en valgt reaktant for blanding, en suspensjon for å utføre kvantita-tive og/eller kvalitative bestemmelser, innbefattende preparering av et prøvevolum av omkring 5-1000 mikroliter inneholdende flere celler, innføring i prøven i det minste en reaktant, som innbefatter antistoffbundne mikrosfærer, for å tilveiebringe en suspensjon egnet for å utføre bestemmelsen, karakterisert ved hurtig blanding av resultantsuspensjonen med prøven og reaktanten i en tid av i størrelsesorden 60 sekunder eller mindre tilstrekkelig for å akselerere reaksjonshastigheten mellom cellen og reaktanten uten å ødelegge cellulare egenskaper av interesse eller nøyaktigheten ved bestemmelsen, umiddelbart etter blandingen utføres i det minste en separering av noen av cellene fra prøven eller en bestemmelse av egenskapene til cellene uten en inkubasjonsperiode.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven er et biologisk fluid.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at prøven er fullblod med røde og hvite blod-cellepopulasjoner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at reaktanten er et foretrukket blodecelleut-tynningsmiddel.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at mikrosfærene er magnetiske og det foretas en magnetisk fjerning av bundne røde blodceller for fullblods-prøven etter en hurtig blanding.