CN1018673B - 用于增强生物反应而进行小容积搅拌的方法和仪器 - Google Patents

Abstract

一种方法和仪器，用来对至少一种确定的生物反应进行加速，包括提高由此所做的测定的精度。反应包括选定活生物细胞，该细胞以小容积被制备；还包括将含有抗体的微球体快速搅拌，这种抗体至少专用于粘结其中的一种细胞。微球体可以是磁性的、而被粘结细胞可以被磁性除去，以分析剩下的血球群体。微球体可以以连续的方式或同时的方式被引入。

Description

本发明的目的在于对含有一种生物或含有细胞的其他流体进行定性和/或定量测定中大大地加速反应速度和提高其精度。更详细地说，本发明是指用来加速免疫反应速度的方法和仪器，在这种免疫反应中，至少被涂覆有一种选定抗体的微球体被快速地与含有细胞的样品混合而不明显地损害所研究的细胞的性质。本发明也可用于某些生化反应的测定。

与本发明有关的这类免疫反应包括抗原/抗体反应，在这种反应中，微球体（不管其是磁性的还是非磁性的）被涂覆有抗体一类的东西，这种抗体将专门与位于我们希望测定的细胞表面上的抗原粘结。这种的反应可以包括对用于特定粘结的抗原的标记和示踪，或者可以包括对一种细胞，相对于其中的一种抗原进行示踪或标记。

在此以前，涉及到对细胞样品中被示踪或被标记的微球体进行混合的实验室做法，是要培育几分钟到几小时。其时间所以拖得如此长的理由之一要归咎于所用微球体群体中的物理和化学性质的差别。这样长时间周期大大地限制了这些程序并妨碍任何一种类型的快速试验，特别是妨碍对自动化技术的应用。

已有技术企图将特定反应的时间周期搞到最佳，其办法是改变反应物的容积和浓度以及进行反应的温度和所需要的混合。很明显，可以采用多么少的反应混合物的体积这样一个下限是存在的。还有，提 高温度可以使免疫反应变性，而使劲搅拌又会破坏细胞。

在以往的技术中，曾将各种各样的混合（搅拌）系统和方法用于特定的免疫反应。以往的技术表明，长时间搅拌混合物是自动化系统所不希望的。这样的自动化系统特别适用于在单位时间内分析大量样品。

因此，本发明的第一个目的是提供一种在含有细胞的样品中加快反应速度的方法，而选定的反应物被引入这种样品供搅拌，以提供一种悬浮液来进行定性和/或定量测定，上述方法包括制备一定容积含有细胞的样品，向样品中引入至少一种反应物以提供一种适用于测定的悬浮液;其特征是：快速搅拌由样品和反应物形成的悬浮液，以大大减小足以加速样品反应物之间的反应速度的时间周期，而不损害所研究细胞的性质或测定的精度。

本发明的第二个目的是提供一种仪器以便加速含有细胞的样品中的反应速度，而选定的反应物被引入这个样品供搅拌，以提供一种悬浮液去进行定量和/或定性测定，上述仪器包括一定容积的含有细胞的样品，还有用来向样品中至少引入一种反应物的装置，以提供适合于进行测定的悬浮液;其特征在于用一个装置快速搅拌样品和反应物所组成的悬浮液，以便大大减小足以加速细胞和反应物之间反应速度的时间周期，并且不损害所研究细胞的性质和测定精度。

本发明的第三个目的是提供一种方法，它至少能使一种确定的生物反应得到增强和加速，而这种反应涉及到在定量和定性测定中的选定活生物细胞，上述方法特征在于：制备一定小容积的包含至少一种上述生物细胞的生物样品，引入至少一种反应物，该反应物至少适宜于上述细胞，将这种反应物引入上述小容积中，并快速搅拌上述样品 和反应物的混合物，以便大大减小足以加速至少一种上述确定生物反应的时间周期，又不明显地损害所研究细胞的生物性质。

本发明的第四个目的在于提供一种仪器，它至少能增强和加速一种确定的生物反应，该反应涉及在定量和/或定性测定中的选定活生物细胞，上述仪器的特征在于：提供一个小容积的至少包含上述生物细胞的生物样品;以及用于向上述小容积中引入至少一种适宜于上述细胞的反应物的装置，还有用于快速搅拌上述样品和反应物的混合物的装置，以便大大减小足以加速至少一种上述确定的生物反应时间周期，但又不明显地损害所研究细胞的生物性质。

体现本发明的方法和仪器靠提高此领域所不曾料到且不同寻常的反应速度成功地得到了在这种免疫反应中的最佳结果。此外，本发明使连续搅拌程序成为可能，而这一点制别有助于自动化系统。还有，本发明可以用来加速搅拌反应物并形成象细菌、病毒和霉菌一类的机体，这些东西具有从生化反应所产生的有用的特别性质。

一种用于对至少一个免疫反应进行加速的改进方法和仪器包括提高进行定性和/或定量测定的精度，这种测定涉及一种含有诸如细菌、病毒和霉菌这样的细胞或形成的机体的流体悬浮液。小体积的含有细胞的样品，还有被标记和示踪并特别粘结以确定细胞或形成机体的位置的微球体，在某个时间内被快速地搅拌，这一点特别有助于与现有技术进行比较。这个快速搅动始终允许获得最佳测定，而又不明显地损害被研究的细胞或形成机体的性质。

本发明获得的快速搅动结果特别适合于自动系统，其理由是它能减小反应时间并能在一个自动系统中连续搅动。所用微球体可以是磁性的或非磁性的。

本发明的最佳实施例将借助实例加以叙述，请参考本说明书的附图，其中，

图1是本发明的一个实施例的示意方框图;

图2是本发明的第二个实施例的示意图;

图3A和3B是本发明的一个搅拌器的实施例侧视图，分别是填料和倾倒（或卸料）位置;

图4是图3A和3B中的搅拌器的一个驱动实施例;

图5是图3A和3B中的搅拌器的第二个驱动实施例;

图6A，6B和6C是本发明的另一个搅拌器实施例的侧视图，与图3A和3B所示的搅拌器相似，它还示出了本发明的一个磁铁移动实施例;

图7是一组结果曲线，它所用的搅拌器与图3A和3B及图6A-6C所示的相似;

图8是本发明的另一个搅拌器实施例的透视图;

图9是图8所示搅拌器的侧视图;

图10是图8所示搅拌器的侧视图，它说明了本发明的另一个磁铁运动的实施例;

图11是对图10所示磁铁移动实施例沿线11-11剖开后的顶视剖视图;

图12是图8所示搅拌器的详叙实施例的侧视图;

图13是图12所示搅拌器的顶视平面视图;

图14是一组结果曲线，所用的搅拌器与图8-11所示的搅拌器相似。

参见图1，体现本发明的系统的一个实施例用参考数字10来标 记。系统10包括：一个含有细胞（未示出）的生物样品12;一种反应物14，14含有一种与细胞进行选择性反应的材料;一种液相或固相粘结材料和搅拌器16。样品12可以包括全血，包含细胞的人体流体，或包含形成机体的其他流体，这类形成机体可以是细菌、病毒和霉菌。

样品12通过线18被送进搅拌器16中。至少有一种反应物14通过线20也被送进搅拌器16中。反应物14可以是一些涂覆有一种抗体的微球体，该抗体至少对一种需要被粘结到该微球体（末示出）的细胞有效。反应物14还可以是一种择优的细胞溶解与被涂覆微球体的结合。

一种这样的择优细胞溶解和一种同时被使用的抑制在美国专利申请168，428号中公开，其名称为：从全血样品中分离、识别和/或分析白细胞的方法和试剂系统，本说明书用它作参考文献。

样品12与其中的细胞的混合物以及反应物14随后在搅拌器16中被快速地搅动。该混合物被搅拌的时间明显地减小，即一般在2秒钟到60秒钟之间;而对全血样品来讲最好控制在5到15秒钟之间。搅拌时间周期的减小使得能够完成反应而又不明显的损害所研究细胞的性质。

在样品搅拌中的一个关键因素是选定样品12和所用反应物14的容积。这个容积被选定为50到700微升，对全血样品来讲该容积最好为100到200微升。加快反应速度可以在不提高反应温度的情况下获得。搅拌可以在室温下完成，从而避免了对所研究细胞性质的任何可能的有害影响。

提高样品容积可以在本发明的参数范围内调节，例如至少可以是1000微升，而不明显增加搅拌的时间周期。

经过较短的搅拌周期后，该混合物可以经过线22从搅拌器16中卸出来供定量和/或定性分析用。例如，可以对所研究的细胞加以分析或按图2所示进一步进行。

第二个搅拌系统24示于图2中（在每个附图中相应元件使用相同号码）。生物样品12还可以再次通过线18送进搅拌器16中。反应物被分别表示为细胞溶解（lyse）26和一些粘结有通常用做缓冲剂和抗体的微球体28，26和28分别通过线30和32送到搅拌器16中。

正如图1所示，该混合物可以通过线22从搅拌器16中卸下并在需要时送进分析器34中。该混合物可以通过线36从分析器34中卸下供进一步分析用，或作为细胞用来按照与这里所述的相似的方式进一步分析处理。分析器34还可以通过线36′耦合到带有其他接点的另外的搅拌器（未示出）上去。

该混合物也可以通过线38卸到磁性移动装置40中去。至少在这种情况下某些微球体将由磁性材料构成，而粘结到微球体上的细胞则被装置40中的磁场所俘获。剩下的所研究的细胞随后通过线42卸到第二个分析器44中供进一步分析用。

可以使用本发明的系统10和搅拌器16的某些特定分析系统在美国专利申请168，301号中公开，其名称是：为了对表示选定特征的群体进行计数，对细胞或形成的机体筛选所用的自动化分析器和方法，此文在这里被引用做参考文献。

图3A和3B示出了第一种搅拌器实施例46，46可被用做搅 拌器16。搅拌器46包括一个U型结构48，作为例子，这个U型结构具有一对开口端50和52。U型管48包括中央臂54，54上并有一个孔56。U型管48一般沿孔56的轴线做部分旋转或摆动，但缓慢地搅拌样品12和反应物14的混合物。正如从图3A和3B所能看到的，孔56保持在相对固定的位置，因此在需要时可以很容易地再加进液体和反应物，而这时搅拌器46在被操作。还有，为了便于说明，有一个烧杯58被示出，它正被用来往搅拌器46中加料，而烧杯60用来收集被搅拌和反应过的混合物。孔56并不必须是接收元件的入口。当入口50或52处于图3A所示的加料位置时搅动被中断，因此孔56可以省去，或者入口50和52可以被耦合到一列式的流动系统上。

图4示出了驱动机构62的第一个实施例，62可用来为U型管48提供旋转式摆动运动的动力。机构62包括驱动齿轮64，64被安装或固定在U型管48上，例如粘结上去或卡箝在上面（未示出），要求其旋转轴的中心与孔56的轴心对准。齿轮64和U型管48由一个齿形花键轴66加以旋转，其中锯齿与齿轮64的齿相啮合。U型管48由于轴66沿箭头68所示方向的运动而摆动。

第二个驱动机构实施例70示于图5。搅拌器46和U型管48通过中央臂54安装在安装支架72上。安装支架72被安装或附着在驱动马达74的轴（未示出）上。驱动装置70通过马达轴和支架72完成摆动和旋转，其中马达和轴最好是能可逆旋转的。

带有磁性分离机构的搅拌器76示于图6A-6C中。U型管48被安装或固定在安装板78上，78又被安装在可逆马达的轴（未示出）上，以提供U型管48的摆动。一个磁性移动系统80也 被安装在安装板78上以实现其旋转。

系统80包括一个在图6A-6C中以实线表示其处于非启动位置的气缸82。气缸82在图6A中以点线表示其启动后的位置，气缸82使磁铁84位于紧靠U型管48底部的位置上，这将能在混合物通过磁铁时吸住所有的磁性微球体。然后U型管48可以向收集烧杯60卸料，而不存在细胞被磁铁84和磁性微球体俘获或移去的问题。

磁铁84被安装在可绕一点转动的轴或臂86上，86可绕枢点88旋转。气缸82被启动以转动轴86并继而转动磁铁84离开U型管48，以便使磁性微球体自由运动。气缸82在最初的搅拌中被启动，以便使微球体可以自由地搅拌和将细胞粘结在它上面。气缸82还将再次被启动以便将磁性微球体从U型管48上移走。可使用一个足够大的磁场，从而在不摆动U型管48的情况下将所有磁性微球体俘获。

图7示出了采用使用U型管48的搅拌仪器从全血采样中得到的一组测定结果。在这个例子中，在其上粘结有红血球专门抗体的40微升磁性微球体与150微升缓冲剂溶液结合形成了反应物14。在这个例子中，所用的特定红血球专门抗体被1985年11月19日受理的美国专利申请799489号的申请所公开，其题目是：用于人体外周血液中的白血球回收的单克隆抗体和应用上述单克隆抗体回收的方法，这里将它加以引用作为参考文献。生物样品12是10微升全血样品，它被加到反应物14中。U型管48在磁场外被旋转或摆动5秒钟以便粘结抗体并将微球体粘结到红血球上。磁铁84放在U型管48相邻的地方而使U型管48再摆动10秒钟。

正如上所述，如果所有磁性微球体被放在磁场内，则就不需要进一步摆动。由此形成的样品被卸下和分析，而其结果是：超过99.5%的红血球（A）被磁性微球体和磁铁84移走。这就允许在样品中进行淋巴细胞的数量分析（B），和粒细胞及单核细胞的数量分析（C）。正如众所周知的那样，否则红血球将阻塞对淋巴细胞、粒细胞和单核细胞的检测。

另一个搅拌器90的实施例示于图8-10。搅拌器90包括一个偏心安装和由旋转马达驱动装置94驱动的臂92。臂92以箭头96所示的偏心运动方式被驱动。这个运动造成了一种涡旋搅拌效应，由此液体、细胞和微球体的混合物试图上升到管或容器98的壁上。涡旋效应提供了一种非常有效和快速的将样品12和反应物14的混合物搅拌的效果。如前所述，搅拌器90首先可以在磁场外（图9）操作，然后在磁场中操作（图10）以便提供分离。磁分离也可以不通过操作搅拌器90而得到。

在这个实施例中，磁场是由一批磁棒100提供的，它们可以是弯曲的（图8）或直的（未示出）。磁铁100可以象图6A-6C所示的那样做相对于管98的运动，或者象图9或10中所示那样使管98做相对于磁铁100的运动。

搅拌器90的一个具体实施例是示于图12和13的搅拌器102。搅拌器102是装在基座104上的，基座104包括位于其一端108上的反射镜106。反射镜106用于观看混合物在容器98中的存在与否。基座104可放在任何方便的表面上，它可以有支脚110。基座104可以除去，而搅拌器102可以安装在一个系统里或安装在所希望的任何其他方便的表面上。

一个搅拌器驱动马达112可以被安装在马达座或基座114上，这个座114又装在支撑部件116上。部件116可以包括一个臂118，通过118有若干螺钉120连到座114上。

马达112包括一个驱动轴122，轴122被旋转安装在座114上并驱动滑轮124，例如用一个圆形驱动带126。偏心销钉128装在滑轮124上并伸展到座114中的通道130中。销钉128与搅拌器臂92的第一端132相配合。

搅拌器臂92的第二端134保持住容器98。臂92还包括槽136，槽136绕着装在座114上的固定销钉138做滑动配合。当偏心销钉128旋转时，臂92的第一端132做往复运动（图13）以便使装在第二端134上的容器98产生搅拌振荡。

容器98可以借助一个保持器140或其它装置被装在或固定在臂92上，最好是摩擦性保持机构。保持器140可以借助一些螺钉或螺栓142固定在臂端134上。保持器140可以包括底部容器保持架144，架144可以被类似的一些螺栓或螺钉146来保持。所选的特定尺寸和材料不是关键性问题，并可按照需要去改变之。

在搅拌器90，102中反应的一个全血样品的结果示于图14中。40微升涂覆有磁性微球体的红血球专用抗体与150微升缓冲剂结啮形成反应物14。用在如图7所示样品中的同样的专用抗体被用在这个例子中。样品12是10微升的全血样品，它被加到容器98中的反应物14中。容器98被旋转或振荡5秒钟以产生混合物。然后将磁场加上10秒钟而不操作搅拌器90，以便将粘结有磁性微球体的红血球从所剩样品中分离出来。然后将所剩样品加以分析，并 再次有总数超过99.5%的红血球（A）被分离。随着红血球（A）实际上被全部分离时，则淋巴细胞（B）和粒细胞和单核细胞（C）也被得到以供分析。

根据上述技术进行修改和变化本发明是可能的。也可以用其他类型的抗体，例如特定的中性白细胞（N）专用抗体可被使用，它在美国专利申请168306号中被公开，题目是：专用于中性白细胞的单克隆抗体，它在1986    12月8日申请，美国专利系列号为938864。磁场的施加也可以用电磁装置。搅拌器如果需要可以在施加磁场期间启动。其它的搅拌器结构也可以被使用，例如U型结构48可以是一个与烧杯58，60相似的开口结构。流体的互相加入可能形成一部分预搅拌作用，从而有利于提高反应速度。因此可以理解，在后面所述的权利要求的范围内，本发明可以用与本说明书叙述不同的方式加以使用。

Claims (22)

1、一种使含有细胞的样品加速反应速度的方法，而选定的反应物被引入该样品加以搅拌，以便提供进行定量和/或定性测定所要的悬浮液，上述方法包括制备一定容积的含有细胞的样品，对该样品至少引入一种反应物，以提供适用于进行测定的悬浮液，其特征在于：

·制备约5至1000微升含有大量细胞的样品，

·将至少一种含有周围具有抗体的微球的反应物引入上述样品中的至少部分细胞，从而提供用于进行测定的悬浮液，

·快速搅拌由样品和反应物所形成的悬浮液，以便大大减小足以加速细胞与反应物之间反应的速度的时间周期，而不损害所研究的细胞的性质或测定精度，

·紧接着上述的搅拌过程之后，执行下面的二个步骤中的至少一个：即把部分细胞以样品中分离以及不经过孕育期就测量上述细胞的性质。

2、按照权利要求1所述的方法，其特征在于：样品容积处于大约5到50微升的范围内。

3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述搅拌是在大约2至60秒钟的时间内完成的。

4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述样品至少是一种生物流体，一种细胞悬浮液或形成机体的悬浮液，而上述反应物包括粘结有微球体的抗体。

5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：上述样品是含有红血球和白血球群体的全血，而上述反应物至少是一种适宜的血球减少剂或适宜的红血球分离（lysing）剂。

6、一种使含有细胞的样品中加快反应速度的仪器，选定的反应物被引入这个样品加以搅拌，从而提供一种进行定量和/或定性测定的悬浮液，上述仪器包括一定体积的含有细胞的样品，及用于将至少一种反应物引入样品以提供适于进行测定的悬浮液的装置，其特征在于：

·一份体积约5至1000微升含有大量细胞的样品，

·将至少一种含有周围具有抗体的微球的反应物引入上述样品中的至少部分细胞，从而提供用于进行测定的悬浮液的装置，

·快速搅拌由样品（12）和反应物（14，26，28）所形成的悬浮液的装置（16，46，76，90，102），以便大大减小足以加速细胞与反应物之间反应的速度的时间周期，而不损害所研究的细胞的性质或测定精度，

·紧接着上述的搅拌过程之后，执行下面二个步骤中的至少一个：即把部分细胞从样品中分离以及不经过孕育期就测量上述细胞的性质。

7、根据权利要求6所述的仪器，其特征在于：样品容积处于大约5-50微升之间。

8、根据权利要求6所述的仪器，其特征在于：上述搅拌是在大约2-60秒钟的时间周期内完成的。

9、根据权利要求6所述的仪器，其特征在于：上述样品的至少是一种生物流体，一种细胞悬浮液，或形成机体的悬浮液，而上述反应物包括粘结有微球体的抗体。

10、根据权利要求6所述的仪器，其特征在于：上述样品是含有红血球和白血球群体的全血，而上述反应物至少是一种适宜的血球减少剂或一种适宜的红血球分离剂。

11、一种对定量和/或定性测定中的选定活生物细胞的至少一种确定的生物反应进行增强和加速的方法，其特征在于：

·制备一小份约5至1000微升至少含有许多生物细胞的生物样品，上述的生物细胞含有全血样品或者至少含有全部白血细胞的部分全血样品，

·把至少一种具有周围结合有抗体的微球的反应物引入上述的小体积中的至少一些上述的细胞中，

·快速搅拌上述样品与反应物的混合物，以大大减小足以对至少上述一种确定的生物反应加速的时间周期，而又不明显地损害所研究细胞的生物学性质，

·紧接在上述的搅拌过程之后，执行下面的二个步骤中的至少一个：即把上述的生物细胞从上述样品中分离出来，以及不经过孕育期就测定上述生物细胞的性质。

12、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：上述小容积容纳5-1000微升间的液体。

13、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：上述减小后的时间周期处在2-60秒钟的范围内。

14、根据权利要求11所述的方法，其特征在于：上述生物样品包括全血样品，其中至少包括红血球群体和白血球群体，而上述反应物至少是一种红血球优先分离，或者包括用抗体粘结的微球体。

15、根据权利要求14所述的方法，其特征在于：上述抗体是专用于红血球或中性白血球以及其结合的。

16、根据权利要求15所述的方法，其特征在于：上述微球体是磁性的，而且在快速搅拌后至少能将上述被粘结的中性白细胞或上述粘结的红血球从上述全血样品中磁性分离掉。

17、一种对定量和/或定性测定中的选定活生物细胞的至少一种确定的生物反应进行增强和加速的装置，其特征在于：

·一小份约5至1000微升至少含有许多生物细胞的生物样品，上述的生物细胞含有全血样品或者至少含有全部白血细胞的部分全血样品，

·把至少一种具有周围结合有抗体的微球的反应物引入上述的小体积中的至少一些上述的细胞中的装置，

·快速搅拌上述样品与反应物的混合物的装置（16，46，76，90，102），以大大减小足以对至少上述一种确定的生物反应加速的时间周期，而又不明显地损害所研究细胞的生物学性质，

·紧接在上述的搅拌过程之后，执行下面的二个步骤中的至少一个：即把上述的生物细胞从上述样品中分离出来，以及不经过孕育期就测定上述生物细胞的性质。

18、根据权利要求17所述的仪器，其特征在于：上述小容积容纳5-1000微升的液体。

19、根据权利要求17所述的仪器，其特征在于：上述减小后的时间周期是在2-60秒钟之间。

20、根据权利要求17所述的仪器，其特征在于：上述生物样品包括一种全血样品，该全血样品至少包括红血球群体和白血球群体，而上述反应物至少是一种红血球优先分离，或者包括一种粘结有抗体的微球体。

21、根据权利要求20所述的仪器，其特征在于：上述抗体是专用于红血球或中性白细胞及其结合的。

22、根据权利要求21所述的仪器，其特征在于：上述微球体是磁性的，并包括用来在上述快速搅拌后，将至少一种上述粘结红血球或上述中性白细胞从上述全血样品中磁性分离的装置。

Images