NO176244B - Fremgangsmåte ved fremstilling av et koaguleringsaktivt kompleks av Faktor VIII-fragmenter - Google Patents
Fremgangsmåte ved fremstilling av et koaguleringsaktivt kompleks av Faktor VIII-fragmenter Download PDFInfo
- Publication number
- NO176244B NO176244B NO880776A NO880776A NO176244B NO 176244 B NO176244 B NO 176244B NO 880776 A NO880776 A NO 880776A NO 880776 A NO880776 A NO 880776A NO 176244 B NO176244 B NO 176244B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- fviii
- units
- mixture
- incubation
- molecular weight
- Prior art date
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims description 27
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 title claims description 9
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 title claims description 9
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 title claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 36
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 6
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 5
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 5
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 5
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 claims description 5
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 claims description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 2
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 2
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 2
- WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L manganese(2+);methyl n-[[2-(methoxycarbonylcarbamothioylamino)phenyl]carbamothioyl]carbamate;n-[2-(sulfidocarbothioylamino)ethyl]carbamodithioate Chemical compound [Mn+2].[S-]C(=S)NCCNC([S-])=S.COC(=O)NC(=S)NC1=CC=CC=C1NC(=S)NC(=O)OC WPBNNNQJVZRUHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 claims 1
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 65
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 65
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 37
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 31
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 8
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 8
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 8
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 4
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 101001030665 Dictyostelium discoideum GDP-L-fucose synthase Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000002265 redox agent Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
- C07K14/755—Factors VIII, e.g. factor VIII C (AHF), factor VIII Ag (VWF)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
Fremgangsmåte for fremstilling av et koaguleringsaktivt kompleks av Faktor VIII- fraqmenter
Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av et koagulasjonsaktivt kompleks av et N-terminalt fragment av faktor VIII med en molekylvekt på 92-210 kD og et C-terminalt fragment av faktor VIII med en molekylvekt på 80-70 kD, idet enkelte av de naturlig forekommende aminosyrer i det ene eller begge fragmenter kan være utelatt eller utskiftet med andre aminosyrer. F står i det følgende for faktor, og tilstøtende bokstav (er) angir romertall (i koag^u-leringskaskaden)..
Faktor VIII er et protein som forekommer naturlig i blod.
Det deltar som hjelpefaktor under omdannelsen av FX til aktivert FX (FXa). Nærvær av FVIII øker hastigheten av FXa-dannelsen ca. 200 000 ganger (Dieijen et al., J. Biol. Chem, 156, s. 3433, 1981). Mangel på FVIII (Hemofili A) gir seg utslag ved ukontrollerte blødninger.
FVIII's rolle i koaguleringskaskaden fremgår av følgende sk j erna:
FVIII kan aktiveres av trombin eller FXa og inaktiveres av trombin, FXa eller protein C.
Pasienter med hemofili A.kan behandles med FVIII-prepara-ter, enten forebyggende eller akutt ved blødninger.
FVIII kan utvinnes av blodplasma, hvor ca. 1 ppm av proteinet er FVIII. Ved denne fremgangsmåte kan det kun oppnås begrensede mengder av FVIII, og det er derfor ønskelig å fremstille FVIII biosyntetisk i cellekultur. Dette har lykkes for tre forskergrupper (Wood et al, Nature 312, s. 330, 1984 - Toole et al, Nature 312, s. 342, 1984 - Truett et al,
DNA 4, s. 333, 1985).
I cellekultur kan det fremstilles 2 mg fremmed protein pr. ml, som for FVIII ville svare til 20.000 enheter pr. ml. Dette nivå overstiger i stor grad det som er beskrevet i litteraturen for FVIII. En av årsakene til dette er at FVIII er et meget stort protein med en molekylvekt på ca. 330 KD (Vehar et al, Nature 312, s. 337, 1984).
FVIII renset fra blodplasma eller fra cellekultur omfatter et fragment kalt faktor VIII lett kjede eller FVIII-LC med en molekylvekt på ca. 8 0 KD, og et fragment, kalt faktor VIII tung kjede, eller FVIII-HC med en molekylvekt på 92-210 KD. Fragmentene oppstår ut fra 330 KD-proteinet ved proteolytisk nedbrytning, slik at 80 KD-FVIII-LC er det C-terminale fragment, mens FVIII-HC er det N-terminale fragment, hvis størrelse avhenger av nedbrytningsgraden.
Det er således kjent at det i koaguleringsaktivt FVIII inngår et 80 KD-fragment og et fragment med molekylvekt på 92 KD eller mer (Fulcher og Zimitierman, Symposium on FVIII, Scripps Clinic, 1982).
Det ville være en fordel å fremstille FVIII ut fra mindre fragmenter, hvis disse fragmenter in vitro kunne settes sammen til koaguleringsaktivt FVIII. På grunn av fragmentenes mindre størrelse i forhold til intakt FVIII, ville de lettere kunne fremstilles biosyntetisk i store mengder. Dessuten ville fremstillingen av fragmenter av FVIII være fordelaktig med hensyn til en etterfølgende rensning fra cellekultur, idet produktet skifter ladning og molekylvekt ved kompleks-dannelsen. Da man således både kan rense fragmentene og komplekset, er det mulighet for å oppnå et renere slutt-produkt.
Det har ved forsøk vist seg at man ikke ved enkel sammenblanding av fragmentene er i stand til å oppnå koaguleringsak-tive produkter. Det er heller ikke i litteraturen beskrevet fremgangsmåter eller betingelser ved hvilke fragmenter av FVIII kan omdannes til et koaguleringsaktivt kompleks.
Den foreliggende oppfinnelse er særpreget ved at de to innledningsvis nevnte N-terminale og C-terminale fragmenter omsettes med hverandre i nærvær av ett eller flere toverdige salter såsom f.eks. av mangan, kalsium eller kobolt, en komponent av protrombinkomplekset, såsom f.eks. FIX, FlXa, FX, FXa eller en blanding av to eller flere av disse komponenter, eventuelt en blanding av et toverdig salt og en komponent av protrombin-komplekset, fortrinnsvis FX, en substans med reaktivitet overfor forbindelser som inneholder gruppen -SH og/eller -S-S, såsom f.eks. ditiotreitol, merkaptoetanol eller cystein, eventuelt en blanding av en slik substans og et toverdig salt.
Resultatet er ganske overraskende, idet det i litteraturen er omtalt rensning av FVIII-LC og FVIII-HC, kfr. dansk patentsøknad 5387/85, uten at det er rapportert forsøk på aktivitetsskapende sammenblanding. Dette til tross for at aktivitetsdannelse ved sammenblanding kunne ha stor teoretisk og praktisk betydning.
Burke et al (Abstract 14 s 111. Research in clinic and laboratory 16, 198 6) har vært i stand til å fremstille koaguleringsaktivt FVIII in vivo med celler som var transfektert med DNA både når det gjaldt FVIII-LC og FVIII-HC. Det var imidlertid ikke mulig å få koaguleringsaktivitet ved å blande sammen kultursupernatanter med innhold av henholdsvis FVIII-LC og FVIII-HC, selv om forskjellige betingelser ble forsøkt.
FVIII-LC kan renses fra humant plasma og er uten koaguleringsaktivitet (se WO 86/02838). Likeledes kan FVIII-HC-fragmenter renses fra blodplasma (Truett et al, DNA 4, s. 3 33, 1985). Disse fragmenter er likeledes uten koaguleringsaktivitet .
DEFINISJONER
Med FVIII-LC eller FVIII lett kjede forstås fragment fra det C-terminale område i hel-lengde-FVIII. Fragmentets molekylvekt er typisk ca. 80 KD, men kan være 7 0 KD eller mindre. Fragmentet med molekylvekt 80 KD har immunologisk reaktivitet i den beskrevne analyse med hensyn til FVIII-LC-antigen og ikke i analysen med hensyn til FVIII-HC-antigen.
Med FVIII-HC eller FVIII tung kjede forstås fragment fra det N-terminale område i hel-lengde-FVIII. Fragmentets molekylvekt er typisk 92 KD, men kan være mindre og opp til 210 KD. FVIII-HC renset fra plasma består av en blanding med molekylvekt 92-210 KD. Fragmenter med molekylvekt større enn eller lik 92 KD har immunologisk reaktivitet i den beskrevne analyse med hensyn til FVIII-HC-antigen men ikke i analysen med hensyn til FVIII-LC-antigen.
Med koaguleringsaktivt FVIII forstås protein som er i stand til å forkorte koaguleringstiden for hemofili A-plasma i en koaguleringsanalyse. Koaguleringsaktivt FVIII er dessuten i stand til å fremme dannelsen av FXa i Coatest-analysen (se nedenfor) og derved omdanne det kromogene substrat. Koaguleringsaktivitet angis som FVIII:C.
Med protrombin-kompleks forstås koagulasjonsfaktorer som inneholder T-karboksyglutaminsyre, d.v.s. FlI, FVII, FIX, FX protein C eller aktiverende former av disse koagulasjonsfaktorer (Davie et al. Advances in enzymology 48 s. 277, 1979) .
METODER
Coatest- analyse med hensyn til FVIII;C
Ved denne analyse måles FVIII:C i et system som består av FlXa, FX, Ca<2+> og fosfolipid (PL) (Rosen et al, Thromb Haemostas 54 s. 818, 1985). Det dannes FXa i en mengde som avhenger av FVIII:C-mengden. Analysen utføres som angitt nedenfor:
Coatest-analyse med hensyn til FVIII:C
1. 50 /Lii prøve tilsettes 50 /il aktiveringsreagens (blanding av FIXa/FX og PL). Inkubasjonstid 10 minutter, 22°C. 2. Det tilsettes 25 /il 25 mM CaCl2 og blandingen inkuberes i 20 minutter ved 22°C. 3. Det tilsettes 50 /il kromogent substrat for FXa (S2222). 4. Etter inkubering i 15 minutter tilsettes sitronsyre, og EA05 for prøven avleses.
I Coatest-analysen er det ikke mulig å følge en enzymatisk aktivering av FVIII, idet FVIII under analysen aktiveres fullt ut ved inkubasjon med FIXa/FX, PL og Ca<2+>.
Immunologisk kvantifisering av FVIII- LC
FVIII-LC-antigen (Ag) måles ved spesifikk immunoanalyse
(Nordfang et al, Thromb Haemostas 53, s. 346, 1985). Human-inhibitor-antistoff belegges på mikroplater, prøve tilsettes, og bundet FVIII-LC påvises med peroksydasemerket F(ab')2-fragment av human-inhibitor-IgG. Som standard anvendes normalt humant plasma.
Immunologisk kvantifisering av FVIII- HC
FVIII-HC-antigen (Ag) måles i spesifikk inhibisjons-analyse. Hunde-inhibitor-antistoff belegges på mikroplater med løse brønner. Prøve og <125>I-merket FVIII-HC tilsettes. Mengden av FVIII-HC i prøven bestemmer mengden av bundet 125i-FVIII-HC. Som standard anvendes FVIII-konsentrat (FVIII Nordisk), som er fastsatt til å inneholde 1 FVIII-HC-enhet pr. FVIII:C-enhet.
Mengden av FVIII-LC og FVIII-HC bestemt ved immunoanalyse er forholdsmessig angitt. D.V.S, at forholdet mellom FVIII:C-enheter, FVIII-LCAg-enheter og FVIII-HCAg-enheter for forskjellige typer FVIII ikke er 1:1:1. Det antas imidlertid at enheter for de forskjellige analyser er sammenlignbare, men det kan likevel være en viss forskjell på VIII:C-enheter, FVIII-LCAg-enheter og FVIII-HCAg-enheter for en FVIII-prøve, hvor alt protein er koaguleringsaktivt i Coatest.
Bestemmelse av molekylvekt
Molekylvekten er bestemt ved redusert SDS-PAGE (Laemmli, Nature 227 s. 680, 1970).
Fremstilling av FVIII
FVIII-prøve til kontrollforsøk ble fremstilt ut fra FVIII-konsentrat (se WO84/03628) ved affinitetskromatografi på Sepharose med anti-von Willebrand-faktor fra geit (Truett et al, DNA 4 s. 333, 1985).
Fremstilling av FVIII- LC ( prøve A)
FVIII-LC kan renses fra blodplasma ved flere fremgangsmåter såsom beskrevet i WO 86/02838. Det er anvendt høy-konsentrert FVIII-LC, isolert ved affinitetskromatografi på monoklonalt 47-IgG av Nordiocto, fremstilt som angitt av 0. Nordfang et al : Thrombosis and Haemostasis, Vol. 54, s. 586-590, 1985. Nordiocto, oppløst i 200 ml buffer A (0,02 M imidazol, 0,15 M NaCl, 10 mM EDTA, pH 7,4) til en konsen-trasjon av VIII-LCAg på 110 enheter pr. ml, ble inkubert over natten med 7 ml 47 IgG-Sepha-rose (koplet med 9 mg IgG/ml). Inkubasjonsblandingen ble helt på søyle og eluatet oppsamlet. Gelen ble vasket med 40 ml buffer A og 40 ml buffer A med i alt 0,65 M NaCl. FVIII-LC ble eluert med 40 ml 20 mM imidazol/0,65 M NaCl/10 mM EDTA/50% ety-lenglykol/pH 7,4. En toppfraksjon på 4 ml ble dialysert til 50 mM imidazol/0,15 M NaCl/10% glycerol/0,02% NaN3/pH .7,4. Den dialyserte prøves innhold av FVIII-komponenter fremgår av tabell 1.
Fremstilling av FVIII- HC ( prøve B)
FVIII-HC er fremstilt ut fra FVIII-prøve ved affinitetskromatografi på monoklonal-56-IgG-Sepharose, fremstilt som angitt av O. Nordfang et al : Thrombosis and Haemostasis, Vol. 54, s. 586-590, 1985, 56-IgG-Sepharose binder FVIII-LC/FVIII-HC-komplekset via FVIII-LC. 25 ml FVIII-prøve med et innhold på 4 05 FVIII-HCAg-enheter pr. ml ble inkubert over natten med 1,5 ml 56-IgG-Sepharose (koplet med 4 mg 56-IgG/ml). Inkubasjonsblandingen ble helt på søyle og eluatet oppsamlet. Gelen ble vasket med 5 ml buffer B (20 mM imidazol/0,15 M NaCl/10% glycerol/0,1 M lysin/pH 7,4) inneholdende 0,35 M CaCl2. Gelen ble deretter vasket med 15 ml buffer B med et totalinnhold av NaCl på 0,65 M, etterfulgt av 5 ml buffer B med 10 mM EDTA og 0,02% NaN3 (EDTA-buffer). Gelen ble drenert og inkubert 1 time ved romtemperatur med EDTA-buffer. Etter inkuberingen ble FVIII-HC eluert med 5 ml EDTA-buffer. En toppfraksjon på 2 ml ble dialysert til 50 mM imidazol/0,15 M NaCl/10% glycerol/0, 02% NaN3/pH 7,4. Den dialyserte prøves innhold av FVIII-komponenter fremgår av tabell 1.
Prøve A og B er analysert med SDS-PAGE, kfr. tegningen, hvor Spor 1 svarer til prøve A (FVIII-LC) 4 FVIII-LCAg-enheter, Spor 2 er molekylvektsmarkører og
Spor 3 svarer til prøve B (FVIII-HC) 8 FVIII-HCAg-enheter.
Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen illustreres i det føl-gende ved hjelp av noen utførelseseksempler.
EKSEMPEL 1
Prøve A og B ble hver fortynnet 10 ganger i buffer C (50 mM imidazol, 0,15 M NaCl, 0,1% BSA, pH 7,4). 20 /il A (fortynnet 1:10) ble blandet med 20 Ml B 1/10, 3 /il 0,15 M MnCl2 og 40 /xl buffer C. Etter 48 timers inkubering ved 22°C inneholdt inkubasjonsblandingen 1200 m-enheter VIII:C/ml, målt ved hjelp av Coatest.
For sammenlikning er følgende forsøk utført
Forsøk A:
Forsøket ble gjentatt som beskrevet i eksemplet med den forandring at det ble tilsatt 3 /xl buffer C i stedet for 3 /xl 0,15 M MnCl2. Etter 48 timers inkubering ved 22°C inneholdt denne inkubasjonsblanding mindre enn 5 m-enheter VIII:C/ml målt ved Coatest.
Forsøk B:
Prøve A ble fortynnet 4 0 ganger i buffer C. 80 /il A (fortynnet 1:40) ble blandet med 3 /il 0,15 M MnCl2. Etter 48 timers inkubering inneholdt inkubasjonsblandingen mindre enn 5 enheter VIII:C pr. ml. Tilsvarende inneholdt inkubasjonsblanding med prøve B mindre enn 5 m-enheter VIII:C pr. ml. Forsøk C: 80 /il FVIII-prøve fortynnet 1000 ganger i buffer C ble blandet med 3 /il 0,15 M MnCl2. Etter 48 timers inkubering ble det målt 170 m-enheter VIII:C pr. ml. 80 /il FVIII-prøve fortynnet 1000 ganger i buffer C ble blandet med 3 /il buffer C. Etter 4 8 timers inkubering ble det målt 14 0 m-enheter FVIII:C pr. ml.
EKSEMPEL 2
Prøve A og B ble hver fortynnet 10 ganger i buffer C. 2 0 /il A 1/10 ble blandet med 20 /ti B (fortynnet 1:10), 3 /il 2,2 M CaCl2 og 40 /il buffer C. Etter 12 døgns inkubering ved 22°C inneholdt inkubasjonsblandingen 1300 m-enheter VIII:C pr. ml. For sammenlikning er utført følgende forsøk;
Forsøket ble gjentatt som beskrevet ovenfor, men med den forandring at det ble tilsatt 3 /xl buffer C i stedet for 3 /il 2,2 M CaCl2. Etter 12 døgns inkubering ved 22°C inneholdt inkubasjonsblandingen mindre enn 5 m-enheter VIII:C pr. ml.
EKSEMPEL 3
Prøve A og B ble hver fortynnet 100 ganger i buffer C. 100 /xl A og 100 /xl B ble blandet. 50 /xl av blandingen ble analysert i Coatest som angitt ovenfor. Det ble målt 1,5 enheter pr. ml i blandingen. 5 0 /xl av blandingen ble dessuten analysert i modifisert Coatest med 1 times for-inkubering med FIXa/FX før tilsetting av fosfolipid (PL). Herved steg Coatest-aktiviteten til 3,0 m-enheter pr. ml.
For sammenlikning er utført følgende forsøk:
FVIII-prøve ble fortynnet 3 0.000 ganger i buffer C. 50 /xl fortynnet prøve ble analysert i Coatest som angitt ovenfor. Det ble målt 3,4 m-enheter pr. ml. 50 /xl av den fortynnede VIII:C-prøve ble dessuten analysert i modifisert Coatest med 1 times for-inkubering med FIXa/FX før tilsetting av PL. Herved ble det målt 3,8 m-enheter pr. ml for den fortynnede FVIII-prøve .
EKSEMPEL 4
Ved utførelse av forsøk som angitt i. eksempel 1 ble det etter 2 4 timers inkubering målt 1000 m-enheter VIII:C pr. ml. Ved tilsetning av 40 /il FIXa/FX i stedet for 40 /xl buffer C ble det målt 1600 m-enheter pr. ml etter 24 timers inkubering. For sammenlikning er utført følgende forsøk: Forsøket ble utført som beskrevet i eksempel 1, første sammenlikningsforsøk. Etter 24 timers inkubering ble det målt mindre enn 5 m-enheter pr. ml i inkubasjonsblandingen.
Enda et sammenlikningsforsøk ble utført slik:
40 /xl FVIII-prøve fortynnet 500 ganger i buffer C ble blandet med .40 /xl FIXa/FX og 3 /xl 0,15 M Mn2+. Etter 24 timers inkubering ble det målt 120 m-enheter pr. ml. Ved å erstatte 40 /xl FIXa/FX med 40 /xl buffer C ble det målt 170 m-enheter pr. ml. Ved dessuten å erstatte de 3 /xl 0,15 M Mn<2+> med 3 /xl
buffer C ble det målt 140 m-enheter pr. ml.
EKSEMPEL 5
Prøve A og B ble hver for seg fortynnet 2 0 ganger i buffer C. 20 /il A 1/20 ble blandet med 20 /il B 1/20, 40 /il FIXa/FX og 3 /il 0,15 M CaCl2. Etter 4 timers inkubering ved 22°C inneholdt blandingen 199 m-enheter FVIII:C pr. ml. Hvis FIXa/FX i blandingen ble erstattet med 40 /il buffer C, ble det målt 43 m-enheter FVIII:C pr. ml etter 4 timers inkubering.
EKSEMPEL 6
Prøver av FVIII-LC og FVIII-HC inneholdende henholdsvis 800 enheter FVIII-LC:Ag pr. ml og 850 enheter FVIII-HC:Ag pr. ml ble hver fortynnet 3 ganger. 20 /il FVIII-LC 1/3 ble blandet med 2 0 /il FVIII-HC 1/3 og 10 /il Me<2+>. I blanding A var Me<2+> 2 5 mM Mn<2+>. I blanding B var Me<2+> 250 mM Ca<2+> og i blanding C var Me<2+> 25 mM Mn<2+> og 250 nM Ca<2+>. Etter 24 timers inkubering inneholdt blandingen A 10,3 enheter FVIII:C pr. ml, blanding B inneholdt 4,0 enheter og blanding C inneholdt 12,9 enheter FVIII:C pr. ml. Etter 144 timers inkubering inneholdt bland-ingene A, B og C henholdsvis 6,6 enheter, 6,5 enheter og 11,9 enheter FVIII:C pr. ml.
EKSEMPEL 7
COS-celler ble transfisert med plasmid pSVF8-80, som uttrykker 80 KD-kjeder, kfr. dansk patentsøknad 04 28/87. Supernatant fra kulturen inneholdende 870 m-enheter FVIII-LC: Ag pr. ml ble tilført plasma-renset FVIII-HC til en sluttkonsentrasjon på 20 FVIII-HC:Ag-enheter pr. ml og Mn<2+> til en sluttkonsentrasjon på 5 mM. Ettér 24 timers inkubering ved 22°C inneholdt blandingen 137 mU FVIII:C pr. ml. Når plasma-renset FVIII-LC ved en konsentrasjpn på 1000 m-enheter FVIII-LC: Ag pr. ml på tilsvarende måte ble tilført FVIII-HC og Mn<2+>, inneholdt den inkuberte blanding 3 3 m-enheter FVIII:C pr. ml etter 2 4 timers inkubering. Når det til kultursupernatanten kun ble tilsatt Mn<2+> og ikke FVIII-HC, inneholdt blandingen etter inkubering i 24 timer mindre enn 2,5 m-enheter FVIII:C pr. ml.
EKSEMPEL 8
25 /il FVIII-LC ble i buffer C blandet med 25 /il FVIII-HC, 7 iil MnCl2 og 10 fil redoksmiddel, slik at det ble oppnådd sluttkonsentrasjsoner av de enkelte komponenter som angitt i tabell 2. FVIII:C ble målt etter 5 timers inkubering ved 2 0°C.
Ved de angitte konsentrasjoner av DTT (ditiotreitol), ME (merkaptoetanol) og Cys (Cystein) er det i vandig buffer en likevekt mellom oksyderende og reduserende form.
EKSEMPEL 9
FVIII-HC ble fremstilt som beskrevet ovenfor og med den modifikasjon at EDTA-elueringsbuffer samt dialysebuffer ble tilsatt 50 /il merkaptoetanol. Etter fortynning ble rekombinasjon med FVIII-HC-prøver utført ved 20 timers inkubering i buffer C ved romtemperatur med tilsetning av merkaptoetanol til 35 MM, MnCl2 til 5 mM og FVIII-LC til 22 FVIII-LC:Ag-enheter pr. ml.
Tabell 3 viser rekombinasjon med de to typer FVIII-HC-prøver .
EKSEMPEL 10
Inkubasjonsblanding med følgende sammensetning ble fremstilt i buffer C ut fra separerte FVIII-fragmenter : 60 enh./ml FVIII-LC, 60 enh./ml FVIII-HC, 50 mM CaCl2, 2 enh./ml
FX.
Etter 2 0 timers inkubering ved romtemperatur ble det målt 6,9 FVIII:C-enheter pr. ml. I tilsvarende inkubasjonsblanding uten FX ble det etter 20 timers inkubering ved 20°C målt 0,59 FVIII:C-enheter pr. ml.
Claims (3)
1. Fremgangsmåte ved fremstilling av et koagulasjonsaktivt kompleks av et N-terminalt fragment av faktor VIII med en molekylvekt på 92-210 kD og et C-terminalt fragment av faktor VIII med en molekylvekt på 80-70 kD, idet enkelte av de naturlig forekommende aminosyrer i det ene eller begge fragmenter kan være utelatt eller utskiftet med andre aminosyrer ,
karakterisert ved at de to fragmenter omsettes med hverandre i nærvær av ett eller flere toverdige salter såsom f.eks. av mangan, kalsium eller kobolt, en komponent av protrombinkomplekset, såsom f.eks. FIX, FlXa, FX, FXa eller en blanding av to eller flere av disse komponenter, eventuelt en blanding av et toverdig salt og en komponent av protrombin-komplekset, fortrinnsvis FX, en substans med reaktivitet overfor forbindelser som inneholder gruppen -SH og/eller -S-S, såsom f.eks. ditiotreitol, merkaptoetanol eller cystein, eventuelt en blanding av en slik substans og et toverdig salt.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,
karakterisert ved at det N-terminale fragment er en tung kjede med en molekylvekt på ca. 92 kD og at det C-terminale fragment er en lett kjede med en molekylvekt på ca. 80 kD.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1-2, karakterisert ved at derivatiseringen består av en utskiftning av én eller flere cys-aminosyrer med en annen aminosyre, fortrinnsvis serin.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK295786A DK295786A (da) | 1986-06-24 | 1986-06-24 | Fremgangsmaade til fremstilling af et koagulationsaktivt kompleks af faktor viii fragmenter |
| PCT/DK1987/000080 WO1988000210A1 (en) | 1986-06-24 | 1987-06-24 | A process for producing a coagulation active complex of factor viii fragments |
| CA000559223A CA1305413C (en) | 1986-06-24 | 1988-02-18 | Process for producing a coagulation active complex of factor viii fragments |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO880776D0 NO880776D0 (no) | 1988-02-23 |
| NO880776L NO880776L (no) | 1988-04-22 |
| NO176244B true NO176244B (no) | 1994-11-21 |
| NO176244C NO176244C (no) | 1995-03-01 |
Family
ID=25671724
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO880776A NO176244C (no) | 1986-06-24 | 1988-02-23 | Fremgangsmåte ved fremstilling av et koaguleringsaktivt kompleks av Faktor VIII-fragmenter |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0272304B1 (no) |
| JP (1) | JP2593500B2 (no) |
| AU (1) | AU607927B2 (no) |
| CA (1) | CA1305413C (no) |
| DE (1) | DE3788944T2 (no) |
| NO (1) | NO176244C (no) |
| WO (1) | WO1988000210A1 (no) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR910006424B1 (ko) * | 1985-08-21 | 1991-08-24 | 인코텍스 비.브이 | 편성브리프(brief) 제조방법 |
| US5198349A (en) * | 1986-01-03 | 1993-03-30 | Genetics Institute, Inc. | Method for producing factor VIII:C and analogs |
| ATE89169T1 (de) * | 1989-07-15 | 1993-05-15 | Boehringer Ingelheim Int | Antikoagulanz enthaltendes mittel. |
| ES2078978T3 (es) * | 1989-08-17 | 1996-01-01 | Baxter Diagnostics Inc | Procedimiento de determinacion cromogenica de niveles de factores de coagulacion sanguinea en plasma y otros fluidos. |
| WO1995018827A1 (en) * | 1994-01-07 | 1995-07-13 | Novo Nordisk A/S | Factor viii derivatives |
| EP1194161B1 (en) | 1999-07-13 | 2005-11-23 | Biovitrum Ab | Stable factor viii compositions |
| ATE428439T1 (de) | 2001-12-21 | 2009-05-15 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Flüssige zusammensetzung aus faktor vii polypeptiden |
| PL207018B1 (pl) | 2002-06-21 | 2010-10-29 | Novo Nordisk Helth Care Ag | Kompozycja farmaceutyczna, sposób przygotowania stabilnego polipeptydu czynnika VII i zastosowanie polipeptydu czynnika VII |
| US7897734B2 (en) | 2003-03-26 | 2011-03-01 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Method for the production of proteins |
| CA2465004A1 (en) * | 2003-05-19 | 2004-11-19 | National Institute For Biological Standards And Control | Composition |
| MXPA05012476A (es) | 2003-05-23 | 2006-02-22 | Novo Nordisk Healthcare Ag | Estabilizacion de proteina en solucion. |
| ES2382157T3 (es) | 2003-06-25 | 2012-06-05 | Novo Nordisk Health Care Ag | Composición líquida de polipépttidos del factor VII |
| KR101293503B1 (ko) | 2003-08-14 | 2013-08-07 | 노보 노르디스크 헬스 케어 악티엔게젤샤프트 | 인자 ｖｉｉ 폴리펩티드의 액상 수성 약학적 조성물 |
| CA2549593C (en) | 2003-12-19 | 2014-02-11 | Novo Nordisk Health Care Ag | Stabilised compositions of factor vii polypeptides |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4657894A (en) * | 1983-03-31 | 1987-04-14 | Scripps Clinic & Research Foundation | New factor VIII coagulant polypeptides |
| IE80638B1 (en) * | 1983-03-31 | 1998-10-21 | Scripps Research Inst | Monoclonal antibodies to new factor VIII coagulant polypeptides |
| DE3588242T2 (de) * | 1984-01-12 | 2004-03-11 | Chiron Corp. (N.D.Ges.D. Staates Delaware), Emeryville | Für Faktor-VIIIc kodierende DNA-Sequenzen und verwandte DNA-Konstruktionen |
| SE8501050D0 (sv) * | 1985-03-05 | 1985-03-05 | Kabivitrum Ab | Biologically active fragments of human antihemophilic factor and method for preparation thereof |
-
1987
- 1987-06-24 JP JP62504030A patent/JP2593500B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-24 EP EP87904383A patent/EP0272304B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-24 DE DE3788944T patent/DE3788944T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-24 WO PCT/DK1987/000080 patent/WO1988000210A1/en active IP Right Grant
- 1987-06-24 AU AU76448/87A patent/AU607927B2/en not_active Ceased
-
1988
- 1988-02-18 CA CA000559223A patent/CA1305413C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-02-23 NO NO880776A patent/NO176244C/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1988000210A1 (en) | 1988-01-14 |
| DE3788944T2 (de) | 1994-05-26 |
| JPH01500514A (ja) | 1989-02-23 |
| EP0272304A1 (en) | 1988-06-29 |
| NO880776L (no) | 1988-04-22 |
| CA1305413C (en) | 1992-07-21 |
| AU607927B2 (en) | 1991-03-21 |
| AU7644887A (en) | 1988-01-29 |
| JP2593500B2 (ja) | 1997-03-26 |
| NO176244C (no) | 1995-03-01 |
| DE3788944D1 (de) | 1994-03-10 |
| NO880776D0 (no) | 1988-02-23 |
| EP0272304B1 (en) | 1994-01-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5543502A (en) | Process for producing a coagulation active complex of factor VIII fragments | |
| NO176244B (no) | Fremgangsmåte ved fremstilling av et koaguleringsaktivt kompleks av Faktor VIII-fragmenter | |
| Tanaka et al. | Poly (l‐proline)‐binding proteins from chick embryos are a profilin and a profilactin | |
| US7498146B2 (en) | Stable factor VIII/von willebrand factor complex | |
| US4657894A (en) | New factor VIII coagulant polypeptides | |
| EP0197901A1 (en) | Biologically active fragments of the human antihemophilic factor and method for their preparation and pharmaceutical preparations | |
| NO167533B (no) | Fremgangsmaate ved fremstilling av faktor viii koagulerende polypeptider og monoklonale antistoffer overfor disse. | |
| Holmberg et al. | Purification of F. VIII: C by antigen-antibody chromatography | |
| US4886876A (en) | Factor VIII coagulant polypeptides | |
| Nordenman et al. | Purification of thrombin by affinity chromatography on immobilized heparin | |
| US5071954A (en) | Synthetic prothrombin peptides and antibodies directed against them | |
| CA2253246A1 (en) | Purified multimerase | |
| Hessel et al. | Fibrinogen Aarhus—a new case of dysfibrinogenemia | |
| US5214033A (en) | Factor VIII coagulant polypeptides | |
| FI100107B (fi) | Menetelmä hyytymistä tehostavan tekijä VIII -fragmenttien yhdistelmän valmistamiseksi | |
| Seegers et al. | Preparation of bovine prethrombin 2: Use of acutin and activation with prothrombinase or ecarin | |
| US5124439A (en) | Antibodies against fibrin; immunogenic peptides suitable for preparing the antibodies, method for determining fibrin and pharmaceutical preparation based on the antibodies | |
| Katayama et al. | Immunoenzymometric analysis for plasma von Willebrand factor degradation in diabetes mellitus using monoclonal antibodies recognizing protease-sensitive sites | |
| JP2593500C (no) | ||
| US5362854A (en) | Factor VIII coagulant polypeptides: method of making | |
| Legaz et al. | [9] Bovine factor VIII (antihemophilic factor) | |
| Muszbek et al. | Cleavage of thrombosthenin A by thrombin. Evidence for the existence of two types of bovine platelet actin | |
| Peake et al. | Peptide inhibitors of C3 breakdown | |
| Scheefers-Borchel et al. | Discrimination between fibrin and fibrinogen by a monoclonal antibody against a synthetic hexapeptide representing the amino-terminus of the alpha-chain of fibrin | |
| Koppert et al. | A MONOCLONAL ANTIBODY, SPECIFIC FOR HUMAN FIBRINOGEN AND FIBRINO-PEPTIDE A-CONTAINING FRAGMENTS. ITS APPLICATION IN AN ENZYME-IMMUNOASSAY FOR FIBRINOGEN DEGRADATION PRODUCTS, SUITABLE FOR USE IN PLASMA. |