NO175846B - - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å oppnå et immunogen som omfatter ikke-infeksiøse retrovirale partikler uten ytre kappe-proteiner. Immunogenet kan anvendes for forebyggelse og behandling av retroviral sykdom og mer spesifikt inngå i et ytre kappefritt viralt preparat til anvendelse ved vaksinering og immunoterapi mot humant immunsvikt-virus.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen er karakterisert ved at det dyrkes celler som er infisert med retrovirus, cellekulturen sentrifugeres og supernatanten oppsamles, /3-propiolakton settes til supernatanten, supernatanten fryses og utsettes deretter for 7-bestråling, supernatanten tines, hvoretter retroviruspartiklene isoleres fra kulturene ved ultrasentrifugering.

Ervervet immunosviktsyndrom, også kjent som AIDS, er blitt beskrevet som en moderne pest. I de syv år siden dens første beskrivelse i 1981 har den krevet nesten 60.000 ofre, og vært ansvarlig for 32.000 dødsfall bare USA. Imidlertid har man ennå ikke sett den virkelige innvirkning av sykdommmen. Viruset kan forbli latent i infiserte individer i fem år eller mer før symptomene viser seg. Mange amerikanere kan uten å vite det være infisert og i stand til å infisere andre som kommmer i kontakt med deres kroppsvæsker. Hvis den ikke kan holdes i sjakk, vil de personlige, sosiale og økonomiske følger av AIDS være enorme.

Agenset som forårsaker AIDS, er retroviruset human-immun-sviktvirus (HIV). Retroviruser adskilles ved det faktum at deres genetiske materiale, som er RNA, koder for informasjon for viral replikasjon. Ved infeksjon av en vertcelle virker det som templat for transkripsjon til DNA, katalysert ved et enzym kalt revers transkriptase. DNA som er produsert på denne måte, går inn i cellenukleus hvor det integreres i verts-DNA som et provirus.

Når det er aktivert på riktig måte, blir retroviralderivert DNA transkribert og translatert for å produsere RNA som inneholder virioner som så frigjøres fra cellen ved en knoppskytingsprosess.

Visse viruser, inkludert retroviruser, kan forbli i en latent tilstand i måneder eller år før de aktiveres og det produseres virioner. Selv om vedkommende er symptomfri, kan en vert ikke desto mindre huse viruset i en proviral form, og således være potensielt under risiko for sykdom og for å infisere andre. Når et individ blir infisert med HIV, vil viruset fortrinnsvis feste seg til og gå inn i en spesiell klasse av celler kalt T4-lymfocytter, karakterisert ved tilstedeværelse av en celleoverflatemarkør betegnet CD4. Disse hvite blodceller spiller en udelt rolle i immunsystemet, idet de virker som vesentlige komponenter i både denne humorale og cellulære immunrespons. Mange av de skadelige virkninger av HIV kan tilskrives den funksjonelle undertrykkelse eller ødeleggelse av T4-lymfocytter.

Det intakte HIV-virion er grovt sfærisk og er omtrent 110 nanometer i diameter. Virionet har en ytre membran dekket med knopper eller pigger laget av glykoprotein, gpl60/120. I tillegg eksisterer det et transmembranprotein betegnet gp41. Inne i virionet er det strukturelle proteiner: et ytre skall sammensatt av fosfoprotein pl7 og et indre nukleoid eller en sentral kjerne laget av fosfoproteinet p24. Det virale RNA er til stede inne i kjernen sammen med to kopier av enzymet revers transkriptase, p66/51, som er nødvendig for syntese av viral DNA fra RNA~templat. En skjematisk modell av HIV er presentert i figur 1.

Som vist i figur 2 koder HIV RNA-genomet for tre hoved-strukturene gener: <g>a<g>, pol og env, som er flankert i hver ende av lange terminalgjentatte (LTR) sekvenser, gag-genet koder for de gruppe-spesifikke kjerneproteiner, p55, p39, p24, pl7 og pl5. pol-genene koder for revers transkriptase p66/p51 og protease p31. env-genene koder for det ytre kappe-glykoprotein gpl20 og dets forløper gpl60 og transmembran-glykoprotein gp41. Noen av genene har tilbøyelighet til å være høyst variable, spesielt env-genene. I tillegg er det fem andre gener, som ikke de andre retroviruser har, som enten er involvert i transkripsjons- eller translasjons-regulering eller koder for andre strukturelle proteiner. Hele HIV-genomet er nå blitt sekvensdannet. Se Råtner et al. Nature 313:277

(1985) som er inkorporert her ved referanse.

HIV fester seg til vertscellene ved vekselvirkning mellom kappeglykoproteinene med en celleoverflatereseptor. Det viser seg at når HIV kommer i kontakt med en T4-celle, reagerer gpl20 med CD4-reseptoren. Viruskappen blir så sammensmeltet med celle-membranen, og den indre kjerne av viruset går inn i den infiserte celle, hvor transkripsjonen av RNA inn i et DNA-provirus blir katalysert ved revers transkriptase. Proviruset kan forbli i cellene i latent form i noen måneder eller år, og i løpet av denne tiden er det infiserte individ symptomfritt. Imidlertid, hvis viruset senere aktiveres og forårsaker virusreplikasjon og immunosupresjon, vil individet være mottakelig for opportunistiske infeksjoner, inkludert cancer, forbundet med AIDS. Andre human-retroviruser har ytre kappeproteiner.

Ennå kjenner man ikke noen vaksine eller behandling som er effektiv mot AIDS-syndromet. Forsøk på å utvikle vaksiner har så

langt mislykkes. Visse antistoffer som er reaktive med HIV, særlig anti-gpl60/l20 og virusnøytraliserende antistoffer er til stede i høye nivåer gjennom både de asymptomatiske og symptomatiske faser av HIV-infeksjonen, hvilket antyder at snarere enn å spille en ,beskyttende rolle kan slike antistoffer faktisk fremme tilhefting og gjennomtrengning av viruset inn i vertscellen.

Det eksisterer således et behov for effektive midler som kan anvendes til forebyggelse og terapi av retrovirale infeksjoner> spesielt slike som kan tilskrives HIV. Den foreliggende oppfinnelse tilfredsstiller disse behov og gir også relaterte fordeler.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen oppnås immunogen som omfatter ikke-infeksiøse retrovirale partikler fri

for ytre kappeproteiner. Immunogenet kan anvendes til immunisering av et individ som er infisert med et retrovirus inkludert HIV, for å indusere immuno-beskyttende faktorer beskyttende mot progresjon av infeksjonen. Videre er immunogenet anvendbart til vaksinering

av et individ som ikke på forhånd er infisert med HIV, for å forhindre påfølgende infeksjon. Immunogenet kan også anvendes til å frembringe anti-stoffer til passiv immunoterapi, alene eller sammen med aktiv immunoterapi, i individer infisert med et retrovirus, inkludert HIV.

Figur 1 er et skjematisk diagram over HIV som viser opp-setning av de forskjellige genprodukter. Figur 2 er et diagram over genene i HIV og genproduktene som kodes for i dette. Figur 3 gir en skjematisk representasjon av nivået av visse antistoffer og antigener til stede i progresjonen fra en symptomfri tilstand til ARC og AIDS i HIV seropositive individer for HIV-

infeksjon til AIDS.

Figur 4 viser Western Blots av immunogenet fremstilt som i eksempel I, som viser at det er fritt for ytre kappeproteiner når de er kartlagt med homologe og heterologe sera som inneholder høye titere av antistoff mot de ytre kappeproteiner. A: Kommersielle HIV Western Blot-strimler kartlagt med heterologe sjimpanse-sera; B: Western Blot-strimmel med immunogen, kartlagt med heterologe sjimpanse-sera; C: kommersielle HIV Western Blot-strimler kartlagt med homologe human-sera; D: Western Blot-strimler med immunogen, kartlagt med homologe human-sera.

Ved hjelp av oppfinnelsen oppnås et effektivt middel til forebyggelse av HIV-infeksjon og påfølgende HIV-forårsaket AIDS-,relatert kompleks (ARC) og AIDS og til post-eksponeringsbehandling for å stoppe progresjon av retrovirale infeksjoner som inkluderer HIV. Individer som er blitt utsatt for HIV-virus, uttrykker i sitt serum visse antistoffer som er spesifikke for HIV. Slike individer betegnes "seropositive" for HIV, i kontrast til individer som er "seronegative". Tilstedeværelse av HIV-spesifikke antistoffer kan bestemmes ved kommersielt tilgjengelige målingssystemer. Nivået av disse antistoffer er indikativt for progresjonen av AIDS-syndromet.

Som vist skjematisk i figur 3 vil høye nivåer av anti-gpl60/120 (ytre kappe)-antistoff som er til stede i den symptomfrie fase av HIV-infeksjonen, også vedvare i den symptomatiske fase. Nivået av anti-p2 4-antistoff i den symptomfrie fase er høyt, men viser seg å synke i den symptomfrie fase. Imidlertid inneholder HIV-seropos.itive sera et antistoff som inhiberer funksjonen til revers transkriptase (anti-RT antistoff eller RTI). I individer hvor RTI er til stede i høye nivåer, er forsøk på virus-isolering sjeldnere positive enn der hvor det er fraværende. Det viser seg derfor at nedgangen i cellulære og humorale immuno-beskyttende faktorer slik som TA-celler og anti-GAG-antistoffer, inkludert anti-p24, og anti-POL antistoffer, inkludert RTI, er forbundet med progresjon av HIV-infeksjon til AIDS.

Frembringelse av immunobeskyttende faktorer kan induseres ved maksimering av et individ med et effektivt immunogen. Tidligere er det blitt gjort forsøk på å utvikle en vaksine basert på visse virale proteiner, for eksempel kappeproteinene. Foreliggende oppfinnelse frembringer et immunogen som inneholder HIV-gen-produkter, som ekskluderer de ytre kappeproteiner som er anvend-bare til å stimulere produksjon av immunobeskyttende faktorer som er effektive til å forebygge infeksjon i ikke-infiserte individer og til å forsinke eller forhindre progresjon av HIV-infeksjon til AIDS i infiserte individer. Immunogenet omfatter intakte viruspartikler hvorfra den ytre kappe er blitt fjernet, eller omfatter et eller flere HIV-gen-produkter som er forskjellige fra gpl20 eller gpl60.

A. Definisjoner

Som anvendt her refererer begrepet "retrovirus" til et virus som som genetisk materiale har ribonukleinsyre (RNA) som transkri-beres til DNA som blir innskutt i vertsgenomet. Eksempler på retroviruser inkluderer HTLV-I, HTLV-II STLV-I, og lentivirus-familien som inkluderer HIV, visnavirus, ekvint infeksiøst anemi-virus, felint immunsvikt virus og bovint immunosvikt-virus. Disse er beskrevet i Fauci, Science 239:617 (1988) og referanser inkludert der, hvorav hver er inkorporert her ved referanse.

Som anvendt her inkluderer begrepet "HIV" typer 1 og 2 og er synonymt med HTLV-III og LAV-1 og LAV-2. HIV refererer til viruset generisk og inkluderer alle former, subtyper og variasjoner. Forskjellige cellelinjer som er varig infisert med HIV-virus, er blitt utviklet og deponert ved ATCC inkludert dem som har adgangs-nummer CCL 214, TIB 161, CRL 1552 og CRL 8543, hvorav alle er beskrevet i US-patent nr. 4.725.669 og Gallo, Scientific American 256:46 (1987) hvorav hver er inkorporert her ved referanse.

Som anvendt her refererer begrepet "ytre kappe-protein" til den del av membranglykoproteinet i et retrovirus som stikker frem ut over membranen, i motsetning til transmembranprotein gp41. Det ytre kappeprotein er i HIV synonymt med gpl2 0 og dets forløper gpl60.

Som anvendt her refererer begrepet "ytre kappefritt" til et preparat av retroviruspartikler eller retrovirus-genprodukter som mangler de ytre kappeproteiner.

Som anvendt her refererer begrepet "gpl20" eller "gpl60/120"

til glykoproteiner som har enten den antigene spesifisitet eller den biologiske funksjon hos det ytre kappeprotein; gpl60 menes å være forløperen til gpl20.

Som anvendt her refererer "AIDS" til ervervet immunsvikt-syndrom som beskrevet av Adler, Brit. Med. J. 294: 1145 (1987). Det er karakterisert ved tumorer og en rekke opportunistiske infeksjoner. "ARC" refererer til AIDS-relatert kompleks som beskrevet av Adler (se ovenfor). Den symptomatiske fase av HIV-inf eks joner refererer til angrep av symptomer som er karakteris-tiske for ARC eller AIDS. "AIDS-syndromet11 inkluderer både AIDS og ARC.

Som anvendt her refererer begrepet "genprodukt" til et polypeptid eller protein som blir kodet for av et gen. Begrepet er ment å inkludere proteinderivater slik som glykoproteiner. Det skal forstås at begrensede modifikasjoner kan gjøres i aminosyre-sekvensen i genproduktet uten å ødelegge den biologiske funksjon eller immunogenitet av genproduktet og at bare en del av den primære sekvens kan kreves for immunogenitet.

Som anvendt her refererer begrepet HIV-infisert eller HIV-ikke-infisert til mennesker i hvilke HIV-virus eller provirus henholdsvis er til stede eller ikke til stede. Retrovirus infisert eller retrovirus ikke-infisert refererer til individer i hvilke et retrovirus eller provirus henholdsvis er til stede eller ikke til stede. For tiden er serologiske tester for å påvise tilstedeværelse av antistoffer mot viruset den mest anvendte fremgangsmåte for å påvise infeksjon. Slike fremgangsmåter kan imidlertid resultere i både falske negativer, som der hvor et individ har pådratt seg viruset, men ennå ikke frembragt en immunrespons, og ikke falske positiver, som hvor et foster kan motta antistoffene, men ikke viruset fra moren. Andre fremgangsmåter for å bestemme tilstedeværelse av viruset er eller kan bli tilgjengelige. Der hvor serologiske tester gir en indikasjon på infeksjon, kan det være nødvendig å betrakte alle dem som gir seropositive tester som faktisk å være infisert. Videre kan noen av de individer som er funnet å være seronegative, faktisk behandles som om de er infisert hvis visse andre indikasjoner på infeksjon, slik som kontakt med en kjent bærer, er tilfredsstilt. Mens begrepene "seropositiv" og "seronegativ" kan anvendes her som de lettest tilgjengelige indikatorer på infeksjon, er de ment å være synonyme med henholdsvis "infisert" eller "ikke-infisert".

Identifikasjon av HIV-spesifikke gener og genprodukter er basert på terminologien av HIV type 1 som presentert i figur 1. Det er imidlertid ment at en referanse til et spesifikt gen eller genprodukt fra HIV type 1, basert på dets molekylvekt, også vil inkludere det tilsvarende gen eller genprodukt fra HIV type 2, og der hvor et homologt gen er til stede, fra andre retroviruser. Genproduktene fra andre typer og arter kan ha litt forskjellige molekylvekter. For eksempel er HIV type 1 gp41 ekvivalent med gp36 fra type 2, mens type 1 gpl20 tilsvarer type 2 gpl3 0. Gener blir identifisert ved understrekning i typebetegnelsen, slik som gag, mens det tilsvarende genprodukt blir identifisert ved at det benyttes store bokstaver slik som GAG. Hele HIV-genet er blitt sekvensdannet. Se Råtner et al. Nature 313.277 (1985), som er inkorporert her ved referanse.

HIV kan dyrkes fra en prøve av perifert blod fra infiserte individer. For eksempel kan mononukleære celler fra perifert blod slik som lymfocytter, oppnås ved å legge et lag av en prøve av heparinisert venøst blod over en Ficoll-Hypaque tetthetsgradient og sentrifugere prøven. De mononukleære celler blir så oppsamlet, aktivert, som med fytohemaglutinin i to til tre dager, og dyrket i et passende medium, fortrinnsvis tilsatt interleukin 2. Viruset kan påvises enten ved en måling for revers transkriptase, ved en antigen-oppfangningsmåling for p24, ved immunofluorescens eller ved elektronmikroskopi for å påvise tilstedeværelse av viruspartikler i celler, hvorav alle er fremgangsmåter som er vel kjent for fagmannen på området. Når det er isolert, kan viruset over-føres til andre celler.

Det er viktig å anvende en ikke-infeksiøs vaksine for å unngå innføring av infeksjonen i en vert. Forskjellige fremgangsmåter er vel kjent for å gjøre et patogen ikke-infeksiøst. Se for eksempel Hanson, MEDICAL VIROLOGY II (1983) (de la Maza og Peterson, eds) Elsevier, N.Y. Viruset kan inaktiveres eller gjøres replikasjons-defekt. Fortrinnsvis blir det imidlertid behandlet med en kombinasjon av /?-propiolakton og 7-stråling. For de mengdene som er anvendt her, må /3-propiolakton være i kontakt med viruset i et minimum på 2,5 timer. For fullstendig å eliminere alt rest-/?-propiolakton, må /3-propiolakton forbli i løsning i et minimum på

5 timer ved 37°C.

Det isolerte virus blir så behandlet for å fjerne de ytre kappeproteiner. Slik fjerning utføres fortrinnsvis ved gjentatt frysing og opptining av viruset sammen med fysikalske metoder som forårsaker svelling og kontraksjon av viruspartiklene, selv om andre fysikalske eller ikke-fysikalske metoder, slik som lyd-behandling, også kan anvendes alene eller i kombinasjon.

Alternativt kan i det vesentlige rensete genprodukter av retrovirus slik som HIV, som er forskjellige fra de ytre kappe-proteiner, anvendes som immunogen. Slike genprodukter inkluderer de produkter som kodes for av gag-genene (p55, p39, p2 4, pi7 og pl5), pol-<g>enene (p66/51 og p31-34) og transmembran-glykoprotein gp41. Disse genprodukter kan anvendes alene eller i kombinasjon. Alternativt kan genproduktene av de gjenværende fem gener i HIV-genomet anvendes. Genproduktene kan isoleres og renses fra viruset eller kan produseres ved kloning -og ekspresjon av det passende gen i en vertsorganisme slik som bakterie-, sopp- eller pattedyrceller ved fremgangsmåter som er vel kjent på fagområdet. Alternativt kan antigenene syntetiseres, ved å anvende fremgangsmåter som er vel kjent på fagområdet, slik som automatisert peptidsyntese. Amino-syresekvensen til genproduktene er blitt utledet fra nukleotid-sekvensen.

Et undersett av individer bestemt til å ha retrovirus-infeksjoner, slik som HIV, kan effektivt behandles ved aktiv immunoterapi ved å anvende et ikke-infeksiøst immunogen fremstilt fra retroviruset. Dyr som er kjent for å ha retrovirusinfeksjon, kan også behandles ved en slik fremgangsmåte. I tilfellet med HIV blir et seropositivt individ immunisert med et ytre kappefritt immunogen, fortrinnsvis inkorporert i et adjuvans. Alternativt kan immunogenet administreres i sin vandige form uten adjuvans. Dosen selekteres for å være immunologisk effektiv, og er hovedsakelig fra 1 til 100 mikrogram protein, fortrinnsvis 30 mikrogram protein.

Aktiv immunisering påføres og gjentas fortrinnsvis én gang ved et minimumsintervall på minst 90 dager, selv om tilleggs-doseringer kan være på sin plass i henhold til forandringer i immunokompetansenivået, basert for eksempel på en nedgang i antistoffer mot HIV-genprodukter som er forskjellige fra ytre kappeproteiner. Slik immunisering utføres fortrinnsvis i utgangs-punktet ved en intramuskulær injeksjon fulgt av intradermal injeksjon, selv om enhver kombinasjon av intradermale og intra-muskulære injeksjoner kan anvendes.

Fortrinnsvis blir immunoresponderingsevnen eller immuno-kompetansen til det seropositive individ bestemt før immunisering for å bestemme et passende terapiforløp. Som en fremgangsmåte for slik bestemmelse blir sera fra individer kartlagt for tilstedeværelse av antistoffer mot p24 (som ved hjelp av ELISA), for RTI-antistoff og/eller for nivået av T4-celler ved fremgangsmåter som er vel kjent på fagområdet. Individer som viser indikatorer på lav immunokompetanse, slik som lave p24- eller RTI-antistofftitere eller lave antall T4-celler er passende kandidater for passiv immunoterapi, fortrinnsvis sammen med, og enten forutgående for eller samtidig med aktiv immunoterapi.

Seronegative individer kan vaksineres for å indusere immuno-beskyttende faktorer for å forhindre infeksjon. Fortrinnsvis blir vaksinen administrert først ved intramuskulær injeksjon fulgt av en boosterinjeksjon gitt enten intramuskulært eller intradermalt. En fysiologisk effektiv dose, fortrinnsvis i området 1 til 100 mikrogram og mer foretrukket 30 mikrogram immunogen gis pr. dose. Fortrinnsvis blir vaksinen administrert sammen med et adjuvans, mest foretrukket et vann-i-olje-type-adjuvans. Forskjellige passende adjuvanser er vel kjente på fagområdet som beskrevet av Warren og Chedid, CRC Critical Reviews in Immunology 8:83 (1988), som er inkorporert her ved referanse.

I tillegg, fordi antistoffer mot gpl60/120 kan forenkle virusabsorpsjon til celler, kan disse spesifikke antistoffer fjernes fra en person som er infisert med HIV, før immunoterapi. Immunosorbente kolonner sammensatt av hule celluloséfibre modifiseres til kovalent å binde ligander reaktive med anti-gpl60/120 antistoffer. Slike ligander inkluderer gpl60/120 antigener fremstilt fra rensete glykoproteiner oppnådd fra nylig innhøstede viruspartikler eller fra kultursupernatant fra HIV-produserende T4-lymfocytter. Alternativt kan slike ligander fremstilles ved rekombinant-DNA-metoder ved å anvende transfekterte celler. Alternativt kan anti-idiotyper reaktive med anti-gpl60/120 antistoffer anvendes. Slike anti-idiotype antistoffer kan lages ved fremgangsmåter vel kjent på fagområdet, for eksempel Riott et al. Lancet, 9.mai 1981, s. 1041 ff. som er inkorporert her ved referanse. Fremgangsmåter for anvendelse av slike kolonner for ekstrakorporlig fjerning av frembrakte antistoffer, er de som er beskrevet i Larue et al., Symp. on Plasma Exchange in Nephrology; Int'l. J. of Art. Organs 8:23 (1984), som er inkorporert her ved referanse.

B. Eksempler

De følgende eksempler er ment å illustrere oppfinnelsen. Selv om de er typiske for dem som anvendes, kan andre alternative prosedyrer kjent for fagmenn på området, alternativt anvendes.

EKSEMPEL I

Fremstilling av virale partikler fri for den ytre kappe

Celler infisert med HIV ble dyrket i media A som besto av RPMI 1640 med 10% fetalt bovint serum (FBS) 25 mM HEPES, 50 mikrogram/ml gentamicin og 100 mikrogram/ml streptomycin.

Kulturene ble ekspandert ved å tilsette stokkceller til spinnerkolber og bringe volumet opp til omtrent 8 liter med forvarmet media A. Splittforholdet var omtrent 1:5. En splitt nummer to ble utført som foran med et splittforhold på 1:3.

Supernatanten fra 5 til 7 dager gammel suspensjon av de HIV-inf iserte celler ble filtrert gjennom et 0,45 ^m filter (Prostack; Millipore Corporation, Bedford, MA). En 1:40 stokkløsning av f3-propiolakton (Sigma Chemical Corporation, St. Louis, MO) ble fremstilt fersk før anvendelse og tilsatt til supernatanten til en sluttkonsentrasjon på 1:4000. Løsningen ble inkubert i fem timer ved 37°C, og pH ble opprettholdt ved 7,2-7,4.

Etter fem timer ble 20 ml av supernatantløsningen fjernet for å sikre nivået av infektivitet og mengden av gjenværende /3-propio-lakton. Supernatanten ble så frosset ved -70°C. Den frosne supernatant ble så utsatt for 4,5 mR <60>Co-7-stråling (Radiation Sterilizers Inc, Tustin, CA).

Supernatantløsningen ble så tint opp og konsentrert 40 ganger ved å anvende Millipore Pellicon-systemet med polysulfonfiltere med 100.000 MV tilbakeholdelsesgrense, fulgt av instruksjoner gitt av produsenten. Konsentratet ble plassert i T-21 rotorflasker (Beckman Instruments, Brea, CA), på forhånd behandlet med 70% isopropylalkohol (IPA) og sentrifugert ved 28.000 rpm i en time. Supernatanten fra rørene ble fjernet og pellets resuspendert i natrium Tris EDTA (NTE) til et sluttvolum på omtrent 24 ml NTE. 4 ml av denne suspensjon ble lagt i lag over 8 ml 3 0% sukrose i polyallomerrør som på forhånd var blitt behandlet med 70% IPA og sentrifugert i en time ved 28.000 rpm. Supernatanten ble avrent fra 3 0% sukrosen og pellets grundig resuspendert i NTE.

En gradient i ultraklare sentrifugerør, på forhånd behandlet med 70% IPA, ble opprettet ved å tilsette 3 ml 45% sukrose til røret og legge et lag over 6 ml 30 % sukrose. 3 ml av suspensjonen ovenfor ble lagt i lag oppå. Rørene ble sentrifugert i 60 minutter ved 28.000 rpm.

Løsningen over bånd ved 35%-grenseflaten ble pipettert bort og kastet. Båndene fra alle rør ble kombinert i ett konisk rør og fortynnet 1:10 med fosfatbufret saltvann (PBS). Løsningen ble sentrifugert i polyallomerrør forbehandlet med 7 0% IPA i én time ved 28.000 rpm. Supernatanten ble fjernet, og pellets resuspendert i PBS ved en konsentrasjon på 1 ml pr. 10 liter startmateriale.

Alternativt, spesielt der hvor immunogenet fremstilles i store mengder, kan bestrålingstrinnet utføres etter at båndene ble kombinert. Deretter blir viruset bånddannet på en 15-50% sukrose-gradient. Virusbåndene ble kombinert og resuspendert i PBS. Viruset ble pelletert ved 28.000 rpm i 1 time og resuspendert i PBS til en sluttkonsentrasjon på 1,0 mg/ml.

Mengden av protein til stede ble bestemt i henhold til fremgangsmåten til Bradford, Anal. Biochem. 72:248 (1976), som er inkorporert her ved referanse. Proteinet ble fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 1,0 mg/ml i PBS.

Nivået av rest-/?-propiolakton i immunogenet fremstilt ved fremgangsmåten i eksempel I ble bestemt ved å anvende en kapillar gassvæskekromatograf (Carlo ERBA Series 4100), i henhold til produsentens instruksjoner. Standardløsninger av /3-propiolakton og smørsyre som hadde konsentrasjoner mellom 1 ppm og 500 ppm, ble fremstilt. To mikrolytiske prøver ble injisert i kapillar-kromatografen ved å anvende instruksjonene fra produsenten. Påvisningsgrensen ble bestemt til å være 0,1 ppm. Immunogenet ble bestemt til å inneholde mindre enn 0,05 ppm /3-propiolakton.

Åtte prøver av immunogen fremstilt i henhold til fremgangsmåten ovenfor, ble analysert på /3-propiolaktoninnhold ved kapillargasskromatografi, ved å anvende smørsyre som intern standard. Denne kromatografiske tilstand var som følger: kolonne: 30 m X 0,25 mm smeltet silisiumdioksyd åpen tubulær; stasjonær fase: 100% cyanopropylsilikon; injektortemperatur 140°C; temperaturprogram 70°C/minutt, 20°C/minutt til 130°C; injeksjon-steknikk: splittløs. Under betingelsene ovenfor var tilbake-holdelsestidene for /3-propiolakton og smørsyre henholdsvis 7,52 minutter og 6,7 0 minutter. En injeksjon på 2 mikroliter av en 1 ppm løsning av /3-propiolakton frembragte en topp som kunne kvantifiseres. Konsentrering av 1 ppm-løsningen til en tiendedel av dens volum ved avdampning av løsningsmiddel ved 40°C under redusert trykk forårsaket ikke et tilfredsstillende tap av /3-propiolakton. Påvisningsgrensen etter konsentrering var 0,1 ppm (0,1 mikrogram/ml).

For å bekrefte at immunogenet var fritt fra de ytre kappe-proteiner, ble immunogenet først separert på 11,0% SDS-PAGE-geler i henhold til fremgangsmåten til Laemmli, U.K., Nature 227:680

(1970), som er inkorporert her ved referanse. Det separerte materialet ble så overført til nitrocellulosepapir i henhold til fremgangsmåten til Towbin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 76:4350

(1979), som er inkorporert her ved referanse, og immunofarget i henhold til fremgangsmåten til Tsang et al., Meth. Enzymology 92:377 (1983), som er inkorporert her ved referanse. Som det kan sees i figur 4 har Western-Blots av det således oppnådde immunogen ikke noe bånd som tilsvarer gpl20/160, som angitt i kontrollene når de er omsatt med sera som inneholder høye titere av anti-gpl60/120.

Som vist i figur 4 var kommersielle Western Blot-strimler med

HIV-proteiner (Bio-Rad, Richmond, CA) ("kommersielle Western Blot strimler") kartlagt med heterologe sera (sjimpanse A86-C og A-3) som inneholdt høytiter-antistoffer mot ytre kappeproteiner, gpl60/120, negative (ikke-reaktive) på Western Blot-strimler fremstilt med det ytre kappefrie immunogen ved fremgangsmåten i eksempel 1. Homologe humane sera (003 og 010) som inneholdt høytiter-antistoffer mot ytre kappeproteiner gpl60/12 0, var reaktive med kommersielle Western Blot-strimler, men ikke-reaktive på Western Blot-strimler fremstilt fra det ytre kappefrie immunogen. Både homologe og heterologe sera reagerte med andre HIV- genprodukter.

Mangel på ytre kappeproteiner på immunogenpartiklene ble bekreftet ved elektronmikroskopi. Immunogenpreparatet ble fiksert med 2,5 glutaraldehyd, post-fiksert med Os04, dehydratisert gjennom en gradert rekke med etanolløsninger og nedsenket i EPON-812. Tynne snitt ble fremstilt med en LKB Microtome (LKB, Uppsala, Sverige) ved å anvende en diamantkniv. Tykkelsen av snittene var 60 nanometer. Snitt ble farget med uranylacetat og blysitrat og observert og fotografert med et Zeiss 109 elektronmikroskop. HIV-infiserte celler ble fremstilt ved samme fremgangsmåte som kontrollene. Immunogenet ble sett å mangle den mørkt fargede ytre kappe vist i kontrollene, som gjenspeiler gpl60/120 på virus-overflaten.

EKSEMPEL II.

Immunoterapi til seropositive individer

Ni individer seropositive for HIV ble behandlet med immunoterapi. Et immunogen som omfatter ikke-infeksiøse HIV-partikler som manglet de ytre kappeproteiner, ble fremstilt i henhold til fremgangsmåten i eksempel I. Immunogenet ble emulgert i et 1:1 forhold i inkomplett Freuds adjuvans (IFA) i en emulgator (Spex 8000 Mixer Mill; Spex Industries Inc., Edison, N.J.). 1,0 ml løsning, som inneholdt 100 mikrogram protein, ble administrert intramuskulært. En booster på 100 mikrogram protein uten adjuvans ble administrert 9 0 dager ved intradermal injeksjon. Tilstedeværelse av HIV-virus i en pasients perifere blodlymfocytter ble bestemt både pre- og post-immunisering ved sam-dyrking med ferskt tilførte perifere blodlymfocytter stimulert med PHA og interleukin-1 (IL-2) ved fremgangsmåten til Gallo et al., J. Clin. Microb. 25:1291 (1987), som er inkorporert her ved referanse. Prøvesett for å påvise tilstedeværelse av HIV-antigener, slik som p24, er kommersielt tilgjengelige (for eksempel HIV p24 Assay; E. I. DuPont & DeNemours Co., Inc., Wilmington, DE). Hver pasient ble testet tre ganger før immunisering, og ved uker 2, 4, 6, 8, 12 og 14 postimmunisering.

Tabell I gir resultatene fra viral isolering fra pasientene. Pasienter 010 og 003, hvorfra man fra begge hadde isolert HIV før immunisering, viste ikke isolerbart virus gjennom uke 12 etter immunisering. Pasienter 008 og 009 var virusfrie ved kultur gjennom uke 8 etter immunisering. Alle disse fire pasienter hadde vist høye titere av anti-p24 (>1:5000) og RTI (>1:1000) før immunisering. De gjenværende fem pasienter, som viste lavere anti-p24 og RTI-titere før immunisering, fortsatte å vise isolerbart virus etter immunisering.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for å oppnå et immunogen som omfatter ikke-inf eksiøse retrovirale partikler uten ytre kappe-proteiner, karakterisert ved å dyrke celler som er infisert med nevnte retrovirus, sentrifugere cellekulturen og oppsamle supernatanten, tilsette /3-propiolakton til supernatanten, fryse supernatanten og deretter utsette den for 7-bestråling, tine supernatanten og deretter isolere retroviruspartiklene fra kulturene ved ultrasentrifugering.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved å isolere HIV-partikler.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at det isoleres partikler som er uten ytre-kappe-proteinene gpl60 og gpl20.