NO175308B - Kromogen enzymsubstratforbindelse, anvendelse av forbindelsen samt forsöksinnretning for bestemmelse av et bestemt enzym i en flytende pröve - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører kromogene enzymsubstratforbindelser, anvendelse av forbindelsene samt en forsøks-innretning for bestemmelse av et bestemt enzym i en flytende prøve.

Bestemmelsen av enzymer er viktig innenfor en rekke felter, såsom biokjemisk forskning, miljømessig og industriell forsøksvirksomhet, og innenfor medisinsk diagnose. Kvantifi-seringen av enzymnivåer i kroppsvæsker, såsom serum og plasma, gir legen meget nyttig informasjon ved diagnosti-sering av sykdomstilstander og deres behandling. I tillegg til å være analytter av interesse i biologiske fluider, kan enzymer også tjene som deteksjonsreagenser i en rekke analytiske systemer såsom immunoanalyser og nukleinsyre-hybridiseringsteknikker. I slike systemer er enzymer nyttige, direkte eller indirekte, som merker for å overvåke omfanget av antigen-antistoff-binding eller nukleinsyrehybridisering som finner sted.

Følgelig har ønsket om å detektere enzymanalytter og å benytte enzymmerker som et diagnostisk verktøy for forskjellige analytiske forsøkssystemer gitt opphav til utviklingen av optiske indikatorforbindelser for anvendelse ved deteksjon og måling av aktiviteten av slike enzymer. Typisk innbefatter slike kjente optiske indikatorforbindelser en detekterbar kjemisk gruppe, såsom et fluorogen eller et kromogen som er derivatisert med en enzym-spaltbar substrat-gruppe som er spesifikk for enzymet av interesse. Slike optiske indikatorforbindelser viser et optisk signal som er forskjellig fra det optiske signalet som tilveiebringes ved den spaltede native formen av fluorogenet eller kromogenet. Prinsipielt spalter enzymet indikatorforbindelsen slik at fluorogenet eller kromogenet frigjøres i form av et distinkt fluorescent eller farget produkt slik at det tilveiebringes en endring i fluorescens eller farge som er proporsjonal med mengden enzym tilstede, hvilket i sin tur kan korreleres med mengden analytt tilstede i en prøve.

Spesielt er deteksjonen og/eller bestemmelsen av hydrolaser, dvs. enzymer som katalyserer hydrolysereaksjoner av estere, glykosidiske bindinger, peptidbindinger, andre karbon-nitrogen-bindinger og syreanhydrider [se Lehninger, Biochemistry (Worth Publishers, Inc., New York, NY, 1970) s. 148], av interesse ved diagnose og overvåking av forskjellige sykdommer som f.eks. bestemmelsen av amylase og lipase ved diagnose av bukspyttkjerteldysfunksjon [se Kaplan og Pesce, Clinical Chemistry - Theory, Analysis and Correlation (CV. Mosby Co., St. Louis, MO, 1984) kap. 45], bestemmelsen av N—acetylglukosaminidase (NAG) som en indikator for nyresykdom [se Price Curr. Probl. Clin. Biochem. 9, 150(1979)] og deteksjon av esterase som en indikator for leukocytter [se Skjold, Clin. Chem. 31, 993 (1985)]. I tillegg til deres verdi ved overvåking av sykdom, har hydrolaser i senere år fått økende betydning innenfor det diagnostiske området så vel som innenfor bioteknologi. F.eks. har alkalisk fosfatase og, fortrinnsvis, p<->D-galaktosidase funnet økende anvendelse som indikatorenzymer for enzymimmunoanalyser [se Annals of Clinical Biochemistry 16, 221-240 (1979)].

Følgelig har anvendelsen av enzymer såsom glykosidaser, spesielt p<->D-galaktosidase, som indikatorenzymmerker i analytiske forsøkssystemer gitt opphav til utviklingen av substratglykosider såsom fenyl-p<->D-galaktosid, o-nitrofenyl-p<->D-galaktosid og p-nitrofenyl-3-D-galaktosid [se Biochem. Z., bind 333, s. 209 (1960)] som hydrolyseres av p<->D-galaktosidase og frigjør fenolene som bestemmes fotometrisk i det ultrafiolette området, eller nitrofenolene som bestemmes i det synlige kortbølgeområdet. Europeisk patentpublikasjon nr. 156.347 beskriver glykosider av resorufinderivater som er spesifikke for, og spaltes av, den spesielle glykosidasen av interesse slik at det frigjøres resorufinderivat som kan bestemmes fotometrisk i det synlige området eller enkelt eksiteres til fluorescens. Tilsvarende beskriver US patent nr. 3.950.322 en N-acyl-neuraminsyre derivatisert med et fluorogen såsom 4-metyl-umbelliferon, fluorescein, metyl-fluorescein, resorufIn eller umbelliferon for deteksjon av neuraminidase hvor det fluorogene substratglykosidet tilsvarende påvirkes av enzymet slik at fluorogenet frigjøres.

Anvendelsen av p<->D-galaktosider er også beskrevet i forbindelse med histokjemiske undersøkelser, såsom naftyl-p<->D-galaktosidene beskrevet i Histochemie, bind 35, s. 199 og bind 37, s. 89 (1973), og 6-brom-oc-naf tylderivatene derav beskrevet i J. Biol. Chem., bind 195, s. 239 (1952). Ifølge slike forsøkssystemer omsettes naftolene som frigjøres ved vekselvirkningen mellom galaktosidet og enzymet med forskjellige diazoniumsalter slik at de respektive azo-farge-stoffene oppnås som deretter kan visualiseres.

Forskjellige akridinforbindelser har vært beskrevet som akridinfargestoffer for anvendelse som indikatorforbindelser i analyser for deteksjon av hydrogenperoksyd (europeiske patentpublikasjoner nr. EP 38.205, 45.220 og 124.287), og som multiple fluorofore merker som induserer selvslukking og som enzymatisk fluoresceres til fluorescens (canadisk patent nr. 1.124.643) Akridin-oransje er også beskrevet for anvendelse som en fluorescent biokjemisk farge (US patent nr. 3.793.131, 4.190.328, 4.257.775 og 4.345.027).

Selv om slike kjente optiske indikatorforbindelser er nyttige for deteksjonen av enzymanalytter og merker i et analytisk forsøkssystem, foreligger ikke desto mindre et antall problemer som påvirker analysefølsomheten og nøyaktigheten, såsom lave ekstinksjonskoeffisienter, dårlig vannoppløse-lighet, absorbansmaksima som interfererer med forskjellige pigmenter og andre bestanddeler som vanligvis er tilstede i biologiske fluider, og fargeskift mellom den optiske indikatorforbindelsen og det frigjorte kromogenet eller fluorogenet som er vanskelig å måle uten anvendelse av kompliserte instrumenter.

Følgelig er det et formål ved foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe kromogene enzymsubstratforbindelser som kan anvendes som optiske indikatorforbindelser i analytiske forsøkssystemer for nøyaktig og følsom bestemmelse av enzymer i en flytende prøve.

Videre er det en hensikt med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe kromogene enzymsubstratforbindelser som kan inkorporeres i den faste, porøse matriksen av en analytisk forsøksinnretning som optiske indikatorforbindelser for måling av enzymer som er inkorporert deri, eller i en flytende prøve påført på denne.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringe nye kromogene enzymsubstratforbindelser, kjennetegnet ved formelen:

hvor

Y er en rest av en forbindelse Y-OH valgt fra gruppen bestående av a-D-galaktose, p-D-galaktose, a-D-glukose, p-D-glukose, a-D-mannose, N-acetylglykosamin og N-acetylneuraminsyre eller en oligosakkaridkjede på fra mellom 2 til 20 monosakkaridenheter, eller tosylbeskyttet alanin eller fosforsyre, og

R og R', som kan være like eller forskjellige, er alkyl inneholdende fra 1 til 6 karbonatomer, fenyl, naftyl eller danner sammen en cykloheksa-2,5-dien-4-on eller 4-hydroksycykloheksylrest.

Hovedfordelene ved foreliggende oppfinnelse skyldes anvendelsen av 7-hydroksy-9H-akridin-2-on-kromogener som mellomprodukter som er derivatisert med en egnet enzymatisk-spaltbar gruppe Y. Når spesielt den enzymatisk-spaltbare gruppen Y spaltes ved hjelp av et spesifikt enzym for denne i en basisk oppløsning, fortrinnsvis fra mellom pH 7,0 til pH 10,0, frigjøres en deprotonert form av kromogenet som har et absorbansmaksimum som er vesentlig større enn absorbansmaksimumet for den kromogene enzymsubstratforbindelsen Ifølge foreliggende oppfinnelse, hvorved det tilveiebringes en klart forskjellig i absorbansen dem imellom. Den klare forskjellen i absorbans tilveiebringer et lett observerbart og detekterbart optisk signal som kan måles nøyaktig og korreleres med mengden enzym tilstede i en flytende prøve.

Det anvendes nye 7-hydroksy-l,3-dihalogen-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-kromogenmellomprodukter som er spesielt nyttige for fremstilling av de kromogene akridinon enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, og det er angitt fremgangsmåter for fremstilling derav. Figur 1 er et flytdiagram av syntesen for fremstilling av 7-hydroksy-9H-akridin-2-on-kromogenene. Figur 2 er et flytdiagram for syntesen for fremstilling av 7-hydroksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-kromogenene ved anvendelse av 7-hydroksy-l,3-diklor-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-mellomproduktet. Figur 3 er et flytdiagram for syntesen for fremstilling av 7-hydroksyspiro [ak r i din-9 ,1' -cykloheksa-2 ' ,5 '-dien] - 2(9H)4-dion-kromogenene og analoger derav. Figur 4 er en grafisk fremstilling som viser doseresponsen av en forsøksinnretning inkorporert med det kromogene enzymsubstratet ifølge foreliggende oppfinnelse for p-D-galaktosidase.

De kromogene enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er avledet fra 7-hydroksy-9H-akridin-2-on-kromogener (1 det følgende betegnet akridinoner) som har den generelle formelen:

som er beskrevet 1 litteraturen hvor R og R' er fenyl [F. Kehrman og J. Tschui, Heiv. Chlm. Acta., bind 8, s. 23

(1925)] eller metyl [H. Goldstein og W. Kopp, Heiv. Chim. Acta., bind 11, s. 478 (1928)]. De synlige absorpsjons-spektrene for de tidligere nevnte difenyl- og dimetyl-kromogene er beskrevet av R. Hill et al., J. Chem. Soc. (C), 2462 (1970), hvor et 175 nm skift i absorpsjon (Xmaks) mellom den protonerte formen og den deprotonerte formen av slike dimetyl- og difenylkromogener rapporteres. Slik deprotonering finner sted i basiske oppløsninger, vanligvis fra pH 7,0 til pH 7,5, ved den fenoliske hydroksylgruppen av kromogenet (2) ved delokalisering av den negative ladningen av anionet gjennom molekylet som følger:

Den deprotonerte formen (3) tilveiebringer en blå farge som adskiller seg klart fra den gule fargen som tilveiebringes av den protonerte formen (2) derav.

Tilsvarende er andre akridinonanaloger beskrevet av Hill, et al., supra, hvor f.eks. R og R' tilsammen danner en cyklo-heksa-2,5-dien-4-on-rest [C. Lieberman, Chem. Ber., bind 7, s. 1098 (1874), identifisert som 7-hydroksyspiro[akridin-9,l'-cykloheksa-2',5'-dien]-2(9H),4-dion av Hill et al.,

[supra] slik at det tilveiebringes kromogener av formelen (4):

eller hvor R og R' sammen danner en 4-hydroksycykloheksylrest slik at det tilveiebringes kromogener av formelen (5): så vel som en substituert form av forbindelse (4) slik at det tilveiebringes kromogener av formelen (6): hvori forbindelser (4), (5) og (6) har optiske egenskaper som ligner på de som vises av akridinonf orbindelsene av den generelle formel (2) og dimetyl- og difenylanalogene derav som beskrevet ovenfor. En akridinonanalog (7) av forbindelse (6) er også beskrevet i US patent nr. 3.781.711 av formelen:

Ifølge foreliggende oppfinnelse er, når den fenoliske hydroksylgruppen av kromogenet (2) er derivatisert med en enzymatisk-spaltbar gruppe innbefattende en rest av en forbindelse Y-OH som er en enzym-spesifikk enhet, de resulterende forbindelsene nye kromogene enzymsubstratforbindelser av de generelle isomere formlene (8):

hvori Y står for den enzymatisk spaltbare gruppen, R og R', som kan være like eller forskjellige, er alkyl eller aryl, eller danner sammen en cykloheksadienonrest, fortrinnsvis en cykloheksa-2,5-dien-4-on-rest, eller en 4-hydroksycykloheksylrest. Det skal understrekes at slik isomeri for den kromogene enzymsubstratforbindelsen som vist ved struktur-formelen (8) vil finne i tilfellet hvor R og R' er forskjellige.

Det bør understrekes at foreliggende oppfinnelse beskriver den første anvendelsen av akridinonklassen av kromogener som indikatorgrupper i kromogene enzymsubstrater og, følgelig, omfatter en lang rekke substituerte akridinonderivater.

De kromogene enzymsubstratforbindelsene (8) har i det vesentlige de samme fargeegenskapene som den protonerte formen av kromogenet (2), uavhengig av pH for den flytende omgivelsen, hvorved etter kontakt mellom den avledede kromogene enzymsubstratforbindelsen (8) og et egnet enzym i omgivelser innbefattende en basisk oppløsning fra pH 6,5 til pH 10, den enzymatisk-spaltbare gruppen Y avspaltes av enzymet slik at den dissosierte eller deprotonerte formen av kromogenet (3) som har et absorbansmaksimum som er vesentlig høyere enn absorbansmaksimumet for den kromogene enzymsubstratforbindelsen (8) frigjøres slik at det tilveiebringes en klar endring i absorbansmaksimum dem imellom. Følgelig er den kromogene enzymsubstratforbindelsen (8) ifølge foreliggende oppfinnelse spesielt nyttig i et analytisk forsøks-system som krever deteksjon av en enzym-merket analysereagens som anvendes deri. Den klare og målbare endringen i absorbansmaksimum som genereres mellom substratforbindelsen (8) og den deprotonerte formen av kromogenet (3) kan detekteres nøyaktig, måles og korreleres med mengden analytt tilstede i en flytende prøve.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er den enzymatisk-spaltbare gruppen Y en rest av en forbindelse Y-OH innbefattende en enzym-spesifikk enhet slik at det tilveiebringes kromogene enzymsubstratforbindelser som gir spesifisitet til en lang rekke enzymer som opptrer innenfor klinisk kjemi, spesielt hydrolaser.

Det vil være åpenbart for fagmannen at valget av den enzymatisk-spaltbare gruppen Y naturligvis vil avhenge av det spesielle enzymet av interesse. Når f.eks. enzymet av interesse er en glykosidase, kan et glykosid fremstilles hvori den enzymatisk-spaltbare gruppen Y er den glykosidiske resten svarende til det naturlige substratet for den spesielle glykosidasen. Egnede glykosidrester innbefatter, som nevnt, rester av p<->D-galaktopyranose, oc-D-galakto-pyranose, e-D-glukopyranose, a-D-glukopyranose og a-D-mannopyranose, så vel som aminosukkertyper såsom N-acetyl-glukosamin og N-acetylneuraminsyre, og lignende rester. Andre egnede glykosidiske rester innbefatter oligosakkaridkjeder med mellom 2 og 20, fortrinnsvis 2 og 7, monosakkaridenheter tilknyttet ved hjelp av a-l-4-glukosidiske forbindelsesledd, som kan være nedbrutt ved hjelp av sakkaridkjede-oppspaltende enzymer til mono- eller oligosakkarid som i sin tur kan være spaltet ved hjelp av en tilsvarende glykosidase, som i .eks. rester av maltopentose, maltoheksose og maltoheptose.

Det skal understrekes at i visse tilfeller hvor den glvkosi-diske resten er en oligosakkaridkjede som beskrevet ovenfor, blir en slik kjede først modifisert eller nedbrutt til et kortere oligosakkarid eller monosakkarid ved hjelp av enzymet som skal bestemmes slik at det dannes en sekundær subst rat-forbindelse, hvori den enzymatisk-spaltbare gruppen er spaltet fra akridinon-indikatorgruppen ved hjelp av et sekundært enzym, i hvilket tilfelle den sekundære substratforbindelsen deretter bringes i kontakt med det sekundære enzymet slik at det genereres en målbar endring i absorbans som beskrevet tidligere. Når f.eks. enzymet som skal bestemmes er a-amylase, spaltes oligosakkaridkjeden slik at det dannes en sekundær glykosidsubstratforbindelse, f.eks. et a-glukosid eller e-glukosid, hvori den resulterende glykosid-gruppen derav er spaltbar fra akridinon-indikatorgruppen ved hjelp av et sekundært glykosidaseenzym, f.eks. a-glukosidase eller p-glukosidase.

De kromogene enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes for deteksjonen av proteoly-tiske enzymer som vanligvis finnes i leukocytter. Når f.eks. Y er resten av den N-beskyttede aminosyren N-tosyl-L-alanin og R og R' er som definert ovenfor, er esteren representert ved formelen (10):

For deteksjonen av alkalisk fosfatase i en prøve, er tilsvarende den enzymatisk-spaltbare gruppen Y en rest av forbin-deisen Y-OH, hvori Y-OH er en fosforsyregruppe slik at det tilveiebringes en kromogen fosfatester av formelen (11):

De kromogene akridinon enzymsubstratforbindelsene (8) ifølge foreliggende oppfinnelse kan fremstilles ved å omsette forbindelsen Y-OH, hvor Y er en valgt enzymatisk spaltbar gruppe, med et egnet derivatisert 7-hydroksy-9H-akridin-2-on-kromogen, hvilket skal beskrives i større detalj nedenfor, under kondensasjonsreaksjonsbetingelser som er kjent innen teknikken. Generelt kobles det egnede akridininkromogenet under egnede betingelser med et reaktivt derivat av forbindelsen Y-OH, fortrinnsvis et karbohydrat (sukker) eller et karbohydrat-derivat eller en syre som beskrevet ovenfor, slik at det tilveiebringes et kromogent akridinon enzymsubstrat som har den ønskede stereoisomerlen.

Fenolene (13) fremstilles ved fremgangsmåten beskrevet av Hill, et al., supra, hvor R og R' begge kan være metyl eller fenyl og A, B og C er hydrogen, fra den tilsvarende 3—hydroksyacetofenonen eller 3-hydroksy-benzofenon (12) som omsettes med [reaksjon (a)] en metylmagnesiumbromid-Grignard-reagens eller fenylmagnesiumjodid-Grignard-reagens. Det skal understrekes at Grignard-reagensen kan velges fra en lang rekke slike reagenser som er beskrevet innen teknikken som innbefatter, men som ikke nødvendigvis er begrenset til, alkyl- og aryl-Grignard-reagenser, som når X står for brom eller jod, så vel som de som bærer substituenter i form av funksjonelle grupper såsom -O-alkyl (alkoksy), -O-aryl (aryloksy), -alkyl og -aryl. Tilsvarende er syntesen av en rekke substituerte 3-hydroksyacetofenoner (12) hvor R kan være alkyl eller substituert alkyl, og 3-hydroksybenzofenoner (12) hvor R kan være aryl eller substituert aryl, beskrevet og innbefatter forbindelser av den generelle formeld, 2) hvor R kan velges fra en rekke grupper.

Den ønskede indofenol (16) fremstilles ved å omsette.- ) nr\ egnet substituerte fenolen (13) som dannes ved reaksjon ) med et egnet substituert benzokinon-N-klorimin (14) i vs f: i;> alkali [reaksjon (b)] som beskrevet av Hill, et al., sv ; hvor R og R' begge kan være metyl eller fenyl og alle A-:; hydrogen og som beskrevet mer generelt av Gibbs, et Supplement nr. 69 til Public Health Reports, Washin^t D.C. (1928). En alternativ syntesemåte for fremstillingen indofenolen (16) er også beskrevet av Corbett, J. Chem. Soc.

(B), s. 1502 (1970) hvor en egnet substituert fenol (13) omsettes med en egnet substituert p-aminofenol (15) og

oksygen i nærvær av vandig alkali [reaksjon (c)]. Substi-tuentene D, E, F og G av p-aminofenolen (15) er beskrevet hvor D, E og G kan være hydrogen og F kan være metyl eller klor, eller D, F og G kan være hydrogen og E kan være metyl, eller D og G kan være metyl og E og F kan være hydrogen, eller D og E kan være metyl eller klor og F og G kan være hydrogen, eller D kan være klor og E, F og G kan være hydrogen.

Indofenolen (16) som dannes fra enten reaksjon (b) eller (c) anvendes deretter for å fremstille 7-hydroksy-9H-akridin-2-onene (17) og (18) ifølge fremgangsmåten beskrevet av Hill, et al., supra, [reaksjon (d)] hvori indofenolen (16) reduseres (trinn 1) til dens leukoform med f.eks. tinn(II)klorid i vandig syre eller andre mildt reduserende midler som er kjent innen teknikken såsom natriumhydrosulfitt, natrium-borhydrid og lignende. Det resulterende leukomellomproduktet ringsluttes (trinn 2) ved oppvarming av mellomproduktet i vandig mineralsyre, fortrinnsvis 2N HC1, i ca. 1 time ved 90-100'C, og oksyderes deretter (trinn 3) med f.eks. luft (02) i vandig alkali eller en rekke andre kjemiske oksydasjonsmidler såsom kaliumferricyanid eller alkalimetallperiodater, fortrinnsvis natriumperiodat og lignende. Det skal understrekes at det ikke er nødvendig å isolere de forskjellige mellomproduktene som dannes i trinnene 1-3 av reaksjon (d) for å oppnå tilfredsstillende utbytter av akridinonene (17) og (18).

Det er, i forbindelse med foreliggende oppfinnelse fordelaktig at det tilveiebringes nye 7-hydroksy-l,3-dihalogen-9H-akridin-2-on-derivater av de tautomere formlene (19):

hvor R og R', som kan være like eller forskjellige, er alkyl, fenyl eller naftyl som beskrevet tidligere, fortrinnsvis laverealkyl eller fenyl, og X er en halogenrest, fortrinnsvis brom eller klor. Slike mellomprodukter er spesielt nyttige for fremstillingen av et dimetylakridinonkromogen (20) (figur 2) som deretter kan omsettes med en rest Y av Y-OH-forbindelsen slik at de kromogene enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes.

Spesielt kan, som vist i figur 2, dimetylakridinonkromogenet (20) fremstilles ved først å omsette 3-(1-hydroksy-l-metyl-etyl)fenol (21) [Bruce, et al., J. Chem. Soc. (C), 1627

(1966)] og 2,6-diklorkinon-4-klorimid (22) [Gibbs, et al., U.S. Public Health Reports, Supp. 69 og Chem. Abs., bind 23, 3450 (1929)] med natriumhydroksyd i vandig tetrahydrofuran [reaksjon (e)] under egnede betingelser slik at den diklor-substituerte indofenolen (23) dannes, som i sin tur reduseres [reaksjon (f)] slik at forbindelse (24) oppstår, denne syre ringsluttes [reaksjon (g)] og resulterer i forbindelse (25), og oksyderes deretter [reaksjon (h)] og resulterer i det nye 7-hydroksy-l,3-diklor-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (26) ifølge foreliggende oppfinnelse. Diklor-derivatet (26) behandles først med (1) Raney-nikkel og hydrogeneres, og behandles deretter med (2) natriumperjodat og resulterer 1 dimetylakridinonkromogenet (20).

Selv om R og R' 1 akridinonene (17) og (18) kan velges fra en rekke substituenter som beskrevet tidligere, kan R og R<*> også sammen danne en cyklisk enhet og fremstilles ved fremgangsmåten beskrevet av Hill, et al., supra (figur 3) som har den generelle strukturen (27) (7-hydroksyspiro[akridin-9,1'-cykloheksa-2',5'-dien]-2(9H),4'-dion). Når A', B', C og D' alle er hydrogen, kan forbindelse (27) reduseres med nikkel-aluminiumlegering i vandig natriumhydroksyd [reaksjon (j )] slik at de mettede analogene derav (30) oppstår. Tilsvarende er det beskrevet akridinoner av formel (27) hvor A' kan være isopropyl, D' kan være metyl, og B' og C kan være hydrogen (US patent nr. 3.781.711).

Glykosidene av akridinonderivatene av den generelle formelen (8) kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen karbohydratkjemien ved anvendelse av kjente derivater av karbohydrater av formelen Y-OH som omsettes med et egnet kromogen (2). Slike karbohydratderivater som i noen tilfeller bærer beskyttelsesgrupper, er kommersielt tilgjengelige (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA), eller kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken ["Methods in Carbohydrate Chemistry" (Academic Press, 1963), bind 2]. Akridinonderivatene av den generelle formelen (2) omsettes med et mono- eller oligosakkarid eller 1-halogenderivat derav, hvor alle hydroksylgrupper er substituert med en beskyttende gruppe ved fremgangsmåter som er kjente innenfor karbohydratkjemien, slik at det oppnås per-O-substituerte glykosider, hvorfra glykosidene av akridinonderivatene av den generelle formelen (8) oppnås ved avspaltning av de beskyttende gruppene ved fremgangsmåter som er kjente innen teknikken.

Forbindelsene av den generelle formelen (2) omsettes med de per-O-substituerte 1-halogensakkaridene, fortrinnsvis i nærvær av protonakseptorer såsom alkallhydroksyder eller alkalikarbonater, i vandig aceton eller (under faseover-føringsbetingelser) i en vann/kloroform- eller vann/benzen-blanding. Denne fremgangsmåten kan videre utføres ved først å omvandle akridinonderivatet av den generelle formelen (2) med alkalihydroksyd eller -alkoholat til alkalisalter eller, ved anvendelse av eventuelt substituerte aminer, til ammonium-salter, og deretter omsette disse med de per-O-substituerte 1-halogensakkaridene i dipolare aprotiske oppløsningsmidler såsom aceton, dimetylsulfoksyd, diklormetan, tetrahydrofuran eller dimetylformamid. Ved den videre syntesen av per-O-substituerte glykosider fra akridinonderivatene av den generelle formelen (2) og per-O-substituerte 1-halogen-sakkarider, har additiver i form av enkle sølvsalter eller blandinger av sølvsalter, såsom sølvoksyd, sølvkarbonat på "Celite" (Johns-ManviIle Corp., Denver, CO, TJSA), sølvtriflat eller sølvsalicylat og/eller av enkle kvikksølvsalter eller blandinger av kvikksølvsalter, såsom kvikksølvbromid, kvikksølvcyanid, kvikksølvacetat eller kvikksølvoksyd, og/eller av enkle kadmiumsalter eller blandinger av kadmiumsalter såsom kadmiumkarbonat eller kadmiumoksyd, eventuelt med anvendelse av tørkemidler såsom kalsiumklorid, en molekylar sikt eller "Drierite" (W.A. Hammond Drierite Co., Xenia, OH, USA), i oppløsningsmidler såsom metylenklorid, kloroform, benzen, toluen, etylacetat, kinolin, tetrahydrofuran eller dioksan vist seg effektive. Ved syntesen av ot-forbundne glykosider, smeltes en forbindelse av den generelle formelen (2) med et sakkarid hvis hydroksygrupper er substituert med en beskyttende gruppe, fortrinnsvis en acetyl-gruppe, i nærvær av en Lewis-syre, såsom sinkklorid [se Chem. Ber. 66, 378-383 (1933) og "Methods in Carbohydrate Chemistry" (Academic Press, 1967) bind 2, s. 345-347]. Temperaturen av reaksjonen er fortrinnsvis mellom 80 og 130°C, mer foretrukket mellom 110 og 130°C. De resulterende per-O-substituerte glykosidene av akridinonderivater av den generelle formelen (2) er tilsvarende nye forbindelser. Fjernelse av de beskyttende gruppene fra de per-O-substituerte glykosidene for fremstilling av glykosider av den generelle formelen (8) utføres ved fremgangsmåter som er kjente innenfor karbohydratkjemien [se Advances in Carbohydrate Chem. 12, 157 (1976)], såsom med beskyttende acylgrupper med natriumetylat, bariumetylat eller ammoniakk i metanol. Egnet som en "beskyttende gruppe" som vanligvis anvendes innenfor karbohydratkjemien er spesielt en acetyl, benzoyl, benzyl eller trimetylsilylrest.

Akridinonderivater av den generelle formelen (8) hvor Y er resten av en oligosakkaridkjede med fra 2 til 20 monosakkaridenheter tilknyttet via a-l-4-glukosidiske forbindelsesledd kan i tillegg fremstilles fra a- og p-akridinon-glukosider ved hjelp av en enzymatisk prosess først beskrevet av French, et al., J. Am. Chem. Soc. 76, 1287 (1954), og senere av Wallenfels, et al., Carbohydrate Research 61, 359

(1978), innbefattende overføringen av glukosidet til en fordannet polysakkaridkjede ved hjelp av enzymet (l-4)-a-glukan-4-glukosyltransferase (også kjent som cyklomalto-dekstrin-glukantransferase; EC 2.4.1.19).

Ifølge en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse kan kromogene enzymsubstratforbindelser av den generelle formelen (8), hvor Y fortrinnsvis er p-D-galaktose eller P-D-glukose, og R og R' er metyl, fremstilles ved å omsette dimetylkromogenet (20) med et 1-halogenderivat av den enzym-spesifikke enheten, fortrinnsvis et 1-bromderivat derav, substituert ved hydroksyposisjonene med beskyttende grupper, fortrinnsvis acetat-beskyttende grupper, slik at de per-O-substituerte derivatene dannes, hvilke kan hydrolyseres for å fjerne slike beskyttende grupper for å gi den ønskede kromogene enzymsubstratforbindelsen. F.eks. kan p<->D-galaktosidet av (20), det kromogene enzymsubstratet (8) hvor Y er resten av p-D-galaktose og R og R' er metyl, fremstilles for anvendelse ved bestemmelsen av a-D-galaktosidase. Spesielt omsettes dimetylakridinonkromogenet (20), hvor R og R' er metyl i den generelle formelen (2), med acetobromgalaktose og sølvoksyd i etylacetat/klnolin for fremstilling av 7-(tetra-0-acetyl -e-D_-galaktopyranos,vloks.v)-9 .9-dlmetvl-9H-akridln-2-on (31) av formelen:

Acetatet-beskyttelsesgruppene av (31) hydrolyseres deretter med natriummetoksyd i metanol slik at man oppnår det ønskede 7-e-D-galaktopyranosyloksy-9, 9-dimetyl-9H-akridin-2-on (32) ifølge foreliggende oppfinnelse av formelen:

Det resulterende galaktosidet (32) har en absorbans (^maks) på 438 nm (gult), en ekstinksjonskoeffisient på 27.400 og er oppløselig i en fosfat-bufret oppløsning (pH 7,4). Ved hydrolysen av galaktosidet ved hjelp av p<->D-galaktosidase fra en flytende prøve, er det frigjorte kromogenanionet oppløse-lig i den fosfat-bufrede oppløsningen og viser en absorbans på 634 nm (blått) slik at det tilveiebringes en endring på 196 nm i absorbans. Videre spalter enzymet substratet (Kca-t) i et omfang på 1,32 x IO<4> mol/min<1>/mol aktivt sete i en 50 mM fosfat-bufret oppløsning (pH 7,4) Inneholdende 5 mM MgCl2» og viser en bindingskonstant (Km) på 0,17 mM, og tilveiebringer følgelig et meget fordelaktig substrat for p-D-galaktosidase. e-D-glukosidet av (20), det kromogene enzymsubstratet (8) hvor Y er resten av e-D-glukose og R og R' er metyl, kan tilsvarende fremstilles ved å omsette dimetylakridinonkromogenet (20) med acetobromglukose og sølvoksyd i kinolin for fremstilling av 7-(tetra-O-acetyl-p-D-glukopyranosyl-oksy)-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (33) av formelen:

De acetat-beskyttende gruppene av (33) hydrolyseres deretter med natriummetoksyd i metanol og resulterer i det ønskede- 7-P-D-glukopyranosyloksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (34 ) ifølge foreliggende oppfinnelse av formelen:

Esterne av akridinonderivatene av den generelle formelen (9) kan fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innenfor organisk kjemi ved omsetning av kjente derivater av karboksylsyrer av formelen Y-OH, hvor Y-Z-C- og hvor Z er definert som R og R' ovenfor, med akridinonderivatet av den generelle formelen (2). Ifølge foreliggende oppfinnelse er en N-beskyttet aminosyrerest, N-tosyl-L-alanin som kan fremstilles ved fremgangsmåten beskrevet av Beecham, J. Am. Chem. Soc., bind 79, s. 3257 (1957), og deretter omsettes med tionylklorid for tilveiebringelse av N-tosyl-L-alaninylklorid-mellomproduktet (35) av formelen: som deretter kan omsettes med dimetylakridinonkromogenet (20) i tetrahydrofuran og pyridin slik at det tilveiebringes 7-(N-tosyl-L-alaninyloksy )-9,9'-dimetyl-9H-akridin-2-on (36) av formelen:

Slike estere kan tilsvarende fremstilles ved å omsette en forbindelse av den generelle formelen (2) med Y-OH som beskrevet ovenfor, eller med et egnet reaktivt derivat derav, ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen den organiske kjemien [se J. March, "Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanism and Structure" (McGraw-Hill Book Co., New York, NY, 1968) s. 319-323]. De reaktive derivatene som benyttes kan f.eks. være syreklorider eller bromider, eller blandede anhydrider som konvensjonelt anvendes innenfor peptidsyntese, som f.eks. de med etylkloro-format, eller aktive estere såsom de av N-hydroksysuccinimid.

Tilsvarende kan uorganiske estere av akridinonderivatene av den generelle formelen (8) fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innenfor organisk syntese. De kjente derivatene av uorganiske syrer Y-OH, såsom fosforsyre, f.eks. forbindelse (11) hvor omsettes med en forbindelse av den generelle formelen (2) ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innenfor den organiske kjemien, såsom vist i Koller og Wolfbeis, Monatsh. 116, 65 (1985) for uorganiske estere av visse kumariner.

Ifølge en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse kan dlmetylkromogenforbindelsen (20) i pyridin først omsettes med fosforoksyklorid (POCI3) og deretter vandig natriumhydroksyd slik at det dannes dinatrium-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-7-fosfat (37) av formelen:

som hydrolyseres ved hjelp av alkalisk fosfatase i 1,0 W dietanolaminbuffer (pH - 9,8) inneholdende 5,0 mM MgCl£ og viser en KM = 0,48 mM og en <K>cat - 1,94 x IO<5> mol/min/mol enzym. En referanseforbindelse, p-nitrofenylfosfat, har under de samme betingelsene Krø - 0,97 mM og Kca-t <=> 4,16 x 10<5 >mol/min/mol enzym.

De kromogene enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige i analytiske forsøkssystemer som krever måling av mengden enzym som er tilstede, spesielt de analytiske forsøkssystemer som anvender enzymmerkede analysereagenser. Slike analytiske forsøkssystemer innbefatter, men er Ikke begrenset til, enzymimmunoanalyser som er kjent innen teknikken som kompetitive, "sandwich" og immuno-metriske teknikker hvor mengden enzymmerke i en spesiell fraksjon kan måles og korreleres med mengden analytt under bestemmelse oppnådd fra en flytende prøve.

Anvendelsen av spesifikke bindende stoffer, såsom antigener, haptener, antistoffer, lectiner, reseptorer, avidin og andre bindende proteiner, og polynukleotider, merket med et enzym er utviklet i den senere tid og anvendt ved målingen av stoffer i biologiske fluider [se f.eks. Clin. Chem., bind 22, s. 1232 (1976); U.S. Reissue patent nr. 31.006; og UK patent nr. 2.019.308]. Generelt avhenger slike målinger av evnen til et bindende stoff, f.eks. et antistoff eller et antigen, til å bindes til en spesifikk analytt hvori en merket reagens innbefattende slikt bindende stoff merket med et enzym anvendes for å bestemme omfanget av slik binding. Typisk bestemmes bindingsomfanget ved måling av mengden enzymmerke tilstede i den merkede reagensen som enten har, eller ikke har, deltatt i en bindingsreaksjon med analytten, hvori mengden enzym som detekteres og måles kan korreleres med mengden analytt tilstede i en flytende prøve.

De kromogene enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt nyttige i analytiske forsøkssystemer som beskrevet ovenfor hvor en analytisk forsøksinnretning innbefattende en bærermatriks inkorporert med den kromogene enzymsubstratforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes, naturen av den enzym-spesifikke enheten derav avhenger naturligvis av det spesielle enzymet som detekteres.

Naturen av materialet av en slik bærermatriks kan være et hvilket som helst stoff som er i stand til å inkorporeres med den kromogene enzymsubstratforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, såsom de som anvendes for reagensbånd for oppløsningsanalyse. F.eks. beskriver US patent nr. 3.846.247 anvendelsen av filt, porøse keramiske bånd, og vevde eller matte flettede glassfibrer. Som erstatninger for papir beskriver US patent nr. 3552.928 anvendelsen av trefliser, klede, svampmateriale og leirholdige stoffer. Anvendelsen av syntetiske harpiksvlieser og glassfiberfilter istedenfor papir er foreslått i britisk patent nr. 1.369.139 og britisk patent nr. 1.349.623 beskriver anvendelsen av et lysgjennom-trengelig nettverk av tynne filamenter som et dekklag for en underliggende papirmatriks. Denne referansen beskriver også impregnering av papiret med en del av et reagenssystem og impregnering av nettverket med andre potensielt inkompatible reagensér. Fransk patent nr. 2.170.397 beskriver anvendelsen av baerermatrikser som inneholder mer enn 5056 polyamidfibrer. En annen tilnærmelse til baerermatrikser er beskrevet i US patent nr. 4.046.513 hvori konseptet med trykking av reagenser på en egnet bærermatriks er anvendt. US patent nr. 4.046.514 beskriver sammenveving eller sammenfUtring av filamenter som bærer reagenser i et reaktant system. Alle slike bærermatrikskonsepter kan anvendes ved foreliggende oppfinnelse, på samme måte som andre løsninger. Fortrinnsvis innbefatter bærermatriksen et sugende materiale, såsom filterpapir, hvorved en oppløsning av den kromogene enzymsubstratforbindelsen ifølge oppfinnelsen anvendes for å impregnere matriksen. Den kan også innbefatte et system som fysisk inneslutter analysereagensene, såsom polymere mikro-kapsler, som deretter brytes ved kontakt med prøven. Den kan innbefatte et system hvori analysereagensene er homogent kombinert med bærermatriksen i en fluid eller halvfluid tilstand som senere hårdner eller herder, slik at analysereagensene innesluttes.

I en foretrukket utførelse er bærermatriksen et sugende materiale i form av en sone eller et lag inkorporert med den kromogene enzymsubstratforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse som anvendes hvor en spesiell analyse utføres i flytende omgivelse ved anvendelse av en uoppløselig analysereagens som er kjent innen teknikken for fysikalsk å separere de frie spesies av den merkede reagensen fra de bundne spesies av den merkede reagensen. Ifølge et slikt analyse-system fjernes en porsjon av væske inneholdende de frie spesies og påføres på bærermatriksen hvori den kromogene substratforbindelsen som er inkorporert deri vekselvirker med enzymmerket av den merkede reagensen av de frie spesies av den flytende prøven slik at det tilveiebringes et detekterbart signal som visuelt kan observeres og/eller måles med et egnet instrument, såsom et spektrofotometer.

Tilsvarende kan det anvendes en forsøksinnretning innbefattende to eller flere baerermatrikser i form av f.eks. et øvre lag eller en sone og et nedre lag eller en sone. Det nedre laget av en slik forsøksinnretning kan være inkorporert med den kromogene enzymsubstratforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, mens en flytende prøve inneholdende analytten som skal bestemmes påføres på det øvre laget av innretningen. Analytten som diffunderer deri deltar i de nødvendige bindingsreaksjonene slik at det genereres frie og bundne (dvs. immobiliserte) spesies av den enzymmerkede reagensen som beskrevet ovenfor. Følgelig er de frie spesies av den merkede reagensen som genereres på denne måten frie til å migrere inn i det nederste laget hvor enzymmerket av de frie spesies spalter den enzymatisk-spaltbare gruppen av den kromogene enzymsubstratforbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse som er inkorporert deri, slik at det tilveiebringes et målbart, detekterbart signal som beskrevet tidligere.

Foreliggende oppfinnelse skal i det følgende illustreres ved hjelp av de følgende eksemplene. Uthevede tall i parentes refererer til strukturformlene som er benyttet i figurene og/eller beskrivelsen.

EKSEMPEL 1

Syntese og analyse av 7-hydroksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (20).

For å demonstrere egnetheten av kromogenet (2) for anvendelse som en indikator i de kromogene enzymsubstratforbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse ble 7-hydroksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-kromogenet (20) av formelen:

fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Hill, et al., J. Chem. Soc. (C), 2462 (1970), hvor R og R' i den generelle formelen (2) er metyl. Ved analyse av dimetylkromogenet (20) ble slikt kromogen bestemt å ha en fenolisk pKa på 7,1, en absorbans (<X>maks) på 459 nm, og å være oppløselig og stabil i vandige, basiske oppløsninger. Når dimetylkromogenet (20) var deprotonert, viste anionet derav en absorbans på 635 nm og en ekstinksjonskoeffisient på 53.100 ved pH = 10 slik at det ble tilveiebragt et skift på 176 nm i absorbansmaksimumet og den høye ekstinksjonskoeffisienten som er nødvendig for de kromogene enzymsubstratforbindelsene Ifølge foreliggende oppfinnelse.

EKSEMPEL 2

Syntese av 7-hydroksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-l-on (20) fra 7-hydroksy-l,3-diklor-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-mellomprodukt (26) (figur 2).

(a) Syntese av 7-hydroksy-l,3-diklor-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (26)

En blanding av 2-(3'-hydroksyfenyl)-2-propanol (21) (1,52 g, 10,0 mmol) fremstilt som beskrevet av Bruce, et al., J. Chem. Soc. (C), 1627 (1966) og 2,6-diklorkinon-4-klorimid (22) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI, USA)

(2,10 g, 10,0 mmol) i tetrahydrofuran (5 ml) ble fortynnet med H2O (5 ml), avkjølt i et isbad og i løpet av 10 minutter dråpevis behandlet med vandig 2M NaOH (10,5

ml, 21 mmol). Den resulterende dypblå reaksjonsblandingen ble omrørt ved 0°C i 1,5 timer og ble deretter blandet i en kraftig omrørt blanding av mettet vandig NH4CI (500 ml) og etylacetat (300 ml). Fasene ble separert og den vandige fasen ble ekstrahert en gang med etylacetat (100 ml), deretter ble de kombinerte etylacetatlagene vasket en gang med mettet vandig NH4CI (200 ml). Den resulterende etylacetatoppløsningen av (23) ble deretter vasket to ganger med en oppløsning av Na£S204 (25 g) i H2O (250 ml). De kombinerte vandige vaskevannene ble ekstrahert en gang med etylacetat (50 ml), deretter ble de kombinerte

etylacetatlagene vasket en gang med mettet vandig NaCl (saltvann) (150 ml), tørket over Na2S04, filtrert og gjort fri for oppløsningsmiddel i vakuum slik at, det ble oppnådd en rå form av (24) som en brun tjære som ble benyttet uten rensing. En oppløsning av den rå (24) i metanol (10 ml) ble langsomt blandet i rask omrørt, deoksygenert (ved hjelp av inert gasspyling) vandig 2M HC1 (250 ml) ved romtemperatur. Den resulterende suspen-sjonen ble oppvarmet i et oljebad av 100°C under en inert gassatmosfære i 1,25 timer, under denne tiden separerte det ut et mørkt, gummiaktig faststoff. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, raskt omrørt med etylacetat (200 ml) og fasene separerte; det vandige laget ble ekstrahert en gang med etylacetat (200 ml), og deretter ble de kombinerte etylacetatlagene vasket en gang med saltvannsoppløsning (50 ml). Den resulterende etylacetatoppløsningen av (25) ble omrørt ved kraftig omrøring i 15 minutter med en oppløsning av NaI04 (3 g) i H2O (100 ml), deretter ble fasene separert og etylacetat-laget ble vasket en gang med saltvannsoppløsning (100 ml), tørket over Na2S04, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at det ble oppnådd en rå form av 7-hydroksy-l,3-diklor-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (26) som deretter ble opptatt i kokende etylalkohol (500 ml) og konsentrert ved koking til et volum på ca. 150 ml. Ved avkjøling separerte forbindelsen (26) i form av fine rødsorte nåler slik at det etter to innhøstinger ble oppnådd 2,5 g ( 82%). En del av den første innhøstingen ble rekrystallisert fra etylalkohol slik at det ble oppnådd en analytisk prøve av (26) som ikke hadde noe smeltepunkt lavere enn 250°C.

IR (KBr) cm"<1> 1624, 1492, 1451, 1304, 985, 500;

<1->H NMR (DMSO-d<6>) S 1,74 (s, 6H), 6,84 (d av d, J1=8,5 Hz og J2=2,4 Hz, 1H), 7,06 (d, J=2,4 Hz, 1H), 7,50 (d, J=8,5 Hz, 1H), 7,76 (s, 1H),

<1>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 172,07, 162,70, 145,73, 141,18, 140,85, 139,23, 134,8, 134,6, 134,28, 132,46, 115,95, 114,12, 26,27 (1 sammenfallende bånd, et skjult av bppløsningsmiddelbånd);

Analyse

(b) Syntese av 7-hydroksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (20)

En oppløsning av diklorforbindelsen (26) fra trinn (a) av foreliggende eksempel (2,0 g, 6,49 mmol) i vandig IM NaOH (60 ml) og etylalkohol (40 ml) ble behandlet med Raney-nikkel 2800 (W.R. Grace and Co., Baltimore, MD, USA) (1 teskje) og hydrogenert ved 275,8 kPa Ztø under risting ved ca. 70°C i 5 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble reaksjonsblandingen filtrert gjennom diatomejord ("Celite", Johns-Manville Corp. Denver, CO, USA), fortynnet med H2O (500 ml), deretter surgjort med vandig 2M HC1 (100 ml) og ekstrahert fem ganger med etylacetat (200 ml). De kombinerte etylacetatekstraktene ble kraftig omrørt med en oppløsning av NaI04 (4 g) i H2O (300 ml) i 10 minutter ved romtemperatur, deretter behandlet med vandig IM HC1 (100 ml). Fasene ble separert og det vandige laget ble vasket to ganger med etylacetat (50 ml); de kombinerte etylacetatlagene ble vasket en gang med saltvannsoppløsning (50 ml), tørket over MgS04, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum. Spor av resterende vann ble fjernet ved azeotrop behandling med toluen og deretter vakuumtørking ved 60"C for å oppnå dimetylkromogenet (20) (1,38 g, 89$) i form av et rødt pulver. Rekrystallisering fra etylacetat/heksan (1:1) ga dimetylkromogenet (20) i form av rubinrøde nåler identisk med de fremstilt ved fremgangsmåten til Hill, et al., supra.

EKSEMPEL 3

Syntese av 7-e-D-galaktopyranosyloksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (32) ved anvendelse av 7-(tetra-O-acetyl-p-D-galaktopyranosyloksy-9,9-tyl-9H-akridin-2-on (31) mellomprodukt,

(a) Syntese av 7-(tetra-0-acetyl-3-D-galaktopyranosyloksy)-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (31)

En blanding av dimetylkromogenet (20) fremstilt ifølge eksempel 2 (1,57 g, 6,56 mmol) acetobromgalaktose (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (3,238 g, 7,87 mmol), Ag20 (1,825 g, 7,87 mmol) og CaS04 ("Drierite", W.A. Hammond Drierite Co. Xenia, OH, USA) (2,625 g) i etylacetat (31,65 ml) inneholdende vannfri kinolin (15,8 ml) ble omrørt i 19 timer ved romtemperatur i en flaske med kork som var beskyttet mot lys. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat (75 ml), filtrert gjennom "Celite" og ekstrahert to ganger med vandig 1,25M HC1, (hver gang 75 ml). De kombinerte vandige ekstraktene ble vasket en gang med etylacetat (50 ml), deretter ble de kombinerte etylacetatlagene vasket to ganger med salt-vannsoppløsning (hver gang 35 ml), tre ganger med 5% vandig NaHCOs (hver gang 75 ml) og endelig med saltvanns-oppløsning (75 ml). Etylacetatoppløsningen ble deretter tørket over Na2S04, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum slik at det ble oppnådd en brunoransje skummet rest (4,78 g). Skumresten ble opptatt i etylacetat/heksan (3:2, 55 ml), behandlet med aktivert karbon ("Darco G-60", ICI Americas, Inc. Wilmington, DE, USA) (4,78 g), og omrørt ved romtemperatur i en time. Blandingen ble filtrert gjennom "Celite", filterkaken ble vasket med etylacetat/heksan (3:2, 115 ml), deretter ble filtratet og vaskevaesken kombinert og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at det ble oppnådd et brungult skum (4,17

g). Skummet ble opptatt i kokende etylacetat (5,5 ml), fortynnet med heksan (9 ml) og skrapet kraftig for å

indusere krystallisasjon slik at det ble oppnådd et utbytte på 3,0 g (80#) av 7-(tetra-0-acetyl-3-D-galaktopyranosyloksy)-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (31) etter to

innhøstinger. En rekrystallisasjon fra etylacetat/heksan (2:1) resulterte i en analytisk prøve av (31) i form av rosetter av fine gule nåler med et smeltepunkt på 156,5-158,0°C.

IR (KBr) cm-<1> 2970, 1755, 1645, 1620, 1515,1375, 1235, 1080;

1-H NMR (DMSO-d<6>) S 1,50 (s, 6H), 1,93 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 1,97 (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 4,00-4,15 (m, 2H), 4,42-4,62 (m, 1H), 5,20-5,40 (m, 3H), 5,67-5,80 (m, 1H), 6,52-7,70 (m, 6H);

<13>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 186,44, 169,92, 169,53, 169,20, 158,15, 151,00, 147,29, 141,44, 139,62, 137,34, 133,05, 131,23, 127,46, 115,55, 113,80, 96,76, 70,75, 70,23, 68,28, 67,50, 61,84, 36,87, 32,25, 31,80, 20,42 (4 sammenfallende bånd);

Analyse

(b) Syntese av 7-g-D-galaktopyranosyloksy-9.9-dlmetyl-9H-akridin-2-on (32)

En oppløsning av 7-(tetra-O-acetyl-p<->D-galaktopyranosyloksy)-9,9-dimetyl-9H-akrldin-2-on (31) fra trinn (a) av foreliggende eksempel (5,3 g, 9,3 mmol) i varm metanol (250 ml) av HPLC-kvalitet, ble avkjølt til romtemperatur og behandlet med natriummetoksyd (0,106 g, 1,96 mmol). Hydrolysereaksjonen ble etterfulgt av tynnsjiktskromatografi (silikagel; metanol/CHCl3 (15:85)) og var avsluttet etter 1,33 timer. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsats av eddiksyre (0,112 ml) og blandingen deretter inndampet i vakuum slik at det ble oppnådd et mørk oransje faststoff. Det mørke, oransje faststoffet ble opptatt i varm etanol (75 ml), behandlet med "Darco G-60", omrørt i 10 minutter, og deretter filtrert gjennom "Celite" ved anver. ;lse av varm etanol (100 ml) for å rense filterkaken. filtratet og vaskeoppløsningen ble kombinert og konsen; rert i vakuum inntil produktet begynte å separere, der. eter ble oppløsningen ytterligere konsentrert ved kokin- til et volum på ca. 50 ml. Etter avkjøling separerte gal kto-sidet (32) som et amorft oransje pulver, og ett( ; to innhøstinger ble det oppnådd et utbytte på 3,3 g ( 3$). En del ble rekrystallisert fra etanol og vakuuml rket (0,1 torr) ved 132°C i en time slik at det ble oppnå d en analytisk prøve av galaktosidet (32) som synes å sintre ved ca. 140°C før det viste et smeltepunkt på 184-186°C (dekomponering).

IR (KBr) cm-<1> 3400, 1635, 1610, 1505, 1240, 1070;

<1>H NMR (DMSO-d<6>) S 1,50 (s, 6H), 3,40-3,72 (m, 6H), 4,51 (d, J=4,l Hz, 1H), 4,66 (t, J=5,l Hz, 1H), 4,88 (d, =3,5 Hz, 1H), 5,00 (d, J=7,7 Hz, 1H), 5,18 (d, J=5,0 Hz, 1H), 6,60 (d av d, Ji=9,8 Hz og J2=2,0 Hz, 1H), 6,79 (d, J=2,0 Hz, 1H), 7,06 ((d av d, Jj-8,7 Hz og J2=2,6 Hz, 1H), 7,31 (d, J=2,6 Hz, 1H), 7,42 (d, J=9,8 Hz.lH), 7,59 (d, J=8,7 Hz, 1H);

<13>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 186,45, 159,60, 150,34, 147,52, 141,48, 139,51, 136,68, 133,00, 130,99, 127,26, 115,43, 114,10, 100,40, 75,79, 73,40, 70,22,.68,25,60 ,48 , 37,15, 32,28, 31,89;

Analyse

EKSEMPEL 4

Syntese av 7-g-D-glukopyranosyloksy-9.9-dlmetyl--9H-aki iln-2-on (34) ved anvendelse av 7-(tetra-0-acetyl-P-D-£ uko-pyranosyloksy)-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (33)-m* :lom-produkt.

(a) Syntese av 7-(tetra-O-acetyl-p-D-glukopyranosyloksy ; 9,9t dimetyl-9H-akridin-2-on (33)

En blanding av dimetylkromogenet (20) fremstilt i alge eksempel 2 (0,2393 g, 1,0 mmol), acetobromglukose ( Lgma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (0,8224 g, 2,0 mrnc;) og Ag20 (0,51 g, 2,2 mmol) ble omrørt i vannfri kinolin (7,5 ml) i 17 timer ved romtemperatur i en flaske med kork beskyttet mot lys. Reaksjonsblandingen ble fortynnet med etylacetat (100 ml), filtrert gjennom "Celite" og ekstrahert to ganger med vandig 1,25M HC1 (hver gang 50 ml). De kombinerte vandige ekstraktene ble vasket ei; gang med etylacetat (10 ml), deretter ble de kombi, erte etylacetatlagene vasket en gang med saltvannsopplc ning (20 ml), en gang med 5% vandig NaHCHOs (50 ml) og er. gang med saltvannsoppløsning (20 ml). Etylacetatoppløsningen ble deretter tørket over Na2S04, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum. Råproduktet ble kromatografert på silikagel (75 g) ved anvendelse av aceton/CHCls (1:9) oppløsningsmiddel; det klart gule hovedproduktbåndet ble samlet og inndampet til tørrhet i vakuum slik at det ble oppnådd et oransje skum. Skummet ble krystallisert fra etylacetat/heksan (1:1) slik at det ble oppnådd 7-(tetra-0-acetyl -e-D-glukopyranosyloksy )-9 ,9-dimetyl-9H-akr i din-2-on (33) (0,498 g, 87*) i form av gyldengule små n.iler. En del av ble rekrystallisert som angitt ovenfor slik at det ble oppnådd en analytisk prøve av (33) med et smeltepunkt 142 ,0-143,5°C.

IR (KBr) cnT<1> 1980, 1754, 1637, 1617, 1514, 1368, 1132, 1074, 1038;

<1->H MR (DMSO-d<6>) S 1,52 (s, 6H), 1,91 (s, 3H), 1,9' (s, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 3,98-4,19 (m. 2H), 4,32-4,38 (m, 1H), 5,03-5,13 (m, 2H), 5,42 (t, =9,6 Hz, 1H), 5,83 (d, J=8,0 Hz, 1H), 6,62 (d av d, =9,8 Hz og J2=2,l Hz, 1H), 6,81 (d, J=2,l Hz, 1H), 7, 4 (d av d, Ji=8,7 Hz og J2=2,7 Hz, 1H), 7,27 (d, J=2, Hz, 1H), 7,43 (d, J=9,8 Hz, 1H), 7,63 (d, J=8,7 Hz, 1

<13>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 186,46, 170,00, 169,62, 3 ,33, 169,12, 158,08, 150,99, 147,31, 141,44, 139,67, 1.. ,32, 133,04,131,26, 127,47, 115,44, 113,84, 96,15, 72,03, 71,13,70,58, 68,96, 61,92, 37,13, 32,27, 31,79, 20,52, 20,40, 20,30 (en sammenfallende topp);

Analyse

(b) Syntese av 7-p-D-glukopyranosyloksy-9,9-dimet\ i-9H-akridin-2-on (34)

En oppløsning av 7-( tetra-O-acetyl-p-D-glukopyrai,-syl-oksy )-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (33) fra trinn (a) av foreliggende eksempel (0,47 g, 0,82 mmol) i metan' 1 av HPLC-kvalitet (30 ml) ble avkjølt i et isbad, ben; :dlet med natriummetoksyd (20 mg) og fikk oppvarmen til romtemperatur. Hydrolysereaksjonen ble fulgt ved hjelp av tynnsjiktskromatografi (silikagel; metanol/CHCl3 (15:85)) og var fullført i løpet av 1,5 timer. Reaksjoner; ble stoppet ved tilsats av eddiksyre (ca. 20 pl) og Inndampet til tørrhet i vakuum slik at det ble oppnådd en rå form av glukosidet (34) som et oransje skum. Den råe formen av glukosidet (34) ble kromatografert på silikagel (75 g) ved anvendelse av metanol/CHCl3 (15:85) oppløsningsmiddel og det gule hovedproduktbåndet ble samlet og frigjort for oppløsningsmiddel i vakuum slik at det ble oppnådd et oransje skum som ble krystallisert fra et minst mulig volum varm etanol slik at man fikk glukosidet (34) (0,28 g, 86*) i form av klart oransje små nåler med et sr. Lte-punkt på 232-233°C (dekomponering).

IR (KBr) cn<T>l 3320, 2900, 1627, 1604, 1500, 1230, U.3;

1-H NMR (DMSO-d<6>) S 1,52 (s, 6H), 3,12-3,19 (m, 1H), 3,23-3,35 (m, 2H), 3,40-3,49 (m, 2H), 3,67-3,' (m, 1H), 4,59 (t, J=5,2 Hz, 1H), 5,05 (d, J=6,2 Hz, 1H), 5,12 (d, J=4,0 Hz, 1H), 5,35 (d, J=4,4 Hz, 1H), 6,60 (d av d, J1=9,8 Hz og J2=2,l Hz, 1H), 6,80 (d, J=2,0 Hz, 1H), 7,05 (d av d, Ji=8,7 Hz og J2=2,6 Hz, 1H), 7,30 (d, J=2,5 Hz.lH), 7,43 (d, J=9,8 Hz, 1H), 7,59 (d, J=8,7 Hz, 1H);

<13>C NMR (DMSO-d<6>) ppm 186,15, 159,40, 150,28, 14' ,40, 141,26, 139,33, 136,65, 132,80, 130,82, 127,00, 11' ,37, 113,90, 99,90, 77,13, 76,64, 73,16, 69,86, 60,74, : ,00, 31,98, 31,65.

Analyse

EKSEMPEL 5

Syntese av 7-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (36) ved anvendelse av N-tosyl-L-alaninylklorid-meilom-produkt (35)

(a) Syntese av N-tosyl-L-alaninylklorid (35)

Syntesen av N-tosyl-L-alaninylklorid (35) anvendes som utgangsmateriale N-tosyl-L-alanin fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet av Beecham, J. Am. Chem. Soc, bind 79, s. 3257 (1957). L-alanin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) (100 g, 1,11 mol) ble oppløst i vandig 1,0M NaOH (2,25 1), avkjølt til 5°C og omrørt mens en oppløsning av p-toluensulfonylklorid (tosylklorid) (218 g, 1,11 mol) i toluen (450 ml) langsomt ble tilsatt. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 20 timer. Lagene ble separert og det avkjølte vandige laget ble surgjort til pH 1,0 med konsentrert saltsyre. Det vite faste stoffet ble samlet ved filtrering, vasket med vann og tørket slik at man fikk N-tosyl-L-alanin (17-- g, 66*) med et smeltepunkt på 134-135°C.

IR (CHC13) cm-<1> 1726, 1340, 1165, 1095;

XE NMR (DMSO-d<6>) S 1,20 (d, J=7 Hz, 3H); 2,40 (s, 3H), 3,85 (p, J=8Hz, 1H), 6,4 (br. d, 1H), 7,41 (d, [<i B]=8 Hz, 2H) og 7,75 (d, [Jab]=8 Hz, 2H) (senter av møn ter: 7,58), 8,03 (br. d, J=8 Hz, 1H).

N-tosyl-L-alaninylklorid (35) ble deretter fremsti' i ved fremgangsmåtene (i) og (ii) nedenfor, ved anvende e av N-tosyl-L-alanin, som følger: (i) En blanding av N-tosyl-L-alanin (12,4 g, 0,05 mol) og tionylklorid (25 ml) ble oppvarmet i 1,5 limer til 55°C, og deretter inndampet til tørrhet i v kuum fra et bad på 40° C. Den røde faste reste:, ble oppløst i kokende CCI4 (200 ml), avfarge i med aktivert karbon ("Norit 211", American Norit Co., Inc., Jacksonville, FL, USA), filtrert og aviiølt. Det kremfargede faste stoffet ble samlet ved filtrering, vasket med heksan og tørket slik il man fikk N-tosyl-L-alaninylklorid (35) (8,48 g, 65?) med et smeltepunkt på 101-101,5°C.

IR (CHCI3) cm"<1> 3360, 3260, 3025, 1775, 1605, 1350, 1170, 910;

XE NMR (CDCI3) S 1,48 (d, J=7 Hz, 3H), 2,43 (s, 3H), 4,33 (p, J=8 Hz, 1H), 5,93 (br. d, J=8 Hz, 1H), 7,31 (d. [Jab]=8 Hz» 2H) °g 7»76 (d> [Jab]=8 Hz» 2H)' (sentrum av mønster: 7,53).

Analyse

(11) En blanding av N-tosyl-L-alanin (3,1 g, 13 mmc ) og tionylklorid (6 ml) ble oppvarmet i 1,5 time til 50°C, deretter fortynnet med tørr heksan (50 ml). Blandingen ble raskt omrørt, avkjølt og det aste stoffet ble samlet ved filtrering slik at man fikk 3,15 g (93*) N-tosyl-L-alaninylklorid (35) m l et smeltepunkt på 99-100°C. IR-spekteret for ette materialet var identisk med det for det rekryst Lli-serte materialet fremstilt ved fremgangsmåte (;}.

(b) Syntese av 7-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-9,9-dimety -9H-akridin-2-on (36)

En oppløsning av dimetylkromogenet (20) fremstilt i <zlge eksempel 2 (38 mg, 0,16 mmol) i vannfri tetrahydre:uran (3,2 ml) ble omrørt ved romtemperatur og behandlet porsjonsvis, i løpet av 1,5 timer, med N-tosvl-L-alaninylklorid (35) fra trinn (a) av forelig ,ende eksempel (243 mg, 0,93 mmol) og vannfritt pyridin (280 pl) samtidig som det ble opprettholdt en atmosfære av inert gass over reaksjonen. Når tilsatsen var full-stendig, ble reaksjonen omrørt i ytterligere en lime, deretter blandet i etylacetat (50 ml), og deretter ekstrahert to ganger med vandig IN sitronsyre (hver gang 10 ml). De kombinerte vandige ekstraktene ble vask' t en gang med etylacetat (10 ml), og de kombinerte etylacetatlagene ble ekstrahert tre ganger med 5* vandig NaHC03 (10 ml hver gang). De kombinerte NaHC03-ekstraktene ble vasket en gang med etylacetat (10 ml), deretter ble de kombinerte etylacetatlagene vasket en gang med saltvanns-oppløsning (20 ml), tørket over Na2S04, filtrert og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at man fikk en oransje viskøs olje (110 mg). Denne ble kromatografert på silikagel (50 g) ved anvendelse av aceton/CHCl3 (1:9) oppløsningsmiddel. Det gule hovedproduktbåndet (Rf 0,32) ble samlet og inndampet til tørrhet i vakuum, slik at man fikk 7-(N-tosyl-L-alaninyloksy)-9,9-dimety;-9H-akridin-2-on (36) (40 mg, 54*) i form av et gult gi s.

IR (CHC13) cm-<1> 1758, 1639, 1617, 1516, 1343, 1215, 165, 670;

<1>H NMR (CDCI3) S 1,52 (s, 6H), 1,57 (d, J=7,2 Hz, 3H), 2,44 (s, 3H), 4,22-4,32 (m, 1H), 5,25 (br. d, J=8,£ Hz, 1H), 6,65-6,59 (m, 2H), 6,86 (d av d, «^=8,6 V- : og J2=2,5 Hz, 1H), 7,07 (d, J=2,5 Hz, 1H), 7,40 (d, 10,2 Hz, 1H), 7,33 (d, [JAB]=8,1 Hz, 2H) og 7,f; (d, [J^g]=8,1 Hz, 2H) (sentrum av mønster: 7,57), 1, : ' (d, J=8,6 Hz, 1H);

<13>C NMR (CDCI3) ppm 186,91, 170,58, 153,01, li- ,66, 146,98, 143,87, 141,60, 140,16, 138,76, 137,13, lo ,89, 132,04, 129,81, 127,97, 127,35, 120,62, 118,38, P ,76, 37,26, 32,14, 21,53, 19,58 (3 sammenfallende bånd).

EKSEMPEL 6

Syntese av dinatrium-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on-7-fosfat

(37)

En oppløsning av dimetylkromogenet (20) fremstilt ifølge eksempel 2 (0,2393 g, 1,0 mmol) i vannfri pyridin (3 ml) ble holdt under en atmosfære av inert gass, avkjølt til (TC og deretter behandlet i en porsjon med POCI3 (0,28 ml, 3 mmol) og ble omrørt ved 0°C i en time. Reaksjonsblandingen ble blandet i H20 (100 ml) av romtemperatur og pH av den resulterende oppløsningen ble regulert til 7,0 ved forsiktig tllsats av vandig 10M NaOH. Oppløsningen ble konsentrt rt i vakuum til få ml og deretter kromatografert på silikagel (100 g) ved anvendelse av etanol/vandig 1,0M trietylammonium-bikarbonat (7:3) oppløsningsmiddel. Det gule hovedproiukt-båndet (Rf i dette system er ca. 0,45) ble samlet og inndampet til tørrhet i vakuum, deretter ble resten tre ganger oppløst i metanol (5 ml) og inndampet til tørrhet i vrkuum for å fjerne spor av trletylammoniumbikarbonat. Rest' : ble opptatt i H2O (2-3 ml), ført gjennom en ionevekslerha piks ("Amberlite IRC-50", Na-form, Rohm & Haas Co., Philade"! ala, PA, USA) kolonne og eluatet ble inndampet til tørr; t i vakuum. Resten ble triturert med metanol, derette ble trituratet filtrert gjennom "Celite" og inndampet til 1 rhet i vakuum slik at man fikk en rå form av dinatrium-akridinon-fosfatet (37). Råproduktet (37) ble opptatt i en minst mulig mengde varm H2O (1-2 ml), fortynnet med et tredobbet volum etanol og skrapet for å indusere krystallisasjon slik at man etter to innhøstinger fikk 0,0915 g (25*) av (37). En rekrystallisasjon fra ^O/etanol (1:3) ga den analytiske prøven av dinatrium-akridinon-fosfatet (37) i form av fine brunoransje nåler som dekomponerte ved oppvarming til over 100°C.

IR (KBr) cm-<1> 3430, 1635, 1610, 1505, 1246, 1124, 988, 953, 879, 711, 571;

<!>h NMR (D20) S 1,57 (s, 6H), 6,72 (d av d, J;i=9,8 Hz og J2=2,l Hz, 1H), 6,86 (d, J=2,2 Hz, 1H), 7,28 (br. d av d, J1=8,3 Hz og J2=2,0 Hz, 1H), 7,50 (d, J=9,8 Hz, 1H), 7,53 (br. d, J=2,4 Hz, 1H), 7,63 (d, J=8,7 Hz, 1H);

<13>C NMR (D20) ppm 192,16, 160,73, 153,18, 152,94, 144,60, 143,40, 139,05, 135,47, 133,47, 129,66, 122,43, 120,73, 40,46, 34,09 (1 sammenfallende bånd).

EKSEMPEL 7

Analytisk forsøksinnretning for deteksjonen av p-D-galaktosidase.

Et 5,1 cm bredt x 5,1 cm langt stykke av "Whatman 54"-filterpapir (Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA) ble neddykket i en vandig oppløsning innbefattende 0,3M bicinbuffer (pH 7,9) og 4,0 mM MgCl2 og lufttørket over natten ved romtemperatur. Filterpapiret ble deretter neddykket i en metanoloppløsning inneholdende 15 mM av substratproduktet (32) fra eksempel 3 og lufttørket i en time ved romtemperatur slik at man fikk et filterpapir som var gult av farge.

Et 0,5 cm bredt x 1,0 cm langt stykke av det ovenfor omtalte impregnerte gule filterpapiret ble montert på og langs kanten av en overflate av en 0,25 cm x 8,125 cm polystyrenbærer ("Tricite", Dow Chemical Co., Midland, MI, USA) som på forhånd var laminert med et 2 mm bånd av "Double Stlck" dobbeltklebende tape (3M Company, St. Paul, MN, USA) og anvendt som en analytisk forsøksinnretning for deteksjon av p<->D-galaktosidase fra en flytende prøve.

EKSEMPEL 8

Bestemmelse av p-D-galaktosidase fra en flytende prøve.

Ti analytiske forsøksinnretninger ble fremstilt ifølge eksempel 4 og anvendt for å bestemme doseresponsen av substratproduktforbindelsen (32) ifølge foreliggende oppfinnelse for e-D-galaktosidase.

Ti vandige prøveoppløsninger inneholdende e-D-galaktosidase-konsentrasjoner på 0,02 ng/ml, 0,04 ng/ml, 0,06 ng/ml, 0,08 ng/ml, 0,12 ng/ml, 0,14 ng/ml, 0,16 ng/ml, 0,18 ng/ml og 0,20 ng/ml ble fremstilt og en analytisk forsøksinnretning ble dyppet i hver. De respektive analytiske forsøksinnretningene ble deretter montert i et "SERALYZER"-reflektansfotometer (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) og reflektansen av lys fra forsøksinnretningen inneholdende det frigjorte kromogenet (20) som beskrevet i eksempel 1 ble målt ved 630 nm etter 50-70 sekunder, hvorved reflektansverdiene ble avsatt som funksjon av den respektive prøveoppløsningskonsentrasjonen og avslørte en lineær doserespons som eksemplifisert i figur 4.

EKSEMPEL 9

Syntese av 7-p<->maltoheptaosyloksy-9,9-dimetyl-akridin-2-on (43)/(DMA-G7).

En reaksjonsblanding av 12,5 mM 7-p<->D-glukopyranosyloksy-9,9-dimetyl-9H-akridin-2-on (34), i det følgende betegnet DMA-G1, fra trinn (b) av eksempel 4, 62,0 mM a-cyklodekstrin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) og 56 enheter/ml cyklodekstrin glukanotransferase (EC 2.4.1.19, Ammano Pharmaceutical Co., Japan) i piperazin-N,N'-bis-(2-etan-sulfonsyre)buffer (PIPES, pH 6,0) i 4 timer ved 50°C. Blandingen ble deretter oppvarmet til 100°C (kokende vann) 3 10 minutter for å inaktivere cyklodekstringlukotransferasen, og deretter inndampet til tørrhet under vakuum og gjenoppløst i 0,5 ml vann slik at man fikk en blanding av glukosidet (DMA-G1), usubstituerte maltooligosakkarider (f.eks. glukose, maltose, maltotriose, maltotetrose, maltopentose, maltoheksose, maltoheptose og a-cyklodekstrin), og den ønskede 7-p-maltoheptaosyloksy-9,9-dimetyl-akridin-2-on (DMA-G7) forbindelsen og kromogene maltooligosakkarider av kortere kjedelengde (7-p<->malto, -maltotrio, -maltotetra, -maltopenta og -maltoheksaosyloksy-9,9-dimetyl-akridin-2-oner, i det følgende betegnet som henholdsvis DMA-G2 (38), DMA-G3 (39), DMA-G4 (40), DMA-G5 (41) og DMA-G6 (42) av formelen angitt i tabell 1.

De ønskede DMA-G7-spesiene ble separert fra DMA-G1- til DMA-G6-spesies ved høytrykksvæskekromatografi (HPLC) ved anvendelse av en preparativ reversert fase C-18-kolonne (Regis Chemical Co., Morton Grove, IL, USA). Systemet besto av to "Constmetric-III"-utmålingspumper, "Chromatography Control Module", og "Spectromonitor II"-detektor (alle fra Laboratory Data Control, Riviera Beach, FL, USA). Den gjenoppløste substratreaksjonsblandingen ble injisert i EPLC-systemet og eluert i 90 minutter ved en strømningshastighet på 6,0 ml/minutt. En lineær gradient fra 0* til 25* CH3CN/H2O ble anvendt for eluering av DMA-G1 til DMA-G7 og usubstituerte maltooligosakkaridspesies fra kolonnen. De usubstituerte maltooligosakkaridene ble eluert og fjernet ved det tomme volumet, og kolonneeluanten ble overvåket ved 520 nm for å detektere fraksjonene inneholdende spesiene DMA-G1 til DMA-G7. Fraksjonene (9,0 ml) inneholdende DMA-G7, DMA-G6, DMA-G5, DMA-G4, DMA-G3, DMA-G2 og DMA-Gl ble samlet ved retensjons-tider på henholdsvis 42,5,44,6, 48,5, 53,1, 58,5 64,6 og 70,8 minutter, med en fraksjonskollektor (LKB, Bromma, Sverige) hvorved ca. 50* av DMA-G1 fra reaksjonsblandingen ble omvandlet til den ønskede DMA-G7. Fraksjonen inneholdende DMA-G7 samlet i 42,5 minutter ble gjenanalysert ved hjelp av HPLC for å fastslå dens renhet.

EKSEMPEL 10

Flytende analytisk forsøkssystem for deteksjon av a-amylase.

En flytende a-amylase-deteksjonsreagens ble fremstilt ved å kombinere 1,8 mM DMA-G7 (43) fremstilt ifølge eksempel 9, 38 enheter a-glukosidase og 20 enheter p<->glukosidase i 1,0 ml bufret oppløsning innbefattende 50 mM PIPES, 50 mM NaCl og 5,0 mM kalsiumklorid (pH 7,0). Amylase-kontrollserum (0,025 ml) inneholdende henholdsvis 37 IU/1, 175 IU/1 og 313 U/l, av a-amylase hie tilsatt til deteksjonsreagensen, uavh; ngig av hverandre, og inkubert ved 37'C. Den enzymatiske . irk-ningen av a-amylase på substratforbindelsen i hve: av blandingene frigjorde kromogene maltooligosakkaridfo oin-delser derav av kortere kjedelengde (f.eks. DMA-G2 til DMA-G4) som i sin tur ble enzymatisk påvirket av a-glukosida^e og P-glukosidase for å frigjøre den optisk aktive forme ■ av dimetylakridinonkromogenet (20). Omfanget av fargeem ring produsert av det frigjorte kromogenet i hver av blandingene ble målt ved 634 nm på et "Cary 219"-spektrofotometer (V:rian Associates, Inc., Sonnyvale, CA, USA) fra mellom 1 >g 9 minutter etter at hver av serumprøvene var tilsatt til deteksjonsreagensen (tabell 2). a-amylase-reaktiviteteie i prøvene ble beregnet ved å ta et gjennomsnitt av ; på hverandre følgende avlesninger mellom 3 og 6 minutter g en lineær doserespons for a-amylasekonsentrasjonen ble avledet fra dette (tabell 3).

EKSEMPEL 11

Analytisk forsøksinnretning for deteksjonen av a-amylase.

Et stykke "Whatman 54"-filterpapir (Whatman, Inc., Clifton, NJ, USA) ble neddykket i en oppløsning innbefattenik den flytende a-amylase-deteksjonsreagensen fremstilt :;ølge eksempel 10, 0,1* "Triton X-100" (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO, USA) og 0,5* karboksycellulose og tørket.

Analytiske forsøksinnretninger ble fremstilt ved å monte;e et 0,5 cm bredt x 1,0 cm langt stykke av det tidligere nevnte impregnerte filterpapiret på, og langs kanten av, en - overflate av 0,5 cm x 8,125 cm polystyrenbaerere ("Tricite",Dow Chemical Co., Midland, MI, USA) på forhånd laminert med et 2 mm bånd av "Double Stick" dobbelt-klebende tape (3M Company, St. Paul, MN, USA).

Tre 30 pl porsjoner av ufortynnet serum inneholdende henholdsvis 39 IU/1, 78 IU/1, 117 IU/1, 157 IU/1, 235 IU/1 og 313 IU/1 av a-amylase ble uavhengig av hverandre påført på en forsøksinnretning og omfanget av fargeendringen produsert av det frigjorte kromogenet på hver innretning ble målt ved 630 nm på et"Seralyzer"-reflektansfotometer (Miles Inc., Elkhart, IN, USA) fra mellom 0 sekunder og 240 sekunder etter at serumprøven var tilsatt på hver forsøksinnretning. For å linearisere reflektansdataene generert av omfanget av fargeendring med hensyn på konsentrasjonen av a-amylase ble forsøksinnretningsreaktivitetene bestemt ved å foreta en lineær regresjon av L(R) hvor L(R) = a/(R+b) og hvor R = reflektans, a = 0,57986 og b = 0,16498, mellom 180 og 200 sekunder, og en lineær doserespons for a-amylase ble avledet fra dette (tabell 4).

Claims (7)

1. Kromogen enzymsubstratforbindelse, karakterisert ved formelen: hvor Y er en rest av en forbindelse Y-OH valgt fra gruppen bestående av a-D-galaktose, P-D-galaktose, a-D-glukose, (3-D-glukose, oc-D-mannose, N-acetylglykosamin og N-acetylneursm.in-syre eller en oligosakkaridkjede på fra mellom 2 ti(. 20 monosakkaridenheter, eller tosylbeskyttet alanin éller fosforsyre, og R og R', som kan være like eller forskjellige, er alkyl Inneholdende fra 1 til 6 karbonatomer, fenyl, naftyl eller danner sammen en cykloheksa-2,5-dien-4-on eller 4-hydroksycykloheksylrest.

2. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at Y er en fosfatgruppe.

3. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R og R', som kan være like eller forskjellige, er alkyl inneholdende fra 1 til 6 karbonatomer eller fenyl eller danner sammen en cykloheksa-2,5-dien-4-on-rest eller en 4-hydroksycykloheksylrest.

4. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R og R', som kan være like eller forskjellige, er alkyl inneholdende fra 1 til 6 karbonatomer eller fenyl.

5. Forbindelse ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at R og R' begge er metyl.

6. Anvendelse av en kromogen enzymsubstratforbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5 for å bestemme et spesielt enzym i en flytende prøve.

7. Forsøksinnretning for bestemmelse av et bestemt enzym i en flytende prøve, karakterisert ved at den omfatter en bærermatrise inkorporert med en kromogen akridinonenzymsubstratforbindelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5.