NO171886B - Fremgangsmaate for fremstilling av et farmasoeytisk preparat i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestaaende av fosfolipidkomponenter - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av farmasøy-tiske preparater inneholdende acylerte fosfatidyletanolaminderivater, fosfatidyletanolamin og forbindelser som har farmakologiske egenskaper.

De farmasøytiske preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse administreres i form av liposomer.

Farmasøytiske administreringssystemer basert på liposomer er beskrevet i den generelle oversikten utgitt av G. Gregoria-dis, "Liposome Technology", bind II, "Incorporation of Drugs, Proteins and Genetic Material"; CRC Press 1984. Slike systemer har den fordelen at biologisk aktivt materiale kan innføres i vev ved fagocytose, spesielt i vev i reticulo-endothelsystemet. F.eks. er en transportmekanisme kjent hvorved antibiotika innføres i infisert vev ved fagocytose slik at det forårsakes forbedret fjernelse eller ødeleggelse av den infiserende mikroorganismen. Endocytose er også en nyttig mekanisme ved bekjempelsen av betennelsessentre. Antireumatiske farmasøytiske midler innkapslet i liposomer innføres fortrinnsvis i infisert vev i motsetning til "friskt" vev. Videre kan cytostatiske midler, vanlig kjent som "anti-kreftmidler", når de innkapsles i liposomer, innføres i spesifikke organer i reticulo-endotelsystemet (lever, milt eller marg). På grunn av filtrering i kapil-larrørene i lungen og senere transport ved migrerende monocytter, kan biologisk aktivt materiale f.eks. forbindelser som har immunmodulerende egenskaper, konsentreres i alveolarmakrofager. Dette resulterer i en forbedret virkning på metastatiske lungetumorer og i en samtidig reduksjon av toksisitet.

En representativ utgave av tidligere kjent teknikk utgjøres av svensk utlegningsskrift nr. 459.228 hvor det beskrives liposomsammensetninger inneholdende lysofosfolipider og andre fosfolipider. Disse sammensetningene er kjente for deres carsinostatiske egenskaper.

Det er nå overraskende funnet at opptaket av liposomer og deres endocytose ved makrofager, spesielt alveolarmakrofager, forøkes når acylerte fosfatidyletanolaminderivater innbe-fattes i skallstrukturen for liposomene.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av

a) et syntetisk fosfolipid med formelen

der m betyr to eller tre, R^ og R2 uavhengig av hverandre

betyr alkyl, alkenyl eller acyl, hver med 10 til 20 karbonatomer, X betyr en direktebinding, C^-C^alkylen, C2-C4-alkenylen, eller C^-C^alkylen eller C2-C4~alkenylen substituert med hydroksy, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav,

b) et syntetisk fosfolipid med formelen

der R3 og R4 betyr acylgruppen av en mettet eller en umettet karboksylsyre med 10 til 20 karbonatomer og 1-2 dobbeltbindinger, 1 et forhold fosfolipidkomponent (I):fosfolipidkomponent (II) fra ca. 10:90 opp til 50:50, c) en lipofil forbindelse eller en blanding av forbindelser med farmakologisk aktivitet, og, eventuelt, d) et lipid fra naturlige kilder valgt blant fosfatidylcolin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol, fosfatidylglyserol,

kardiolipin og kolesterol, og derivater derav, og en farmasøytisk akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,0-8,0 og, eventuelt, farmasøytisk akseptable additiver.

I forbindelse med beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse, har de generelle betegnelsene som er anvendt ovenfor og nedenfor fortrinnsvis følgende betydninger: Betegnelsen "lavere" benyttet ved definisjoner av organiske rester, f.eks. lavere alkyl, lavere alkylen, lavere alkoksy, lavere alkanoyl, osv., betyr at slike organiske rester, med mindre annet uttrykkelig er angitt, inneholder opptil 7, fortrinnsvis opp til 4, karbonatomer.

Nomenklaturen for fosfolipidene av formlene I og II er i overensstemmelse med anbefalingene av IUPÅC- og ITJB-kommi-sjonen vedrørerende biokjemisk nomenklatur (CBN) ifølge Eur. J. of Biochem. 79, 11-21 (1977) "Nomenclature of Lipids"

(sn-nomenklatur, stereospesifikk nummerering).

Med mindre annet er angitt er det benyttet generiske navn foreslått av Verdens Helseorganisasjon (WHO) (Recommended International Non-properietary Names) for å definere de aktive bestanddelene, disse navnene er tatt fra standard læreboken "Pharmazeutische Chemie" (E. Schroder, C. Rufer og r. Schmiechen, Thieme Verlag Stuttgart, 1982) og Merck Index (tiende utgave).

I det syntetiske fosfolipidet av formel I (komponent a) er m fortrinnsvis to.

Alkyl Ri og/eller R2 er fortrinnsvis rettkjedet med et like antall fra 10 til 20 karbonatomer, f.eks. n-decyl, n-dodecyl, n-tetradecyl, n-heksadecyl, n-oktadecyl eller n-icosyl.

Alkenyl R^ og/eller R2 er fortrinnsvis rettkjedet med et like antall fra 10 til 20 karbonatomer og en dobbeltbinding, f.eks. 9-cis-dodecenyl, 9-cis-tetradecenyl, 9-cis-heksa-decenyl, 6-cis-okta-decenyl, 6-trans-oktadecenyl, 9-trans-oktadecenyl eller 9-cis-icosenyl.

Acyl Ri og/eller R2 er fortrinnsvis rettkjedet med et like antall fra 10 til 20 karbonatomer, f.eks. Cio-C2o~alltanoyl eller Cio-C20~al^en°yl•

Alkanoyl R^ og/eller R2 er fortrinnsvis n-dekanoyl, n-dodeka-noyl, n-tetradekanoyl, n-heksadekanoyl, n-oktadekanoyl og n-icosanoyl.

Alkenoyl R^ og/eller R2 er fortrinnsvis 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 6-trans-oktadecenoyl, 9-cis-oktadecenoyl, 9-trans-oktadecenoyl, 11-cis-oktadecenoyl og 9-cis-icosenoyl.

X definert som C^-C^alkylen er rettkjedet eller forgrenet C1-C4-alkylen, f.eks. metylen, 1,1-etylen, 1,1-, 1,2- eller 1,3-propylen, eller fortrinnsvis 1,2-etylen.

X definert som C2~C4-alkenylen er fortrinnsvis rettkjedet alkenylen, f.eks. vinylen, propenylen, eller 1,2- eller 2,3-butenylen.

X definert som Ci~C4-alkylen eller C2-C4~alkenylen substituert med hydroksy er fortrinnsvis rettkjedet C1-C4-alkylen substituert med 1 eller, avhengig av antallet karbonatomer, opp til 4 hydroksygrupper, f.eks. 1-hydroksy-1.2- etylen, 1,2-dihydroksy-l,2-etylen, 1- eller 2-hydroksy-1.3- propylen eller 1,2-dihydroksy-l,3-propylen.

Et farmasøytisk akseptabelt salt av fosfolipidet (I) dannes fortrinnsvis ved reaksjon med en eller to ekvivalenter av fortynnet vandig alkalimetallhydroksyd, f.eks. natrium- eller kaliumhydroksyd og er fortrinnsvis mono- eller dinatrium-saltet.

Andre farmasøytisk akseptable salter dannes ved reaksjon med aminer så som trimetyl-, etyl-, dietyl-, eller trietylamin, piperidin, piperazin, 2-hydroksyetylpiperazin, cykloheksyl-amin, pyrrolidin, eller kolin.

I det syntetiske fosfolipidet (I) er R^ og R2 fortrinnsvis rettkjedet alkenoyl med et like antall fra 10 til 20 karbonatomer, f.eks. 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans-, eller 11-cis-oktadecenoyl, eller 9-cis-icosenoyl, X er C2~C4-alkylen, f.eks. 1,2-etylen eller 1,3-propylen, eller C2~C4-alkenylen, f.eks. vinylen.

Mest foretrukket er natrium eller dinatriumsaltene av N-[1,2-di-(9-ci s-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol] -N-hydroksysuksinylamin og N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin.

I fosfolipidet av formel II (komponent b)) er acylgruppene R3 og R4 fortrinnsvis rettkjedede med et like antall fra 10 til 20 karbonatomer, f.eks. Cio-<C>20_alkanoyl eller Cio~<c>20~ alkenoyl, spesielt 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans- eller 11-cis-oktadecenoyl.

Mest foretrukket er 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin.

Forbindelser eller blandinger av forbindelser som har farmakologisk aktivitet (komponent c)) er fortrinnsvis legemidler valgt fra gruppen bestående av antiflogistiske og/eller ant i inf1ammatori ske midler, antibiotika, mark-drepende midler, antimykotika, antineoplastiske midler, og forbindelser som har immunmodulerende virkning.

Antiflogistiske og/eller ant i inf1ammator iske midler er fortrinnsvis glukokortikoider, f.eks. kortison, hydrokort-ison, prednison, prednisolon, fluocortolon, triamkinolon, metylprednisolon, prednyliden, parametason, deksametason, betametason, beklometason, fluprednyliden, desoksimetason, fluocinolon, flumetason, diflukortolon, klokortolon, klobetazol eller fluorkortinbutylester, salter av substituerte fenyleddiksyrer eller 2-fenylpropionsyrer, f.eks. alklofenac, ibufenac, ibuprofen, clindanac, fenclorac, ketoprofen, fenoprofen, indoprofen, fenclofenac, diclofenac, flurbiprofen, pirprofen, naproksen, benoksaprofen, karprofen eller cicloprofen; analgetisk aktive antranilsyrederivater, f.eks. av formelen:

hvori R^, R2 og R3, uavhengig av hverandre, står for hydrogen, metyl, klor eller trifluormetyl, f.eks. mefenam-syre, flumenamsyre, tolfenamsyre eller meklofenamsyre; analgetisk aktive anilin-substituerte nikotinsyrederivater, f.eks. miflumsyre, kloniksin eller fluniksin; analgetisk aktive heteroaryleddiksyrer eller 2-heteroarylpropionsyrer som har en 2-indol-3-yl eller pyrrol-2-ylrest, f.eks.

indometacin, oksmetacin, intrazol, acemetazin, cinmetacin, zomepirac, tolmetin, colpirac eller tlaprofensyre, analgetisk aktive indenyleddiksyrer, f.eks. sulindac, analgetisk aktive heteroaryloksyeddiksyrer, f.eks. benzadac.

Antibiotika er fortrinnsvis tetracyklinderivater av formelen:

hvori R^ står for hydrogen eller pyrrolidin-l-ylmetyl, R2 står for hydrogen eller hydroksy, R3 står for hydrogen, hydroksy eller metyl, R4 står for hydrogen eller metyl, og R5 står for hydrogen, klor eller dimetylamino, f.eks. klortetra-cyklin, oksytetracyklin, tetracyklin, demetylklortetracyklin, metacyklin, doksycyklin, minocyklin eller rolitetracyklin, aminoglykosider, f.eks. kanamycin, amikacin, gentamicin , cla' c2 eller C2D, sisomicin, netilmicin, spektinomycin, streptomycin, tobramycin, neomycin B, dibekacin, eller kanendomycin, makrolider, f.eks. maridomycin eller erythro-mycin, linkomyciner, f.eks. klindamycin eller linkomycin, penicillansyre og cefalosporansyrederivater som har antibio-tisk aktivitet med 6p<-> eller 7p<->acylaminogrupper, som er tilstede i fermentative, semi-syntetiske eller syntetisk oppnåelige 6p<->acylaminopenicillansyre eller 7p-acylamino-cefalosporansyrederivater eller i 7g<->acylaminocefalosporan-syrederivater modifisert i 3-stillingen, f.eks. penicillan-syrederivater er blitt kjent under navnet penicillin G eller V, feneticillin, propicillin, nafcillin, oksacillin, kloksacillin, dikloksacillin, flukloksacillin, cyklacillin, epicillin, mecillinam, meticillin, azlocillin, sulbenicillin,

tikarcillin, mezlocillin, piperacillin, karindacillin, azidocillin eller clklazillln, eller cefalosporinderivater som er blitt kjente under navnene cefaklor, cefuroksim, cefazlur, cefacetril, cefazolin, cefaleksin, cefadroksil, cefaloglycin, cefoksitin, cefaloridin, cefsulodin, cefotiam, ceftazidin, cefonicid, cefotaksim, cefmenoksim, ceftizoksim, cefalotinn, cefradin, cefamandol, cefanon, cefapirin, cefroksadin, cefatrizin, cefazedon, ceftrikson eller ceforanid, andre p-laktamantistoffer av klavam-; penem- eller karbapenemtypen, f.eks. moksalaktam, klavulansyre, nocar-dicin, sulbactam, aztreonam eller tienamycin, eller andre antibiotika av biomycin-, novobiocin-, klor- eller tiamfen-ikol-, rifampicin-, fosfomycin-, kolisin- eller vankomycin-typen.

Anti-markmidler er fortrinnsvis antimonforbindelser, f.eks. kaliumantimonyltartrat, stibofen, natriumstibokaptat eller natriumstiboglukonat.

Antimyotika er f.eks. tiokarbonsyrederivater, f.eks. dibenztion, tolnaftat, eller tolcidat, imidazolderivater, f.eks. klotrimazol, miconazol, ekonazol, iconazol, eller ketokonazol, eller polyenderivater så som nystatin, natamycin eller amfotericin B.

Antineoplastiske midler er fortrinnsvis alkyleringsmidler inneholdende bis-(2-kloretyl)-amingruppen så som klormetin, klorambucil, melfalan, uramustin, mannomustin, ekstramustin-fosfat, mekloretaminoksyd, cyklofosfamid, ifosfamid, eller trifosfamid, alkyleringsmidler inneholdende en substituert aziridingruppe, f.eks. tretamin, tiotepa, triazikon eller mitomycin, alkyleringsmidler av metansulfonestertypen så som busulfan, alkylerende N-alkyl-N-nitrosoureaderivater, f.eks. karmustin, lomustin, semustin, eller streptozotocin, alkyleringsmidler av mitobronitol-, dakarbazin-, eller prokarbazintypen, kompleksdannede midler så som cis-platin, antimetabolitter av folinsyretypen, f.eks. metotreksat, purinderivater så som merkaptopurin, tioguanin, azatioprin, tiamiprin, vidarabin, eller puromycin, pyrimidinderivater, f.eks. fluoruracil, floksuridin, tegafur, cytarabin, idoksuridin, flucytosin, antibiotika så som daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, mitramycin, bleomycin Å2 eller B2 eller etoposid, eller vinkaalkaloider, eventuelt sammen med klormetamin, prednisolon, prednison eller prokarbazin.

Forbindelser eller blandinger av forbindelser som har immunmodulerende virkning er f.eks. muramylpeptider av formelen:

hvori H1 står for L-Ala-D-isoGln-L-Ala-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, L-Ala-D-Glu-(Cg flTp-ma-L-Ala-2 - (1 ,2-di palm i toyl-sn-glycero-3-hydroksyf osforyl-oksy )-etylamid, L-Ala-D-isoGln-OH, L-Ala-D-Gln-NB^-oc-n-butylester, L-Ala-D-isoGln-L-(stearoyl)-Lys, L-Val-D-Gln-NB^-oc-n-metylester, L-Ala-D-isoGln-L-Ala-1,2-dipalmitoyl-sn-glycerinester eller L-Ala-D-isoGln-L-Ala-kolesterinester-gruppen, R2 står for hydrogen, metyl eller n-propyl, R3 står for hydrogen, n-stearoyl, 10-(2,3-dimetoksy-l,4-diokso-5-metyl)-2,5-cykloheksadienoyl, 2-behenoyloksy-2-metyl-propanoyl eller n-oktanoyl, og R4 står for hydrogen eller n-oktanoyl, så vel som 2-palmitoyltioderivatet derav, lipo-peptider så som n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(m-DAP-Gly)-NH2, n-lauroyl-L-Ala-D-i soGln-(L-DAP-Gly)-NH2, n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(L-Lys-D-Ala)-NH2, n-oktanoyl-L-Ala-D-isoGln-(L-Lys-D-Ala)-NH2 eller palmitoyl-Cys-((2R)-2,3-dilauroyloksypropyl)-Ala-D-Glu-(Gly-taurin-Na)-NH2, eller er lymfokiner som

produseres av lymfocytter, monocytter eller makrofager etter stimulering ved antigener eller mitogener.

Lymfokiner er spesielt gamma-interferon, spesielt naturlig eller rekombinanthumant-gamma-interferon, spesielt humant-gamma-interferon som kan oppnås ifølge europeisk patentpublikasjon nr. 63.482, 77.670, 83.777, 88.540, 89.676, 95.350, 99.084, 110.044 og 112.967 og de internasjonale (PCT) publikajsonene (W0) 83/04.053 eller W0 84/02.129.

Foretrukket er humant gamma-interferon av følgende amino-syresekvenser:

ifølge europeisk patentpublikasjon 121.157 og

ifølge GB patentskrift 2.107.718, humant interleukin 2 som kan oppnås f.eks. fra kulturfiltrater av cellekulturer av leukemi eller lymfomaceller etter aktivering eller stimulering med humane T-cellemitogener og ved rensing med reversert fase EPLC, kulturfiltrater som inneholder blandinger av forbindelser kjent som migreringsinhiberingsfaktor (MIF), leukocyttmigreringsinhiberingsfaktor, makrofagaktiverende faktor (MÅF), kolonistimulerende faktor, så vel som interleukin 1 og 2 og gamma-interferon som kan oppnås fra kulturer av humane T-lymfocytter fra milter eller fra perifert blod etter stimulering ved hjelp av antigener eller mitogener, eller f.eks. humant T-celleleukemi-lymfomavirus (HTLV I eller II), fytohemaglutinin, eller konkanavalin, spesielt de kulturfiltratene eller isolatene som inneholder en høy prosentandel av makrofagaktiverende faktor (MAF).

Foretrukket er N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin eller natrium-N-acetyldesmetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin av formel V, eventuelt i kombinasjon med renset, naturlig eller rekombinant humant gamma-interferon.

Lipider (komponent d)) valgt fra gruppen bestående av fosfatidylkolin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol, fosfatidylglyserol og kardiolipin, er syntetiske fosfolipider eller er blandinger av fosfolipider som har forskjellige acylgrupper av forskjellig molekylvekt og struktur, f.eks. soyabønne- eller kyllingegg-fosfatidylkolin eller fos-fatidylkinolin fra bovinhjerne, bovinlever eller svinelever, fosfatilydserin fra bovinhjerne, fosfatidylinositol fra soyabønner eller gjær, fosfatidylglyserol fra eggeplomme, eller kardiolipin fra bovinhjerte.

Derivater av kolesterol er f.eks.- kolesatan, koprostan, ergosterol eller stigmasterol.

De farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse er, når de anvendes i form av liposomer, kjennetegnet ved sin utmerkede fagocytose. For eksempel er fagocytose av multi-lammelære liposomer bestående av en 3:7 molar blanding av natrium-N-[l,2-di-(-9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fos-foetanol]-N-hydrok&ysuksinylamin (I) og dioleoylfosfatidyletanolamin (II) eller natrium-N-[1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin (I) og dioleoylfosfatidyletanolamin (II) ved museperitoneale makrofager høyere enn fagocytose for multilamellære liposomer bestående utelukkende av fosfatidyletanolamin eller av en 3:7 molar blanding av fosfatidylserin og fosfatidylkolin. Dette kan demonstreres in-vitro ved inkubering av museperitoneal-makrofager med multilamellære liposomer inneholdende spor-mengder av <125>j som en Uposom markør. Ved jevne mellomrom vaskes kulturene og mengden av celle-tilknyttet stråling bestemmes. Videre viser liposomer bestående av fosfolipider av formel I og II i et molforhold på 3:7 inneholdende immunmodulatorer så som MDP og gamma-interferon høyere aktivering av makrofager til tumoricidtUstand ved lavere doser enn liposomer bestående av fosfatidylkolin og fosfatidylserin inneholdende den samme mengden av MDP og gamma-interferon. Dette kan også vises in vitro ved å belegge peritoneale musemakrofager i kulturbrønner og aktivere makrofagene med multilamellære liposomer bestående av natrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fos-foetanol]-N-hydroksysuksinylamin (I) og dioleoylfosfatidyletanolamin (II) i et molforhold på 3:7 inneholdende MDP og gamma-interferon og med multilamellære liposomer bestående av fosfatidylkolin og fosfatidylserin i det samme molfor-holdet inneholdende MDP og gamma-interferon. Liposompre-paratene benyttes ved en konsentrasjon på 100 nmol totalt fosfolipid pr. brønn og inneholder 6 enheter rekombinat immungamma interferon og 0,2 g MDP. Etter vasking av brønnene tilsettes IO<4> [<125>I]jododeoksyuridin - merket BL6 melanoma-celler. Cytoksitet bestemmes etter 72 timers kultivering ved å måle radioaktiviteten knyttet til de vedhengende levedyk-tige målcellene etter vasking av kulturene tre ganger med Hank<*>s avbalanserte saltoppløsning. Prosent cytotoksisitet kan beregnes med hensyn på antall tellinger pr. minutt i kontrollkulturer inneholdende uaktiverte makrofager og målceller. ;De farmasøytiske preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er, når de anvendes i form av liposomer, videre kjennetegnet ved utmerkede frigivelsesegenskaper ved lave pH-verdier. Frigivelsesegenskapene for liposomer bestående av dinatrium-N-[l,2-di-( 9-c i s-oktadecenoyl) -sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl )-sn-glycero-3-f osf oetanolamin i et molforhold på 3:7 analyseres ved fluorescensfremgangsmåten for å måle lekkasjen fra liposomer ved lave pH-verdier som beskrevet av Ellens et al., Biochemistry 1984, 23, 1532-1538. For å undersøke pH-avhengigheten av lekkasjen, injiseres liposomer i buffer-oppløsninger varierende fra pH 4,0 til 7,4 og prosentandelen av oppfanget 8-aminonaftalen-1,3,6-trisulfonsyre (ANTS) og p-xylylen-bis-pyridiniumdibromid (DPX) som erstatter de innkapslede farmasøytiske forbindelsene i denne analysen bestemmes. Fullstendig innkapsling av den vann-oppløselige fluoroforen ANTS kompieksbundet med "slukkeren" DPX fjerner det meste av ANTS fluorescens. Lekkasje av ANTS fra liposomene kan følges ved økningen i fluorescens forårsaket av frigivelsen av DPX "slukking". ;Det er nå funnet at det forekommer i det vesentlige ingen lekkasje over pE 6,0. Når pH imidlertid reduseres, foregår en samtidig økning i mengden ANTS/DPX frigitt fra liposomene. Den halve maksimalverdien finner sted ved ca. pH 4,5 og fullstendig frigivelse ved ca. 4,0. ;Det er kjent at patologisk vev har en omgivende pH som er betydelig lavere enn den for normalt vev. For eksempel har primære tumorer, metastaser, betennelser og infeksjoner reduserte lokale pE-omgivelser. Liposomene femstilt ifølge foreliggende oppfinnelse vil derfor avlevere sitt innhold, f.eks. antiinflammatoriske legemidler eller immunmodulatorer spesifikt på betennelsessete, den primære tumoren eller metastasen og frigi disse legemidlene i de sure omgivelsene i dette patologiske vevet. F.eks. frigir liposomer bestående av en 3:7 molar blanding av dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl )-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin (I) og dioleoylfosfatidyletanolamin mer av sitt innhold, f.eks. en effektiv dose av rekombinant humant gamma-interferon, ved lave pH-verdier, f.eks. pH 4, enn ved høyere eller nøytrale pH-verdier. Dette kan vises in vitro i bufferoppløsninger av pH 7,4 og pH 4 ved bestemmelse med jevne mellomrom av stålingen av merket ^<25>I-interferon frigitt fra lipidene. Ved en pH-verdi på ca. 4, frigis f.eks. mer enn 25$ av inneslut-tet gamma-interferon fra liposomer etter 180 minutter. ;De farmasøytiske preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse er derfor, når de anvendes i form av liposomer, utmerkede administreringssystemer for legemiddelavlevering til de lokale områdene med redusert pE av patologisk vev. Derfor er de spesielt nyttige innenfor kreft-kjemoterapi for å overvinne metastatiske tumorceller. ;Vandige liposomdispersjoner hvori fosfolipidene av formlene I og II er det innkapslende materiale og forbindelser eller en blanding av forbindelser som har farmakologisk aktivitet innkapsles, eventuelt etter konsentrering eller isolering av liposomene, f.eks. i (ultra)sentrifugen, er egnede for terapeutiske formål for parenteral (bukkal, lingual, sublingual, i.v., i.c, topisk, s.c, i.m. eller nasal) sluttadministrering. ;For parenteral administrering (topisk) kan den liposom-holdige vandige dispersjonen være blandet med vanlige fortykningsmidler, f.eks. hydroksypropylmetylcellulose, egnede konserveringsmidler, antioksidanter og parfymer, og kan benyttes i form av en lotion eller en gel for påføring på huden eller slimhinnene. ;For parenteral administrering kan den vandige dispersjonen av de anrikede liposomene suspenderes i en egnet bærervæske, f.eks. sterilt, kalsiumfritt, isotonisk natriumklorid eller glukoseoppløsning, eventuelt bufret til pH 7,2-7,4. ;Dosen av den aktive bestanddelen som skal administreres er generelt den høyeste og laveste doseringsmengden som foreskrevet f.eks. i Deutsches Arzneimittelbuch (DAB) [German Pharmacopoieia] for den spesifikke aktive bestanddelen for den spesielle administreringsformen, pasientens alder og helsetilstand. Vandige liposomdispersjoner har imidlertid også den fordelen at den aktive bestanddelen administrert i mindre doser ikke desto mindre kan overføres til reseptorene og gi en terapeutisk virkning, eller på den annen side, at administrering av høye doser muliggjøres uten uønskede bivirkninger. ;Den foretrukne doseringsmengden for de liposom-innkapslede immunomodulatorene av muramylpeptid- eller lipopeptidtypen er ca. 0,001 opp til 10 mg/kg legemesvekt pr. dose. For humant gamma-interferon eller blandinger inneholdende MAF er den foretrukne doseringsmengden ca. 0,01 ml liposomdispersjon pr. kilo legemsvekt, inneholdende 100-1000 enheter gamma-interferon eller MAF. Dersom muramylpeptider administreres sammen med gamma-interferon, er det anslått at den høyeste dosen som kan tilføres til et menneske på ca. 70 kg er ca. 10 mg liposomer pr. kg legemsvekt, inneholdende 3 mikrogram av muramylpeptidet og 1500 enheter gamma-interferon. Den høyeste og den laveste dosen av det innkapslede materiale, konsentrasjonen av fosfolipidene i den vandige fasen så vel som konsentrasjonen av de innkapslede forbindelsene kan variere ifølge resultater som kan fastsettes eksperimentelt ved kliniske forsøk. ;Foreliggende oppfinnelse vedrører fortrinnsvis en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av: a) et fosfolipid av formel I, hvori m står for to, R^ og R£ er som definert ovenfor, X står for C^-C^alkylen, C2-C4-alkenylen eller Ci-C4~alkylen substituert med hydroksy eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, b) et fosfolipid av formel II, hvori R3 og R4 uavhengig av hverandre står for rettkjedet <C>io~c20~alkan°yl eller C10<-C>20<->;alkenoyl, ;c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser som har farmakologisk aktivitet og eventuelt en farmasøytisk ;akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,2-7,4. ;Mer foretrukket vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av a) et fosfolipid av formel I, hvori m står for to, Rj og R2 er definert ovenfor, X står for C2~C4-alkylen eller C2-C4-alkenylen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, b) et fosfolipid av formel II, hvori R3 og R4 uavhengig av hverandre står for rettkjedet <C>io-C20~alkan°y1 eller C10<-C>20<->;alkenoyl, ;c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser valgt fra gruppen bestående av antiflogistiske og/eller antiinflammatoriske midler, antibiotika, antimarkmidler, antineoplastiske midler og immunmodulatorer og en farmasøytisk akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,2-7,4. ;Foreliggende oppfinnelse vedrører spesifikt en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av ;a) et fosfolipid av formel I, hvori m står for to, R^ og R2 står uavhengig av hverandre for rettkjedet alkanoyl eller ;alkenoyl med et like antall fra 10 til 20 karbonatomer, X står for C2-C4~alkylen, f.eks. 1,2-etylen eller 1,3-propylen, eller C2-C4~alkenylen, f.eks. vinylen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, ;b) ét fosfolipid av formel II, hvori R3 og R4 står for rettkjedet CiQ-C2o~alken°y1 med et like antall fra 10 til 20 ;karbonatomer, ;c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser valgt fra gruppen bestående av antiflogistiske og/eller antiinflammatoriske midler, antibiotika, natineoplastiske midler og immunmodulatorer og en farmasøytisk akseptabel bæreropp-løsning bufret til pH 7,2-7,4. Oppfinnelsen vedrører mer spesifikt en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av a) et fosfolipid av formel I, hvori m står for to, R^ og R2 står uavhengig av hverandre for 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans-, eller 11-cis-oktadecenoyl, eller 9-cis-icosenoyl, X står for C2-C4-alkylen, f.eks. 1,2-etylen eller 1,3-propylen, eller C2~C4-alkenylen, f.eks. vinylen, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, b) et fosfolipid av formel II, hvori E3 og R4 uavhengig av hverandre står for 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-heksadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans-, eller 11-cis-oktadecenoyl, eller 9-cis-icosenoyl, c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser valgt fra gruppen bestående av antiflogistiske og/eller antiinflammatoriske midler, antibiotika, antineoplastiske midler og immunmodulatorer og en farmasøytisk akseptabel bæreropp-løsning bufret til pH 7,2-7,4. Spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for fresmtilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende kiposomer bestående av a) natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin eller natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin, b) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser valgt fra gruppen bestående av antiflogistiske og/eller antiinflammatoriske midler, antibiotika, antineoplastiske midler, og immunmodulatorer og en farmasøytisk akseptabel bærer-oppløsning bufret til pH 7,2-7,4. Av høy preferanse er en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av a) natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin eller natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-f osfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin, b) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser valgt fra gruppen bestående av diklofenak, pirprofen, mitomycin, cytarabin, daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, etoposid, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-CC^-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksy-fosf oryl-oksy)-etylamid-dinatriumsalt, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, N-acetyldesmetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-glutamin-a-n-butylester, Na<->(N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl)-N^-stearoyl-L-lysin, 6-0-stearoyl-N-acetylD-muramyl-L-alanin-D-isoglutamin og lymfokiner og en farmasøy-tisk akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,2-7,4. Spesielt foretrukket er en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av a) natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin eller natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin, b) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser fra ;gruppen bestående av diklofenak, pirprofen, mitomycin, ;cytarabin, daktinomycin, daunorubicin, doksorubicin, etoposid, N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, natr ium-N-acetyldesmetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, renset, naturlig eller rekombinant humant gamma interferon, interleukin 2, og forbindelser oppnådd fra kulturer av humane ;T-lymfocytter fra milten eller fra perifert blod etter stimulering ved hjelp av antigener eller mitogener og som er kjennetegnet ved en høy prosentandel makrofagaktiverende faktor (MAF) og en farmasøytisk akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,2-7,4. ;Mest foretrukket er en fremgangsmåte for fremstilling av farmasøytiske preparater i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av ;a) natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfo-etanol]-N-hydroksysuksinylamin eller ;natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin, b) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, c) en forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser ;bestående av N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-hydroksyfosforyloksy)-etylamid, natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin, natrium-N-acetyldesmetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamin, og renset, naturlig eller rekombinant humant gamma-interferon og en farmasøytisk akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,2-7,4. ;Fremgangsmåten for fremstilling av de farmasøytiske preparatene omtalt ovenfor er kjennetegnet ved at ;a) det fremstilles en homogen blanding bestående av fosfolipider av formlene I og II, en lipofil forbindelse eller ;blanding av forbindelser som har farmakologisk aktivitet og, eventuelt, et lipid nevnt ovenfor fra naturlige kilder og den homogene blandingen som derved oppnås dispergeresi en vandig fase, eller ;<p>) en homogen blanding bestående av fosfolipider av formlene I og II og, eventuelt, et lipid omtalt ovenfor fra naturlige kilder fremstilles og den homogene blandingen som derved oppnås dispergeres eventuelt i en vandig fase som inneholder en hydrofil forbindelse eller blanding av forbindelser som har farmakologisk aktivitet og, om nødvendig etter gjennom-føring av et hvilket som helst av prosesstrinnene a) eller <p>), bufres den vandige dispersjonen som oppnås til pH 7,0-7,8 og, om ønsket, separeres ikke-innkapslede lipider og/eller forbindelser som har farmakologisk aktivitet fra den vandige fasen og/eller liposomene som derved oppnås konsentreres eller frasepareres fra den vandige fasen. ;Den homogene blandingen fremstilles ved dannelse av en film eller av et lyofilisat. ;Filmen fremstilles ved fremgangsmåte a) ved å oppløse fosfolipidene (I) og (II) og den lipofile forbindelsen eller blandingen av forbindelser og, eventuelt, et lipid nevnt ovenfor fra naturlige kilder eller ifølge fremgangsmåte <p>) ved å oppløse fosfolipidene (I) og (II) og, eventuelt, et lipid omtalt ovenfor fra naturlige kilder i et organisk oppløsningsmiddel og avspalte oppløsningsmidlet. ;Egnede oppløsningsmidler er f.eks. usubstituerte eller substituerte, f.eks. halogenerte, alifatiske eller cykloalifa-tiske hydrokarboner, f.eks. n-heksan, cykloheksan, metylen-klorid, eller kloroform, alkoholer, f.eks. metanol eller etanol, lavere alkankarboksylsyreestere eller amider, f.eks. eddiksyretylester eller dimetylformamid, eller etere, f.eks. dietyleter, tetrahydrofuran eller dioksan, eller blandinger av disse oppløsningsmidlene. Det organiske oppløsningsmidlet avspaltes deretter ved å pålegge et vakuum, fortrinnsvis et høyvakuum, eller ved avblåsning med en inert gass, f.eks. nitrogen. ;Lyofilisatet fremstilles ifølge fremgangsmåte a) ved å oppløse fosfolipidene (I) og (II) og de lipofile forbindelsene eller blandingen av forbindelser eller ifølge fremgangsmåte <p>) ved å oppløse fosfolipidene (I) og (II) i et organisk oppløsningsmiddel ifølge fremgangsmåten beskrevet i TJS-patent nr. 4.311.712. Egnede oppløsningsmidler er i fast form sammen med fosfolipidene (I) og (II) ved temperaturen for lyofili-seringsprosessen og har et smeltepunkt på mer enn 0°c, f.eks. iseddiksyre, benzen eller dioksan, spesielt tert-butanol. ;En homogen blanding kan også fremstilles ved å spraytørke en oppløsning av fosfolipidene (I) og (II) og av det innkapslede materialet i et organisk oppløsningsmiddel som har et lavt kokepunkt, så som kloroform. Et pulver oppnås ved denne f remgangsmsåten. ;Forholdet mellom fosfolipidkomponenten (I) og fosfolipidkomponenten (II) i den homogene blandingen er ca. 10 til 90 opp til 50 til 50 mol-#. Fortrinnsvis er forholdet 30 til 70 mol-#. Det tilnærmede forholdet mellom de molare mengdene av det innkapslede materialet (gamma-interferon) dividert med den totale mengden av fosfolipidene (I) og (II) er ca. 0,0001 til 0,1 til 1,0, fortrinnsvis 0,005 til 0,01:0,1. ;Dispersjonen utføres ved mekanisk risting (omrøring, risting, "Vortex"-blander) av den vandige fasen hvortil ifølge fremgangsmåte a) den homogene blandingen av fosfolipidene (I) og (II) og de lipofile forbindelsene eller den lipofile blandingen av forbindelser som har farmakologisk aktivitet er tilsatt. Ifølge fremgangsmåte <p>) tilsettes den vandige fasen inneholdende de hydrofile forbindelsene eller blandingen av forbindelser som har farmakologiske egenskaper til den homogene blandingen av fosfolipidene (I) og (II). ;En blanding av små, store, unilamellære eller multilamellære liposomer dannes spontant med høy hastighet uten tilførsel av ytre energi. 0,1 til 40 vekt-#, fortrinnsvis 2 til 20 vekt-#, av den homogene blandingen relativt til den samlede vekten av den vandige dispersjonen kan dispergeres i den vandige fasen. Slike dispersjoner kan videre fortynnes til ca. 1 mikromol lipid pr. ml. Slike liposomdispersjoner inneholder inne-sluttet ca. 2,5 mikroliter av den vandige fasen pr. mikromol av lipidet. ;Sure eller basiske vandige dispersjoner bufres til pH 7,0-7,8, fortrinnsvis 7,2-7,4. Fortrinnsvis utføres dispersjonen i en vandig fase som har en pH fra 7,2 til 7,4. ;Fremgangsmåte a) foretrekkes i det tilfellet at lipofile, vann-uoppløselige forbindelser er innkapslet i liposomer, f.eks. lipofile muramyltripeptider. ;Fremgangsmåte <p>) foretrekkes i det tilfellet at hydrofile vann-uoppløselige forbindelser er innkapslet i liposomer, f.eks. cytarabin eller cytostatiske forbindelser, så som trifosfamid. ;Fremstillingen av de farmasøytiske preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse i form av liposomer kan også utføres ved andre fremgangsmåter som er kjent innen teknikken for fremstilling av liposomer, f.eks. ved ultralydbehandling med ultralydbølger, med infusjonsfremgangsmåter eller reversert fasefordampning. ;Dispersjonstrinnet utføres ved temperaturer under 60°C, fortrinnsvis ved romtemperatur. I tilfelle en potensiell termisk følsomhet av det innkapslede materialet, utføres dispersjonen under avkjøling og, eventuelt, under en atmosfære av en inert gass, f.eks. nitrogen eller argonatmosfære. ;De oppnådde liposomene kan gjøres lagringsstabile i den vandige fasen opp til flere uker eller måneder etter tilsats av stabilisatorer, f.eks. mannitt eller laktose. ;Størrelsen av liposomene som dannes avhenger, blant annet, av strukturen av den aktive bestanddelen og lipidkomponenten, blant annet forholdet mellom komponentene og konsentrasjonen av disse komponentene i den vandige dispersjonen. Ved f.eks. å øke eller redusere konsentrasjonen av lipidkomponentene, dannes vandige faser som har et høyt innhold av små eller store liposomer. ;Separasjonen av små liposomer fra store liposomer bevirkes ved hjelp av konvensjonelle separasjonsfremgangsmåter, f.eks. sedimentering av de store liposomene i en ultrasentrifuge, ved gelfiltrering eller ekstrudering gjennom rettporede filtere. Ved sentrifugering, f.eks. fra 5 til 60 minutter i et rotasjonsfelt som gir opphav til en treghetskraft ekvivalent med et gravitasjonsfelt på 5000-40 000 x g, avsettes store liposomer ved bunnen av beholderen, mens små liposomer forblir dispergert og kan avdekanteres. Etter gjentatt sentrifugering oppnås fullstendig separasjon av store liposomer fra små liposomer. ;Fortrinnsvis separeres liposomer fra den vandige fasen i det tilfelle at den vandige fasen ifølge fremgangsmåte p) inneholder ikke-innkapslede vann-uoppløselige forbindelser eller farmasøytiske midler. Spesielt bør vann-oppløselige antineoplastiske midler, f.eks. alkylerende midler så som cyklofosfamid, frasepares ved filtrering, ultrafiltrering, dialyse eller ved sentrifugering for å forhindre eventuelle bivirkninger forårsaket av ikke-innkapslede forbindelser. Liposomfraksjonen kan blandes med en bæreroppløsning bufret til pH 7,2-7,4, f.eks. isoton, steril natriumkloridoppløsning bufret til pH 7,2-7,4. ;Liposomer i den vandige fasen som har en diameter større enn 6,0 x IO-* m, f.eks. store mul ti lami Hære liposomer, kan frasepareres ved gelfiltrering, f.eks. med "Sepharose" eller "Sephacryl" som bærere.

Ved ekstrudering gjennom rettporede filtere, f.eks. membran-filtere av "Åcrodisc"-, "Nucleopore"- eller polykarbonattypen som har en porediameter på ca. 1,0 x 10"^ - 1,0 x 10"^ m ved et trykk på ca. 0,1 til 1,5 bar og en filtreringshastighet på ca. 20 ml/time, oppnås en spesielt uniform størrelsesfor-deling av liposomene.

Dannelsen av liposomer og deres innhold i den vandige fasen kan detekteres på i og for seg kjent måte ved å anvende forskjellige fysikalske analytiske fremgangsmåter, f.eks. ved mikroskopi av fryse-bruddprøver og tynne snitt i et elektron-mikroskop, ved røntgenrefraksjon, ved dynamisk lysspredning, ved massebestemmelse av filtratet i en analytisk ultrasentrifuge og, spesielt, ved spektroskop!, f.eks. i det kjernemag-netiske resonansspekteret (^H, ^C Qg 31p).

Syntetiske fosfolipider av formelen I er kjente. Deres fremstilling som mellomprodukter er beskrevet i den europeiske patentpublikasjon nr. 56992.

Fosfolipidene av formel II er alle kjente. Noen av dem er kommersielt tilgjengelige (Avanti, Fluka, Serva, Sigma).

De farmasøytiske preparatene omtalt ovenfor, spesielt de antiflogistiske, antireumatiske, anti-markmidlene, antimykotika, antibiotika eller antineoplastiske midlene er alle kjente, se f.eks. "MERCK Index", 10de utgave.

Fremstillingen av muramylpeptider av formel V er beskrevet i britisk patentskrift nr. 1.570.625, og i de europeiske patentpublikasjonene 25.495 og 21.367. Immunmodulatorer av lipopepitdtypen er også kjente, se europeisk patentpublikasjon nr. 114.787 og europeisk patent nr. 330.

Fremstillingen av renset, naturlig eller rekombinant, gamma-interferon er beskrevet i de europeiske patentpublikasjonene 63.482, 77.670, 83.540, 89.676, 95.350, 99.084, 110.044, 112.976 eller 121.157, 1 britisk patent nr. 2.107.718 så vel som i de internasjonale (PCT) publikasjonene (WO) 83/04053 eller WO 84/02129.

Fremstillingen av renset interleukin 2 er beskrevet i europeisk patentpublikasjon 106.179 og i US-patent nr. 4.448.879.

Bufferoppløsningene av pH 7,0 til 7,8 er fortrinnsvis sterile fosfatbufferoppløsninger basert på dihydrogenfosfat/hydrogen-fosfatlikevekten (KH2P04/Na2HP04). Fremstillingen av disse bufferoppløsningene er beskrevet i standard oppslagsbøker, f.eks. "Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis", Springer Verlag, bind 1, side 357-359. Spesielt benyttes steril, isotonisk kalsiumfri bufferoppløsning på pH 7,2 (Dulbecco) eller Hank's avbalanserte saltoppløsning (M.A. Bioproducts, Walkersville MD, USA).

De følgende eksemplene illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1: a) I en rundbundet flaske oppløses 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin i en tilstrekkelig mengde tert-butanol inntil begge lipidene er oppløst. Oppløsningen filtreres under sterile betingelser over "Acrodisc"-filter (2,0 x 10"^ m) og helles i en steril flaske. Denne flasken nedfryses ved -45°C. Et vakuum pålegges på den nedfrosne flasken og oppløsnings-midlet fjernes inntil romtemperatur nås. Flasken forsegles under inert gassatmosfære, f.eks. argonatmosfære.

Til denne flasken inneholdende et lyofilisat av lipidkomponentene nevnt ovenfor, tilsettes 2,5 ml av en steril, fosfat-bufret (pH 7,2-7,4), kalsiumfri natriumkloridoppløsning (Dulbecco) inneholdende doksorubicin i en konsentrasjon på 4 g/l med en steril sprøyte. Flasken ristes deretter i 10 minutter på en standardisert laboratorierister ("Vortex", hastighet 6) og plasseres i en sentrifuge. Etter sentrifugering i et gravitasjonsfelt på ca. 40 000 x g i ca. 60 minutter, avdekanteres supernatanten. Liposomdispersjonen resuspenderes i 2,5 ml 0,8556 steril, fosfat-bufret (pH 7,2-7,4) natrium-kloridoppløsning (Dulbecco). Sentrifugeringen og resuspen-deringen gjentas inntil supernatanten er fri for doksorubicin. Liposomdispersjonen som oppnås er egnet for parenteral administrering.

b) Fremstilling av natrium- N- fl. 2- di-( 9- cis- oktadecenoyl)- sn-glvcero- 3- fosfoetanol1- N- hydroksysuksinylamin

200,6 mg (270 mikromol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin tørkes under nitrogen og plasseres under høyvakuum i to timer. Det tørre lipidet oppløses i 10 ml nydestillert pyridin inneholdende 54 mg (540 mikromol) ravsyreanhydrid. Reaksjonsblandingen omrøres i 2 timer under nitrogenatmosfaere ved 55° C. Overskuddet av pyridin fjernes ved avdampning under redusert trykk og overskuddet av ravsyreanhydrid hydrolyseres ved å suspendere resten i en blanding av kloroform-metanol-0,5856 vandig natriumklorid-oppløsning (1:2:0,8 volum/volum). Produktet ekstraheres ved fordeling etter tilsats av en volumdel kloroform og en volumdel 0,5856 vandig natriumkloridoppløsning. Den nedre fasen vaskes tre ganger med en blanding av kloroform-metanol-0 ,5856 vandig natriumkloridoppløsning (3:48:47 volum/volum). Oppløsningsmidlet fjernes ved rotasjonsfordampning og resten resuspenderes i kloroform. Rf (Merck silikagel 60 pla-ter)^,375 (kloroform, metanol, vann-65/25/4; DV: 254,6 nm (bred); smp. 154°C.

Eksempel 2: Ved en fremgangsmåte tilsvarende eksempel 1 fremstilles vandige liposomdispersjoner inneholdende 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfo-etanolamin og 0,1 mg opptil 10 mg N-acetyl-L-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt eller 0,1 mg opptil 10 mg N-ace tyldesmetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt eller 1000 til 100 000 enheter av rekombinant humant immun gamma-interferon oppnådd ifølge EP-A-121.157 (Kyowa Hakko Kogyo Co.) eller en kombinasjon av 1000 til 1 000 000 enheter av dette rekombinante humane immune gamma-interferonet med 50-200 mikrogram natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin eller natrium-N-acetyldesmetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

Eksempel 3: a) I en rundbundet flaske oppløses 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin i en tilstrekkelig mengde av tert-butanol inntil begge lipidene er oppløst. Oppløsningen filtreres under sterile betingelser over "Acrodisc"-filter (2,0 x 10~<7 >m) og fylles i en steril flaske. Flasken roteres ved 1750 opm (omdreininger pr. minutt) og oppløsningsmidlet fjernes i en dampavrenset, filtrert (ved et trykk på 1 bar) tørr nitrogen. Flasken evakueres i høyvakuum på 6,0 x IO-<2> mbar og er stabil under en inert gassatmosfære av argon.

Til denne flasken som inneholder en tynn film av lipidkomponentene omtalt ovenfor tilsettes 2,5 ml av en steril, fosfat-bufret p(pH 7,2-7,4), kalsiumfri natriumkloridoppløsning (Dulbecco) inneholdende diklofenak i en konsentrasjon på 2 g/l med en steril sprøyte. Flasken ristes deretter i 10 minutter på en standardisert laboratorierister ("Vortex", hastighet 6) og plasseres i en sentrifuge. Etter sentrifugering i et gravitasjonsfelt på ca. 40 000 x g i ca. 60 minutter, avdekanteres supernatanten. Liposomdispersjonen resuspenderes i 2,5 ml 0,85$ steril, fosfat-bufret (pH 7,2-7,4) natriumkloridoppløsning (Dulbecco) og er egnet for parenteral administrering.

Eksempel 4; I en rundbundet flaske oppløses 0,1 mg N-acetylmuramyl -L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dlpalmi t oy 1 - sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)-etylamid (fremstilling ifølge europeisk patent nr. 25.495), 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin i en tilstrekkelig mengde steril tert-butanol inntil alle komponentene er oppløst. Oppløsningen filtreres under sterile betingelser over "Acrodisc"-filter (2,0 x

10~<7> m) og fylles i en steril flaske. Flasken roteres ved 1750 opm og oppløsningsmidlet blåses av i en strøm av renset, filtrert (ved et trykk på 1 bar) tørr nitrogen. Flasken evakueres i et høyvakuum på 6,0 x 10~<2> mbar og forsegles under en inert argongassatmosfære.

Til denne flasken inneholdende en tynn film av komponentene omtalt ovenfor tilsettes 10 ml av en steril, fosfat-bufret (pH 7,2-7,4), kalsiumfri, natriumkloridoppløsning (Dulbecco) med en steril nål. Flasken ristes deretter i 10 minutter på en standardisert laboratorierister ("Vortex", hastighet 6). Liposomdispersjonen som oppnås er lagringsstabil ved 4°C og er egnet for parenteral administrering.

Eksempel 5: I en rundbundet flaske oppløses 0,1 mg N-acetylmuramy 1 -L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyloksy)etylamid (fremstilt ifølge europeisk patent nr. 25.495), 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,10 (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin i en tilstrekkelig mengde steril tert-butanol inntil alle komponentene er oppløst. Oppløsningen filtreres under sterile betingelser over "Acrodisc"-filter (2,0 x IO"<7 >m) og fylles på en steril flaske. Denne flasken nedfryses ved

-45"C. Et vakuum pålegges på den frosne flasken og oppløs-

ningsmidlet fjernes inntil romtemperatur nås. Flasken forsegles under en inert argongassatmosfære.

Til denne flasken som inneholder et lyofilisat av komponentene omtalt ovenfor, tilsettes 10 ml av en steril, fosfat-bufret (pH 7,2-7,4), kalsiumfri natriumkloridoppløsning (Dulbecco) med en steril sprøyte. Flasken ristes deretter i 10 minutter på en standardisert laboratorierister ("Vortex", hastighet 6). Liposomdispersjonen som oppnås er lagringsstabil ved 4°C og er egnet for parenteral administrering.

Eksempel 6: Ved en fremgangsmåte analog eksemplene 4 eller 5 fremstilles liposomdispersjoner inneholdende 0,1 mg til 10 mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(l ,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroksyfosforyioksy)-etylamid, 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin.

Eksempel 7: Ved en fremgangsmåte analog eksempel 1 fremstilles liposomdispersjoner inneholdende 86,3 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin og 168,1 mg (0,026 mmol) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glycero-3-fosfoetanolamin og 0,1 mg opptil 10 mg N-acetyl-L-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt eller 0,1 mg opptil 10 mg N-acetyl-desmetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminnatriumsalt.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et farmasøytisk preparat i form av en vandig dispersjon inneholdende liposomer bestående av fosfolipidkomponenter, karakterisert ved at a) en homogen blanding bestående av a) et syntetisk fosfolipid med formelen der m betyr to eller tre, og R2 uavhengig av hverandre betyr alkyl, alkenyl eller acyl, hver med 10 til 20 karbonatomer, X betyr en direktebinding, Ci-C4-alkylen, C2-C4-alkenylen, eller Ci-C4-alkylen eller C2~C4-alkenylen substituert med hydroksy, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, b) et syntetisk fosfolipid med formelen der R3 og R4 betyr acylgruppen av en mettet eller en umettet karboksylsyre med 10 til 20 karbonatomer og 1-2 dobbeltbindinger, i et forhold fosfolipidkomponent (I)rfosfolipid-komponent (II) fra ca. 10:90 opp til 50:50, c) en lipofil forbindelse eller en blanding av forbindelser med farmakologisk aktivitet, og, eventuelt, d) et lipid fra naturlige kilder valgt blant fosfatidylcolin, fosfatidylserin, fosfatidylinositol, fosfatidylglyserol, kardiolipin og kolesterol, og derivater derav, og en farmasøytisk akseptabel bæreroppløsning bufret til pH 7,0-7,8 og, at eventuelt, farmasøytisk akseptable additiver, fremstilles og at den således oppnådde homogene blanding dispergeres i en vandig fase, eller p) en homogen blanding bestående av syntetiske fosfolipider med formel I og II i det ovenfor angitte forhold og, eventuelt, et lipid nevnt ovenfor fra naturlige kilder fremstilles og at den således oppnådde homogene blanding dispergeres i en vandig fase inneholdende en hydrofil forbindelse eller blanding av forbindelser med farmakologisk aktivitet, og hvis nødvendig, etter å ha gjennomført enten prosesstrinn a) eller p), den således oppnådde dispersjon bufres til pH 7,0-7,8 og, hvis ønskelig, ikke-innkapslede lipider og/eller forbindelser med farmakologisk aktivitet separeres fra den vandige fasen og/eller de således oppnådde liposomer konsentreres eller frasepareres fra den vandige fasen.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at a) en homogen blanding bestående av a) natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glysero-3-fosfoetanol]-N-hydroksysuksinylamin eller natrium- eller dinatrium-N-[1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glysero-3-fosfoetanol]-N-hydroksyglutarylamin (I), b) 1,2-di-(9-cis-oktadecenoyl)-sn-glysero-3-fosfoetanolamin (II) og c) en lipofil forbindelse eller en kombinasjon av forbindelser med farmakologisk aktivitet, fremstilles, eller<p>) en homogen blanding bestående av syntetiske fosfolipider med formel (I) og (II) fremstilles og den således oppnådde homogene blanding dispergeres i en vandig fase inneholdende en hydrofil forbindelse eller en blanding av forbindelser med farmakologisk aktivitet, og hvis ønskelig, etter gjennomføring av et av prosesstrinnene a) eller <p>), den således oppnådde vandige dispersjon bufres til pH 7,2-2,4.