NO171507B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av terapeutisk aktive nukleotidderivater - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en

analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formel I

hvori B er guanin, adenin, thymin, uracil, cytosin, 5-metylcytosin, 4-etoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, 4-isopropoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, eller 5-metyl-2-okso-pyrimidin;

X er H;

Y' er H eller OH; og

hvor n er null, 1 eller 3; eller

Y' og Z sammen danner et cyklisk fosfatester;

og de farmasøytisk akseptable estere og salter av denne.

Virus har lenge vært kjent for å være årsaken til noen av

de mest kostbare, problemfylte og ødeleggende infeksjoner for mennesket. I senere år er dette mønster blitt understreket ved utbruddet av ervervet immunsviktsyndrom (AIDS) som er blitt funnet å være resultatet av infeksjon med det humane immunsviktvirus (HIV).

Forskjellige aktive midler er blitt foreslått til behandling av virus, slik som AIDS. Typisk har disse aktive midler lidd av en ufordelaktig terapeutisk indeks, dvs. forholdet mellom aktivitet og toksisitet (mao. deres fordelaktige virkning ble dominert av deres toksiske natur).

F.eks. er medikamentet AZT (3'-azidotymidin) beskrevet i europeisk patentsøknad 86307071.0; det blir for øyeblikket anvendt til behandling av AIDS. Det gir imidlertid ingen helbre-delse av sykdommen. AZT er også nokså toksisk for benmargen, og krever at pasienter under behandling mottar hyppige blodover-føringer, og selv om deres sykdomssymptomer minskes og livet forlenges, er AIDS-relatert død fortsatt betraktet som å være uunngåelig.

Et annet eksempel er medikamentet DDC (2',3'-dideoksycytidin), som beskrevet i PCT/US86/01626, som har en internasjonal inngivelsesdato den 8. august 1986, med krav om prioritet fra U.S. serienr. 769 017, inngitt 26. august 1985. Dette medikament er i den inneværende periode under undersøkelse for behandling av HIV-infeksjon. Det er sterkere enn AZT, men det er også veldig toksisk, hvilket ofte fører til alvorlig perifer nervelidelse.

4'-substituerte nukleosider er blitt beskrevet tidligere [se Ann. N.Y.Acad.Sci., 255, 151 (1975)]. Mere spesielt er forskjellige 4'-metoksypurin og 4'-metoksypyrimidin ribonukleo-sider og 4'-azidocytidin blitt syntetisert og kartlagt m.h.t. deres antivirusaktivitet, men har ikke vist noen anvendbarhet i dette henseendet. F.eks. er 4'-azidocytidin cytotoksisk og mangler anti-HIV-aktivitet.

Det er stadig ønskelig å fremskaffe antivirusaktive midler som har en høy terapeutisk indeks; dvs. som gir fordelaktig virkning med liten eller ingen toksisk virkning. Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelse gir en slik fordelaktig virkning med lav toksisk virkning.

Forbindelsene med formel I fremstilles ifølge foreliggende oppfinnelse ved

a) at man omsetter en forbindelse med formel II

hvor:

B' er det samme som B i formel I, eller en acylert ekvivalent av dette;

R er metyl eller en acylgruppe slik som anisoyl, benzoyl, acetyl eller furan-2-karbonyl;

X er H; og

Z' er metylen med en avgående gruppe slik som jod eller brom,

med et oksyderende middel, fulgt av tilsetning av en base; eller

b) at man omsetter en forbindelse med formel

hvor:

B er som ovenfor angitt;

X er H;

Y' er H eller OH;

R<3> er laverealkyl; og

R4 er -OH eller tri-substituert silyloksy;

med (1) hvis R<4> er OH, et silylerende middel og en base fulgt av et azid og en Lewis-syrekatalysator, eller (2) hvis R<4> er tri-substituert silylosky, som reagerer med et azid i nærvær av en Lewis-syrekatalysator; eller

at man lar en forbindelse med formel I, hvor n er null, reagere med et fosforylerende middel for å gi en forbindelse med formel I, hvor n er 1 eller 3; eller

at man lar en forbindelse med formel I hvor n er 1, reagere med en ringdannende middel for å gi en forbindelse med formel I hvor Y' og Z sammen danner et cyklisk fosfat; eller

at man lar en forbindelse med formel I reagere med en pyridinkatalysator og et syreklorid for å gi den tilsvarende ester av en forbindelse med formel I; eller

at man lar en forbindelse med formel I reagere med en farmasøytisk akseptabel base for å danne det tilsvarende baseaddisjonssalt med formel I; eller

at man lar et baseaddisjonssalt av en forbindelse med formel I reagere med en syre for å danne den frie forbindelse med formel I; eller

at man omdanner et farmasøytisk akseptabelt baseaddisjonssalt av en forbindelse med formel I til et annet farmasøytisk akseptabelt baseaddisjonssalt av en forbindelse med formel I.

DETALJERT BESKRIVELSE

Definisjoner og generelle parametere

De følgende definisjoner er fremsatt for å illustrere og definere meningen og rekkevidden av de forskjellige begreper anvendt for å beskrive den her foreliggende oppfinnelse.

Begrepet "alkyl" refererer til et cyklisk, forgrenet eller rettlinjet kjedemonovalent alkylradikal på 1-20 karbonatomer. Dette begrep er videre eksemplifisert ved slike radikaler som metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl, i-butyl, 2-metyl-2-propyl, n-oktyl, n-dekyl, n-tetradekyl og n-nonadekyl. Begrepet "laverealkyl" refererer til et cyklisk, forgrenet eller rettlinjet kjedemonovalent alkylradikal på 1-4 karbonatomer. Begrepet "laverealkyl" er videre eksemplifisert ved slike radikaler som metyl, etyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, t-butyl eller i-butyl.

Begrepet "laverealkoksy" refererer til gruppen -O-R', hvor R' er laverealkyl.

Begrepet "acyl" referer til gruppen -C(=0)-W, hvor W er en alkylgruppe som inneholder 1-20 karbonatomer, adamantyl,1 aryl, amino, alkylamino, dialkylamino, en alkoksygruppe som inneholder 1-20 karbonatomer,

-CH2-0-CH3, -CH2-NH2, eller en gruppe med formelen:

hvor A er hydrogen, laverealkyl eller aryl.

Begrepet "aryl" refererer til et monovalent umettet aromatisk karbocyklisk radikal som har en enkelt ring (f.eks. fenyl) eller to kondenserte ringer (f.eks. naftyl), som valgfritt kan være mono-, di- eller tri-substituert, uavhengig, med hydroksy, laverealkyl, laverealkoksy, klor, fluor, og/eller cyano.

Begrepet "halo" refererer til fluor, brom, klor og jod.

Begrepet "heterocyklisk" refererer til et monovalent umettet eller aromatisk karbocyklisk radikal som har minst ett heteroatom, slik som N, 0 eller S, i ringen, idet hver tilgjengelige posisjon i denne eventuelt kan substitueres, uavhengig med f.eks. hydroksy, okso, amino, imino, laverealkyl, laverealkoksy, brom, klor, fluor og/eller cyano. Inkludert i denne klasse av substituénter er puriner og pyrimidiner.

Begrepet "purin" refererer til nitrogenholdige bicykliske heterocykler, som typisk inkluderer de naturlig forekommende puriner adenin (eller 6-aminopurin), hypoksantin (eller 6-hydroksypurin), guanin (2-amino-6-oksopurin) og xantin (2,6-dihydroksypurin). Disse forbindelser kan være av naturlig eller syntetisk opprinnelse, isolert eller fremstilt ved å anvende utelukkende eller en hvilken som helst kombinasjon av kjemisk, biokjemisk eller enzymologisk metodikk.

Begrepet "pyrimidin" refererer til nitrogenholdige mono-cykliske heterocykler, som typisk inkluderer de naturlig forekommende pyrimidiner cytosin (4-amino-2-oksopyrimidin), uracin (2,4-dioksopyrimidin), 5-metylcytosin (4-amino-5-metyl-2-okto-pyrimidin), og thymin (5-metyl-2,4-dioksopyrimidin). Som anvendt her inkluderer begrepet pyrimidin også deler som er blitt derivatisert eller modifisert ved substitusjon på foreldregrunn-strukturen, slik som 4-etoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, 4-isopropoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin og 5-metyl-2-okso-pyrimidin og lignende. Disse forbindelser kan være av naturlig eller syntetisk opprinnelse, isolert eller fremstilt ved å anvende utelukkende eller en hvilken som helst kombinasjon av kjemisk, biokjemisk eller enzymologisk metodologi.

"Thymidin" er ved definisjon 1-(2-deoksy-^-D-erytro-pentofuranosyl) thymin. Ved overenskomst er forbindelsen ikke referert til som 2'-deoksythymidin, selv om 2-posisjonen i formel I og II ikke er OH.

Begrepet "nukleosid" refererer til en forbindelse sammen-satt av en hvilken som helst pentosedel festet til den naturlige posisjon i et purin (9-posisjonen) eller pyrimidin (1-posisjonen) eller til den ekvivalente posisjon i en analog.

Begrepet "nukleotid" refererer til en fosfatester substituert i 5'-posisjon i et nukleosid. Et nukleotid kan ha én, to eller tre fosforylgrupper. Således kan det for ethvert gitt nukleosid være en monofosfat, difosfat og trifosfatester. Videre kan mono-fosforyldelen være bundet til to posisjoner i pentosen, for å danne det 3'5'-cykliske fosfat.

Under navngivning av forbindelsene fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse vil følgende nummereringssystemer anvendes for furanosylringen:

Når den foregående struktur representerer et nukleosid, er posisjonene typisk referert til som primærposisjonen (f.eks. 4'), mens posisjonene på purin eller pyrimidin ikke refereres slik.

Puriner nummereres i henhold til følgende formel:

idet de f.eks. representerer guanin når 2-posisjonen er substituert med NH2 og 6-posisjonen er substituert med =0 (kalt okso).

Pyrimidiner er nummerert i henhold til følgende formel:

idet de f.eks. representerer thymin når 2-posisjonen er =0 (kalt okso), 4-posisjonen er = 0 (kalt okso) og 5-posisjonen er -CH3.

Posisjonen av dobbeltbindinger i purin og pyrimidinsubsti-tuenter vil være klart for fagfolk på området. Det bør forstås videre at substitusjonen av en hydroksy eller amino på purin og pyrimidinringen også omfatter de tautomere okso- eller imino-former.

De 3',5'-cykliske fosfatestere er representert ved følgende formel:

Forbindelsene fremstilt i henhold til oppfinnelsen vil navngis ved å anvende de ovenfor viste nummereringssystem som 4'-substituerte nukleosider og derivater. Noen representative forbindelser er navngitt i de følgende eksempler.

Forbindelsen med formel I, hvor B er thymin, X er H, Y' er OH og N er null, kan kalles: 4 ' -azidotymidin, eller 1-(4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl) thymin, eller 1-(4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl)-5-metyl-2,4-dioksopyrimidin.

Forbindelsen med formel I hvor B er 2-aminopurin, X er H, Y' er OH og n er null, kalles 9-(4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl)-2-aminopurin.

Visse forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelse har asymmetriske karboner og kan fremstilles enten i optisk aktiv form, inkludert /3-D- eller a-L-formene, eller som en rasemisk blanding. Med mindre annet er spesifisert, er alle forbindelsene beskrevet her i /3-D-furanosylkonfigurasjonen. Imidlertid må rekkevidden av den foreliggende oppfinnelse her ikke betraktes som begrenset til denne form, men til å omfatte alle andre individuelle optiske isomerer av de foreliggende forbindelser og blandinger av disse.

En kjemisk binding angitt som (|) refererer til den ikke-spesifikke stereokjemi til de asymmetriske karbonatomer, f.eks. i posisjon 4' i furanosylringen (se reaksjonsskjema B) .

"Farmasøytisk akseptable estere" og "etere" inkluderer de forbindelser med formel I, hvor et oksygen eller et nitrogen er blitt modifisert, f.eks. acylert ved tilsetning av gruppen

-C(=0)-W, hvor W er en alkylgruppe som inneholder 1-20 karbonatomer, adamantyl, aryl, amino, alkylamino, dialkylamino, en alkoksygruppe som inneholder 1-20 karbonatomer, -CH2-0-CH3, -CH2-NH2, eller en gruppe med formelen:

hvor A er hydrogen, laverealkyl eller aryl [slike forbindelser fremstilt i henhold til beskrivelsene til N. Bodor et al., Pharmac. Ther., 19, 327-386 (1983), hvor forbedret blod/hjerne-barrierepermeabilitet er foreslått for forbindelser som har den foreliggende del]. Spesielt foretrukne estere er adamantoat, palmitoat og dihydropyridylestrene. Denne oppfinnelse beskriver de forbindelser med formel I som er estere som beskrevet her, og

samtidig er de farmasøytisk akseptable syretilsetningssalter av disse. Oppfinnelsen beskriver også isopropyl og benzyletere av forbindelsene med formel I.

Et "farmasøytisk akseptabelt salt" kan være et hvilket som helst salt dannet fra en uorganisk eller organisk syre eller base. Begrepet "farmasøytisk akseptabelt anion" refererer til anionet av slike syretilsetningssalter. Begrepet "farmasøytisk akseptabelt kation" refererer til kationet av slike basetilset-ningssalter. Saltet, anionet og/eller kationet er valgt ikke å være biologisk eller ellers uønsket.

Anionene er dannet fra uorganiske syrer, slik som saltsyre, hydrobromsyre, svovelsyre (som gir sulfat- og bisulfatsaltene), nitrogenholdig syre, fosforsyre og lignende, bg organiske syrer slik som eddiksyre, propionsyre, glykolsyre, pyrodruesyre, oksalsyre, eplesyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, sitronsyre, benzosyre, kanelsyre, fenylglykolsyre, metansulfonsyre, etansulfonsyre, salicylsyre, p-toluensulfonsyre og lignende.

Kationene dannes fra baser, slik som alkaliske jordhydrok-syder, inkludert kalsiumhydroksyd, kaliumhydroksyd, natriumhydroksyd, litiumhydroksyd og lignende, fortrinnsvis natriumhydroksyd.

Som anvendt her betyr begrepene "inert organisk løsnings-middel" eller "inert løsningsmiddel" et løsningsmiddel som er inert under betingelsene for reaksjonen som blir beskrevet i samsvar med dette [inkludert f.eks. benzen, toluen, aceetonitril, tetrahydrofuran ("THF"), dimetylformamid ("DMF"), kloroform, metylenklorid (eller diklormetan), dietyleter, pyridin og lignende]. Med mindre det motsatte er spesifisert, er løsningsmidlene anvendt i reaksjonene i den foreliggende oppfinnelse inerte organiske løsningsmidler.

Som anvendt her betyr begrepet "q.s." tilsetning av en mengde tilstrekkelig til å oppnå en stadfestet funksjon, f.eks. å bringe en løsning til et ønsket volum (f.eks. 100 ml).

Med mindre det motsatte er spesifisert, finner reaksjonene beskrevet her sted ved atmosfærisk trykk over et temperaturområde fra omtrent -20°C til omtrent- 100°e, mere foretrukket fra omtrent 10°C til omtrent 50°C, og mest foretrukket ved omtrent rom- (eller "omgivelses-") temperatur, f.eks. omtrent 20°C.

Isolasjon og rensing av forbindelsene og intermediatene beskrevet her kan utføres om ønsket ved en hvilken som helst egnet separasjon eller rensingsprosedyre slik som f.eks. filtrering, ekstraksjon, krystallisering, kolonnekromatografering, tynnskikt-kromatografering eller tykkskikt-kromatografering, eller en kombinasjon av disse fremgangsmåter. Spesifikke illust-rasjoner av egnede separasjons- og isolasjonsprosedyrer kan fås ved referanse til eksemplene nedenfor. Imidlertid kan andre ekvivalente separasjons- eller isolasjonsprosedyrer selvfølgelig også anvendes.

Som anvendt her betyr begrepet "behandling" eller "å behandle" enhver behandling av en sykdom i et pattedyr, inkludert: (i) forebyggelse av sykdommen, dvs. unngåelse av alle kliniske symptomer på sykdommen; (ii) inhibering av sykdommen, dvs. at man stopper utviklingen eller progresjonen av kliniske symptomer; og/eller (iii) lettelse av sykdommen, dvs. å forårsake tilbakegang av kliniske symptomer.

Som anvendt her betyr begrepet "effektiv mengde" en dosering tilstrekkelig til å gi behandling av sykdomstilstanden som blir behandlet. Dette vil variere avhengig av pasienten, sykdommen og behandlingen som utføres.

Syntese av forbindelsene med formel I

Som anvendt i reaksjonsskjemaene er substituentene B, B', R, X, Y', Z og n de samme som beskrevet i sammendraget av oppfinnelsen.

Forbindelsene med formel I, hvor Y' er OH, fremstilles som beskrevet med referanse til reaksjonsskjerna A.

Utqanqsmaterialer

Idet det refereres til reaksjonsskjerna A, er startmateria-lene med formel I 2'-deoksy-erytro-pentofuranosylnukleosider, ribufuranosylnukleosider og arabinofuranosylnukleosider valgt fra forbindelsene hvor B er f.eks. adenin (6-aminopurin), guanin (2-amino-6-oksopurin), uracil (2,4-dioksopyrimidin), tymin (5-metyl-2,4-dioksopyrimidin), cytosin (4-amino-2-okso-pyrimidin), hypoxantin (6-hydroksypurin), xantin (2,6-dihydroksypurin), 5-metylcytosin, 4-etoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, 4-isopropoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, og 5-metyl-2-okso-pyrimidin. Mange av disse materialene er tilgjengelig kommersielt fra slike tilførere som Aldrich Chemical Company eller Sigma Chemical Company; og når det ikke er det, kan de lett fremstilles i henhold til fremgangsmåtene som er vel kjent på fagområdene og publisert i litteraturen.

Fremstillin<g> av mellomprodukt 2

Idet vi refererer til reaksjonsskjerna A, blir en forbindelse med formel I jodert ved å anvende en blanding av trifenylfosfin, jod og pyridin, eller lignende joderingsmidler slik som metyltrifenoksyfosfonjodid, i et løsningsmiddel (slik som dioksan, tetrahydrofuran eller diklormetan). Etter at man har holdt blandingen ved en temperatur mellom romtemperatur og omtrent 50°C, fortrinnsvis ved omtrent romtemperatur, i en periode fra omtrent 4 timer til omtrent 16 timer, fortrinnsvis omtrent 8 timer, isoleres et mellomprodukt med formel 2 ved avdampning av løsningsmidlene og ekstraksjon av resten, fulgt av enten krystallisering eller kromatografering.

Fremstilling av mellomprodukt 3

En forbindelse med formel 2 løses eller suspenderes i et løsningsmiddel (slik som metanol eller en annen alkohol, eller dioksan, tetrahydrofuran, dimetylformamid, dimetylsulfoksyd; fortrinnsvis metanol) ved tilsetning av en base (slik som natriummetoksyd, kalium-t-butoksyd eller lignende; fortrinnsvis natriummetoksyd). Løsningen oppvarmes ved en temperatur fra periode på omtrent 12 timer til 24 timer, fortrinnsvis omtrent 16 timer. Etter å ha nøytralisert med en syre (slik som eddiksyre), blir løsningsmidlene fjernet ved avdampning, og en forbindelse med formel 3 blir krystallisert ut av resten eller isolert ved kromatografering.

Alternativt kan det fremstilles en forbindelse med formel 3 ved å løse forbindelsen med formel 2 i et løsningsmiddel (slik som dimetylformamid, dimetylsulfoksyd, N-metyl-2-pyrrolidon eller lignende) og tilsette en base (slik som 1,8-diazabicyklo[5,4,0]undek-7-en eller 1,5-diazabicyklo[4,3,O]non-5-en) og å holde temperaturen ved romtemperatur i en periode på omtrent 12 timer til 24 timer, fortrinnsvis omtrent 16 timer. Etter fjerning av løsningsmiddelet ved avdampning, blir forbindelsen med formel 3 renset ved kromatografering.

Fremstilling av mellomprodukt 4

En f or V' ^i.<p>e med formel 4 fremstilles ved å tilsette en løsning av en forbindelse med formel 3 (i dimetylformamid eller N-metyl-2-pyrrolidon eller lignende; fortrinnsvis DMF) til en blanding av et alkalisk metallazid (slik som natrium- eller litiumazid, fortrinnsvis natriumazid) og et joderingsmiddel

(slik som jodmonoklorid eller jodin, fortrinnsvis jodmonoklorid)

i en løsning fortrinnsvis med samme løsningsmiddel. Etter røring av blandingen i en periode på omtrent 5 minutter til 2 timer, fortrinnsvis omtrent 1 time; i et temperaturområde på omtrent 0-50°C, fortrinnsvis ved omtrent romtemperatur; isoleres forbindelsen ved ekstraksjon, eventuelt fulgt av kromatografering eller ved krystallisering.

Fremstilling av forbindelser med formel II

En løsning av en forbindelse med formel 4 og et syreklorid eller anhydrid (slik som benzoylklorid, anisoylklorid eller eddiksyreanhydrid eller lignende) i et løsningsmiddel (slik sompyridin) holdes ved et temperaturområde på 20°C til 50°C, fortrinnsvis ved omtrent romtemperatur; i en periode på 6-24 timer, fortrinnsvis omtrent 16 timer. Forbindelsen med formel II utvinnes ved avdampning av løsningsmiddelet og renses ved

kromatografering eller ved krystallisering.

Fremstilling av forbindelser med formel I

En forbindelse med formel II løses eller suspenderes i et løsningsmiddel slik som diklormetan mettet med vann og behandles med et oksyderende middel (slik som en karboksylperoksysyre, f.eks. peroksybenzosyre, pereddiksyre, 3-klorperoksybenzosyre eller lignende). Reaksjonsbiproduktene fjernes ved ekstraksjon, og resten behandles med en base (slik som vandig natriumhydroksyd, natriummetoksyd, metanolisk natriummeteoksyd, metanolisk ammoniakk, ammoniumhydroksyd, vandig dimetylamin eller lignende). Forbindelsen med formel I-A isoleres ved avdampning av løsningsmiddelet og rensing, f.eks. ved kromatografering.

Forbindelser med formel I-A fremstilt ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen, kan identifiseres ved tilstedeværelse av en påvisbar mengde av formel II eller saltet eller syren dannet fra peroksysyren anvendt i reaksjonen. Mens det er vel kjent av farmasøytiske midler må møte farmakopestandarder før godkjennelse og/eller markedsføring, og at forløpere (slik som formel II) eller biprodukter (slik som syrene eller saltene) ikke bør overskride grensene foreskrevet av farmakopestandarder, kan sluttforbindelsene fremstilt ved en fremgangsmåte i henhold til den foreliggende oppfinnelse ha mindre, men påvisbare mengder av slike materialer tilstede, f.eks. på nivåer i området 1 del pr. million eller 2%. Disse nivåer kan påvises, f.eks. ved HPLC-massespektrometri. Det er viktig å måle renheten av farmasøytiske forbindelser for tilstedeværelse av slike materialer, idet tilstedeværelsen av disse i tillegg er beskrevet som en fremgangsmåte for å påvise anvendelse av en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen.

Forbindelsene med formel III, spesielt der hvor Y' er OH, fremstilles som beskrevet med referanse til reaksjonsskjema B.

Utgangsmaterialer

Idet vi refererer til reaksjonsskjema B, er utgangsmater-ialene med formel 5 2'-deoksy-erytro-pentofuranosylnukleosider, ribofuranosylnukleosider og arabinofuranosylnukleosider valgt fra forbindelsene hvor B er f.eks. guanin, adenin, thymin, uracil, cytosin, hypoksantin, zantin, 5-metylcytosin, 4-etoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, 4-isopropoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, eller 5-metyl-2-okso-pyrimidin. Mange av disse materialer er tilgjengelig kommersielt fra slike tilførere som Aldrich Chemical Company og Sigma Chemical Company; og der hvor det ikke er det, kan de lett fremstilles i henhold til fremgangsmåtene som er vel kjent på fagområdet og publisert i litteraturen. Se f.eks. Synthetic Procedures in Nucleic Acid Chemistry, vol. 1, Zorbach og Tipson, utg., Wiley Interscience

(1986); og Nucleic Acid Chemistry, del 1-3, Townsend og Tipson, utg., Wiley Interscience (1978, 1978, 1986).

Fremstilling av mellomprodukt 6

En forbindelse med formel 5 reageres med et selenerende middel (slik som et arylselenylhalogenid eller selencyanat; fortrinnsvis o-nitrofenylselencyanat) i nærvær av et fosfin (f.eks. trifenylfosfin, tri-n-butylfosfin) i et løsningsmiddel (slik som tetrahydrofuran, diklormetan eller dioksan). Etter å ha holdt reaksjonen ved en temperatur fra omtrent 0-50°C, fortrinnsvis ved omtrent romtemperatur i en periode på omtrent 30 minutter til omtrent 24 timer, fortrinnsvis omtrent 1 time, blir forbindelsen med formel 6 isolert etter ekstraksjon, avdampning og rensing, f.eks. kromatografering.

Fremstilling av mellomprodukt 7

En forbindelse med formel 6 løses eller suspenderes i et løsningsmiddel (slik som diklormetan, kloroform eller lignende) og behandles med et oksyderende middel (slik som hydrogenperoksyd eller et karboksylperacid, f.eks. peroksybenzosyre, 3-klorperoksybenzosyre, pereddiksyre eller lignende). Eventuelt kan et nøytraliserende middel (slik som natriumbikarbonat eller lignende) tilsettes. Réaksjonsblandingen røres ved en temperatur mellom omtrent 0°C og 50°C, fortrinnsvis ved omtrent romtemperatur, i en periode på omtrent 5 minutter til omtrent 24 timer, fortrinnsvis i 3 0 minutter. Forbindelsen med formel 7 isoleres etter ekstraksjon og avdampning, fulgt eventuelt av rensing på silisiumdioksydgel eller lignende. Fortrinnsvis blir forbindelsen med formel 7 omdannet direkte til en forbindelse med formel 8 uten rensing.

Fremstilling av mellomprodukter 8 og 9

En forbindelse med formel 7 blir oppvarmet i et løsnings-middel (slik som toluen, benzen eller lignende) i nærvær av en base (slik som en trialkyl- eller triarylamin, fortrinnsvis trietylamin) til en temperatur i området på omtrent 50°C til omtrent 100°C i en periode på omtrent 10 minutter til omtrent 5 timer, fortrinnsvis omtrent 1 time. Forbindelsen med formel 8 isoleres etter avdampning og rensing og eventuelt krystallisering. Avhengig av naturen av substituenten Y', kan den isomere forbindelse med formel 9 også isoleres fra reaksjonsblandingen.

Fremstilling av forbindelser med formel III

En forbindelse med formel 8 reageres med en persyre (slik som peroksybenzosyre, 3-klorperoksybenzosyre, pereddiksyre eller lignende) i nærvær av et alkoholløsningsmiddel (slik som en primær laverealkylalkohol, fortrinnsvis metanol, etanol eller lignende). Løsningen røres ved en temperatur mellom omtrent -40°C og 50°C i en periode på noen få minutter til omtrent 48 timer, avhengig av Y'-gruppen. F.eks., hvis Y' er H, blir løsningen rørt fortrinnsvis ved en temperatur på mellom -10°C og 0°C i omtrent 1-2 minutter; hvis Y' er F, blir løsningen rørt fortrinnsvis ved omtrent romtemperatur i omtrent 1 time til omtrent 48 timer. Forbindelser med formel III (hvor R<3> er en laverealkylgruppe som tilsvarer den primære laverealkohol anvendt i reaksjonen) isoleres etter ekstraksjon, avdampning og krystallisering; eventuelt kan rensing ved kromatografering anvendes.

Andre 4'-azidoforbindelser med formel I kan fremstilles ved å starte fra 4'-metoksyforbindelsene (f.eks. forbindelsene med formel III laget som vist i reaksjonsskjema B) som beskrevet med referanse til reaksjonsskjema D.

Formel III

Formel III eller (13)

Fremstilling av mellomprodukt 13

En forbindelse med formel III behandles med et silylerende middel (f.eks. et tri-substituert silylklorid, slik som trimetylsilylklorid, t-butyldimetylsilylklorid eller lignende) i et løsningsmiddel (slik som diklormetan, kloroform, tetrahydrofuran, dimetylformamid, dioksan eller lignende); og i nærvær av en base (slik som trietylamin, pyridin, imidazol eller lignende); ved en temperatur i området på omtrent 0°C til 60°C, fortrinnsvis ved romtemperatur, i en periode fra omtrent 10 minutter til omtrent 10 timer, fortrinnsvis i omtrent 3 timer. Forbindelsen formel 13 (hvor R<3> er laverealkyl, og enhver Y' som var OH i formel III, eventuelt er R<4>, og R<4> er en trisubstituert silyloksygruppe) isoleres ved avdampning, ekstraksjon og eventuelt kromatografering.

Fremstilling av formel I- D

Forbindelser med formel III eller formel 13 omdannes til en forbindelse formel I-D ved å løse en forbindelse med formel III eller formel 13 i et løsningsmiddel (slik som diklormetan, kloroform eller lignende) og behandle den med et azid (slik som azidotrimetylsilan, natriumazid, litiumazid eller lignende) i nærvær av en Lewis-syrekatalysator (slik som trimetylsilyltrifluormetansulfonat, triisopropylsilyltrifluormetansulfonat eller lignende) ved en temperatur i området på omtrent 0°C til omtrent 100°C, fortrinnsvis ved romtemperatur; i en periode på 10 minutter til 100 timer, fortrinnsvis 24-50 timer.,Forbindelsen med formel I isoleres ved avdampning, eventuelt ved å behandle den med en vandig base eller et fluorid. Til slutt følges eventuell ekstraksjon av rensing, slik som silisiumdioksydgel-kromatografering og krystallisering.

Fremstilling av fosfonatsaltene med formel I

Fosfonatsaltene med formel I fremstilles ved reaksjon mellom en forbindelse med formel II og fosfonsyre eller et salt av et di-laverealkylfosfonat ved å anvende fremgangsmåter kjent i litteraturen.

Fremstilling av fosfatsaltene med formel I

Fosforyleringsmidler anvendbare til fremstilling av fosfatsaltene inkluderer f.eks. fosforylklorid, pyrofosforylklorid og lignende, som vil være kjent for fagfolk på området.

5'-monofosfatestrene av nukleosidene beskrevet her, fremstilles ved å starte fra foreldrenukleosidet, f.eks. ved å anvende fremgangsmåter beskrevet av Imai et al., Journal of Organic Chemistry, 34, 1547 (1969).

5'-difosfatestrene og 5'-trifosfatestrene av nukleosidene beskrevet her, fremstilles ved å starte fra monofosfåtene, f.eks. ved å anvende fremgangsmåter beskrevet av Hoard et al., Journal of the American Chemical Society, 87, 1785 (1965).

3',5'-cykliskfosfatestere av nukleosidene beskrevet her, fremstilles ved å starte fra monofosfåtene, f.eks. ved å anvende fremgangsmåter beskrevet i Smith et al., Journål of the American

Chemical "Society, 83, 698 (1961).

Fremstilling av saltene med formel I

De farmasøytisk akseptable salter med formel I fremstilles ved å løse en forbindelse med formel I i et egnet løsningsmiddel (slik som vann) ved å tilsette 1-3 molare ekvivalenter (fortrinnsvis én molar ekvivalent) av en passende syre (slik som saltsyre) eller base (slik som et alkalisk jordhydroksyd, f.eks. litiumhydroksyd, kalsiumhydroksyd, kaliumhydroksyd, natriumhydroksyd eller lignende; fortrinnsvis natriumhydroksyd) og røring. Saltet isoleres ved lyofilisering eller ved presipitering ved å anvende teknikker som vil være åpenbare for fagfolk på området.

Fremstilling av estrene med formel I

De farmasøytisk akseptable estere med formel I fremstilles ved å tilsette en forbindelse med formel I og en katalysator (slik som 4-dimetylaminopyridin) i pyridin, dråpevis til et passende syreklorid av acylgruppen som skal tilsettes (slik som adamantankarboksylsyreklorid, palmitinsyreklorid, N-metyl-dihydropyrid-3-ylkarboksylsyreklorid eller isopropylsyreklorid) enten i ren form eller i et løsningsmiddel (slik som metylenklorid, dikloretan eller lignende). Reaktantene røres ved romtemperatur i 10-24 timer, fortrinnsvis fra 12-18 timer. Produktet isoleres ved fremgangsmåter vel kjent på fagområdet, slik som kromatografering.

Foretrukne fremgangsmåter og siste trinn

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelse kan fremstilles i henhold til følgende siste trinn (hvor ikke-essensielle substituenter ikke er diskutert, men vil være åpenbare for fagfolk på området fra referanse til de foregående reaksjonsskjemaer): et 4'-azidoa-5'-deoksy-5'-jodnukleosid blir bragt i kontakt med et acylhalogenid for å gi en forbindelse i henhold til formel II;

et 3'-O-acyl-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-jodnukleosid eller

et 2 ', 3 ' -"di-O-acyl-4 ' -azido-5' -deoksy-5' -jodnukleosid blir bragt i kontant med en persyre, fulgt av en base for å gi en forbindelse i henhold til formel I;

en forbindelse med formel III, hvor Z' er metoksy, blir bragt i kontakt med et azid i nærvær av en Lewis-syrekatalysator for å gi en forbindelse i henhold til formel I;

en forbindelse med formel I, hvor n er null, blir bragt i kontakt med et fosforyleringsmiddel for å gi en forbindelse i henhold til formel I, hvor n er 1,

en forbindelse med formel I, hvor n er 1, blir bragt i kontakt med et fosforyleringsmiddel for å gi en forbindelse i henhold til formel I, hvor n er 3;

en forbindelse med formel I, hvor n er 1, blir bragt i kontkt med et ringdannende middel (slik som dicykloheksylkarbo-diimid) for å gi en forbindelse i henhold til formel I, hvor Y' og Z sammen danner en cyklisk fosfatester;

en forbindelse med formel II blir reagert med fosfonsyre eller et salt av en di-laverealkylfosfonsyre for å gi en forbindelse med formel I, hvor Z er (R'0) 2P(0) CH2-;

en forbindelse med formel I, etter beskyttelse av reaktive nitrogenatomer på purin- eller pyrimidinheterocyklus ved acyle-ring (f.eks. benzoylering), blir reagert med en sterk base, (f.eks. natriumhydrid), fulgt av tilsetning av et alkylhalogenid (slik som benzylbromid eller 2-jodpropan) for å gi den tilsvarende eterforbindelse med formel I etter deacylering;

en forbindelse med formel I blir bragt i kontakt med en pyridinkatalysator og et syreklorid for å gi den tilsvarende ester;

en forbindelse med formel I blir bragt i kontakt med en farmasøytisk akseptabel base for å danne det tilsvarende basetilsetningssalt med formel I;

substitusjon av et farmasøytisk akseptabelt basetilsetningssalt med formel I med en annen farmasøytisk base; og

man bringer et basetilsetningssalt med formel I i kontakt med en syre for å danne den tilsvarende frie syreforbindelse med formel I.

Foretrukne forbindelser

For øyeblikket foretrukne er forbindelsene med formel I, hvor B er guanin, adenin, thymin, uracil, cytosin, hypoksantin, xantin, 5-metylcytosin, 4-etoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, 4-isopropoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, eller 5-metyl-2-okso-pyrimidin; spesielt forbindelsene hvor B er adenin, guanin, uracil, thymin eller cytosin.

Også foretrukne er forbindelsene med formel I, hvor X er

H;

spesielt forbindelsene hvor Y' er OH og B er thymin, uracil, cytosin, guanin eller adenin;

og også forbindelsen hvor Y' er H og B er thymin.

Ennå andre foretrukne forbindelser med formel I er de hvor B er thymin.

Mest foretrukket er forbindelsen 4'-azidothymidin.

Anvendbarhet og testing

Generell anvendbarhet

Forbindelsene i henhold til denne oppfinnelse er spesielt anvendbare til behandling av virus-, bakterie- og soppinfeksjo-ner.

Hovedsakelig er infeksjonene behandlet med forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, funnet i pattedyr, inkludert: dyr slik som mus, aper og lignende; og spesielt mennesker.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelse, inkludert de farmasøytisk akseptable salter og estere av disse, og sammensetningene som inneholder dem, er anvendbare som sterke antivirusmidler, spesielt mot humant immunsviktvirus (HIV).

Testing

In vitro-testing for antivirusvirkning mot HIV gjøres f.eks. ved fremgangsmåtene beskrevet av Chen et al., Biochemical Pharmacology, 36 (24), 4361-4362 (1978), eller modifikasjoner av disse.

Inhibering av revers transkriptase og human polymerase bestemmes ved fremgangsmåtene beskrevet av Chen et al. , Molecular Pharmacology, 25, 441-445 (1984), eller som beskrevet av Wang et al., Biochemistry, 21, 1597-1608 (1982), eller ved modifikasjoner av disse.

Tester for toksisitet kan utføres ved fremgangsmåtene beskrevet av Diainiak et al., British Journal of Haematology, 69, 229-304 (1988), eller som beskrevet av Sommadossi et al., Agents and Chemotherapy, 31 (3), 452-454 (1987), eller ved modifikasjoner av disse.

In vivo-testing for å demonstrere den beskrevne antivirusvirkning av de foreliggende forbindelser gjøres f.eks. ved fremgangsmåter beskrevet av Jones et al., Journal of Virology, 62 (2), 511-518 (1988), eller ved modifikasjoner av disse.

Eksempler

De følgende fremstillinger og eksempler er gitt for å gjøre det mulig for fagfolk på området å forstå klarere og å praktisere den foreliggende oppfinnelse. De bør ikke betraktes som å begrense rekkevidden av oppfinnelsen, men bare som å være illustrative og representative for denne.

Fremstilling 1

Formel 2, hvor B er thymin, X er H

Til en suspensjon av thymidin (0,968 g, 4,0 mM) i dioksan (2 0 ml) som inneholdt pyridin (0,65 ml, 8,0 mM) ble det tilsatt trifenylfosfin (1,57 g, 6,0 mM) og jod (1,52 g, 6,0 mM). Etter røring av blandingen i 7 timer ved 21"C ble metanol (1,0 ml) tilsatt, fulgt av fjerning av løsningsmiddelet ved avdampning. En løsning av resten i etylacetat (150 ml) ble ekstrahert suksessivt med vann (30 ml), 10% vandig natriumtiosulfatløsning (30 ml) og saltvann (30 ml). Etylacetatfasen ble konsentrert under vakuum til en sirup som ble tatt opp i varm etanol (50 ml) og filtrert. Filtratet ble konsentrert til et volum på 15 ml. Ved avkjøling krystalliserte 5'-deoksy-5'-jodtymin ut.

Krystallene ble filtrert, skyllet med etylacetat og tørket, ^■—hvilket ga 5 '-deoksy-5 '-jodthymidin (0,806 g) , Heri forbi<g>åelse i ,/ /

henhold til formel 2.

Fremstilling 2

Formel 3, hvor B er tymin, X er H

En IN løsning av natriummetoksyd i metanol (0,85 ml) ble tilsatt til en suspensjon av 5'-deoksy-5'-jodthymidin (100 mg, 0,284 mM), fremstilt f.eks. som beskrevet i fremstilling a!, i vannfri metanol (5 ml). Løsningen ble varmet under tilbakeløp i 16 timer, avkjølt til romtemperatur og nøytralisert ved tilsetning av iseddiksyre. Etter fjerning av løsningsmidler ved avdampning, ble resten krystallisert fra etanol for å gi 58 mg 5'-deoksythymidin-4'-en (en forbindelse i henhold til formel 3)

(sm.p. 208°-210°C).

Fremstilling 3

Formel 4, hvor B er tymin. X er H

Til en rørt suspensjon av natriumazid (8,70 g, 134 mM) i dimetylformamid (60 ml) under nitrogen, ble det tilsatt jodmonoklorid (10,8 g, 67 mM). Etter 20 minutter ble en løsning av 5'-deoksytymidin-4'-en (6,00 g, 26,8 mM) fremstilt f.eks. som beskrevet i fremstilling 2 i dimetylformamid (600 ml) tilsatt dråpevis over 30 minutter. Blandingen ble tillatt å røres ved 21 "C i 1 time til. Mettet vandig natriumbikarbonat ble tilsatt (200 ml), fulgt av nok mettet vandig natriumtiosulfatløsning til å gjøre blandingen fargeløs. Blandingen ble filtrert, og filtratet ble avdampet til en olje. En løsning av oljen i H20 (300 ml) ble ekstrahert fire ganger med etylacetat (250 ml's porsjoner). De kombinerte organiske ekstrakter ble tørket (MgSOA) , og løsningsmiddelet ble fjernet ved avdampning for å gi 4'-azido-5'-deoksy-5'-jodthymidin (en forbindelse i henhold til formel 4) som 12 g viskøs sirup med tilstrekkelig renhet til påfølgende reaksjoner.

Fremstilling 4

Formel 6, hvor B er tymin, Y' er F og X er H

3'-deoksy-3'-fluortymidin (2,04 g, 8,34 mM) og o-nitrofenylselencyanat (2,10 g, 9,20 mM) ble plassert i en kolbe under nitrogen. Tetrahydrofuran (tørr) (50 ml) ble tilsatt, fulgt av 2,2 ml (8,83 mM) tri-n-butylfosfin. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 1,5 timer, fortynnet med 200 ml etylacetat og vasket med 200 ml mettet natriumbikarbonat, fulgt av 200 ml saltvann. Ekstraktet ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk til en gul olje (6,3 g). Kromatografisk rensing av den gule olje på silisiumdioksydgel med heksan/etylacetat (4:1 v/v) som elueringsmiddel ga 2,79 g (6,51 mM, 78%) av 3',5'-dideoksy-3'-fluor-5'-[(2-nitrofenyl)selenyl]tymidin som et amorft, gult faststoff.

Fremstilling 5

Formel 8. hvor B er tymin. Y' er F og X er H

3',5'-dideoksy-3'-fluor-5'-[(2-nitrofenyl)selenyl]-tymidin (2,79 g, 6,51 mM) ble løst i 53 ml metylenklorid. Mettet natriumbikarbonat (17.8 ml) ble tilsatt, fulgt under kraftig røring av 3-klorperoksybenzosyre (85% type) (1,37 g, 6,83 mM). Blandingen ble rørt i 1 time ved romtemperatur, så heilt i 200 ml 10% (v/v) natriumtiosulfat/vann. Blandingen ble ekstrahert to ganger med 200 ml 10% n-butanol/kloroform. Ekstraktene ble vasket med saltvann, kombinert og tørket over magnesiumsulfat. Konsentrasjon under redusert trykk ga 2,90 g selenoksyder som et gult faststoff.

De ubehandlede selenoksyder (2,90 g) ble suspendert i 100 ml toluen, og trietylamin (3,0 ml, 21,5 mM) ble tilsatt. Blandingen ble oppvarmet til 100°C i 1 time, avkjølt til romtemperatur og avdampet ved redusert trykk til en semi-fast rest. Kromatografering av resten på silisiumdioksydgel med etylacetat:heksan (4:1 v/v) som elueringsmiddel og krystallisering fra etylacetat/heksan ga 650 mg (2,87 mM, 44%) 3'-5'-dideoksy-3'-fluortymidin-4'-en (sm.p. 167-169°C).

Fremstilling 6

Formel 6. hvor B er tymin og X og Y' er H

3'-deoksytymidin (2,0 g, 8,84 mM) og o-nitrofenylselencyanat (2,16 g, 9,51 mM) ble plassert i en kolbe under nitrogen. Tetrahydrofuran (tørr) (50 ml) ble tilsatt, fulgt av tri-n-butylfosfin (2,4 ml, 9,63 mM). Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 1 time, fortynnet med 250 ml etylacetat og vasket med 250 ml mettet natriumbikarbonat, fulgt av 250 ml saltvann. Den organiske fase ble tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk til en gul olje (6,3 g). Kromatografering av den ubehandlede oljen på silisiumdioksydgel med en heksan:-etylacetat (1:10 v/v) ga 3',5'-dideoksy-5'-[(2-nitrofenyl)-selenyl]tymidin (3,15 g, 8,67 mM, 87%) som et amorft, gult faststoff.

Fremstilling 7

Formel 8 og 9, hvor B er thymin. og X og Y' er H

3',5'-dideoksy-5'-[(2-nitrofenyl)selenyl]tymidin (3,04, 7,41 mM) ble løst i 20 ml metylenklorid. Mettet

natriumbikarbonat (20 ml) ble tilsatt, fulgt under kraftig røring av 3-klorperoksybenzosyre (85% type) (1,58 g, 7,78 mM). Blandingen ble rørt i 2 0 minutter ved romtemperatur, så heilt i 20 ml 10% (v/v) natriumtiosulfat/vann. Blandingen ble ekstrahert to ganger med 2 00 ml metylenklorid og tre ganger med kloroform (2x200 ml, 1x100 ml). Ekstraktene ble vasket med saltvann, kombinert og tørket over magnesiumsulfat. Avdampning av løsningsmiddelet ga 3,06 g selenoksyder som et gult faststoff.

De ubehandlede selenoksyder (3,00 g) ble suspendert i 100 ml toluen, og trietylamin (3,0 ml, 21,5 mM) ble tilsatt. Blandingen ble tatt under tilbakeløp i 1 time, avkjølt til romtemperatur og avdampet ved redusert trykk til en semi-fast rest. Kromatografering av resten på silisiumdioksydgel med etylacetat:heksan (6:4 v/v) som elueringsmiddel, fulgt av krystallisering fra etylacetat/heksan ga 3',5'-dideoksytymidin-4'-en (646 mg) (44%) (sm.p. 149-153°C) og 3',5'-dideoksytymidin-3'-en (286 mg, 19,5%) (sm.p. 155-156°C).

EKSEMPEL 1

3'- O- p- anisovl- 4'- azido- 5'- deoksv- 5'- iodtyroidin

Formel II, hvor B er tymin, Z er jodmetyl, Y' er 0-p- anisoyl og X er H

En løsning av 4'-azido-5'-deoksy-5'-jodtymidin (11 g, 28 mM), en forbindelse med formel 4 fremstilt f.eks. som beskrevet i fremstilling 3A, og p-anisoylklorid (5,3 g, 31 mM) i pyridin (100 ml) ble holdt ved 21°C i 16 timer. Metanol (10 ml) ble tilsatt, og løsningen ble konsentrert ved avdampning til en viskøs sirup. Sirupen ble kromatografert på en kolonne av silisiumdioksydgel (800 g) ved å anvende 2% metanol i diklormetan som elueringsmiddel. Ren 3'-0-p-anisoyl-4'-azido-5'-deoksy-5'-jodtymidin (tittelforbindelsen) (13 g, 95%) ble utvunnet som et skum som krystalliserte fra etanol (sm.p. 153-154°).

EKSEMPEL 2

4'- azidotymidin

2A. Formel I, hvor B er tymin, n er null, Y' er hydroksyl og X er_hydrogen En løsning av 3-klorperoksybenzosyre (85% type, 21,0 g, 103 mM) i diklormetan mettet med H20 (150 ml) ble tilsatt til en rørt løsning av 3'-O-p-anisoyl-4'-azido-5'-deoksy-5'-jodtymidin (12,0 g, 2 2,8 mM), fremstilt f.eks. som beskrevet i eksempel 1, i diklormetan mettet med H20 (150 ml) . Etter 3 timer ved 21 °C ble reaksjonsblandingen fortynnet med diklormetan (200 ml) og n-butanol (50 ml) og så ekstrahert suksessivt med mettet vandig natriumbisulfitt (100 ml), mettet vandig natriumbikarbonat (100

ml) og H20 (100 ml). Den organiske fase ble så konsentrert under vakuum til en viskøs sirup. En løsning av sirupen i metanol (250 ml) og konsentrert ammoniumhydroksyd (250 ml) ble holdt ved 21°C i 16 timer, og så ble løsningsmiddelet fjernet ved avdampning. Resten ble kromatografert på en kolonne av silisiumdioksydgel (500 g) og eluert med ;8% metanol i diklormetan. Rent produkt ble

utvunnet og krystallisert fra etanol for å gi tittelforbindelse, 4'-azidotymidin (1,46 g, 23%) (sm.p. 175-176°).

2B. Formel I, hvor B varieres

Ved å følge fremgangsmåteh i del A og istedet for 3'-0-p-anisoyl-4'-azido-5'-deoksy-5'-jodtymidin anvende følgende: N6,o3',di-p-anisoyl-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-jodadenosin, N6, n6 , 03 ' , tri-p-anisoyl-4 ' -azido-2 ' , 5 ' -dideoksy-5' - jodadenosin, N2,o3'-di-p-anisoyl-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-jodguanosin, N2,N2,03'-tri-p-anisoyl-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-jodguanosin, 03'-p-anisoyl-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-joduridin, N4,o<3->tri-p-anisoyl-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-jodcytidin, N4,N4,03-tri-p-anisoyul-4'-azido-2',5'-dideoksy-5'-jodcytidin, oppnås følgende henhoidsvi-se forbindelser: 4'-azido-2',5'-deoksyadenosin (sm.p. 92-105°C), 4'-azido-2',5'-deoksyguanosin (sm.p. 250°C), 4 '-azido-2',5'-deoksyuridin (sm.p. 272-273°C), 4'-azido-2',5'-deoksycytidin (sm.p. 84-85°C),

EKSEMPEL 3

1-( 3- deoksv- 4- metoksy- a- L- glvcero- pentofuranosyl) tymidin

Formel III, hvor R3 er CH, ; B er tvmin og X og Y' er H

3',5'-dideoksytymidin-4én (30 mg, 0,144 mM) ble løst i 1,0 ml metanol og holdt under nitrogen. Fast kaliumbikarbonat (36 mg, 0,3 6 mM) ble tilsatt, og blandingen ble avkjølt i et is/vannbad. 3-klorperoksybenzosyre (0,214 mM) ble tilsatt i én mengde og blandingen rørt i 3 minutter før reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 2,0 ml av en l:l-blanding av mettet natriumbikarbonat og 10% (v/v) natriumtiosulfat i vann. Den resulterende blanding ble ekstrahert to ganger med 50 ml etylacetat:kloroform (1:3 v/v). Ekstraktene ble vasket med 2,0 uri-saltvann, kombinert, tørket over magnesiumsulfat*1 Suj^-.-■»—

■r

konsentrert under vakuum. Resten (31 mg) ble kromatografert på to silisiumgelplater, hvilket ga 1-(3-deoksy-4-metoksy-a-L-glycero-pentofuranosyl)tymidin (8 mg, 31 iM, 22%) som en olje.

EKSEMPEL 4

4'- azido- 3'- deoksythvmidin

Formel I, hvor B er thymin; X og Y' er H; og n er null

1-(2,3-dideoksy-4-metoksy-a-L-glycero-pentofuranosyl)thymin (19 mg, 74 /LtM) ble løst i 2 ml dimetylf ormamid under nitrogen og 31 mg (0,45 mM) imidazol og 31 mg (0,21 mM) t-butyldimetylsilylklorid ble tilsatt. Blandingen ble rørt ved romtemperatur i 3 timer før reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 2 dråper metanol. Blandingen ble heilt i 30 ml mettet natriumbikarbonat og ekstrahert to ganger med 50 ml etylacetat. Ekstraktene ble vasket med saltvann, tørket over magnesiumsulfat og konsentrert under vakuum. Den oljeaktige rest (40 mg) ble kromatografert på en silisiumdioksydgelplate ved å anvende kloroform som inneholdt 4% metanol som elueringsmiddel. Isolering av produktbåndet ga en silyleter, l-[2,3-dideoksy-5-0-(1,l-dimetyletyl).dimetylsilyl-4-metoksy-a-L-glycero-pentofuranosyl]thymin (24 mg, 65 juM, 89%)

som en olje.

Det neste trinn ble utført i to porsjoner; henholdsvis 16 mg og 7 mg silyleter. De to ble kombinert for opparbeiding og rensing. Fremgangsmåten for den største porsjonen er beskrevet nedenfor.

Silyleter (16 mg, 43 /iM) ble løst i 1,5 ml metylenklorid og azidotrimetylsilan (45 /xl) og trimetylsilyltrifluormetansulfonat (6 /ul) ble tilsatt.

Blandingen ble rørt i 72 timer ved romtemperatur og kombinert med reaksjonsblandingen fra 7 mg's porsjonen. Fortynning med 50 ml etylacetat:kloroform (1:3 v/v) og vasking med 5 ml mettet natriumbikarbonat, fulgt av 5 ml saltvann og tørking over magnesiumsulfat og påfølgende avdampning ga 16 mg av en olje. Kromatografering av oljen på silisiumdioksydgelplater fulgt av krystallisering fra etylacetat:heksan ga 4'-azido-3'-deoksythymidin (5 mg, sm.p. 55-60°C dekomp.) og 1-(4-azido-2,3-dideoksy-a-L-glycero-pentofuranosyl)thymin (3 mg, sm.p. 129-131-C).

EKSEMPEL 5

4'-azidothymidin

5'- monofosfatdinatriumsalt

Til en suspensjon av 4'-azidothymidin (0,20 g, 0,71 mM) i etylacetat (12 ml) avkjølt til 0°C ble tilsatt

pyrofosforylklorid (0,5 ml, 3,7 mM) . Etter røring i 4 timer ved 0°C ble løsningen nøytralisert (ph 6-7) ved tilsetning av mettet vandig natriumbikarbonat. Den organiske fase ble kastet, og den vandige fase ble rørt i 20 minutter med aktivert 14-60 mesh trekull. Trekullblandingen ble filtrert og trekullet skyllet med vann (200 ml). Alle filtrater og skyllevann ble kastet. Trekullet ble deretter vasket med 50% vandig etanol som inneholdt 5% ammoniumhydroksyd (250 ml) . Disse vaskinger ble konsentrert under vakuum til omtrent 5 ml og påført på en 3 x 23 cm kolonne av DEAE Sephadex (karbonatform). Kolonnen ble eluert med en lineær gradien som besto av 1 liter vann og 1 liter 0,5 M trietylammoniumbikarbonat (pH 7). Rent produkt ble oppsamlet og løsningsmiddelet fjernet ved avdampning. Resten ble avdampet gjentatte ganger sammen med vann, så løst i metanol (0,5 ml). Tilsetning av 0,45 M natriumperklorat i aceton (2 ml) til denne løsning forårsaket at tittelforbindelsen presipiterte ut. Avfiltrering av det faste stoff og tørking under vakuum etterlot 55 mg av 4'-azidothymidin 5'-monofosfatdinatriumsalt (sm.p. 185°C, dekomponering).

EKSEMPEL 6

4'-azidothymidin-5'-difosfattrinatriumsalt og 4'- azidothymin- 5'- trifosfattetranatriumsalt

En løsning av 4'-azidothymidin-5'-monofosfatdinatriumsalt (55 mg, 0,14 mM) i H20 (5 ml) ble påført på en kort kolonne av Dowex 50 (H<+>) harpiks (8 ml) og eluert med H20. Etter konsentrer ing av elueringsmiddelet til 5 ml, ble tributylamin (32 ml) og pyridin (5 ml) tilsatt og blandingen avdampet under vakuum. Resten ble avdampet sammen med pyridin og så med dimetylformamid. Til en løsning av resten i dimetylformamid (1 ml) ble det tilsatt en løsning av karbonyldiimidazol (0,11 g, 0,66 mM) i dimetylformamid (1,5 ml). Etter 2 0 timer ved romtemperatur ble metanol (0,04 ml, 1,0 mM) tilsatt. 3 0 minutter senere ble en løsning av tributylammoniumpyrofosfat (0,675 mM) i dimetylformamid (7 ml) tilsatt, og blandingen ble kraftig rørt i 20 timer ved romtemperatur. Etter filtrering ble løsningen fortynnet med et likt volum metanol og avdampet til en sirup. Sirupen ble løst i vann (10 ml) og påført på en 3 x 23 cm kolonne av DEAE Sephadex (karbonatform) som ble eluert med en lineær gradient som bestå av 2 liter vann og 2 liter 0,5 M trietylammoniumbikarbonat (pH 7). 4'-azidothymidin-5'-difosfatet ble eluert i ren form, fulgt av 4'-azidothymidin-5'-trifosfat. Etter avdampning av løsningsmiddel og gjentatt avdampning sammen med vann, ble hvert produkt løst i en liten mengde metanol. Tilsetning av en 0,45 -M løsning av natriumperklorat i aceton presipiterte så natriumsaltene. Avfiltrering av presipitatene og tørking under vakuum ga 4'-azidothymidin-5'-difosfattrinatriumsalt (12 mg) og 4'-azidothymidin-5'-trifosfattetranatriumsalt (54 mg, sm.p. 204 ° C, dekomponering).

EKSEMPEL 7

4'- azidothymidin- 3'. 5 '- cyklisk fosfatnatriumsalt 4'-azidothymidin-5'-monofosfatdinatriumsalt, fremstilt f.eks. som beskrevet i eksempel 5, blir passert gjennom en kolonne av Dowex 50-X8 kationerbytteharpiks (H+<->form) med vann som elueringsmiddel. Ved avdampning av vannet blir resten løst i en blanding av pyridin og vann som inneholder N,N'-dicykloheksyl-4-morfolinkarboksamidin og avdampes så under vakuum. Resten blir avdampet tre ganger sammen med pyridin. En løsning av den resulterende sirup i pyridin blir tilsatt dråpevis over 1 time til en løsning av dicykloheksylkarbodiimidat i pyridin under tilbakeløp. Når tilsetningen er fullstendig, blir blandingen oppvarmet under tilbakeløp i et tillegg på 2,5 timer, fulgt av fjerning av løsningsmiddelet ved avdampning under vakuum. En løsning av resten i vann blir ekstrahert med 10% butanol i diklormetan og så med dietyleter. Den vandige løsning blir konsentrert ved avdampning og satt på en 3 x 23 cm kolonne av

DEAE Sephadex (karbonatform) som blir eluert med en lineær gradien som består av 1 liter vann og 1 liter 0,5 M trietylammoniumbikarbonat (pH 7). Elueringsmiddel som inneholder det rene produkt blir avdampet under vakuum, og resten avdampes gjentatte ganger sammen med vann. Til en konsentrert løsning av resten i metanol blir det tilsatt 0,45 M løsning av natriumperklorat i aceton. Det presipiterte produkt fjernes og tørkes for å gi tittelforbindelsen 4'-azidothymidin-3'-5'-cyklisk fosfatnatriumsalt, sm.p. 155-157°C.

På lignende måte kan de andre forbindelsene med formel I, hvor n er 1 omdannes til den cykliske fosfatform. Ved å substituere kalsiumklorid istedet for natriumperklorat oppnås 4'-azidothymidin-3',5'-cyklisk fosfatkalsiumsaltet.

EKSEMPEL 8

Natriumsaltet av 4'- azidothymidin 4'-azidothymidin løses i vann. Én molar ekvivalent av natriumhydroksyd i vann tilsettes, og løsningen røres i 1 time. Løsningen blir så lyofilisert for å isolere natriumsaltet av 4'-az idothymidin.

På lignende måte kan alle forbindelser med formel I, hvor n er null, omdannes til basetilsetningssaltene ved behandling med den passende base, f.eks. natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, 1itiumhydroksyd og lignende.

EKSEMPEL 9

9A. 3'. 5'- diadamantovlester av 4'- azidothymidin

4'-azidothymidin (280 mg) og 10 mg 4-dimetylaminopyridin i en løsning av 7 ml pyridin tilsettes 2,1 ekvivalenter av adamantankarboksylsyreklorid som en løsning i 3 ml metylenklorid. Løsningen røres magnetisk i 18 timer ved 21°C, og 1 ml metanol tilsettes så. Løsningen konsentreres, og resten renses ved kromatografering for å gi tittelforbindelsen, 4'-azidothymidin-3',5'-diadamantoat.

9B. 3', 5'- di- O- acetvlester av 4'- azidothymidin

Til en løsning av 4'-azidothymidin (1,00 gf --3,53 mM) i pyridin (10 ml) blir det tilsatt eddiksyreanhydrid (2,0 ml, 21 mM). Etter 2 timer ved 20°C blir løsningsmiddelet fjernet ved avdampning. Resten renses ved kromatografering på silisiumdioksydgel ved å anvende en gradienteluering av 2% til 4% metanol i diklormetan. Ren 4'-azido-3',5'-di-0-acetylthymidin isoleres som 0,92 g (71% utbytte) av et hvitt skum. 4i NMR (CDC13) ga 8,94 (1H, bred s, NH), 7,17 (1H, d, H-6), 6,42 (1H, dd, H-l'), 4,41 (2H, s, H-5'), 2,55 (2H, m, H-2'), 2,17 (3H, s, OAc), 2,16 (3H, s, OAc), 1,96 (3H, d, CH3) .

9C. 3'. 5'- di- O- acetvlester av 4'- azido- 2'- deoksyuridin

En løsning av 4'-azido-2'-deoksyuridin (269 mg, 1,00 mM), eddiksyreanhydrid (1,0 ml, 10,6 mM) og pyridin (6 ml) holdes ved romtemperatur i 4 timer og avdampes så under vakuum til en sirup. Sirupen renses ved tynnskiktkromatografering på silisiumdioksydgel ved å anvende 5% metanol i diklormetan som elueringsmiddel. Produktet krystalliseres fra etanol for å gi 334 mg (95% utbytte) av 4'-azido-2'-deoksy-3',5'-di-0-acetyluridin, sm.p. 136-137°C.

9D. 5'- O- benzoylester av 4'- azidothymidin

En løsning av 4'-azidothymidin (140 mg, 0,5 mM), benzoylklorid (70 /xl, 0,6 mM) og pyridin (1,0 ml) holdes ved 20°C i 3 timer. Etter tilsetning av 0,1 ml metanol blir løsningsmiddelet fjernete ved avdampning. Resten renses ved preparativ tynnskikt-kromatograf ering på silisiumdioksydgel idet man eluerer med 5% metanol i diklormetan. Produktet (4'-azido-5'-O-benzoylthymidin) isoleres som 0,10 g (53% utbytte) av et hvitt skum. <1>H NRM (CDC13) ga 11,37 (1H, bred s, NH), 8,05-7,52 (5H, m, Ph), 7,44 (1H, d, H-6), 6,36 (1H, dd, H-l'), 5,98 (1H, bred s, OH), 4,73 (1H, m, H-3'), 4,65 (1H, d, H-5'), 4,55 (1H, d, H-5'), 2,40 (2H, m, H-2'), 1,70 (3H, d, CH3) .

EKSEMPEL 10

10A. 1- (4 ' -azido-2-deoksy-3 , 5-di-0-acetyl-/3-D-erytropento-furanosyl)- 5- metyl- 4-( 1, 2. 4- triazol- l- yl) pyrimidin- 2( 1H^- on

Til en suspensjon av triazol (693 mg, 10,0 mM)" i acetbnitril

(6,0 ml) blir det tilsatt fosforylklorid (226 ul, 2,43 mM). Blandingen avkjøles til 0°C, og så blir trietylamin (1,26 ml, 9,3 mM) langsomt tilsatt. Etter 10 minutter ved 0°C blir en løsning av 4'-azido-3',5'-di-0-acetylthymidin (460 mg, 1,26 mM) i acetonitril (4,0 ml) tilsatt, og blandingen bringes til romtemperatur. Etter røring i 2 timer blir de faste stoffer fjernet ved filtrering, og filtratet konsentreres ved avdampning. Løsningen renses ved preparativ

tynnskiktkromatografering på silisiumdioksydgel ved å eluere med 5% metanol i diklormetan. Det isolerte produkt krystalliseres fra metanol, hvilket gir 474 mg (90% utbytte) av tittelforbindelsen, sm.p. 109-111°C.

10B. 1- (4-azido-2-deoksy-/?-D-erytro-pentofuranosyl) -4-etoksy-5-metylpvrimidin- 2-( 1H)- on

En løsning av 1-(4-azido-2-deoksy-3,5-di-O-acetyl-/3-D-erytro-pentofuranosyl)-5-metyl-4-(1,2,4-triazol-l-yl)pyrimidin-2(1H)-on (42 mg, 0,1 mM) i IN løsning av natriumetoksyd i etanol (1,0 ml) holdes ved romtemperatur i 2 timer. Løsningen påføres direkte på en preparativ tynnskiktsilisiumdioksydgel-kromatogra-feringsplate, og elueres med diklormetan/meranol 9:1. Den rene tittelforbindelse isoleres som 26 mg (84% utbytte) av et hvitt skum. <X>H NMR (DMS0-d6) ga 7.93 (1H, d, H-6), 6,30 (1H, dd, H-l'), 5,74 (1H, d, )H), 5,64 (1H, t, OH), 4,45 (1H, m, H-3'), 4,32 (2H, q, )CH2CH3), 3,66 (2H, m, H-5'), 2,31 (2H, m, H-2'), 1,89 (3H, d, CH3) , 1,31 (3H, t, 0CH,CH,) .

10C. 1- (4-azido-2-deoksy-j6-D-erytro-pentofuranosyl) -4-iso-propoksv- 5- metylpyrimidin- 2( 1H )- on

En løsning av 1- (4-azido-2-deoksy-3 , 5-di-0-acetyl-/3-D-erytro-pentofuranosyl)-5-metyl-4-(1,2,4-triazol-l-yl)pyrimidin-2(1H)-on (168 mg, 0,40 mM) i en IN løsning av kaliumisopropoksyd i isopropanol (4,0 ml) holdes ved romtemperatur i 1,5 timer. Løsningen nøytraliseres med Dowex 50 (H+) harpiks og filtreres. Filtratet konsentreres under vakuum til en olje som renses ved preparativ tynnskiktkromatografering ved å anvende 10% metanol i diklormetan som elueringsmiddel. Den rene tittelforbindelse oppnås som 105 mg (80% utbytte) av et hvitt skum. <X>H NMR (DMSO-d6) ga 7,90 (1H, d, H-6), 6,30 (1H, dd, H-l'), 5,74 (1H, d, OH) , 5,63 (1H, t, OH) , 5,26 (1H, m, OCH(CH3)2), 4,45 (1H, m, H-3' ) , 3,66 (2H, m, H-5'), 2,31 (2H, m, H-2'), 1,86 (3H, d, CH3), 1,30 (3H, s, CH3) , 1,28 (3H, s, CH3) .

10D. 1- (4-azido-2-deoksy-j8-D-erytro-pentofuranosyl) -5-metyl-pyrimidin- 2-( 1H )- on

En løsning av 1-(4-azido-2-deoksy-3,5-di-0-acetyl-/3-D-erytro-pentofuranosyl)-5-metyl-4-(1,2,4-triazol-l-yl)pyrimidin-2(1H) -on (335 mg, 0,80 mM), hydrazinhydrat (160 ml, 3,2 mM) og acetonitril (6,0 ml) holdes ved 20°C i 1 time og avdampes så under vakuum til en sirup. Sirupen kromatograferes på tynnskikt-silisiumdioksydgel ved å eluere med diklormetan/metanol 85:15 som inneholder 1% konsentrert ammoniumhydroksyd. Hovedproduktet, isolert som et hvitt pulver, oppvarmes under tilbakeløp i etanol (15 ml) i nærvær av sølv(I)oksyd (300 mg). Etter 2 timer blir den filtrerte reaksjonsblanding avdampet under vakuum til en sirup. Sirupen renses ved preparativ tynnskiktkromatografering på silisiumdioksydgel, ved å eluere med diklormetan/metanol 85:15 som inneholder 1% konsentrert ammoniumhydroksyd. Det isolerte produkt krystalliseres fra etylacetat, hvilket gir 88 mg (41% utbytte) av tittelforbindelsen, sm.p. 143-144°C.

10E. 4'- azido- 2'- deoksv- 5- metylcytidin

En løsning av 1- (4-azido-2-deoksy-3 , 5-di-0-acetyl-/3-D-erytro-pentofuranosyl)-5-metyl-4-(1,2,4-triazol-l-yl)pyrimidin-2(1H)-on (21 mg, 50 iil) , dioksan (0,20 ml) og konsentrert ammoniumhydroksyd (0,20 ml) holdes ved romtemperatur i 2,5 timer. Løsningen påføres direkte på en preparativ tynnskiktsilisiumdioksydgelkromatograferingsplate og elueres med diklormetan/metanol 85:15 som inneholder 1% konsentrert ammoniumhydroksyd. Produktet isoleres og krystalliseres fra etanol/etylacetat for å gi 10 mg (71% utbytte) av tittelforbindelsen, sm.p. 132-134°C.

10E. 4'- azido- 2'- deoksycytidin

Til en suspensjon av triazol (480 mg, 6,96 mM) i acetonitril (4,0 ml) blir det tilsatt f osf orylklorid (150 /il, 1,61 mM) . Blandingen avkjøles til 0°C og så blir trietylamin (0,91 ml, 6,4 6 mM) langsomt tilsatt. Etter 10 minutter ved 0°C blir en løsning av 4'-azido-2'-deoksy-3',5'-di-O-acetyluridin (300 mg, 0,85 mM) i acetonitril (2,5 ml) tilsatt, og blandingen blir bragt til romtemperatur. Etter rør ing i 2 timer blir de faste stoffer fjernet ved filtrering, og filtratet blir konsentrert ved avdampning. Resten kromatograferes på preparativ silisiumdioksydgelplater ved å anvende 4% metanol i diklormetan som elueringsmiddel. Hovedproduktet isoleres som 240 mg av et hvitt skum. En løsning av skummet i dioksan (4,0 ml) og konsentrert ammoniumhydroksyd (8,0 ml) holdes ved romtemperatur i 16 timer. Løsningen konsentreres under vakuum og renses ved preparativ tynnskiktsilisiumdioksydgelkromatografering ved å anvende etylacetat/propanol/vann 5,5:1,5:3 (organisk fase) som elueringsmiddel. Produktet isoleres som et skum som blir triturert med etylacetat for å gi 160 mg (70% utbytte) 4'-azido-2'-deoksycytidin som et hvitt pulver, sm.p. 84-85°C.

På samme måte, ved istedenfor adamantankarboksylsyreklorid å substituere det passende antall molare ekvivalenter av det passende syreklorid, oppnås 4'-azidothymidin-3',5'-dipalmitoat, 4'-azidothymidin-3',5'-dibenzoat, 1-(4-azido-2,3-dideoksy-a-L-glycero-pentofuranosyl)thymidin-5'-acetat, eller 1-(4-azido-2,3-dideoksy-a-L-glycero-pentofuranosyl)thymidin-5'-anisoat.

EKSEMPEL 11

4'- azido- 3' , 5'- di- O-( 3- pyridinylkarbonvl) thymidin 4'-azidothymidin (1,05 g, 3,71 mM) løses i tørr pyridin (35 ml) under nitrogen. Nikotinoylkloridhydroklorid (1,45 g, 8,15 mM) fulgt av 4-dimetylaminopyridin (0,1 g, 0,82 mM) og trietylamin (1,5 ml, 8,25 mM) tilsettes under røring. Blandingen røres ved romtemperatur i 5 timer, og reaksjonen stoppes ved tilsetning av metanol (0,5 ml). Blandingen helles i en vandig mettet natriumbikarbonatløsning og ekstraheres med etylacetat. Den organiske fase vaskes med saltvann og tørkes over

magnesiumsulfat. Etter avdampning av løsningsmiddelet blir den oljeaktige rest kromatografert på en silisiumdioksydgelkolonne ved å anvende etylacetat/heksan-blanding som det eluerende løsningsmiddel. Fraksjonene som inneholder produktet, kombineres og avdampes. Resten krystalliseres fra en etylacetat/heksan-blanding for å gi 1-(4-azido-3',5'-di-O-(3-pyridinylkarbonyl)thymidin, sm.p. 204-2 06°C.

EKSEMPEL 12

4'- azido- 5'- O- f1, 4- dihvdro- l- metyl- 3- pyridinylkarbonvl) thymidin

12A. 4'- azido- 5'- O-( 3- pyridinvlkarbonyl) thymidin

4'-azidothymidin (1,05 g, 3,7 mM) løses i tørr pyridin (35 ml) og nikotinoylkloridhydroklorid (0,8 g, 4,4 mM) tilsettes, fulgt av trietylamin (0,62 ml, 4,4 mM). Blandingen holdes ved romtemperatur i 3 timer. Pyridin fjernes under vakuum, og den gjenværende rest renses ved kromatografering. De passende fraksjoner kombineres for etter avdampning av elueringsmiddelet å gi 4'-azido-5'-0-(3-pyridinylkarbonyl)thymidin.

12B. 4'- azido- 5'- 0-( l- metvl- 3- pyridinkarbonyl) thymidin

4'-azido-5'-0-(l-metyl-3-pyridinkarbonyl)thymidin (69 mg, 0,18 mM) løses i aceton (3 ml) og jodmetan (0,1 ml, 1,6 mM) tilsettes. Blandingen tas under tilbakeløp i 4,5 timer, og jodmetan (0,005 ml, 0,8 mM) tilsettes. Etter 2 timer til med oppvarming, tillates blandingen å avkjøles til romtemperatur. Det dannes en rest, og heksan (3 ml) tilsettes for å presipitere mere produkt. Etter fjerning av morvæsken, isoleres 4'-azido-5'-0-(l-metyl-3-pyridinkarbonyl)thymidin som et gult faststoff, sm.p. 130-134°C.

12C. 4'-azido-5'-0-(1,4-dihydro-l-metyl-3-pyridinylkarbonyl)-thymidin

En vandig løsning som inneholder natriumhydrosulfitt (0,2 M) og natriumbikarbonat (0,2 M) avluftes ved å boble en strøm av argongass gjennom løsningen i 2 timer ved romtemperatur. Denne løsning (2,5 ml) tilsettes under argon til 4'-åzido-5'-0-(1-metyl-3-pyridinkarbonyl)thymidin (45 mg, 0,085 mM) ved romtemperatur. Den resulterende blanding røres ved romtemperatur i 30 minutter. Supernatanten fjernes fra det lysegule presipitat, som tørkes under vakuum for å gi 4'-azido-5'-O-(1,4-dihydro-l-metyl-3'-pyridinylkarbonyl)thymidin, sm.p. 115-127"C.

EKSEMPEL 13

4'- azido- 3', 5'- di- O- isopropylthymidin 4'-azido-N<3>benzoylthymidin (1 mM) fremstilt i henhold til fremgangsmåten til M. Sekine et al., Synthesis 1119 (1987) løses i dimetylsulfoksyd (10 ml) og natriumhydrid (2,1 ekvivalenter) tilsettes, og blandingen røres ved romtemperatur i 30 minutter. Til denne blanding tilsettes 2-jodpropan (10 ekvivalenter), og blandingen etterlates ved 60°C inntil det meste av startmateria-let er forsvunnet som målt ved tynnskiktkromatografering. Reaksjonsblandingen fordeles mellom saltvann og etylacetat. Den organiske fase tørkes og avdampes til tørrhet. Resten løses i metanolisk ammoniakk og etterlates i 1 time ved romtemperatur. Løsningsmiddelet avdampes til tørrhet, og resten renses ved kolonnekromatografering for å gi tittelforbindelsen, 4'-azido-3',5'-di-O-isopropylthymidin.

Bestemmelse av aktivitet ved å anvende Alex- celler in vitro-målinq

Denne fremgangsmåte er en modifisering av en fremgangsmåte i utgangspunktet beskrevet av Chen et al., Biochemical Pharmacology, 36 (24) , 4361-4362 (1987) .

A3 01 (Alex) celler blir preinfisert med en konstant mengde av HIV (LAV-stamme) i 3 timer ved 37 °C. Testforbindelser og AZT (kontroll) tilsettes til de infiserte celler i to, tre eller fire gangers fortynninger, på fire steder for kartlegging og åtte steder for bekreftelse. Med mindre det er nevnt, er den høyeste konsentrasjon 200 mM. Testplatene inkuberes i C02 ved 37°C i opptil 12 dager (inkuberingstid avhenger av virussamlingstiter) med et delvis medium/prøveforandrings-midtpunkt i løpet av inkuberingsperioden. Uinfiserte A301-celler med prøvefortynninger, men uten virus, kan anvéndes til å '

evaluere cytotoksysiteten.

Revers transkriptasenivåer måles på slutten av inkuberingsperioden som følger, for å bestemme om antivirusaktivitet er tilstede. 55 ml medium fra de HIV-infiserte Alex-celler tilsettes til 10 ml 3,2% Triton X-100. Denne løsningen inkuberes i 30 minutter ved 37°C, så tilsettes 25 ml 4 ganger målingsblanding til den. 4 ganger målingsblandingen inneholder [<3>H]TTP, poly(A).oligo(dT), kaliumklorid, magnesiumklorid, ditiotreitol og Tris-HCL-buffer, pH 8,0. Etter inkubering av denne løsning i en tilleggstid på 60 minutter, blir 20 ml avsatt flekkvis på Whatman 3 MM papir. Papiret vaskes i 5% TCA, 1% natriumpyrofosfat tre ganger (10 minutter hver), fulgt av én vasking (10 minutter) i etanol. Den gjenværende radioaktivitet på 3MM-papiret kvantifiseres ved scintillasjonsceller og tilsvarer revers transkriptasenivået.

Forbindelsene i henhold til den foreliggende oppfinnelse viser aktivitet når de testes ved denne fremgangsmåte, som vist nedenfor.

Kinetisk studium av revers transkriptase og DNA- polvmeraseinhibering

Denne fremgangsmåte er en modifisering av fremgangsmåter i utgangspunktet beskrevet av Chen et al., Molecular Pharmacology, 25, 441-445 (1984) og som beskrevet av Wang et al., Biochemistry, 21, 1597-1608 (1982).

4'-azidothymidin-5'-trifosfat ble testet som inhibitor mot HIV revers transkriptase og mot a og 6 DNA polymerase fra humane kB-celler. Poly (A) oligo (dT) 12-i8 b"'"e anven<^t som templatprimer for HIV revers transkriptasemålingen, mens aktivert DNA ble anvendt som en templatprimer for a og 6 DNA polymerase. 4'-

azidothymidintrilw^fat ble funnet å være en kompetitiv inhibitor mot thymidintrif osf at med en K A på 0,008 mM, 62,5 mM og 150 mM for HIV revers transkriptase, og a og 6 DNA polymerase.

Bestemmelse av toksisitetvirkninqer ved å anvende humane hematopoetiske celler in vitro

Denne fremgangsmåte er en modifisering av fremgangsmåter i utgangspunktet beskrevet av Diainiak et al., British Journal og Haematology, 69, 229-304 (1988), eller som beskrevet av Sommadossi et al., Agents and Chemotherapy, 31 (3), 452-454 (1987).

Virkningen av 4'-azidothymidin og AZT på dannelsen av erytroide og GM-kolonier fra forløpere i humant perifert blod og benmarg ble sammenlignet; hvorfra inhiberingen av 4'-azidothymidin og AZT mot humane hematopoetiske celler ble sammenlignet.

Fremstilling: av ikke- adherente mononukleære celler

I hvert eksperiment ble perifert blod eller benmarg fra én enkelt donor anvendt. Humane perifere blodmononukleære celler (PBL) ble separert fra heparinisert blod fra medikamentfrie donorer ved tetthetsgradientsentrifugering i Ficoll (Pharmacia). Fullblod fortynnet 1:1 med Hanks balanserte saltløsning (HBSS, Gibco) ble lagt i et lag på toppen av Ficoll og sentrifugert ved 400 x g i 30 minutter. Celler ble oppsamlet fra interfasen, og etter vasking ble konsentrasjonen justert til 2xl0<6> celler/ml i RPMI-1640 medium med 25 mM Hepes buffer (Gibco). Monocytter ble fjernet ved adherens til plast i store petriskåler (150x15 mm), ved å tilsette 2 0 ml av cellesuspensjonen/skål og inkubere i 1 time ved 37°C. Ikke-adherente mononukleære celler (MN) ble fjernet ved kraftig vasking av petriskålen med varm (37°C) HBSS.

Fremstilling av benmarcrmononukleære celler ( BM)

Benmargaspirater fra friske donorer ble oppsamlet i hepariniserte sprøyter. Hele den mononukleære cellefraksjon ble separert ved Ficoll-Paque tetthetsgradientsentrifugering (400 x g i 30 minutter). Celler oppsamlet fra grenseskiktet ble vasket tre ganger i HBSS og resuspendert i kulturmedium som beskrevet nedenfor for CFU-GM-måling.

CFF- GM- måling ( myeloide forløpere)

MN (l,5xl0<6> celler/ml) og BM (lxlO<5> celler/ml) ble dyrket i komplett medium som følger: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco) tilsatt 20% varme-inaktivert fetalt kalveserum (FCS, Hyclone) , 2 mM L-glutamin, 5 x 10-<5> M 2-merkaptoetanol, penicillin (100 U/ml), streptomycin (100 mg/ml) og 0,3% bacto-agar (Difco). Alle tilsatte stoffer var fra Gibco, med mindre annet er spesifisert. Celler ble platet ut i 35x100 mm Lux petriskåler (suspensjonsskåler) i triplikat og inkubert ved 37°C med 5% C02 i luft ved 100% fuktighet. En supernatant fra en T-cellelinje (GCT, Gibco), som inneholdt GM-kolonistimulerende faktor (GM-CSF), ble anvendt i en sluttkonsentrasjon på 10% i komplett medium. Testede forbindelser ble tilsatt til test-skålene i konsentrasjoner på 10"<9> til 10"<4> M. Celler ble inkubert i luft som inneholdt 5% C02 (100% fuktighet) ved 37°C i 14 dager. Kolonier ble talt under et disseksjonsmikroskop. En CFU-GM-koloni ble definert som en klump av 50 eller flere celler som besto av granulocytter, monocytt-makrofager, eller begge.

BFU- E- måling ( for tidlige erytroide forløpere) og CFU- E- måling

( for sene erytroide forløpere)

MN ble dyrket i en konsentrasjon på 3 x 10<5> celler/ml. Kultirmediet besto av Iscoves Modified Eagle Medium (Gibco) tilsatt 3 0% varmeinaktivert FCS (Hycklone), penicillin (100 ml), streptomycin (100 mg/ml), 2-merkaptoetanol (1 x 10"<4>, 1% deioni-sert okseserumalbumin (BSA, Sigma), DEAE-Dextran 40 mg/ml (Pharmacia), 0,8% metylcellulose (4000 Centipose, Fisher) og erytropoietin 2 U/ml (Connaught Laboratories). Celler ble platet ut i 96-brønnsplater (200 ml/brønn) og inkubert ved 37°C med 5% C02 i luft (100% fuktighet) i 7-14 dager. CFU-E-kolonier ble talt på dager 7-8. Klumper av 8 eller flere hemoglobiniserte celler ble betraktet som en koloni. BFU-E-kolonier ble talt på dag 14. Aggregater av 50 eller flere celler ble talt som en koloni. Kolonier ble bekreftet som erytroide ved benzidinfarginger.

Statistisk analyse

Alle tester ble utført i triplikat. De 50% inhibitoriske konsentrasjonene (IC50) for alle typer av kolonier ble bestemt ved å anvende et RS 1-program på en IBM-PC.

Forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelse viser minsket toksisitet når sammenlignet med AZT ved denne fremgangsmåten, som vist i de følgende tabeller.

Komparative virkninger på dannelsen av granulocytt-makrofagkolonier (CFU-GM) ved human benmarg og perifere blodmononukleære celler

Komparative virkninger på erytroide kolonier, DFU-E og BFU-E, ved human benmarg og perifere blodmononukleære celler

Bestemmelse av aktivitet ved å anvende Friend leukemivirus i mus

Denne fremgangsmåte er en modifisering av en fremgangsmåte i utgangspunktet beskrevet av Jones et al., Journal of Virology,

62 (2), 511-518 (1988), eller ved modifikasjoner av denne.

Friend leukemiviruskompleks (FLVC) ble anvendt. Dette retroviruskompleks består av både hjelpe og defekte viruspartik-ler.

Seks uker gamle hunn-Balb/c mus fra Bantin og Kingman, som hver veide gjennomsnittlig 18 g, mottok 0,2 ml av en løsning

(som besto av virus fortynnet i PBS som inneholdt 0,002 M EDTA)

administrert i 2 0 FFU/mus intravenøst. Behandlinger begynte 4 timer etter infeksjon og fortsatte i 9 dager. AZT og 4'-azidothymidin ble administrert i 60 mg/kg/dose 2 ganger daglig på dag 0, 4 og 5; og på dager 1-3 og 6-8 ble det administrert 3 ganger daglig i 40 mg/kg/dose. 2',3'-dideoksycytidin ble administrert i 120 mg/kg/dose 2 ganger daglig på dag 0, 4 og 5; og på dager 1-3 og 6-8 ble det administrert 3 ganger daglig i 80 mg/kg/dose.

Alle behandlinger ble gitt intraperitonealt, 0,5 ml/dose. På dag

9 etter infeksjon ble miltene fjernet, farget og fiksert i Bouins løsning i 2 timer og så veiet. Foci ble talt på miltene. En standard t-test ble kjørt for å sammenligne forskjell i milt-vekter og forskjell i antall foci-dannende enheter (FFU'er) pr. milt mellom grupper.

Forbindelser i henhold til den foreliggende oppfinnelse viser anti-virusaktivitet når de testes ved denne fremgangsmåte, som vist i følgende tabell.

Effektivitet av forbindelser mot Friend leukemivirus i mus

Claims (2)

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av en terapeutisk aktiv forbindelse med formel I hvori B er guanin, adenin, thymin, uracil, cytosin, 5-metylcytosin, 4-etoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, 4-isopropoksy-5-metyl-2-okso-pyrimidin, eller 5-metyl-2-okso-pyrimidin; X er H; Y<»> er H eller OH; og hvor n er null, 1 eller 3; eller Y' og Z sammen danner et cyklisk fosfatester; og de farmasøytisk akseptable estere og salter av denne, karakterisert veda) at man omsetter en forbindelse med formel II hvor B' er det samme som B i formel I, eller en acylert ekvivalent av dette; R er metyl eller en acylgruppe såsom anisoyl, benzoyl, acetyl eller furan-2-karbonyl; X er H; og Z er metylen med en avgående gruppe, slik som jod eller brom; med et oksydasjonsmiddel, fulgt av tilsetning av en base; eller b) at man omsetter en forbindelse med formel hvor B er som ovenfor angitt; X er H; Y' er H eller OH; R3 er laverealkyl; og R4 er -OH eller tri-substituert silyloksy; med (1) hvis R<4> er OH, et silylerende middel og en base fulgt av et azid i nærvær av en Lewis-syrekatalysator, eller (2) hvis R<4 >er tri-substituert silylosky, som reagerer med et et azid i nærvær en Lewis-syrekatalysator; og at man eventuelt omsetter en forbindelse med formel I, hvor n er null, med et fosforylerende middel for å gi en forbindelse med formel I, hvor n er 1 eller 3; eller omsetter en forbindelse med formel I, hvor n er 1 med et ringdannende middel for å gi en forbindelse med formel I hvor Y' og Z sammen danner et cyklisk fosfat; eller omsetter en forbindelse med formel I med en pyridinkatalysator og et syreklorid for å gi den tilsvarende ester av en forbindelse med formel I; eller omsetter en forbindelse med formel I med en farmasøytisk akseptabel base for å danne det tilsvarende baseaddisjon-salt med formel I; eller omsetter et baseaddisjossalt av en forbindelse med formel I med en syre for å danne den frie forbindelse med formel I; eller omdanner et farmasøytisk akseptabelt baseaddisjonsalt av en forbindelse med formel I til et annet farmasøytisk akseptabelt baseaddisjonsalt av en forbindelse med formel I.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1 ved fremstilling av 4'-azido-tymidin, 4'-azido-2'-deoksyadenosin, 4'-azido-2'-deoksyguanosin, 4'-azido-2'-deoksyuridin, 4'-azido-2'-deoksycytidin, 1- (4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl) -4-amino-5-metyl-2-oksypyrimidin, 1- (4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl) -4-etoksy-5-metyl-2-oks opy r iraid i n, 1- (4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl) -4-iso-propoksy-5-metyl-2-oksopyrimidin, 1- (4-azido-2-deoksy-/3-D-erytro-pentofuranosyl) -5-metyl-2-oksopyrimidin, karakterisert ved at man anvender tilsvarende subsituerte utgangsmaterialer.