NO168273B - Anordning for bruk i en assay-teknikk for kvalitativ og/eller kvantitativ paavisning av et kjemisk, biokjemisk ellerbiologisk materiale i en proeve. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en anordning av den art som er angitt i krav l's ingress, samt anvendelse av anordningen som angitt i krav 11.

Internasjonal patentpublikasjon nr. WO/84/02578 beskriver og krever en påvisningsteknikk for kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av kjemisk, biokjemisk eller biologisk materiale i en prøve og som består av a) å dekke minst en på forhånd bestemt del av en overflate med preformet relieff-profil og et substrat med en tynn film av et materiale i stand til å binde materialet som skal påvises hvor over-flatedelen valgfritt er aktiv med hensyn til stråling minst over et på forhånd bestemt bølgelengdeområde; b) kontakte den dekkede overflate med prøven; og c) observere de optiske egenskaper av denne overflatedel for å bestemme en kvalitativ og/eller kvantitativ forandring i optiske egenskaper som et resultat av bindingen av materiale på den tynne materialfilmen. Samme publikasjon beskriver og krever også en anordning for bruk i en slik påvisningsteknikk hvor anordningen består av en substrat med en overflate med en preformet relieff-profil som er optisk aktiv med hensyn til bestråling minst over et på forhånd bestemt område av bølgelengder og hvor minst en på forhånd bestemt del av denne overflate er dekket med en tynn film av et materiale i stand til å bestemme et på forhånd bestemt kjemisk eller biokjemisk eller biologisk materiale. Substratet er mest foretrukket et lamilært plastmateriale og kan passende være i strip-form. Den preformede overflaterelieff-profil kan ha et antall former men stort sett kan profilen gis som et nettverk. Den kan bestå av et enkelt nettverk av to eller tre kryssede nett. Nettverkprofilen kan være firkantbølget, sinusoid eller sagtannet foreksempel kan den også være avledet fra arrangementet av en serie utstikkere dannet på overflaten.

Det vil være passende heretter å bruke uttrykket "nettverk" for å referere til en overflate med en preformet relieff-profil av typen angitt i Internasjonal Patentpublikasjon WO84/02578. Det vil være gunstig at overflaten som består av nettverket kan være av samme materiale som substratet i seg selv eller det kan være av et forskjellig materiale (i hvilket tilfelle substratet vil bære det forskjellige materiale).

Internasjonal Patentpublikasjon nr. WO/84/02578 angir en oppfinnelse hvor et hovedkaraktertrekk er bruken av et nettverk i en påvisningsteknikk. Den kombinerer effektivt de optiske effekter som kan oppnås ved å bruke nettverk med kjemiske eller biokjemiske teknikker brukt i molekylære assays for å forbedre slike assays. Angivelsen av Internasjonal Patentpublikasjon nr. WO84/02578 er innebefattet heri ved referanse til denne. Den nåværende forståelse av de mekanistiske aspekter av denne tidligere oppfinnelse er at forandringen i optiske egenskaper til anordningen som et resultat av bindingen til materiale som skal påvises (foreksempel et spesifikt antigen i blodserum) oppstår essensielt som et resultat av i) massen eller mengden av bundede molekyler og ii) deres dielektriske egenskaper. Sensitivi-tet vil imidlertid avhenge av størrelsen av antigenmolekyl i betraktning: flere små molekyler vil behøve å være bundet enn store molekyler for å gi samme forandring i optiske egenskaper (under forutsetning at de dielektriske egenskaper av forskjellige molekyler er uforandrede). Selv om teknikken ifølge denne tidligere oppfinnelse gir en vesentlig forbedring i faget begrenser likevel denne avhengighet av molekylstørrelse og dielektriske egenskaper anvendelsen av teknikken. Foreliggende oppfinnelse har til hensikt å overkomme eller utjevne denne begrensning av den tidligere oppfinnelse.

Fordi overflatefenomen i stor grad påvirker både de fysiske og kjemiske aspekter til en måleteknikk som innebefatter bruk av aktive molekyler festet til en nettverkoverflate er det ikke mulig å forutsi på forhånd hvordan en anordning som beskrevet og krevet i Internasjonal Patentpublikasjon nr. WO84/02578 vil oppføre seg dersom den ble modifisert ved innebefattelsen av ytterligere molekyler i den tynne film av materiale som var i stand til å binde materiale som skal påvises. Etter utstrakt undersøkelse er det funnet at overraskende meget stor økning i målingssensitivitet kan oppnås dersom de aktive lag (dvs. den tynne film av materialet i stand til å binde materialet som skal påvises) dannet over nettverket er tilsatt et fluorescent molekyl; videre er sensitiviteten av systemet meget mindre avhengig av størrelse eller mengde av de bundede molekyler og deres dielektriske egenskaper. Følgelig i et aspekt av foreliggende oppfinnelse er det fremskaffet en anordning for bruk i en påvisningsteknikk for kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av et kjemisk, biokjemisk eller biologisk materiale i en prøve. Anordningen består av et substrat med eller som bærer en overflate med en preformet relieffprofil som er optisk aktiv med hensyn til bestråling minst over et på forhånd bestemt bånd bølgelengder og hvor minst en på forhånd bestemt del av overflaten er dekket med en tynn film materiale i stand til å binde et på forhånd bestemt kjemisk eller biokjemisk eller biologisk materiale hvor den tynne film av materiale innebefatter molekyler av fluorescent forbindelse hvis fluorescente egenskaper viser en observerbar avhengighet av dets molekylære miljø.

Anordningen er således særpreget ved det som er angitt i krav l's karakteriserende del. Ytterligere trekk fremgår av kravene 2-10.

Den preformede relieff-profil er fortrinnsvis et nettverk. Et enkelt nettverk kan anvendes eller overflaten kan bestå av to eller flere nettverk anbragt gjensidig med en vinkel til hverandre. Hvor det er to slike nettverk kan de være gjensidig ortogonale. Profilen av det ene eller hvert nettverk er fortrinnsvis firkantet bølget eller sinusoid. Sinusoide nettverk er for tiden foretrukket. Sagtannede profiler er også mulige men er ikke for tiden foretrukket.

Den preformede relieff-profil kan alternativt bestå av en regelmessig rad utstikkere. Med en overflate av denne type tilsvarer beliggenheten av toppene av utstikkerne og dalene mellom utstikkerne toppene og dalene av en nettverktype struktur.

Et monomolekylært lag av det respektive materiale vil være tilstrekkelig og vil generelt være foretrukket.

Den preformede relieffprofil kan være tilstede ved overflaten av substratet eller ved overflaten av et lag båret av substratet.

Passende er substratet dannet av plastmateriale. Et for tiden foretrukket plastmateriale er polymetylmetakrylat.

Et alternativt substrat er et glass dekket med et syntetisk polymerisk materiale. Hvor den preformede relieffprofil er dannet av et plastmateriale er plastmaterialer som herdes av ultrafiolett lys foretrukket og spesielt akryliske eller polyestermaterialer kan fordelaktig brukes hvor plastmaterialet fortrinnsvis har en refraktiv indeks i området 1,25 til 1,6 og mer foretrukket en refraktiv indeks på ca. 1,4.

Den aktive overflaten av anordningen (dvs. den overflate som er eller som bærer den preformede overflate) vil generelt bestå av et metall eller et metall-lag. Således kan; et plastsubstrat foreksempel av polymetylmetakrylat, ha add-erende til dette et lag av UV-herdende polyestermater.iale hvori den ønskede relieff-profil genereres og et tynt metall-lag som samsvarer med den preformede relieff-profil (foreksempel en enkel nettverkstruktur i en dybde på ca. 30 nanometer og en periode på ca. 600 nanometer) festet til. dette. Plastmaterialet mellom flaten kan alternativt, være plant: i hvilket tilfelle den ønskede form genereres direkte i metallet.

Generelt vil substratet være lamilært. Det kan være i strip-form.

Nettverkstrukturen tilpasset for en anordning i samsvar med foreliggende oppfinnelse er foretrukket et grundt metall-nettverk foreksempel et difraksjonsnettverk med en dybde (topp til dal) på opptil 400 nanometer, fortrinnsvis på fra 30 til 100 nanometer, og et hyppighet (periode) som er større enn nettverkdybden og generelt er i området fra 4 00 til 2000 nanometer. Det dekkende metall-lag er fortrinnsvis av sølv eller aluminium og har en tykkelse på opptil 500 nanometer foretrukket 100 pluss eller minus 10 nanometer. Mindre foretrukkede dekkmetaller er gull og kobber. Ideelt bør metall-laget være høyt reflekterende ved både absorpsjon (dvs. fargestoff eksitasjon) bølgelengde og ved fluorescentbølgelengden. Et passiviserende eller kuttende lag av foreksempel etoksyd av silitium eller aluminium kan fordelaktig dekke metallet selv.

Et fargestoffmolekyl eller residium kan være bundet til det aktive lag slik at fargestoffmolekylet eller residiet er fjernt fra den metalliske nettverkoverflate. Alternativt kan et fargestoffmolekyl eller residium være bundet direkte til overflaten av metallnettverket og det aktive lag foreksempel av antigen kan så være bundet til fargestoffmolekylet. Ved hvert arrangement er avstanden mellom fargestoffet (fluorokrom) til metallet fortrinnsvis 10 nanometer eller mer for å optimalisere absorpsjon av mellomliggende stråling av fargestoffmolekylet eller residiet.

Bindingen av det aktive lag til nettverket og av fargestoffet (fluorokrom) til nettverket og/eller til det aktive lag bringes i stand ved konvensjonelle teknikker som i seg selv ikke danner en del av foreliggende oppfinnelse.

Om ønsket kan et fargestoffmolekyl eller residium som skal innebefattes i overflatestrukturen av en anordning i henhold til foreliggende oppfinnelse innkorporeres i et fosforlipid lag for å kontrollere overflatefordelingen og konsentra-sjonen av fargestoffmolekyler i den resulterende anordning. Fargestoffet eller stoffene for bruk i en anordning i samsvar med foreliggende oppfinnelse absorberer fortrinnsvis sterkt ved emisjonsbølgelengder til en passende laser som kan danne eksidasjonskilden. Eksempler på passende lasere er argonion (488 nanometer); HeNe (543 nanometer); frekvens fordoblet YAG (532 nanometer); og frekvenstriplet YAG (355 nanometer). Kilder slike som disse er kjent i og for seg og deres form og konstruksjon danner ikke i seg selv en del av foreliggende oppfinnelse. Fargestoffene som er brukt vil generelt absorbere i den blågrønne del av det synlige spektrum og vil fluorisere i det grønne/røde/infrarøde. Typisk vil fargestoff av kuomarin, rodamin eller fluoresin-familiene eller Eu<+>++ ionene bli brukt.

I en foretrukket utførelsesform av en anordning i samsvar med foreliggende oppfinnelse kan fargestoffet være lokali-sert i et sensitivt molekylært miljø som er slik at fluorescensen dempes etter binding av materialet som undergår assays men aktiveres ved fravær av slikt materiale; det motsatte arrangement - dvs. hvor binding av materialaktivi-serende fluorescense som ellers dempes av det molekylære miljø av fargestoffet - er like foretrukket. I disse miljø kan en enkel måling tatt etter at anordningen har blitt ut-satt for materiale for påvisning være tilstrekkelig etter passende kalibrering for å bestemme mengden av materiale tilstede i prøven.

Anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved en påvisningsteknikk hvor anordningen tilføres en væske inneholdende materiale som skal påvises hvor den tynne film av materialet båret av anordningen er valgt i samsvar med materialet som skal påvises hvori en sammenligning gjøres mellom de fluorescente egenskaper av fargestoffmolekylet etter og før binding av materialet som skal påvises. Fordelaktig er innfallende bestrålning rettet mot overflaten av anordningen i en på forhånd bestemt innfallsvinkel og med en bølgelengde som er a) slik at den eksiterer farge-stof fmolekylet til en fluorescent tilstand og b) slik at den er resonant med nettverkoverflatestrukturen for derved å få i stand i hovedsak fullstendig absorbsjon av den innfallende bestråling. Likeledes utføres observasjon av den fluorescente emisjon fra fargestoffmolekylene ved en på forhånd bestemt emisjonsvinkel som kan være den ved hvilken maksimum fluorescense finner sted enten i) i fravær av eller ii) i nærvær av materialet som skal påvises.

For å lette illustrasjonen er det antatt at anordningen er et lamilært plastmaterialet som bærer et enkelt nettverk som er dekket med et monomolekylært (eller omtrent monomolekylært) lag av et på forhånd bestemt antistoff. Anti-stoffmolekylet er bundet til et fluorescent fargestoff ved konvensjonelle kjemiske teknikker. Hvis denne anordning nå brukes for å utføre et assay for antigenet som tilsvarer det bundede antistoff kan bestråling (generelt lys) til-føres ved en første bølgelengde og en innfallingsvinkel som er resonant med nettverkstrukturen slik at i hovedsak fullstendig absorbsjon av lyset finner sted. På grunn av nærheten av fargestoffmolekylet til nettverket resulterer dette i meget sterk absorbsjon av den innfallende bestråling av fargestoffmolekylet. Vanlige betraktninger ville føre til å anta at det fluorescente materialet ville stråle tilbake ved sin fluorescente bølgelengde uniformt i alle retninger. Nettverkoverflaten er imidlertid funnet å ha en dramatisk effekt på den fluorescente oppførsel av fargestoffet; det er antatt at nettverkoverflaten induserer en plasmon overflatebølge som innvirker på fargestoffmolekylet. Resultatet er at fluorescense emitteres ved en spesiell vinkel med hensyn til overflaten av nettverket eller en uniformt over alle vinkler. Det er således funnet at den sterkt rettede fluorescens resulterer fra absorbsjon av den innfallende bestråling gitt at innfallsvinkelen av bestrålingen og dens bølgelengde velges passende. Dersom nå antigenet for hvilken bestemmelsen utføres blir bundet til antigenlaget med dettes assosierte fargestoffmolekyler forandres det molekylære miljø til fargestoffmolekylene. Det er funnet at denne forandring av det molekylære miljø av fargestoffmolekylene resulterer i mindre absorbsjon av innfallende bestråling sannsynligvis fordi det ytterligere molekylære materiale festet over nettverkoverflaten virker som et dielektrisk lag av øket tykkelse for derved å skifte absorbsjonsresonansen. Dette betyr at innfallsvinkelen krevet for maksimal absorbsjon av innfallende bestrålning forandres ved nærvær av antistoffmolekylene og derfor hvis innfallende bestråling fremdeles rettes mot anordningen ved sin opprinnelige innfallsvinkel reduseres absorbsjonen av fargestoffmolekylene vesentlig. Dette betyr i sin tur at mengden av fluorescent bestråling som kommer ut fra nettverkstrukturen også reduseres. Videre reduserer den økede tykkelse av dielektrisk materiale over nettverkoverflaten koblingen mellom plasmonoverflatebølgen og fargestoffmolekylet med et resultat at emisjonsvinkelen av fluorescent bestråling blir bredere. Således vil observasjoner av fluorescent stråling ved den opprinnelige emisjonsvinkel av fluorescense (dvs. den for maksimum intensitet i fravær av antistoff) vise, når antistoff er bundet, en meget skarp reduksjon i intensitet. I et ekstremt tilfelle vil fluorescense bli dempet fullstendig. Således er en meget sensitiv overvåknings- og målingsteknikk tilgjengelig ved hjelp av foreliggende oppfinnelse. Teknikken beskrevet er en fluorescent inhiberingsteknikk; dette er nyttig når høyere konsentrasjoner av analytt skal påvises.

En alternativ fremgangsmåte er mulig ved hjelp av anordningen og kan i enkelte tilfeller være av spesiell fordel. I dette alternative arrangement settes innfallsvinkelen til bestrålingen ved en verdi som er forskjellig fra den som er mest effektiv med nettverk-overflatestrukturen men slik at økning av tykkelsen av dielektrisk materiale over nettverket på grunn av binding av materialet som skal påvises forårsaker innfallsvinkelen å nærme seg og til slutt bli lik den hvor maksimal absorbsjon finner sted. Med dette arrangement vil det være klart at bindingen av materialet som undergår assay vil resultere i økning i absorbsjon av innfallende bestråling heller enn en reduksjon og følgelig i en økning av fluorescent emulsjon heller enn en minkning. Også siden fluorescensefenomenet er avhengig av det molekylære miljø av fargestoffmolekylet, er det mulig å ha null fluorescense (dvs. demping) i anordningen før binding av foreksempel antigen - fluorescense blir så aktivert ved binding av antigenet til overflaten av anordningen. Dette representerer et ytterpunkt av tilfelle under betraktning. Innfallsvinkelen av bestråling kan være valgt slik at maksimal fluorescense observeres ved den valgte emisjonsvinkel når delen av materialet som skal påvises i væsken med hvilken anordningen settes i kontakt har en spesiell verdi. Således vil økning av mengden av foreksempel antistoff gi en saltvannsbærer fra null opprinnelig forår-sake fluorescent emisjon og øke opp til et maksimum hvorpå yttterligere økning antistoffinnhold vil resultere i at fluorescenseintensiteten igjen faller. Denne målingstil-nærmelse kan være av spesiell verdi i kvalitetskontroll av biologisk aktive væsker siden innfallsvinkelen kan settes for å gi maksimal fluorescent emisjon ved ønsket konsentrasjon av det biologisk aktive materialet hvorpå ethvert vesentlig avvik fra den på forhånd bestemte konsentrasjon vil vise seg som en minking i fluorescent emisjon.

Den beskrevne teknikk i foregående avsnitt er en fluorescense aktiveringsteknikk og denne er spesielt effektiv ved bestemmelse av nærvær av meget små mengder materiale som skal påvises (dvs. analytten).

Med anvendelser så som beskrevet ovenfor er det mulig i stedet for å måle intensiteten av fluorescent emisjon å observere levetiden til fargestoffet i sin eksiterte tilstand. Konvensjonelt angis halv-tiden til den eksiterte tilstand som T. Miljøet rundt et fluorescent molekyl har en markert effekt på verdien av T. Således vil avstanden til fargestoffmolekylene fra nettverkoverflaten ha innvirk-ning på T i likhet med uniformiteten av overflatestrukturen. Forutsatt at strukturen er regulær, som generelt vil være tilfelle, er det funnet at det er mulig å observere effekten av et materiale som bindes til foreksempel et antigenlag som bærer en fluorescent fargestoffmerking uten noen uklarhet i den observerte effekt på grunn av endret distanse fra materiale til nettverket. En praktisk bruk av denne teknikk er å observere fluorescentintensiteten etter en på forhånd bestemt tid har gått etter tilføring av innfallende bestråling. Den innfallende bestråling kan være kontinuerlig til den stenges av, eller den kan pulses. Typisk kan observasjoner finne sted ca. 500 nanosekunder etter avbrudd av innfallende bestråling. Ved valg av innfallende vinkel av den innfallende bestråling og observa-sjonsvinkel av emitert fluorescense i måter beskrevet tidligere vil en måling tatt etter en på forhånd bestemt tid har gått etter avslutning av innfallende bestråling gi en enda mer sensitiv måleteknikk siden tilsetning av foreksempel et antistoffmolekyl til det fargestoffmerkede antigen resultere i at levetiden av den eksiterte tilstand til fargestoffmolekylet forkortes. Således er nedgangen i fluorescentintensitet observert etter binding av antistoff enda større enn det som ville blitt observert med "steady-state" innfallende lys og fluorescense.

I en modifisert anvendelse av anordningen blir fargestoff-merkingen festet til materialet som skal påvises heller enn å være inkorporert i anordningen hvorpå prøven settes i kontakt. Undersøkelse av anordningen etter kontakt med prøven gir en indikasjon på tilstedeværelse eller fravær av analytten siden anordningen vil oppvise en grad av fluorescense som resultat av binding av analytten.

En hovedfordel ved enhver essay-teknikk som innebefatter fluoresensfenomener er at observasjoner og målinger foretas ved en bølgelengde som er forskjellig fra den til den innfallende bestråling og således er det ingen vanskelighet ved å skjelne mellom innfallende og utstrålende bestråling. I tillegg siden det generelt vil være passende å arbeide med et lag av aktivt materiale som er monomolekylært og hvor hvert molekyl bærer en fargestoffmerking, ødelegger fravikelse fra disse ideelle betingelser ikke alvorlig validiteten av den beskrevede måleteknikk selv om i utfør-elsesformen som tar i bruk forandringer i halv-tid av den eksiterte tilstand er mangel på uniformitet i anordningen som brukes mer uønsket. Ingen vanskeligheter oppstår med "steady-state"-målinger.

Teknikkene virker tilfredstillende når anordningen er neddykket i en suspensjon eller oppløsning av materialet som skal påvises. Således kan målinger finne sted for eksempel med det påviste materiale i vandig oppløsning. Den innfallende bestråling kan tilføres enten gjennom oppløsnin-gen selv (dvs, ovenfra) eller gjennom substratet til anordningen (dvs. undenifra). Likeledes er det mulig å observere den utstrålende stråling ovenfra eller nedenfra. Det vil forstås at når innfallende bestråling er rettet bakfra på overflaten til substratet, må metallbelegglaget over nettverket være tilstrekkelig tynt for å tillate plasmonfeltet å passere gjennom dette.

Sammenlignet med vanlige fluorescence-systemer gir foreliggende oppfinnelse flere fordeler: 1) I vanlige systemer er fluorokrom fritt for å stråle ut over alle vinkler. Ifølge foreliggende oppfinnelse kobler fargestoffmolekylet via overflateplasmoner til en smal kjegle av vinkler for derved å øke påvisningssensitiviteten ved emisjonsvinkelen. 2) Resonanskobling mellom utstrålende fluorokrom og overflateplasmon reduserer fluorescense-levetiden til molekyl-et. Dette tillater flere eksitasjons-emisjonscykler å bli utført per tidsenhet og leder til øket emitert fluorescent energi sammenlignet med et likt antall frie fargestoffmolekyler. 3) I vanlige flytende fasefluorescense immuno-assay er strålen av lys ved eksitasjonsbølgelengden diffusert over hele prøvevolumet; antallet fotoner per sekund som er tilgjengelig for å virke sammen med hvert fluorokrom er be-grenset. I foreliggende oppfinnelse er lyset konsentrert via overflateplasmon-eksitasjon til en høyintensitet meget smal region i nærheten av den metalliske nettverkoverflate. Sannsynligheten for fluorokrom-interaksjon er derfor meget høyere og øker derved eksitasjonseffektiviteten.

Selv om det har blitt referert i foreliggende oppfinnelse til et lag av antigenmolekyler som det aktive lag som dekk-er nettverkoverflaten vil det forstås at bindingspartnere av andre typer kan brukes hvor valget er bestemt i hvert tilfelle av naturen til materialet som skal påvises. Videre hvor det aktive bindingsmaterialet er av biokjemisk eller biologisk opprinnelse er det ikke essensielt å bruke et fullstendig molekyl så som et antigenmolekyl idet det aktive fragment av det totale antigen er tilstrekkelig for hensikten til foreliggende assay-arrangement. På lignende måte er det ikke essensielt for den fullstendige molekylære struktur av et gitt fargestoff å være bundet til antigenet eller antigenfragmentet; igjen er det aktive fargestoff residium tilstrekkelig.

For bedre å forstå oppfinnelsen og vise hvordan denne kan utføres i praksis vil referanse nå bli gjort per eksempel til medfølgende tegninger hvor: Fig. 1 illustrerer en anvendelse i samsvar med foreliggende oppfinnelse; Fig. 2a viser hvordan den reflekterte energi ved den ab-sorberende bølgelengde varierer som funksjon av den innfallende vinkel av eksitasjonsbestråling; Fig. 2b viser hvordan den reflekterte energi ved den fluorescente bølgelengde varierer med innfallingsvinkelen til eksitasjonsbestrålingen og med mengden bundet analytt; Fig. 3 illustrerer skjematisk et tverrsnitt av en anordning i samsvar med oppfinnelsen; og Fig. 4 illustrerer skjematisk en annen anordning i samsvar med oppfinnelsen.

Under referanse til fig. 1 og 2 faller en stråle av lys hvis bølgelengde korresponderer til absorbsjonsbølgelengden til fargestoffmolekylet inn på et difrasjonsnettverk med en vinkel som generer maksimalt overflateplasmonrespons. Fluorescense ved bølgelengde 3 f når den er tilstede emi-teres ved en vinkel Of.

Vinklene av absorbsjon og emisjon blir bestemt av ligning-en:

Når analyttmolekylet er tilstrekkelig lite til at binding ikke målbart innvirker på resonansvinkelene varierer den reflekterte energi ved absorbsjon og fluorescente bølge-lengder som funksjon av innfallende vinkel på måten vist i fig. 2a og 2b. Den reflekterte energi ved absorbsjons-bølgelengden oppfører seg på vanlig måte for plasmonresonans. Den reflekterte energi ved den fluorescente bølge-lengde øker ettersom mengden av bundet analytt øker og maksimum i kurven finner sted ved innfallingsvinkelen som eksiterer den maksimale plasmonresonans.

Under referanse til fig. 3 er det vist en anordning i samsvar med foreliggende oppfinnelse i tilstanden etter at den er blitt satt i kontakt med en prøve ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Anordningen består av et substrat 10 dannet av polymetylmetakrylat som er ca. 1 mm tykt. Substratet bærer et polyesterlag 11 som bærer en preformet relieff-profil 12. Den aktive overflate til anordningen består av et lag 13 av aluminium med en tykkelse på 20 nanometer som tilsvarer ved dens øvre overflate til relieff-profil 12. Dette lag er dekket av en passiv film 14 av aluminiumoksyd (tykkelse 10 nanometer eller mindre) som også tilsvarer profilen 12. Et monomolekylært lag av antigenmolekyler 15 er kovalent bundet til filmen 13 av aluminiumoksyd og er således immobilisert. Antigenmolekylene 12 er merket med det fluorescente fargestoff Rodamin B. Et monomolekylært diskontinuerlig lag av antistoff 16 er festet til antigenlaget 15. Substratet 10 med lagene 11, 13,

14 og 15 utgjør en utførelsesform av anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse. Den preformede relieffprofil er i form av et enkelt sinusoid nettverk med dybde (topp til dal) på 30 nanometer og med avstand (periode) 600 nanometer. Avstanden som er rektangulær over overflaten av

anordningen er vist sammenpresset for å lette fremstilling-en. Anordningen observeres ved å utføre metoden ifølge oppfinnelsen med monokromatisk lys som er polarisert i et plan perpendikulært til nettverklinjene hvor innfallingsvinkelen til bestrålingen (fra HeNe) laser ble valgt ut for å gi maksimal plasmonresonans. Ved fravær av antistoff 16 dvs. før kontakt mellom anordningen og prøven, ble fluorescense av fluorkrommen sterkt aktivert og ble utstrålt i en smal kjegle i stedet for uniformt. Økning og antall antistoff-molekyler 16 resulterer i progressiv demping av fluorescensen.

Under referanse til fig. 4 er det vist del av en annen type anordning i samsvar med foreliggende oppfinnelse. Lagene 11, 13 og 14 er identiske til dem beskrevet ovenfor i forbindelse med fig. 3. Laget 17 er et bundet lag av anti-stoffmolekyler til hvilke et antall antigenmolekyler 18 har blitt festet etter kontakt mellom anordningen og en assay-prøve. Prøven som inneholder antigenmolekyler 18 (analytt) ble tidligere (ved konvensjonelle teknikker) for å farge-stof fmerke molekylene 18. På grunn av plasmon kobling-effekten beskrevet tidligere kan fluorescense av det dis-kontinuerlige monomolekylære lag 18 observeres selv når meget få molekyler 18 er tilstede. Dette tillater en meget sensitiv metode for å påvise antigenmolekyler 18. Det er mulig å observere denne fluorescense selv ved nærvær av andre komponenter i prøven og ufestede antigenmolekyler.

I fig. 3 er laget 16 monomolekylært med en dekning på ca. 10% av overflaten for eksempel. Med molekyler på ca. 10 nanometer i høyde er dette ekvivalent til en gjennomsnitt-lig lagtykkelse på ca. 1 nm.

Claims (11)

1. Anordning for bruk i en assay-teknikk for kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av et kjemisk, biokjemisk eller biologisk materiale i en prøve, karakterisert ved at den omfatter et substrat, fortrinnsvis et plastmateriale eller glass dekket med et syntetisk, polymert materiale, med en overflate av en preformet relieff-profil som optisk er aktiv med hensyn til bestråling over et på forhånd bestemt område, og

(1) minst én forhåndsbestemt del av overflaten er belagt med en tynn film av et materiale, fortrinnsvis et metall, som er istand til å binde et på forhånd bestemt kjemikalium eller biokjemisk eller biologisk materiale, og

(2) og hvor filmen av materialet fortrinnsvis innbefatter molekyler av en fluoriserende forbindelse, såsom coumarin, rodamin eller fluorescin typen eller er ionet Eu<+>++, hvis fluoriserende egenskaper utviser en observerbar avhengighet av dets molekylære miljø, eller alternativt

(3) det fluorescente molekyl eller fluorokrom er inkorporert i materialet som skal påvises.

2. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at plastmaterialet er et materiale som kan herdes av ultrafiolett lys.

3. Anordning ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at plastmaterialet er et akryl- eller polyestermateriale.

4. Anordning ifølge krav 1, karakterisert ved at plastmaterialet er polymetylmetakrylat.

5. Anordning ifølge ethvert av kravene 1-4, karakterisert ved at substratet er lamilært.

6. Anordning ifølge krav 5, karakterisert ved at substratet er i strip-form.

7. Anordning ifølge krav 1-6, karakterisert ved at den preformede overflate relieff-profil er i form av et enkelt nettverk, av to eller flere nettverk anbragt gjensidig med en vinkel.

8. Anordning ifølge krav 7, karakterisert ved at hvert nettverk er firkantbølget, sinusoid eller med sagtakket profil.

9. Anordning ifølge krav 1-6, karakterisert ved at den preformede overflate relieff-profil består av en regulær rekke utstikkere.

10. Anordning ifølge ethvert av kravene 1-9, karakterisert ved at overflaten består av et metall, såsom sølv, aluminium, kobber, gull, eller av et lag av silicium- eller aluminiumoksyd.

11. Anvendelse av anordningen ifølge kravene 1-10 for kvalitativ og/eller kvantitativ påvisning av et kjemisk, biokjemisk eller biologisk materiale i en prøve, hvor materialet som skal bestemmes eventuelt er merket med en fluoriserende forbindelse, slik at under anvendelse vil den fluoriserende forbindelse være tilstede i eller på filmen.