NO167305B - Fremgangsmaate for fremstilling av gamma-globuliner for intravenoes administrering. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av *y-globuliner som kan administreres intravenøst.

Det foreligger idag på markedet et visst antall preparater av •y-globuliner oppnådd ved forskjellige prosesser og samtidig oppviser de kvaliteter og de mangler som følger med disse prosesser.

Blant manglene som disse prosesser tar sikte på om mulig å redusere, er den meget vesentlige evnen til komplementaktive-ring som kan medføre reaksjoner som går helt til anafylaktisk sjokk. På generell måte skyldes denne antikomplementære evne nærværet av globulinaggregater som er inherente ved forskjellige fremstillingsprosesser og spesielt ved alkoholiske fraksjoneringstrinn.

Dette er grunnen til at det allerede er utviklet forskjellige fremstillingsprosesser som søker å undertrykke eller i det minste å redusere denne mangel.

En første prosess søker å eliminere disse aggregater og består i å gjennomføre en pepsinfermentering av -Yglobu-linpreparatet for å fremtvinge en oppbrytning av de lange kjeder nær bindingen mellom fraksjonene Fab og Fc, se for eksempel FR-PS 2 433 342.

En annen mulighet som har vært benyttet av foreliggende søker består i å behandle et 'Y-globulinpreparat med plasmin for å fremtvinge en fermentering som bevarer en vesentlig prosent-andel (30 - 505É) av -y-globulinet intakt og som gir Fab- og Fc-fragmenter. Dette preparat er aktivt og godt tolerer-bart.

Disse forskjellige prosesser som søker å redusere den antikomplementære virkning oppviser imidlertid mangelen med en større eller mindre fremtvunget fermentering av y-globulinene og består i prinsippet av å søke et kompromiss mellom uskadellgheten og aktiviteten til preparatet. Man kan likeledes henvise til forskjellige fremstillingsprosesser som gir kjemisk modifiserte -y-globuliner: alkylering, reduksjon, sulfonering.

FR-PS 2 301 266 anbefaler ikke å gjennomføre enzymatisk behandling, spesielt med pepsin, av -y-globuliner, men lstedet å gjennomføre en fraksjonering med polyetylenglykolet.

Videre er det påpekt en fremgangsmåte for fremstilling av -y-globuliner ved fraksjonering med polyetylenglykol,. P.E.G., som oppviser denne fordel at man reduserer dannelsen av aggregater eller eliminerer dannelsen, mens man beholder globulinene intakt.

Selv om, om enn i forskjellig grad, de forskjellige prosesser som er beskrevet ovenfor, kan gi sjokkfaktorer ved aktivering av kallicrein-bradykininsystemet, synes disse faktorer forbundet med en restmengde av prekalikreinaktivator.

En annen teknikk som tillater å oppnå "y-globuliner med god kvalitet består i å gjennomføre en behandling ved sur pH-verdi i nærvær av små mengder pepsin, se for eksempel J.J. Walsh: "Purification of normal immunoglobulin for intravenous use". DEVELOP. BIOL. STAND. 1974, 27, 31-6. Imidlertid forblir det fremdeles aggregater og dimerer i en relativt vesentlig mengde.

Man har likeledes i EP-PS 0 120 835 foreslått å unngå å benytte pepslnbehandling eller plasminbehandling, uansett om disse enzymer er uoppløselige eller ikke, for derved å foreslå en fermentering med pankreatiske enzymer ledsaget av en behandling med polyetylenglykol med relativt høy konsentrasjon. Imidlertid er dette *y-globulin ikke ekvilibrert i underklasser.

Fremgangsmåten som, anvendt på -y-globulinpreparater fremstilt ved en fraksjonering og med små mengder PEG eller analoge substanser, forbedrer disse preparater ved spesielt å redusere den antikomplementære virkning, mengden av kallicrein og prekallicreinaktivator samt restmengde PEG.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av, på intravenøs måte, administrerbare -y-globuliner fra utgangsserumfraksjoner rike på -y-globuliner, og denne fremgangsmåte karakteriseres ved at den omfatter et trinn med fraksjonering ved hjelp av polyetylenglykol og et trinn med mild enzymatisk behandling i 10 timer til 10 dager alt etter enzymmengde, ved hjelp av et enzym valgt blant pepsiner, fibrinolyciner og papainer, ved en pH-verdi som på i og for seg kjent måte tilpasses enzymet som benyttes, og eventuelt et trinn med ultrafIltrering for å konsentrere proteiner og så en diafiltrering for å eliminere PEG.

Enzymet som benyttes velges blant pepsiner, fibrinolyciner (plasmln) og papainer.

TJtgangsmaterialet er en utgangsserumf raks Jon som er rik på -y-globuliner som "fraksjon II teknikk 6,9" ifølge Cohn, kjent for å gi produkter frie for hepatitt, eller en placentautgangsfraksjon som "fraksjon teknikk 6,9" ifølge Cohn, modifisert av Taylor. Denne fraksjon har en IgG-renhet på over eller lik 90St. Den kan inneholde variable mengder albumin som kan gå opptil 1056.

Eksempel 1:

1 - Preclpiterlng med PEG:

TJtgangsmaterialet består i en oppløsning av precipitat og en klaring av denne oppløsning, en oppløsning som generelt inneholder 1 - 4# proteiner. Man fortsetter med et utfellingstrinn med tilsetning av polyetylenglykol, PEG, med molekylvekt 4.000, for å oppnå en PEG-konsentrasjon på 5S6. pH-verdien justeres til 5,8 ved tilsetning av 1 N eddiksyre eller 0,1 N HC1 hvorved temperaturen holdes mellom 0 og 4<*>C. Ionestyrken er meget lav, i størrelsesorden 0,02. Man oppnår således et presipltat som inneholder aggregater som man separerer fra oppløsningen ved enkel dekanterlng, ved filtrering eller ved sentrifugering. Presipitatet elimineres .

Med supernatanter som oppnås gjennomføres så en ny precipite-ring uten ny tilsetning av PEG, ved samme temperatur, men ved å øke ionestyrken til 0,05 ved tilsetning av 0,05 - 0, 2% NaCl, fortrinnsvis 0, 1%, og ved å bringe pH-verdien til 7-8,5 og fortrinnsvis 8,0. De utfelte "Y-globuliner blir så separert fra den flytende fase ved dekanterlng eller sentrifugering av det dannede presipltat.

Presipitatet inneholder -y-globulinene frie for aggregater med høy molekylvekt men de kan fremdeles inneholde en mengde nær 10% av dimeriserte proteiner. Den elektroforetiske renhet for dette produkt er over eller lik 90%. Det kan inneholde albumin. Den antikomplementære aktivitet er meget lav. Mengden kallicrein og prekallicreinaktivator er redusert men kan fremdeles foreligge i variable mengder avhengig av mengden benyttet utgangsmateriale.

2 - Mild enzymatisk behandling:

-y-globul inprecipitatet tas opp i apyrogent vann i en konsentrasjon av 20 g/l -y-globuliner. Man tilsetter 50 g/l sakkarose og 0,002 g/l pepsin hvorved temperaturen bringes til å holdes på 37°C, pH-verdien reguleres til 4,1 og det hele Inkuberes i 24 timer.

Man foretrekker å benytte pepsin I oppløsning, i oppløselig-gjort form på klassiske bærere. Inkuberingen gjennomføres I løpet av 10 - 96 timer ved denne temperatur, alt etter mengde benyttet enzym. Etter behandlingen bringes pH-verdien til nøytralverdi.

3 - SluttbehandlIng:

Man gjennomfører en ultrafiltrering for å bringe konsentrasjonen i oppløsningen av -Y-globuliner til 70 g/l.

Dette ultrafiltreringstrinn følges av en diafiltrering med henblikk på å fjerne PEG. Denne diafiltrering gjennomføres ved hjelp av en NaCl-oppløsning på 4,5 g/l. Volumet av diafiltreringsoppløsningen som benyttes er en funksjon av PEG mengden som skal fjernes. Generelt muliggjør et volum tilsvarende 8 ganger oppløsningen av IgG å fjerne mer enn 90# PEG, til å begynne med inneholdt i oppløsningen, og å bringe denne til en mengde på 1,5 til 0,10 g/l.

Man gjennomfører så en Justering av oppløsningen som oppnås til 50 g/l protein, 50 g/l sakkarose, 4,5 g/l natriumklorid, ved pH 7,0.

Det hele fordeles så til slutt på flasker med 0,5 - 2,5 eller 5 g "Y-globuliner hvoretter man gjennomfører en lyofilise-ring.

Eksempel 2:

TJtgangsmaterialet består av et i oppløsning bragt presipltat og en klaring av denne oppløsning som inneholder 1,2 - 125É proteiner og fortrinnsvis 6 - 1096 proteiner.

Mild enzymatisk behandling:

Man fortsetter til en mild behandling av humanfibrinolysin. Konsentrasjonen av humanfibrolysin er 0,5 - 4 caseinolytlske enheter pr. gram proteiner. Inkuberingstemperaturen er 0-37" C og fortrinnsvis 4"C. pH-verdien er 6,0 - 8,0 og fortrinnsvis 7,4.

Inkuberingstiden er avhengig av temperaturen og den benyttede mengde enzym og er 2 dager til 10 dager.

2 - Utfelling av PEG:

Man fortsetter med et utfellingstrinn med proteinoppløsning som generelt inneholder 1-456 proteiner ved tilsetning av PEG med molekylvekt 4.000 for å oppnå en PEG konsentrasjon på 556. pH-verdien justeres til 5,8 ved hjelp av en eddiksyre eller 0,1 N HC1 og temperaturen holdes mellom 0 og 4°C. Ionestyrken er meget lav, i størrelsesorden 0,02.

Man oppnår således et presipltat som inneholder aggregater som man så separerer fra oppløsningen ved enkel dekanterlng, filtrering eller sentrifugering. Presipitatet elimineres.

Med supernatanter som man derved oppnår gjennomføres deretter en ny presipitering uten ytterligere tilsetning av PEG, ved samme temperatur, men ved å øke ionestyrken til 0,05 ved tilsetning av 0,05 til 0,256 NaCl og man bringer pH-verdien til 7 til 8,5, fortrinnsvis 8,0.

Derved felles *y-globulinene ut og man separerer disse fra væskefasen ved dekanterlng eller sentrifugering.

3 - Sluttbehandl ing:

Man gjennomfører en ultrafIltrering for å bringé konsentrasjonen av -Y-globuliner i oppløsningen til 70 g/l. Dette ultrafiltreringstrinn følges av et diafiltreringstrinn for å fjerne PEG. Denne diafiltrering gjennomføres ved hjelp av en natriumkloridoppløsning på 4,5 g/l. Oppløsningsvolumet ved diaf il trer ingen er en funksjon av mengden PEG som skal fjernes. Generelt tillater et volum som tilsvarer 8 ganger oppløsningen av IgG å fjerne mer enn 9056 PEG som til å begynne med inneholdes i oppløsningen og å bringe denne til en verdi på 1,5 til 0,10 g/l.

Man gjennomfører deretter en Justering av oppløsningen til 50 g/l proteiner, 50 g/l sakkarose, 4,5 g/l natriumklorid ved en pH på 7,0.

Man fyller så stoffet i flasker på 0,5 til 2,5 eller 5 g -y-globuliner og gjennomfører så en lyofillsering.

Analysen av -y-globulinene som oppnås ifølge oppfinnelsen viser følgende fordeler: En reduksjon av den antikomplementære evne i de forskjellige benyttede bestemmelsesteknikker.

Underklassene er ekvilibrert.

Fravær av hypotensive faktorer vist ved belastningsprøver på hunder og rotter.

En reduksjon av mengden dimeriserte proteiner på mer enn 5056 i forhold til den opprinnelige mengde og oppnåelse av en mengde monomerer som er meget høy (over 9056).

En mengde på fragmenter under 7 S lik 0 eller i det minste meget lav.

En mengde kallicrein eller prekallicrein lik 0 (under grensen for prøvens følsomhet).

En restmengde PEG som er sterkt redusert med en faktor mer enn 10 i forhold til opprinnelsesmengden.

Claims (8)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av på intravenøs måte administrerbare -Y-globuliner fra utgangsserumfraksJoner rik på -Y-globuliner, karakterisert ved at den omfatter et trinn med fraksjonering ved hjelp av polyetylenglykol og et trinn med mild enzymatisk behandling i 10 timer til 10 dager, alt efter enzymmengde, ved hjelp av et enzym valgt blant pepsiner, f Ibrinolyciner og papainer, ved en pH-verdi som på i og for seg kjent måte tilpasses enzymet som benyttes, og eventuelt et trinn med ultrafIltrering for å konsentrere proteiner og så en diafiltrering for å eliminere PEG.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymbehandlingstrinnet gjennomføres ved en sur pH-verdi i nærvær av spor av pepsin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at enzymbehandlingtrinnet gjennomføres ved en nøytral pH-verdi 1 nærvær av human fibrinolysin.

4. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-3, karakterisert ved at fraksjoneringstrinnet gjennomføres i nærvær av ca. 5% PEG ved pH 5 til 6, fortrinnsvis 5,8, og lav temperatur, fortrinnsvis +2 til +4<*>C, ved en meget lav ionestyrke, i størrelsesorden 0,02, fulgt av en andre presipitering med høyere ionestyrke i størrelses-orden 0,05 og en pH-verdi i størrelsesorden 7 til 8,5, fortrinnsvis 8,0.

5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1-4, karakterisert ved at fraksjoneringstrinnet gjennomføres i nærvær av albumin.

6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2, 4 og 5, karakterisert ved at behandlingen gjennomføres ved en sur pH-verdi over eller lik 4 med pepsin i en mengde av 0,002 g/l pepsin for en oppløsning på 20 g/l >globulln 1 nærvær av sakkarose.

7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 2 og 4 til 6, karakterisert ved at det anvendes et pepsin i uoppløseliggjort form.

8. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 3 til 7, karakterisert ved behandlingen gjennomføres ved en nøytral pH-verdi med humanfibrlno-lycin ved 0,5 til 4 CU/g proteiner.