NO162094B - Fremgangsm te for bestemmelse av lavdensitetslipoprldl) og reagens for gjennomfoering av den. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen gjelder fremgangsmåte og reagens for

bestemmelse av lavdensitets-lipoprotein (LDL).

Bestemmelsen av LDL-fraksjonen (lavdensitets-lipoproteiner), også kalt 3-lipoproteinfraksjonen, har hatt en stor betydning for den differensierte diagnosen av en lipid-stoffskifteforstyrrelse.

Hypercholesterolemi og hypertriglyceridemi begunstiger fremkomst av aterosclerose og hjerteinfarkt. Bestemmelsen av cholesterol og triglycerider i serum hører derfor til de hyppigst gjennomførte tester i klinisk-kjemisk proteinarbeid.

Tallrike undersøkelser av fettstoffskiftet har vist

at den individuelle koronarrisiko kan forstås bedre når ikke bare forandringen i triglycerid- og cholesterolspeilet bestemmes, men de patologiske forskyvninger i lipoprotein-mønsteret som ligger til grunn, fastslås (Munch, med Wschr. 121, (1979) 1639).

De kjente plasmalipoproteiner inneholder en ulik høy andel av protein (apolipoproteiner), fosfolipider, cholesterol og triglycerider. På grunn av deres forhold (forskjellig tetthet) i den analytiske ultrasentrifuge og på grunn av deres forskjellige vandringshastighet i gel-elektroforesen lar de seg oppdele i fire forskjellige klasser:

Chylomikroner

Pre-&-lipoprotein = VLDL (meget lav-densitets-lipoprotein)

Ø-lipoprotein = LDL (lav-densitets-lipoprotein) a-lipoprotein = HDL (høy-densitets-lipoprotein) Undersøkelsen av lipoproteinenes funksjon viste at

LDL innenfor lipoproteizÆne utgjør den avgjørende heterogene bestanddel, ved hvis økning i blodet det foreligger en økt risiko for en koronar hjertesykdom. En tidlig erkjennelse og bekjempelse av denne tilstand er av stor betydning. Det er derfor et behov for en praktikabel fremgangsmåte for kvantitativ bestemmelse av LDL-konsentrasjonen i serum og plasma.

Tidligere ble det i det vesentlige anvendt tre fremgangsmåter for bestemmelse av LDL-cholesterolverdien, som dog

har ulemper:

1. Ultrasentrifugering

Denne fremgangsmåte er ikke egnet for rutinearbeide,

da man for dette behøver en spesiell apparatutrust-ning og gjennomføringen krever en ytterst omsorgsfull arbeidsteknikk og et meget høyt tidsforbruk (flere gangers sentrifugering) i en ultrasentrifuge. Dermed forbeholdes denne analysefremgangsmåte hittil bare medisinske forskningslaboratorier. 2. Elektroforetisk separering med påfølgende visualisering av lipoproteinbåndene ved polyanionfeining og omregning av uklarhetsenheter til cholesterolverdier.

Denne fremgangsmåte er imidlertid tidkrevende og krever en egen elektroforeseapparatur såvel som et densito-meter for beregningen (Lab. Med. 3., (1977) 145) . 3. Bestemmelse av LDL-cholesterol-verdiene ved hjelp av Friedewald-formelen (Clin. Chem. 18, (1972) 499).

For beregning av LDL-cholesterol-verdiene etter Friedewald-formelen er bestemmelsen av 3 parametre nød-vendig: prøvens cholesterol-, HDL-cholesterol- og triglycerid-verdi. Fremgangsmåten er derlor ikke tilstrekkelig praktikabel. Dessuten gjelder denne til-nærmelsesformel bare for chylomikronfrie prøver og prøver med triglyceridverdier under 400 mg/dl.

4. Felningsreaksjoner

En fremgangsmåte ved hvilken LDL utfelles ved hjelp av et lectin er beskrevet i DE-off.skrift 28 57 710. Ved denne metode kan imidlertid verdien for LDL-cholester-olet først oppnås etter gjenoppløsning av bunnfallet hhv. bare ved differensdannelse av cholesterolverdiene før og etter utfeiningen. Dette utgjør en betydelig ulempe.

En utfellingsmetode for lipoproteiner ved hvilken LDL forblir i det overstående over fellingen, beskrives i

DE-patent 26 00 664. Fremgangsmåten er imidlertid

ikke tilstrekkelig praktikabel for anvendelse som rutinebestemmelse, da det er nødvendig med 2 arbeids-trinn for utfellingen av lipoproteinene (tilsetning av to forskjellige reagenser, polyethylenimin og en kationveksler, forbundet med en mellomliggende inkuba-sjonsfase).

Det er derfor et behov for en enkel fremgangsmåte og reagens som lett kan utnyttes med stor treffsikkerhet for bestemmelsen av LDL-lipoprotein.

Denne oppgave løses ifølge oppfinnelsen ved en fremgangsmåte for bestemmelse av lavdensitets-lipoproteiner (LDL) i kroppsvæsker som er karakterisert ved at det tilsettes høy-densitets-lipoprotein (HDL)-antistoff til den prøve som skal undersøkes, og at de derav dannede, uløselige HDL-, VLDL- og chylomikron HDL-antistoffkompleksene fraskilles og LDL eller en av dennes bestanddeler bestemmes, fortrinnsvis enzymatisk, i den overstående væske.

Oppfinnelsen beror på den overraskende konstatering at samtlige lipoproteinfraksjoner som forstyrrer LDL-bestemmelsen, ved siden av HDL selv særlig VLDL og chylomikronene, utfelles sammen med HDL-antistoffene, mens LDL selv ikke omfattes av fellingen. Dette er særlig overraskende fordi såvel HDL som også LDL, VLDL og chylomikroner har en proteinandel som inneholder de samme apolipoproteiner, om også i meget forskjellige konsentrasjoner. Det kunne derfor ikke forutses at antistoffer mot HDL ikke bare utfeller kvantitativt HDL, men også VLDL og chylomikroner, uten derved å innvirke på LDL.

Utfeiningen av VLDL og chylomikroner kan påskyndes,

idet det i tillegg anvendes kjente felningsmidler for disse substanser.

Den LDL-fraksjon som blir igjen i væsken over reagenset, kan bestemmes ved hjelp av de herfor vanlige fremgangsmåter. Bestemmelsen av det deri inneholdte bundne cholesterol foregår foretrukket under anvendelse av fremgangsmåter som er kjent for dette. Således kan bestemmelsen eksempelvis gjennomføres ved forsåpning med alkoholisk kalilut og kjemisk bestemmelse etter Liebermann-Burchard. Det foretas imidlertid fortrinnsvis en enzymatisk bestemmelse under anvendelse av cholesteroloxydase og et enzym eller enzymsystem som spalter cholesterolesteren, som særlig cholesterolesterase. Ved anvendelse av den sistnevnte metode kan forbrukt oxygen, dannet cholestenon eller mest foretrukket dannet ^C^/ bestemmes ved hjelp av fremgangsmåter som er kjent for fagmannen. Da bestemmelsen av bundet cholesterol er kjent for fagmannen, er det ikke nødvendig å gå nærmere inn på denne i foreliggende sammenheng. Det skal dog bemerkes at i rammen for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hindres opp-treden av uklarheter ved fjerning av VLDL- og chylomikron-fraksjoner som kunne forstyrre en optisk måling av cholestenon eller H20o i rammen av farvereaksjoner. Fremgangsmåten egner seg derfor i særlig grad i forbindelse med en kolorimetrisk cholesterolbestemmelsesmetode.

Det er imidlertid også mulig istedenfor de i LDL-fraksjonen inneholdte cholesterol- hhv. andre LDL-bestanddeler som apolipoprotein B, fosfolipider og triglycerider å be-stemme LDL-fraksjonen selv, hvorved det likeledes kan anvendes i og for seg kjente metoder. Eksempelvis skal nevnes den nefelometriske bestemmelse eller den turbidimetriske bestemmelse som er beskrevet i DE-off.skrift 30 07 764.

HDL-antilegemene anvendes i rammen av oppfinnelsen enten i form av et HDL-antiserum, som avfettet HDL-antiserum eller i form av rensede HDL-antistoffraksjoner. Det er også mulig å anvende HDL-antistoffragmenter, eksempelvis Fab, Fab2 og Fab<1->fragmenter. Likeså er det mulig å anvende antistoffer mot apolipoproteinene A, C og/eller E i HDL eller deres fragmenter. Endelig kan det også anvendes mono-klonale HDL-antistoffer.

Fremstillingen av de antistoffer som anvendes,

foregår under anvendelse av rert HDL eller et av de nevnte apolipoproteiner som immunogen. For fremstilling av antistoffene kan de vanligvis anvendte dyrearter anvendes. Foretrukket er sauer og kaniner. Foruten de allerede nevnte dyr hhv. lignende levende vesener, kan det også anvendes cellekulturer for fremstilling av antistoffer.

Separering av de immunaggregater som dannes ved tilsetning av HDL-antistoffene, kan likeledes foregå ifølge vanlige metoder. Dersom det anvendes løselige HDL-anti-stof f er, skjer separeringen hensiktsmessig ved sentrifugering. Dersom det anvendes immobiliserte, bærerbundne HDL-anti-stof fer, kan immunaggregatene skilles ved enkel separering av den flytende fase fra den kompakte faste fase, eksempelvis et fast stoff som er beskiktet med antistoffer. Dersom det anvendes antistoffer som er utvunnet med apolipoproteiner som immunogen, anvendes fortrinnsvis slike ved hvilke det apolipoprotein som anvendes som immunogen, oppviser en lipid-omhylling. Dette lar seg eksempelvis oppnå idet de utvalgte apolipoprotein A-, C- eller/og E-fraksjoner igjen relipideres etter den vanlige delipidering og påfølgende fraksjonering av apolipoproteinene. Fortrinnsvis anvendes imidlertid som immunogen renset fullstendig HDL-fraksjon. Rensingen foregår hensiktsmessig på i og for seg kjent måte ved isolering i en ultrasentrifuge. I tillegg kan det eventuelt foretas en ytterligere rensing ved hjelp av f.eks. immobilisert Concavalin A ifølge affinitetskromatografi- eller elektro-forese-fremgangsmåtene. Disse fremgangsmåter er kjente for fagmannen og behøver ikke her beskrives nærmere.

En ytterligere gjenstand for oppfinnelsen er et reagens for bestemmelse av LDL-fraksjonen i kroppsvæsker ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at det inneholder HDL-antistoffer. I en foretrukken utførelses-form inneholder reagenset ifølge oppfinnelsen ved siden av de allerede nevnte HDL-antistoffer hhv. de fragmenter eller antistoffer som er nærmere beskrevet ovenfor ved forklaringen av fremgangsmåtene hhv. fragmenter av HDL-bestanddelene,

enda et reagens for bestemmelse av cholesterol.

Et foretrukket reagens av foran nevnte art inneholder cholesteroloxydase, et system eller enzymsystem som spalter en cholesterolester, et system for bestemmelse av ^ 2Q2 og et overflateaktivt middel.

Ifølge en spesielt foretrukken utførelsesform av det foran nevnte reagens består dette i det vesentlige av HDL-antistof f, cholesteroloxydase, cholesterolesterase, peroxydase, 3,4-diklorfenol, fenol, 4-aminofenazon, et ikke-ionisk detergent, magnesiumaspartat og en buffer med pH 7

til 8,5.

Reagenset ifølge oppfinnelsen inneholder antistoffet hensiktsmessig i konsentrasjonsområdet fra 10 -7 til 10 -3mol/l (hhv. kilogram faststoff), beregnet på bestemmelsesløsningen. Antistoffet kan foreligge i fast form, fortrinnsvis lyo-filisert, eller i form av en løsning. Som løsningsmiddel kan anvendes vann, fysiologisk koksaltløsning, serummiljø, buffer som f.eks. 0,01 til 0,5 m trisbuffer, pH 7 til pH 8,5 eller 0,005 til 0,1 m fosfatbuffer, pH 6,5 til 8,5, eventuelt med koksalttilsetning av størrelsesorden som i fysiologiske kok-saltløsninger. Dersom antistoffet anvendes i immobilisert form, er eksempler på egnede bærersubstanser polysaccharider som cellulose, dextran, stivelse og deres derivater, silikater, polyamider, collagen, latex, aluminiumoxyd, okseserumalbumin og lignende bærersubstanser. Antistoffet kan også foreligge bundet på overflaten av testbeholdere, som plastreagensrør.

Reagenset kan dessuten inneholde kjente felningsmidler for VLDL og chylomikroner.

En vesentlig fordel med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ligger deri at lipoproteinklassene, med unntagelse av LDL, lar seg fjerne fra prøven etter tilsetning av et eneste reagens, og at det diagnostisk viktige LDL-innhold eller cholesterolinnholdet i LDL-fraksjonen deretter er tilgjengelig ved hjelp av en direkte måling uten ytterligere prøve-forbehandling. Det er videre fordelaktig at de triglycerid-rike lipoproteinklasser som forårsaker uklarheter i prøven, fjernes, slik at det for den påfølgende LDL- eller cholesterol-bestemmelse står en klar prøve til disposisjon.

De følgende eksempler forklarer oppfinnelsen ved hjelp

av en foretrukken utførelsesform.

Eksempel 1

A) Fremstilling av renset HDL

Etter separasjon av VLDL og LDL i ultrasentrifugen isoleres en skarpt avdelt HDL-fraksjon (d 1,080 til 1,210) i ultrasentrifugen som beskrevet i V. P. Skipski: Lipid composition of lipoproteins in normal and diseased states, i: Blood Lipids and Lipoproteins: Quantitation, Composition

and Metabolism. Hrsg.: Nelson, Wiley, New York 1972, 471-583. Fraksjonen sedimenteres hhv. floteres deretter enda to ganger ved tetthetene 1,080 og 1,210.

HDL-fraksjonen renses ved hjelp av immobilisert Concanavalin A ((1974) Febs Lett. 91, 174-198) affinitets-kromatografisk eller ved hjelp av Geon-Pevicon-Block-Elektrophorese etter R. W. Mahley, K. S. Holcombe (1977),

J. Lipid. Res. 18, 314-324.

B) Fremstilling av antiserumet

Dyrearter: Sau eller kanin

Under anvendelse av det ifølge A oppnådde immunogen anvendes følgende immuniseringsskjerna:

C) 50yUl serum blandes med 150yUl av et antiserum som er fremstilt ifølge B. Etter 30 minutters inkubasjon ved romtemperatur avsentrifugeres det oppnådde bunnfall

(2 minutter ved 10.000 g).

50^ul av den klare overstående væske over bunnfallet tilsettes 2 ml av et reagens som inneholder 0,1 mol/l trisbuffer, pH = 7,7, 0,05 mol/l magnesiumaspartat, 1 mmol/1 4-aminofenazol, 6 mmol/1 fenol, 4 mmol/1 3,4-diklorfenol, 0,3% fettalkoholpolyglycolether, 400 U/l cholesterolesterase, 250 U/l cholesteroloxydase og 200 U/l peroxydase.

Etter 20 minutters inkubasjonstid ved romtemperatur måles ekstinksjonen av prøven mot reagens-tomverdien (reagens-tomverdien inneholder 50^ul av antiserumet og tar i betraktning cholesterolinnholdet i antiserumet).

<&>E <_><Æ>prøve ^Ereagens-tomverdi

LDL-cholesterol (mg/dl) = 1,385 x ^E

Eksempel 2

En løsning av hver 50^ul av VLDL, HDL, LDL hhv. chylomikroner blandes med 150^ul av et kanin-antiserum som ble oppnådd med HDL som immunogen. Etter sentrifugering ble cholesterolinnholdet bestemt i den overstående væske som beskrevet i eksempel 1.

Prøve Cholesterolinnhold i prøven

før felning etter felning

Chylomikroner 61,4 mg/dl 2,6 mg/dl

VLDL 2 3,2 mg/dl 2,8 mg/dl

LDL 177,0 mg/dl 165,0 mg/dl

HDL 50,9 mg/dl 0,0 mg/dl

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for bestemmelse av lavdensitets-lipoproteiner (LDL) i kroppsvæsker, karakterisert ved at det tilsettes høy-densitets-lipoprotein (HDL)-antistoff til den prøve som skal undersøkes, og at de derav dannede, uløselige HDL-, VLDL- og chylomikron HDL-antistoffkompleksene fraskilles og LDL eller en av dennes bestanddeler bestemmes, fortrinnsvis enzymatisk, i den overstående væske.

2. Reagens for bestemmelse av LDL-fraksjonen i kroppsvæsker ved fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at det inneholder HDL-antistof f .

3. Reagens ifølge krav 2, karakterisert ved at det i det vesentlige består av HDL-antistoff, cholesteroloxydase, cholesterol esterase, peroxydase, 3,4-diklorfenol, fenol, 4-aminofenazon, en ikke-ionisk detergent, magnesiumaspartat og buffer med pH 7 til 8,5.