NO157358B - Antistoffreagens og fremgangsmaate for hurtig bestemmelse av tilstedevaerelse eller fravaer paa roede blodceller av d-antigen. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår antistoffreagens og fremgangsmåte for blodtypebestemmelse, mer spesielt for hurtig bestemmelse av tilstedeværelse eller fravær på røde blodceller av D-antigen.

Blodtypebestemmelser og da spesielt bestemmelse av et

nærvær eller fravær av RhQ(D)-antigen, er rutine i moderne medisin. Etter oppdagelse av forholdet mellom Rh-faktoren og blodsykdommer i 19 30-årene har man stadig

vært mer opptatt av å påvise Rh-uforenligheter mellom mor og foster slik at slike uforenligheter kan behandles eller unngås i fremtidige barn. For tiden er det mange land som krever at det skal utføres en Rh-prøving av svangre kvinner og hos barn som er født av Rh-negative kvinner. Innføringen av Rh-immunoglobin i 1968 gjorde for første gang mulig å utvikle en fremgangsmåte for behandling av Rh-negative kvinner som hadde Rh-positive barn for å hindre sykdommer hos senere Rh-positive barn hos disse kvinner.

Det er for tiden to typer diagnostiske prøver som brukes

for å kunne påvise D-antigen. Det skal rent innlednings-

vis understrekes at IgG-antistoffet til D-antigen er et såkalt "ufullstendig" antistoff. Dette betyr at IgG-antistoffer med spesifikk reaksjon for D-antigenet ofte ikke agglutinerer seg til Rh-positive røde blodceller som er suspendert i en saltoppløsning. I motsetning til dette vil IgG-antistoffer til D-antigenet alltid frembringe en agglutinering av Rh-positive røde blodceller i salt-oppløsning.

Den første av disse prøvene bruker IgG-anti-D-antistoff

som reagensen. Ettersom anti-D-IgG i seg selv ikke vil frembringe en agglutinering av Rh-positive røde blod-

celler i saltoppløsning, så man må tilføre en eller annen form for forsterkende reagens eller anordning for å frembringe denne agglutinering. Denne forsterkning oppnås ved at man bruker en relativt høy konsentrasjon av en

biologisk polymer (dvs. et ikke-spesifikt protein såsom albumin) eller en syntetisk polymer (f.eks. polyvinyl-pyrrolidon eller et dekstransulfat). Typisk vil konsentrasjonen av albumin i den endelige reagensen ligge omtrent på 20-25%. Skjønt dette tilsatte protein for-sterker agglutineringen av spesifikke IgG anti-D-antistoffer og røde blodceller med D-antigen, så frembringer nevnte proteiner også en ikke-spesifikk agglutinering av røde blodceller hvis overflater er belagt med IgG.

Slike belegg opptrer f.eks. hos individer med slike lidelser som autoimmun hemolytisk anemi eller hemolytiske lidelser hos nyfødte, hvor det er produsert antistoff til pasientens egne røde blodceller, og hvor dette antistoffet binder seg nevnte celler. Falske positive resultater for et nærvær av Rh-antigen vil derfor kunne oppnås i disse individer med nevnte prøve. En betydelig fordel ved nevnte prøve er imidlertid at denne er meget rask ettersom det er liten inkubasjon (vanligvis ingen) før man kan avlese resultatene. Prøven kan som sådan utføres enten i et prøverør eller på en glassplate. En annen fordel er prøvens evne til å påvise visse svake antigener, som ofte betegnes Du, noe som vil bli ytterligere beskrevet i det etterfølgende.

Den annen prøve som brukes for tiden for påvisning av D-antigen, bruker IgM-antistoff istedenfor IgG-antistoff. Ettersom IgG er et fullstendig antistoff med hensyn til nevnte D-antigen, så er det ikke nødvendig å tilsette en forsterkende reagens, og typisk vil reagenssammensetningen totalt inneholde en proteinkonsentrasjon på mindre enn ca. 8 vekt-%, noe som oppnås ved å tilsette (f.eks.) bovinalalbumin til IgM-antiserumet. Denne prøve kan bare utføres i et prøverør. Skjønt denne prøven fjerner ikke-spesif ikk agglutinering av IgG-belagte celler, noe som skjedde med den forsterkende IgG-prøven, så har nevnte prøve også flere ulemper. Den prinsipielle ulempen er at prøven krever en inkubering på fra 15 til 60 minutter ved 37°C, noe som ikke er nødvendig ved den forsterkede IgG-prøven, foruten at den krever IgM-antistoff, noe som er sjeldent og ofte vanskelig å oppnå. Videre er det ikke mulig å utføre den såkalte Du-prøven sammen med denne andre type prøve, ettersom denne DU-prøven bruker anti-

stoff til IgG som sin reagens. Denne antistoff-reagensen vil imidlertid ikke reagere med IgM.

De to samme typer av diagnostiske prøver brukes også

generelt for andre blodgruppeantigener (f.eks. C, E, e,

og lignende), for hvilke IgG-antistoffene også er ufullstendige .

Man vil således kunne tilfredsstille et lenge følt savn,

hvis det var mulig å utvikle en rask prøve for blodgruppeantigener hvor man bruker IgG-antistoff i et lav-proteinpreparat.

Omdannelsen av ufullstendig anti-D IgG til direkte salt-oppløsningsagglutinin ved reduktiv spaltning av disulfid-bindingene er blitt beskrevet i flere artikler. Det ble først rapportert i 1960 av Chan og Deutsch (J. Immuuol. 85, 37-45) og deretter i 1963 av Pirofsky og Cordova (Nature,

197, 392-393), men disse resultatene ble trukket i tvil i 1965 av Mandy et al. (J. Clin. Invest., 44, 1352-1363). Ytterligere undersøkelser som bekreftet konklusjonene,

trukket av Pirofsky og Cordova ble angitt i 1977 av Romans et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74, (6), 2531-2535). Sistnevnte forfattere rapporterte ikke bare omdannelsen av anti-D IgG, men også anti-c, anti-E og anti-K IgG til direkte saltoppløsningsagglutininer. I nevnte artikkel oppnådde man imidlertid agglutinering bare i et prøverør etter 2 timers inkubering av røde blodceller og det reduserte IgG. Skjønt Romans et al. i nevnte artikkel beskriver at ufullstendige IgG antistoffer kan omdannes til fullstendige % antistoffer ved reduksjon, så er det ikke gitt noen beskrivelse av spesifikke fremgangsmåter eller reagenser (og slett ikke en som tilfredsstiller standarder som er satt av føderale myndigheter i US) som kan brukes for å utføre

en typeprøve. I virkeligheten angir nevnte artikkel i sin siste setning at det kan være spørsmål om hvorvidt nevnte reduserte antistoff i praksis kan brukes som en type-reagens, idet man refererer til visse upubliserte under-søkelser som var under utvikling.

I en rapport fra det kombinerte møte mellom den XVII kongress for det internasjonale selskap for hematologi og den XV kongress for det internasjonele selskap for blod-overføringer, 24.-28. juli 1978, ble det publisert et sammendrag som synes å beskrive noe av det arbeid som det er referert til i Romans et al.'s artikkel. I nevnte sammendrag rapporterer Laschinger et al.: "The production and testing of a reliable monospecific anti-D agglutinin with a titer of 16 from a pool of "incomplete" anti-D-sera. Modificaion of pooled "incomplete" anti-c produced a direct reagent with a titer of 8." Disse rapporterte titer-verdier gir ingen forsikring om at de fremstilte materi-aler tilfredsstilte de standarder som er angitt av føderale myndigheter i USA. Det er i nevnte sammendrag ikke gitt noen informasjon m.h.t. denne fremgangsmåte ved hvelp av hvilken disse agglutininer ble fremstilt, den brukte prøvemetode eller den mengde eller tid av inkubasjon som var nødvendig for å oppnå agglutinering. Videre indikerer sammendraget at et brukbart anti-K eller anti-Fy<a> "... has yet to be obtained by this process".

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en antistoffreagens for bruk for hurtig bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet for røde blodceller av D-antigen, innbefattende redusert, S-alkylert IgG-antistoff til det. antigenet som i slide-testen (i det nedenstående også betegnet objektglassprøven) eller hurtigrørtesten har en gjennomsnittlig titer på minst 32 for D-celler, holdt ved en pH-verdi mellom 7,5 og 8,3 av en effektiv, forenlig buffer, kjennetegnet ved at antistoffet holdes i et medium inneholdende polymerisert bovinalbumin for oppnåelse av av en total proteinkonsentrasjon på -

6-10 vekt-%, og ved at antistoffet har blitt fremstilt ved:

(a) oppnåelse av et vesentlig lipid-fritt human-antiserum inneholdende IgG antistoff til D-antigenet; (b) justering av pH-verdien til nevnte antiserum til ca. 8,6 ved tilsetning av en effektiv buffermengde av en forenlig buffer; (c) redusering av nevnte bufferbehandlede antiserum med et reduksjonsmiddel; (d) S-alkylering av nevnte reduserte, buffermiddelbehandlede antiserum med S-alkyleringsmiddel; (e) dialysering av nevnte S-alkylerte, reduserte antiserum ved en pH-verdi mellom 7,5 og 8,3, og (f) justering av den totale proteinkonsentrasjonen for det dialyserte serum til 6-10 vekt-% ved tilsetning av polymerisert bovinalbumin.

Bruk av foreliggende antistoffreagens resulterer i påvisning av RhQ (D) antigen (som er i Rh-blodgruppesystemet) hvorved man unngår de ulemper man hadde ved tidligere kjente teknik-ker. Foreliggende antistoffreagens muliggjør for første gang bruken av IgG-antistoff i objektglass (slide)- eller hurtigprøverørtest ved lavt proteininnhold. Den aktuelle test har ingen ikke-spesifikk reaksjon med IgG-belagte celler, hvilket skyldes det lave proteininnholdet. Videre oppfyller og overstiger foreliggende Rh-antistoffreagens de føderale myndigheters standard med hensyn til styrke og spesifitet både i prøver på objektglass og i raske reagensrørsprøver. Nevnte føderale standarder er angitt i underdel C av del 660, underkapittel F i den "Federal Food, Drug and Cosmetic Act" (se 42. Federal Regulations 54542 ff, No. 195, 7. oktober 1977). Nevnte anti-K-antistoff-reagens oppfyller og ligger over den tilsvarende føderale standard for saltoppløsningsprøven for et materiale for hvilket det ikke er noe referansepreparat tilgjengelig.

Anti-D-reagensen vil vanligvis bli fremstilt ved følgende fremgangsmåte.

Serum oppnås fra individer med høyt nivå av anti-D-IgG

i sin blodstrøm, og behandles for å fjerne visse forurens-ninger og for å rense nevnte IgG. Skjønt den spesifikke fremgangsmåten for fremstilling av anti-D-antiserum som skal brukes i foreliggende reagens, ikke som sådan er en del av oppfinnelsen, så er det i det etterfølgende angitt en egnet fremgangsmåte. Det er imidlertid også kjent andre fremgangsmåter for fremstilling av egnede anti-D-antisera.

Hvis det er nødvendig, så kan plasma defibrineres med en passende mengde av storfe-trombin, dekalsifiseres med natriumoksalat, renses ved sentrifugering; og eventuelt nøytraliseres ved å tilsette blodgruppespesifikt stoff A og/eller AB.

Lipider fjernes i alt vesentlig fra nevnte serum ved en ekstraksjon med triklortrifluoretan. Serumet oppvarmes til maksimalt 5 6,6°C og avkjøles så til 2-8°C, hvoretter triklortrifluoretanet blandes inn ved høy hastighet inntil man får en omdannelse på serumet. Etter at serumet er blitt lagret ved mellom 2 og 9°C inntil skummet er for-svunnet, blir det sentrifugert, igjen oppvarmet og lagret på mellom 2 og 8°C. pH blir justert til 7,3-8,3, og serumet blir så lagret ved -20°C eller lavere.

Det i alt vesentlig lipid-frie serumet kan så behandles på følgende måte for å gi den foreliggende reagens.

pH justert på det alt vesentlige lipid-frie serumet ble justert til ca. 8,6 idet man bruker en effektiv mengde av en forenlig buffer såsom 2M tris-(hydroksymetyl)amino-

metan (TRIS). Et volum 0,04M ditiotreitol i salt-oppløsning tilsettes ca. 4 volumer av det bufrede serum,

og blandingen hensettes på mellom 20 og 3 0°C i minimum en halv time.

Etter denne behandlingen tilsetter man et volum 0,4M jodacetamid i destillert vann til ca. 4 volumer av det behandlede serum. Blandingen hensettes ved 20-30°C i minimum en time. Det resulterende serum blir så dialysert to ganger ved mellom 2-8°C, idet man bruker 10 volumer av nylig fremstilt 0,02M TRIS-buffer i 0,13M NaCl ved pH 7,5-8,3, fortrinnsvis pH 7,7-8,1 hver gang. Etter annen dialyse blir natriumazid tilsatt det behandlede serum til en slutt-konsentrasjon på 0,1% som et konserveringsmiddel, og den totale proteinkonsentrasjon blir justert til mellom 6 og 10 vekt-% med storfe-albumin. Man bruker fortrinnsvis det polymeriserte storfe-serumalbumin som er beskrevet i US patent nr. 4.140.662. Hvis det er nødvendig, kan konsentrasjonen av antistoff i nevnte antistoffreagens justeres ved en fortynning med 0,02M TRIS-buffer i 0,13M NaCl inneholdende 6-8 vekt-% storfe-serumalbumin.

Skjønt man ovenfor har beskrevet en spesiell fremgangsmåte for fremstilling av den foreliggende reagens, så er det underforstått at andre egnede reaksjonsmidler kan brukes istedenfor det foretrukne ditiotreitol, og slike reduksjonsmidler innbefatter f.eks. 2-merkaptoetanol og ditioerytritol. Skjønt jodacetamid er brukt ovenfor som det S-alkylerende middel, så er det underforstått at andre alkyleringsmidler også kan brukes, f.eks. jodeddiksyre. Alternativt kan man bruke ekvivalente fremgangsmåter for

å hindre en nydannelse av disulfidbindingen.

pH-området på 7,5-8,3, fortrinnsvis 7,7-8,1, er viktig for at den foreliggende reagens skal funksjonere skikkelig. Utenfor området på mellom 7,5 og 8,3 vil reaksjonene på reagensene være noe svakere. Skjønt dette pH-området kan opprettholdes ved hjelp av en effektiv bufrende mengde

av enhver forenlig buffer (dvs. en som ikke har en skade-lig effekt på antistoffene eller de røde blodcellene), så er TRIS-buffer å foretrekke.

Foreliggende fremgangsmåte representerer en bedret metode for rask bestemmelse av et nærvær eller fravær av D-antigenet på røde blodceller i et gitt individ ved hjelp av den reagens som er beskrevet ovenfor. Det er antatt at man kan bruke enhver av de tidligere kjente raske typemetoder, såsom objektglassprøven, modifisert ("hurtig") rørprøve eller glasstavmetoden, men at man bruker den foreliggende reagens istedenfor det tidligere kjente IgG-antiserum. Skjønt det nedenfor er angitt hvorledes man kan bruke foreliggende antistoff-reagens i visse tidligere kjente prøver, så er det underforstått at bruken av den foreliggende antistoff-reagens ikke er begrenset til disse spesifikke prøver, men kan brukes generelt i enhver metode som innbefattes av foreliggende fremgangsmåte.

Det er ifølge foreliggende oppfinnelse også tilveiebragt en fremgangsmåte for bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet på røde blodceller hos et gitt individ av D-antigen, ved å tilsette en antistoffreagens til en prøve av røde blodceller som skal testes, og observere om agglutinering forekommer eller ikke, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man anvender antistoff-reagensen som er angitt ovenfor, og foretar observasjonen uten vesentlig inkubasjon.

Med betegnelsen "uten vesentlig inkubasjon" slik det brukes her, forstås en forsinking på bare 2-15 min. før selve observeringstrinnet. Dette står i sterk kontrast til den beskrivelse som er angitt av Romans et al.,

hvor det var en vesentlig inkubasjon. I mange tilfeller kan selve observasjonen skje "uten inkubasjon", noe som betyr at det var ingen forsinkelse mellom blandings-trinnet og observasjonstrinnet. Denne observasjonen kan skje uten inkubasjon for ethvert av de foreliggende

Rh-reagenser i objektglassprøven, og for den foreliggende anti-D reagens i den modifiserte reagensrørmetoden. I de andre metoder og for andre antistoffreagenser vil det være ønskelig å ha en inkubasjon på ca. 2 min. for å

kunne oppnå en høy grad av agglutinering.

Den modifiserte reagensrørmetoden kan utføres på følgende måter. Først fremstiller man en suspensjon av røde blodceller som skal undersøkes. Hensiktsmessig kan dette være en 5% suspensjon i et normalt forenlig serum, dvs. pasientens eget serum eller i plasma eller i en isotonisk saltoppløsning.

Deretter blander man en liten mengde (hensiktsmessig bare en dråpe) av den foreliggende antistoff-reagens med en ekvivalent mengde av den røde blodcellesuspensjonen i et lite prøverør, hvoretter røret sentrifugeres uten ytterligere inkubasjon slik at man fremstiller en liten "knapp" av røde celler og en klar overliggende væske, dvs. på vanlig kjent måte.

Endelig så kan et nærvær eller et fravær av agglutinering bestemmes f.eks. ved å resuspendere cellene ved forsiktig røring og makroskopisk undersøkelse. Hvis det er ønskelig, så kan man anvende en kontrolloppløsning av saltoppløsning eller ikke-spesifikk protein (f.eks. 6-8% bovinalbumin)

i saltoppløsning for å lette denne bestemmelsen.

En objektglassprøve kan utføres på følgende måte:

Igjen fremstiller man først en suspensjon av de røde blodceller som skal undersøkes i et normalt forenlig serum eller i pasientens eget serum eller i plasma. Helt blod kan brukes uten fortynning, ettersom konsentrasjonen av røde blodceller i prøven hensiktsmessig bør være 40-50%.

Deretter blander man en mindre mengde (dvs. ca. en dråpe) av den foreliggende reagens med omtrent det dobbelte volum av cellesuspensjonen på et forvarmet objektglass. Fortrinnsvis bør temperaturen på objektglasset ligge mellom 40—45°C, skjønt man også kan bruke romtemperatur (dvs. mellom 20-30°C).

Etter at den røde blodcellesuspensjonen og antistoff-reagens er blitt skikkelig blandet uten ytterligere inkubasjon, kan man så bedømme et nærvær eller fravær av agglutinering ved å vende på objektglasset frem og tilbake et par minutter og observere eventuell agglutinering. En kontroll av en saltoppløsning eller ikke-spesifikk protein (f.eks. 6-8% bovinalbumin) i saltoppløsning kan også under-kastes samme serie av trinn istedenfor å bruke antistoff-reagens, for derved å ha en negativ kontroll.

Negative resultater for D-antigen i en av disse prøver

kan bekreftes ved Du-prøven på følgende måte. Til en mindre mengde av en 5% suspensjon av røde blodceller av den type som er nevnt ovenfor, kan tilsettes en ekvivalent mengde av den foreliggende anti-D antistoff-reagens under blanding. Etter at denne blandingen er inkubert ved 37°C i ca. 15 minutter, kan cellene vaskes, fortrinnsvis tre ganger med en isoton saltoppløsning, hvoretter de vas-kede celler tilsettes anti-humant serum. Cellene blir så sentrifugert som beskrevet ovenfor, og et nærvær eller fravær av agglutinering kan bestemmes ved observasjon.

Et positivt resultat av denne prøven (men negativt på D-prøven og kontrollprøven) indikerer Rh-positive celler i DU-varianten. En saltoppløsningssuspensjon av de samme røde blodcellene (uten antistoff-reagens) kan brukes som en kontroll.

Skjønt disse fremgangsmåter hvor man bruker foreliggende antistoff-reagens kun er gitt som en illustrasjon, så er det antatt at foreliggende Rh-reagenser kan egnet brukes i enhver agglutineringsprøve for påvisning av ethvert av de ovennevnte antigener, og da spesielt kan de brukes i slike prøver hvor det ikke kreves inkubasjon. Foreliggende anti-K reagens er egnet for bruk i den såkalte saltoppløsningsrørprøven.

Foreliggende oppfinnelse vil nå bli ytterligere beskrevet med henvisning til de vedlagte tegninger.

Fig. 1 viser en sammenligning mellom et parti av det foreliggende anti-D reagens og et kommersielt anti-D

serum for en saltoppløsningsrørprøve;

fig. 2 viser en sammenligning mellom et parti av det foreliggende anti-D reagens og et kommersielt anti-D serum for en prøve på et objektglass og en modifisert rørprøve, og hvor begge reagenser ble brukt for å utføre en modifisert rørprøve;

fig. 3 viser den samme sammenligningen som vist på fig. 2 hvor reagensene—b-l-e--reagert med serumsuspenderte prøve-celler;

fig. 4 viser samme sammenligning som fig. 2 og 3, men for glasstavprøven;

fig. 5 illustrerer samme sammenligning for en objektglass-prøve; og

fig. 6 viser en sammenligning mellom det foreliggende anti-D reagens med polymerisert storfe-albumin og normalt storfe-albumin.

De foreliggende antistoffreagensers reaksjon er blitt

vist i prøver som deretter er blitt sammenlignet med kjente reagenser for prøver på objektglass og i modifiserte prøve-rør, og i prøverørsprøver med saltoppløsning henholdsvis. Som vist ved disse prøver, så reagerer foreliggende antistoff-reagenser minst like godt som de kjente reagenser, og p.g.a. sine egenstående egenskaper vil de gi betydelig praktiske fordeler.

Spesifisiteten til den foreliggende anti-D antistoff-reagens parti 78-AS-074 ble demonstrert ved en sammenligning med "Ortho" anti-D serum for saltoppløsnings-prøverørsprøven parti R149 7. I denne prøven brukte man 284 direkte antiglobulinprøve-positive røde blodceller (slik dette bestemmes ved hjelp av polyspesifikt anti-humanserum). Disse direkte antiglobulinprøve-positive celler ble valgt p.g.a. at de spontant agglutinerer seg i et høyproteinmedium f.eks. av den type som brukes i tidligere kjente IgG-antistoffreagenser. De gir således en god gruppe celler for demonstrasjon av fordelene ved den foreliggende anti-D antistoffreagens, som har en relativt lav proteinkonsentrasjon. Av disse cellene reagerte 55 med "Ortho" Rh-hr kontrollen (reagensoppløsning uten antistoff), noe som ville ha forkastet de prøveresultater som ble oppnådd med et reagens med høyt proteininnhold og høy viskositet, f.eks. anti-D-serum i prøver på et objektglass og i et modifisert prøverør. Disse 55 cellene kunne således med hell prøves ved hjelp av foreliggende anti-D antistoff-reagens, men ikke ved hjelp av tidligere kjente IgG anti-D antistoff-reagens som inneholder en høy konsentrasjon av protein. Tre av de 55 cellene aggluti-nerte seg med saltoppløsning og kunne ikke prøves ved hjelp av vanlige rutinemetoder. De gjenværende 52 cellene ble prøvet ved hjelp av den saltoppløsningsrørprøveprosedyren som er anbefalt på etiketten. Resultatene er grafisk vist på fig. 1. 10 celler viste negative reaksjoner med begge reagenser. 42 celler viste positive reaksjoner med sammen-lignbar styrke med begge reagenser. Ut fra disse resultater kan det konkluderes med at den foreliggende anti-D antistoff-reagens er like spesifikk som "Ortho" anti-D serum for saltoppløsningsprøverørsprøven, og at den kan brukes i prøver hvor "Ortho" anti-D serum i objektglass og modifisert prøverørsprøver gir ikke-spesifikke reaksjoner.

Foreliggende anti-D antistoff-reagens parti 78-AS-074 ble sammenlignet med "Ortho" anti-D serum i objektglass og modifisert prøverørsprøve, parti R5736 og R5773 ved å utføre modifiserte rørprøver, glasstavprøver og objekt-glassprøver ifølge de fremgangsmåter som er anbefalt på etiketten. De modifiserte prøverørsprøvene ble utført ved å bruke saltoppløsningssuspenderte prøveceller og serum-suspenderte prøveceller, respektivt. De resultater man oppnådde med saltoppløsningssuspenderte prøveceller er vist på fig. 2, og indikerer at reaksjonen med de to anti-sera lar seg sammenligne. Resultatene som ble oppnådd med serum-suspenderte prøveceller, er vist på fig. 3. Det fremgår av disse resultater at reaksjonene med foreliggende anti-D antistoff-reagens er noe sterkere enn de reaksjoner man fikk med anti-D serum i nevnte prøve på objektglass og modifiserte prøverør. Glasstavprøve-reaksjonene er vist på fig. 4 og indikerer at reaksjonene med foreliggende anti-D antistoff-reagens er sterkere. Resultatene av objektglassprøvene er vist på fig. 5. I disse prøver viser foreliggende anti-D antistoff-reagens noe svakere reaksjoner enn anti-D serum i prøver på objektglass og modifiserte prøverør. Bruken av polymeri-se-rt bovin-serumalbumin (fig. 6) bedrer styrken på agglutineringen. Figuren viser at styrken på agglutineringen for hver sammensetning med to til tre uker gamle røde blodceller (3-5%) suspendert i saltoppløsning.

På figurene 1-6 er graden av agglutinering angitt ved betegnelsene 0, 1 , 2 , 3 , 4 og S, og hvor 0 betegner ingen observerbar agglutinering, mens 1<+> til og med 4<+ >betegner progressivt større grader av agglutinering, og S betegner "fast" eller maksimal agglutinering.

Claims (5)

1. Antistoffreagens for bruk for hurtig bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet på røde blodceller av D-antigen, innbefattende redusert, S-alkylert IgG antistoff til det antigenet som i slide-testen eller hurtigrørtesten har en gjennomsnittlig titer på minst 32 for D-celler, holdt ved en pH-verdi mellom 7,5 og 8,3 av en effektiv, forenlig buffer, karakterisert ved at antistoffet holdes i et medium inneholdende polymerisert bovinalbumin for oppnåelse av en total proteinkonsentrasjon på 6-10 vekt-%, og ved at antistoffet har blitt fremstilt ved: (a) oppnåelse av et vesentlig lipid-fritt human-antiserum inneholdende IgG antistoff til D-antigenet; (b) justering av pH-verdien til nevnte antiserum til ca.

8,6 ved tilsetning av en effektiv buffermengde av en forenlig buffer; (c) redusering av nevnte bufferbehandlede antiserum med et reduksjonsmiddel; (d) S-alkylering av nevnte reduserte, buffermiddelbehandlede antiserum med S-alkyleringsmiddel; (e) dialysering av nevnte S-alkylerte, reduserte antiserum ved en pH-verdi mellom 7,5 og 8,3, og (f) justering av den totale proteinkonsentrasjonen for det dialyserte serum til 6-10 vekt-% ved tilsetning av polymerisert bovinalbumin.

2. Antistoffreagens ifølge krav 1, karakterisert ved at bufferen benyttet i trinn (b) er 2M tris-(hydroksymetyl)aminoetan.

3. Fremgangsmåte for bestemmelse av tilstedeværelsen eller fraværet på røde blodceller hos et gitt individ av D-antigen, ved å tilsette en antistoff-reagens til en prøve av røde blodceller som skal testes, og observere om agglutinering forekommer eller ikke, karakterisert ved at man anvender antistoff-reagensen ifølge kravene 1-2, og foretar observasjonen uten vesentlig inkubasjon.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at antistoffreagensen holdes ved en pH-verdi mellom 7,5 og 8,3.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at den utgjøres av en slide-test hvor trinn (b) utføres på et test-slide, som på forhånd er oppvarmet til 4 0-5 0°C.