NO149079B

NO149079B - Endebeslag for roer eller slange

Info

Publication number: NO149079B
Application number: NO752691A
Authority: NO
Inventors: Roland Skarud
Original assignee: Wirsbo Bruks Ab
Priority date: 1974-08-01
Filing date: 1975-07-31
Publication date: 1983-10-31
Also published as: CA1044723A; FR2280851B1; DK139768C; DK139768B; JPS51128719A; ATA587975A; SE405282B; AT342938B; DK347675A; DD120695A5; FR2280851A1; DE2532959A1; NO752691L; CH589245A5; NO149079C; FI752179A; SE7508684L

Abstract

Endebeslag for rør eller slange.

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering.

Denne oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre ved dyrkning av en ny stamme, nemlig Microbacterium ammoniaphilum, ATCC 1535^ under aerobe forhold og an-vendelse av karbohydrat som substrat.

Ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan L-glutaminsyre akkumuleres til høy konsentrasjon etter kortere tids opphold i dyrkningsmediet og derved lette en fremstilling av L-glutaminsyre i teknisk målestokk.

Den nye stamme ATCC 1535^, Microbacterium ammoniaphilum, ble for første gang isolert av oppfinnerne fra kloakkvann. Det viste seg at Microbacterium ammoniaphilum som ansøkerne isolerte, er helt forskjellig fra alle de kjente mikroorganismer som kan fremstille L-glutaminsyre, f.eks. fra Micrococcus glutamicus, Brevibacterium divaricatum, Brevibacterium aminogenes, Brevibacterium glutamicus, Brevibacterium kawasaki, Brevibacterium lactofermentus nov. sp., Microbacterium fJavum var. glutamicum, Microbacterium salicinovorum nov. sp., Bacillus megatherium var Nr. 1066, Bacillus gigantus n. sp., Bacillus circulans.

Grunnen til at Microbacterium ammoniaphilum ATCC 1535^ hører til en ny art vil tydelig fremgå av den følgende beskrivelse av stammens bakteriologiske egenskaper, som ble undersøkt i henhold

til den måte som er angitt i "Manuel of Microbiological Methods", som er utgitt av Society of American Bacteriologists (1957).

I. Mikroskopiske iakttagelser:

1) Morfologiske egenskaper:

Vegetative celler: staver, vanligvis 0,6 - 0,8^u x 1,0 - 2,5/U utpreget pleomorfi, i et mikroskop iakttas k]ø/erformede, svakt bøyede og oppsvulmede celler, det iakttas kantede, palisadeaktige celler og celler av form som et kinesisk skrifttegn på grunn av deling ved avknekning, det iakttas ingen forgrening, det iakttas ingen livssyklus eller knoppskytning på noe trinn av gjæringen. 2) Gramtest: positiv, ingen forandring av fargbar-heten i noe trinn av fermenteringen.

3) Sporedannelse: ingen.

H) Plagella: ingen.

5) Små korn (Refrels eller Alberts metode): observert tydelig ved begge cellenes poler, og i noen til-feller bare ved den ene pol.

6) Mobilitet: ingen.

7) Syrefasthet: negativ.

II. Dyrkningskarakteristikker:

I) Agarkolonier:

Vekst: temmelig langsom, etter 24.timer dannes kolonier på 0,5-'l mm i diameter, som etterhånden vokser. Kolonier: liten sirkel, kanten: hel, svakt hevet, overflaten: svakt tørr og glatt, ugjennomsiktig og sitrongul, som blir mørk ved aldring.

2) Forsøk.med agar-strek:

Ve.kst: Utmerket;

Vekstens form: Trådforgrenet;

Lukt: Ingen;

Mediets farge: Uforandret.

3) Agar-stikkultur og tioglykollat-stikkultur:

Vekst bare på overflaten; aerob.

4) , Nærings supp e :

Moderat med dannelse av membranaktig sediment etter vekst, luktfri.

5) Blod-agar:

Hemolytisk -reaksjon: ingen.

6) Løfflermedium:

Rikelig vekst.

7) Blod-tellurittmedium:

Svarte kolonier.

8) Potet-medium:

Sitrongule kolonier fra den opprinnelige kultur.

III. Fysiologiske egenskaper:

1) Temperaturforhold:

Optimal temperatur: 25 - 35°C.

Termisk motstand: overlever i \ time ved 70°C og i T/M time ved 7-2°C i en kultur av skummet melk.

2) Katalasereaksjon: positiv

3) Nitrittdannelse fra nitrat-: ingen

4) .) Hydrogensulf iddannelse : ingen

5) IndoldanneTse-. negativ

6) M. R.-reaksjon-: positiv

7) V.P.-reaksjon: negativ

8) Vekst i Kosers medium: ingen

9) Vekst .i Huckers -medium: ingen

10) Urease: positiv

11) Gelatin-stikkultur: Organismen gror bare på overflaten og smelter ikke gelatin

12) Stivelsehydrolyse: ingen

13) Lakmus melkkultur: uforandret

14) Ammoniakkdannelse: Intet fra pepton

15) Utnyttelse av cellulose: ingen

16) Metylenblått-reduksjon: positiv

17) Dannet pigment: sitrongult, vannuopp-løselig, mediets farge uforandret. 18) Fermentering av forskjellige sukkerarter: Syredannelse med hurtig spaltning fra glukose, fruktose, sukrose, maltose og mannose; syredannelse med sen spaltning fra threhalose og in-ositol;"ingen syredannelse fra laktose, xylose, arabinose, rhamnose, raffinose, galaktose, glyserol, adonitol, mannitol, dulcitol, sor-bitol, salicin, dekstrin, stivelse, inulin og gly-kogen; ingen gassdannelse fra noen sukkerart. 19) Aktiologiske egenskaper: Ikke patogen overfor marsvin og mus. 20) Krav til næring: Cystin og biotin er nød-vendige for vekst. 21) Melkesyre ble observert i en standard kultur hvor mediet inneholdt glukose.

Det er, ut fra de ovenfor nevnte egenskaper hos Microbacterium ammoniaphilum, bestemt i henhold til "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" (1957), 7- opplag, utgitt av Society of American Bacteriologists, helt klart at Microbacterium ammoniaphilum tilhører ordenen Eubacteriales, da den er en bakterie som har følg-ende egenskaper: positiv gram-reaksjon; ingen sporedannelse; negativ syrefasthet; stor pleomorfisme, kantet og palisadeaktig, iakttas tydelig.,

Sett ut fra det faktum at blant familiene av L-glutamin-syreproduserende mikroorganismer er familien Micrococcaceae kule-eller eggformet og ikke har noen termisk motstandsevne, mens familien Brevibacteriaceae ikke har noen pleomorfisme og ingen termisk motstandsevne, og familien Bacillusaceae gir sporedannelse, kan det sluttes at den stamme som den foreliggende oppfinnelse angår, ikke hører til noen av åe ovennevnte familier, men at stammen tilhører familien Corynebacteriaceae. Videre er det ut fra de følgende fakta 1) - 7) ved omhyggelig sammenligning med slekter av familien Corynebacteriaceae som er nevnt i Bergeys Manual, klart at den stamme som den foreliggende oppfinnelse angår, må tilhøre selkten Microbacterium. 1) Stammen aom anvendes i henhold til oppfinnelsen kan ikke tilhøre slekten Listeria, da den ikke har motilitet. 2) Heller ikke kan den tilhøre sfekten Erysipelothrix fordi dens katalasereaksjon er positiv og dejn vokser under aerobe betingelser.

3) Videre kan den ikke tilhøre slekten Cellulomonas,

da den ikke kan utnytte cellulose.

4) Ennvidere kan den ikke tilhøre slekten Arthrobacter, da morfologiske forandringer i livscyklus og forandring av gram-reaksjon i hvert fermenteringstrinn ikke observeres. 5) Etiologisk natur og store krav til næringsstoffer - slik som hos Corynebacterium - observeres ikke, men dens krav til næringsstoffer er større enn hos Cellulomonas og Arthrobacter (begge disse er jord-mikroorganismer), det vil si stammen krever cystin og biotin. 6) Den produserer melkesyre i et medium i en standkul-tur.

7) Den tåler opphetning ved 70°C i 30 minutter og i

15 minutter ved 72°C.

Organismen- som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse adskiller seg både fra Microbacterium lacticum og fra Microbacterium flavum, som i Bergeys Manual beskrives som arter som hører til slekten Microbacterium, på grunn av forskjellen med hensyn til spaltning av stivelse og maltose, åer blir betraktet som nøkkel-identifiseringstrekk for de nevnte to arter. Ennvidere er verken Microbacterium lacticum ATCC Nr. 8l80 eller Microbacterium flavum ATCC Nr. 10340, som er blitt deponert som standard stamme hørende til genus Microbacterium i American Type Culture Collection, og der har fått sine nummere, i stand til å produsere L-glutaminsyre. Der-imot har den stamme som den foreliggende oppfinnelse gjelder, en bemerkelsesverdig evne til å produsere og akkumulere L-glutaminsyre når stammen dyrkes under aerobe betingelser i et medium som inne-, holder karbohydrater, en nitrogenkilde og andre næringsstoffer. Videre er det klart, at den i henhold til oppfinnelsen anvendte stamme adskiller seg tydelig fra to før kjente L-glutaminsyre-produserende arter, nemlig Microbacterium flavum var. glutamicum (se engelsk patent nr. 885.611 og fransk patent nr. 1.245.779) resp. Microbacterium salicinovorum nov. sp. _ IDoi, Kaneko; Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan 34, (10) s. 836 - 866/ som hører til genus Microbacterium. Dette fremgår av de egenskaper som er angitt i den følgende tabell.

Den stamme som anvendes i henhold til den foreliggende oppfinnelse må følgelig ansees som en ny art, som aldri er blitt be-skrevet før. Ansøkerne har gitt den navnet Microbacterium ammoniaphilum, fordi den ikke .alltid krever urea, men bare vandig ammoniakk eller ammoniakkgass muliggjør tilstrekkelig vekst og dermed den be-merkelsesverdige produksjon av L-glutaminsyre.

Det er også ut fra det som foran er angitt helt klart at Microbacterium ammoniaphilum adskiller seg tydelig fra de tidligere kjente L-glutaminsyre-produserende arter som er gram-positive og ikke har noen sporedannelse.

Oppfinnelsen vedrører altså en fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre ved dyrkning av en mikroorganisme under aerobe betingelser i et kulturmedium inneholdende karbohydrat, nitro-genkilse, naringsstoffkilde og mineralsalter, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Microbacterium ammoniaphilum, ATCC 15354.

Fremgangsmåten belyses nærmere i den følgende beskrivelse.

De karbohydrat- og nitrogenkilder som før er blitt anvendt for fremstilling av L-glutaminsyre ved fermentering er også egnet i den foreliggende fremgangsmåte. Som karbohydrat kan det f.eks. anvendes glukose, fruktose, mannose, sukrose, maltose, stivelseshydro-lysatvæske der som hovedbestanddel inneholder de ovennevnte karbohydrater, rørsukker, rørsukkermelasse eller sukkerroemelasse. Videre som nitrogenkilde kan det anvendes ammoniakk eller ammoniumsalter, f.eks. ammoniumklorid eller sulfat; også urea kan benyttes. Enn videre kan det benyttes nitrogenholdige organiske materialer som inneholder forskjellige arter av aminosyrer og vitaminer, f.eks. pepton, kjøttekstrakt, "NZ"-amin, hydrolysat av hveteprotein, maisstøpe-væske. Som mineralsalter kan det benyttes f.eks. magnesiumsalter, kaliumsalter, fosfater og andre anorganiske salter, sammen med de ovennevnte kilder for karbohydrater og nitrogen.

Mere spesielt består en fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen deri at man dyrker den nye stamme av Microbacterium ammonia-philium ved 27_33°C og pH 6,0-8,5 under tilføring av luft og omrøring, stanser dyrkingen etter 28-60 timers forløp, filtrerer bakteriecellene fra suppen, og feller ut L-glytaminsyren ved det isoelektriske punkt ved nøytralisering av filtratet til pH 3)2 eller feller ut saltsyre-saltet av L-glutaminsyren ved å tilføre hydrogenkloridgass, eller ved å behandle filtratet med en ioneutvekslende harpiks eller en ioneutvekslende membran, slik at L-glutaminsyren isoleres.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er uventet overlegen enhver tilsvarende fremgangsmåte i visse henseende på grunn av bruk av den nye stamme Microbacterium ammoniaphilum, ATCC 1535^. Ifølge norsk patent nr. 111.795 er det kjent en fremgangsmåte for fremstilling av en aminosyre, spesielt L-glutaminsyre ved å dyrke flere mikroorganismer i et flytende kulturmedium, idet mikroorganismene omfatter forskjellige bakterier, gjær og sopp. Ifølge eksemplene angitt i pa-tentet oppnås beste resultat ved bruk av Torulopsis utilis ATCC 15239 under bestemte kontrollerte beingelser som representerer fremstilling av L-glutaminsyre med bare 0,67 g pr. 100 ml av væskemediet med et lavt glukoseforbruk av størrelsesorden 60% basert på den gitte mengde og med et lavt utbytte av syre på 22,3$ basert på forbrukt glukose. I motsetning hertil muliggjør fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen å oppnå en markert høyere produksjon av L-glutaminsyre, f.eks. rundt 2 til 4 g eller høyere pr. 100 ml, med et høyere utbytte, f.eks. rundt 40 til 60%, eller høyere basert på forbrukt glukose, som det fremgår av de følgende eksempler.

Generelt adskilles fremgangsmåten ifølge, oppfinnelsen fra enhver tilsvarende kjent prosess deri at utbyttet av L-glutaminsyre basert på forbrukt glukose er så høyt, som er uventet fra det som tidligere er kjent. Den annen tydelige effekt med foreliggende oppfinnelse i forhold til teknikkens stand er at den _nye stamme som benyttes ifølge oppfinnelsen har en uvanlig høyere effektivitet i ammoniakkutnyttelse, enn det .som er kjent fra andre mikroorganismer. Videre i lys av det faktum at ammoniakk er det mest billige, lett håndterlige material som nitrogenkilde i fermenteringer for fremstil-lingen av L-glutaminsyre medfører foreliggende oppfinnelse en -stor fordel for industriell fremstilling av .L-glutaminsyre ved fermentering.

Eksempel 1.

Det ble i-en 500 -m-l rysteko3.be anbragt 100 ml av en

-blanding, som inneholdt 5 volumprosent av en teknisk aminosyreoppløs-ning - som var blitt fremstilt ved hydrolyse av hvete.protein - fra hvilken L-glutaminsyre var blitt fjernet, og 5 volumprosent maisstøpe-væske, samt 0 ,1 g KH2PO^, -0 ,1 g MgSOjj. 7H20. Denne blanding ble innstillet på pH 6,4 -og sterilisert-, og deretter ble det i-den inokulert to små prosjoner (som hver "kunne tas i en sløyfe av platinatråd) av Microbacterium ammoniaphilum ATCC 1535^ som var blitt inkubert på skrå-agar, og blandingen ble -deretter rystet.og dyrket ved 28°C i 24 timer.. Denne kultur ble anvendt som en for-kultur (frøkultur). Et kulturmedium inneholdende 5 vektprosent glukose, 1, 2% urea, 0,1$ ammoniumsulfat, 0, 7% KH^PO^, 0, 1% MgS0^.7H20, 0, 2% av den ovennevnte amino-syreoppløsning og 0,4$ maisstøpevæske ble anbragt i en 500 ml rystekolbe, innstillet på pH 6,8 og sterilisert. Den ovennevnte for-kultur ble inokulert i en mengde av 2,5 ml i hver 100 ml av kulturmediet, og

blandingen ble dyrket under rysting. Etter 36 timers forløp fikk man pr. 100 ml kulturvæske 1,83 g L-glutaminsyre, etter 72 timer 2,11 g, og etter 96 timer 2,12 g, altså omtrent det samme som etter 72 timers forløp. På dette tidspunkt inneholdt væsken 1,50 g/100 ml gjenværende sukker. Utbyttet, beregnet på anvendt sukker var ca. 42% og beregnet på forbrukt sukker ca. 62%.

Eksempel 2.

Et kulturmedium som inneholdt 10,02 vektprosent glukose, 0, 1% ammoniumsulfat, 0, 2% KHgPOjj, 0,05% MgSO^.THgO, 0,2% av den ovennevnte aminosyreoppløsning og 0,4% maisstøpevæske, i en 10 liters be-holder, ble innstillet på pH 7»0. I 5 liter av den resulterende medium, som var blitt sterilisert, ble den samme for-kultur som i eks. 1 inokulert i en mengde av 100 ml, hvoretter blandingen ble dyrket ved 28°C under rysting med 400 omdreininger pr. minutt, mens luft ble blåst inn i en mengde av 5 liter pr. minutt. Etter 6 timers for-løp fra inokuleringen ble ammoniakkgass kontinuerlig innført i væsken, ' som aminokilde, inntil pH = 8,0. Etter 24 timers fbrløp fra starting-en av fermenteringen var det dannet 2,79 g L-glutaminsyre pr. 100 ml, og etter 36 timers forløp 4,13 g- Etter 72 timers forløp var inn-holdet av L-glutaminsyre 4,11 g pr. 100 ml, og denne mengde holdt seg praktisk talt uforandret. Volumet av fermenteringsvæsken var på dette tidspunkt 4,9 liter. Utbyttet, beregnet på anvendt sukker, var følge-lig 40,2% og beregnet på forbrukt sukker 43,1%. Den erholdte fermenteringsvæske ble filtrert og konsentrert, hvoretter L-glutaminsyren ble utfelt ved regulering av pH til 3»2, filtrert fra og tørket, hvor-ved man fikk 185,3 g L-glutaminsyre av 96% renhetsgrad.

Eksempel 3-

500 ml av den samme for-kultur som i eks. 1 ble inokulert i 50 liter av den samme dyrkningsvæske som i eks. 1, som var blitt fremstilt i en fermenteringsbeholder av volum 100 liter. Blandingen ble dyrket under rysting med 280 omdreininger pr. minutt, ved 28°C i l80 timer, mens det i væsken ble blåse inn luft i en mengde av 30 liter/minutt. Væsken ble anvendt som for-kultur for det annet trinn. Et dyrkningsmedium som inneholdt 9,97% glukose på basis av stivelseshydrolysevæske, 0,2 vektprosent KH2P0^, 0,05% MgSOjj.7H20 og 0,5% maisstøpevæske ble tilberedt i en 2 m'' fermenteringstank, hvoretter ammoniakkgass ble innført i væsken til pH 7,2. Den resulterende væske ble inokulert med 50 liter av nevnte annet-trinns kultur og dyr-

ket ved 28°C under rysting ved 190 omdreininger pr. minutt mens det ble blåst inn 500 liter luft pr. minutt. Fra 3 timer etter inokuleringen begynte man å lede inn ammoniakkgass, inntil pH = 8. På denne måte fikk man etter.24 timer fra fermenteringens start 2,75 g L-glutaminsyre pr. 100 ml væske og etter 42 timer 4,26 g/100 ral. Det gjenværende sukker etter 42 timer var 0,28 g/100 ml, beregnet som glukose, og mengden av fermenteringsvæske var 975 liter. Utbyttet beregnet på benyttet sukker var 4l,6% og på forbrukt sukker 42,8%. Fermenteringsvæsken ble behandlet på samme måte som i ekse. 2, hvor-ved man utvant 37»3 kg rå L-glutaminsyre av renhetsgrad 96%.

Eksempel 4.

100 ml av et kulturmedium som inneholdt 5 vektprosent roemelasse, beregnet som glukose, og som var behandlet så den var egnet for fremstilling av L-glutaminsyre, 0,2 vektprosent KH^POjj, 0,05 vektprosent MgSO^.7H20, 1,2 vektprosent urea og 0,1 vektprosent (NH1|)2S01| ble helt i en 500 ml rystekolbe, innstillet på pH 6,4 og sterilisert. Det ble inokulert 2,5 mi av samme for-kultur som i eks. 1, og blandingen ble dyrket under rystning ved 28°C. Etter 72 timers dyrkning var utbyttet av L-glutaminsyre 2,64 g/l. Konsentra-sjonen av de gjenværende karbohydrater i væsken var på dette tidspunkt 0,51 vektprosent. Utbyttet beregnet på anvendt sukker var 53% og på forbrukt sukker 58%.

Claims

Fremgangsmåte for fremstilling av L-glutaminsyre ved dyrkning av en mikroorganisme under aerobe betingelser i et kulturmedium inneholdende karbohydrat, nitrogenkilde, næringsstoffkilde og mineralsalter, karakterisert ved at det som mikroorganisme anvendes Microbakterium ammoniaphilum, ATCC 15354.