NO135671B

NO135671B -

Info

Publication number: NO135671B
Application number: NO1390/70A
Authority: NO
Inventors: M Yoshida; M Hirao
Original assignee: Hayashibara Co
Priority date: 1969-04-15
Filing date: 1970-04-14
Publication date: 1977-01-31
Also published as: ZA702483B; FR2043277A5; BE748974A; SE382226B; NO135671C; NL168270C; CH525280A; NL168270B; AU1390570A; CA938235A; GB1313421A; US3721605A; NL7005374A; DE2018073A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av hovedsakelig makromolekylær amylose av stivelse med høye innhold av amylose ved hydrolyse av den forgrenede del av amylopectinet som er tilstede deri, til lineær amylose ved hjelp av a-1,6-glucosi-dase.

Stivelse, som produseres i eller under jorden, f«eks. i poteter, batat, tapioka, sago, hvete, mais og lignende, består av amylose,

som utelukkende inneholder a-1,4-glucosidbindinger, samt makromolekylært amylopectin som består av lineære molekylkjeder, som utelukkende inneholder a-1,4-glucosidbindinger, hvilke kjeder innbyrdes er bundet sammen ved a-1,6-glucosidbindinger til dannelse av mange forgreninger. Vanlig stivelse har et amyloseinnhold på 20 - 25%o Amylose er en makromolekylær lineær forbindelse med en polymerisasjonsgrad på over 1„000, og den viser partiell krystallinitet og har filmdannende egenskaper på grunn av sin struktur som minner om strukturen av cellulose„ På den annen side har amylopectin en kom-plisert forgrenet struktur og svelles lett til dannelse av geler„ OppLøsninger av amylopectin viser høy viskositet og anvendes som adhes iv.

Naturlig stivelse er således en blanding av amylose og amylopectin med vidt forskjellige egenskaper, og det er derfor nesten umulig å fremstille stivelse med konstante egenskaper på grunn av variasjoner i blandingsforholdet mellom disse to bestanddeler samt i deres molekylvakt„ Ved de forskjellige anvendelser av stivelse er det derfor umulig å oppnå en fullstendig utnyttelse av disse to komponenter.

Det kan f.Rks. nevnes at amylopectininnholdet påvirker amylosefilms bøyelighet på en slik måte at ren amylosefilms bøyningsmot-standsdyktighet på 10400 nedsettes til mindre enn I/IO ved et amylo- pectininnhold på 50% og nedsettes ytterligere når innholdet er så høyt som 80%, slik som tilfellet er i vanlig stivelse» Dette eksempel viser klart at tilstedeværelsen av selv en liten mengde amylopectin medfører en betydelig forringelse av filmens egenskaper.

Mens amylopectin kan fåes i ren tilstand som stivelsen i frø av ilex, kan ren amylose ikke fåes som naturprodukt„ Ved nyere under-søkelser av plant evarianter har det lykkes å tilveiebringe amylomais med et amyloseinnhold på 80% i forsøksmålestokk. men de arter som kan anvendes i større målestokk, gir kun et innhold på 50 - 60%„ De inneholder således stadig amylopectin i et innhold på ca. 50% og er således langt fra å gi ren amylose. Bortsett fra dette.er selv denne amylomais kostbar.

Det er således gjort mange forsøk på å adskille amylose og amylopectin, som f„eks. er tilstede i potet stivelse, og det er allerede markedsført produkter som er fremstilt ved at stivelse i pastatilstand underkastes selektiv utfelning ved tilsetning av salter.

1 disse produkter inneholder amylosen imidlertid fremdeles ca. 20% amylopectin og har en polymerisasjonsgrad på ca. 200. Amylosen er således nedbrutt i betydelig grad i forhold til naturlig amylose»

Det har derfor hittil vært umulig å fremstille ren amylose i industriell målestokk, en amylose som er fri for amylopectin som er et makromolekylært stoff med en avvikende struktur»

På den annen side er behovet for ren makromolekylær amylose meget stort på grunn av dens gode egenskaper i forbindelse med ut-viklingen av amy lomaisst ivelse o.g undersøkelser vedrørende anvend-elsene av denne stivelse»

På dette grunnlag har oppfinnerne nå foretatt omfattende under-søkelser vedrørende industriell fremstilling av makromolekylær amylose og har tilsiktet en nedbrytning av amylopectin i amylosehoIdig stivelse, spesielt stivelse som er rik på amylose, dvs» amylomaisstivelse eller rå amylose adskilt fra stivelse, ved hjelp av forskjellige enzymer, bl0a0varmebestandig a-1,6-glucosidase, som nylig er blitt utviklet av do samme oppfinnere, til modifisering av amylopectin

ved oppnåelse av et amyloselignende molekyl, slik at der fåes en ensartet amylose, hvilket muliggjør full utnyttelse av dens egenskaper .

Det har således vist seg at eftersom amylopectin, som, som det er beskrevet ovenfor, uunngåelig finnes sammen med amylose, har forgrenet struktur på grunn av 1 -1 ,6-gluensidbindingene, kan man utnytte en nedbrytning ved hjelp av -, i ~ 1,6-g lucos idase som viser aktivitet utelukkende på a-1,6-bindingen i de forgrenede deler, til oppnåelse av lineære molekyler som ligner amylose, med ensartet struktur og egenskaper. Ved behandling med a-1,6-glucosidase kan der oppnåes en fullstendig utnyttelse av amylosens egenskaper ut fra et rått amylosemateria]e, og en slik fremgangsmåte er nå hermed opp-nådd i industriell skala.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte ved fremstilling av amylose hovedsakelig bestående av makromolekylær amylose fra preparater av stivelse inneholdende minst 50% amylose, hvilken fremgangsmåte erkarakterisert vedtrinnene: stivelses-preparatet forvæskes ved en temperatur så lav som mulig innen området fra 70 - 130°C, det forvæskede preparat avkjøles hurtig til en temperatur i området 50 - 60°C og blandes og behandles med en varmebestandig a-1,6-glucosidase ved denne temperatur, reaksjonsblandingen avkjøles videre til en temperatur på 4-0 - 50°C, og blandes og behandles med den samme eller en annen a-1,6-glucosidase ved denne lavere temperatur, og den utfelte amylose skilles fra den dannede oppløsning.

Det enzym, a-1,6-glucosidase, som skal anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, dannes av Escherichia intermedia ATCC 21073 (beskrevet i japansk patent nr. 530931) og Pseudo - monas amyloderamosa ATCC 21262, som er funnet av oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse. Det har også allerede vist seg at a-1,6-glucosidase produseres av de vanlige stammer av 11 slekter (Agrobacterium, Azotobacter, Leuconostoc, Microbacterium, Pediococcus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus, Streptococcus, Bacillus og Erwinia) samt Micrococcus, Nocardia og Lactobacillus. Det har videre vist seg at varmebestandige enzymer produseres effektivt av stammene av 5 slekter (Actinomyces, Nocardia, Micromonospora, Streptomyces og Thermonospora som alle tilhører Actinomycetes). Blant de ovennevnte produserende slekter har stammene av Lactobacillus og stammene av artene av Actinomycetes vist seg å gi varmebestandige enzymer som har et aktivt temperatur-område på 50 - 60°C sammenlignet med 30 - 40°C for de andre stammers vedkommende, og dette forhold er spesielt viktig for industriell utnyttelse, spesielt hvor der anvendes enzym og sukker, da det her nøye må påsees at det ikke skjer noen forurensning med forskjellige mikroorganismer„

De nevnte varmebestandige enzymer er identiske med andre enzymer med hensyn til evnen til å hydrolysere a-1,6-glucosidbindingen i stivelse, men de har et lavere aktivt pH-område på 3 - 7 sammenlignet med 4-7 for de andres vedkommende, og de synes å være særlig velegnet til fremstillingen av amylose på grunn av deres reaksjons-mekanisme som avviker fra de andres reaksjonsmekanisme0For disse varmebestandige enzymers vedkommende skal det bemerkes at den dannede amylose utfelles selv under behandlingene med enzym slik at isoler-ingen og rensningen lettes, hvilket vil bli forklart nærmere i det eft e rføIgende.

Med hensyn til den stivelse som skal anvendes som råmateriale til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan det anføres at det ved anvendelse av en hvilken som helst stivelse som inneholder amylose, kan oppnåes i det minste en del av fordelene ved oppfinnelsen, men det resulterende produkt vil muligens ha forholdsvis stort innhold av komponenter med kortere kjeder. Det foretrekkes derfor å anvende stivelse med så høyt amyloseinnhold som mulig, f„eks„ amylomaisstivelse» Også amylose adskilt fra stivelse kan anvendes med godt resultat til oppfinnelsens formål.

Forvæskningen av en slik stivelse eller dens omdannelse til pasta bør utføres under oppvarmning til en så lav temperatur som mulig uten kontakt med luft og, om mulig, efter fjernelse av oppløst oxygen og i en strøm av inert gass, f0eks» nitrogengass, for å oppnå langkjedet amylose ved at amylosens nedbrytning ved oppvarmning hindres, og luftoxydevsjon under dannelse av molekyler med kortere kjeder likeledes hindres»I foreliggende ansøknings eksempler er kon-takten med luften forhindret ved at man først oppvarmer stivelsen til 50°C, hvilket er lavere enn den temperatur ved hvilken stivelsen omdannes til en pasta, hvorefter man fjerner oxygen i en vakuumavgasningsbeholder og derefter oppvarmer i en fullstendig lukket forvæskningsbe-holder» Oppvarmningen utføres ved 70 - 130°C, fortrinnsvis ved en så lav temperatur som mulig» Det er også mulig å anvende ultralyd-bølger med en slik styrke at de ikke fører til nedbrytning av amylosen»Stivelsens konsentrasjon settes til 5 - 15%, fortrinnsvis 5 - 10%, da ph høyere konsentrasjon vil føre til for høy viskositet og således forstyrre enzymets virkning»

Stivelsen som er bragt i pastatilstand, avkjøles hurtig til 50 - 60°C og behandles med a-1,6-glucosidase. Ved denne behandling er det nødvendig å avkjøle stivelsespastaen så hurtig som mulig og å påbegynne behandlingen med enzymer, da den makro-molekylære amylose ellers har høy viskositet og utviser retrogradering som gjør avspaltningen av amylopectinets forgrenede struktur ufullstendig. Ror dette formål er det derfor ønskelig å sprøyte ut stivelsen i et vakuumkjøletårn under samtidig inn-sprøytning av enzymer slik at der oppnåes meget hurtig avkjøling og samtidig gjennomblanding. Blandingen taes ut kontinuerlig og føres til en blandebeholder hvor hydrolysen allerede begynner.

I denne beholder gjennomblandes blandingen i ytterligere 1 -

3 timer for å senke dens høye viskositet slik at retrogradering unngåes.

Det er særlig hensiktsmessig å anvende det varmebestandige enzym som kan fåes fra Lactobacillus og Actinomycetes, eftersom et slikt enzym kan anvendes ved høy temperatur, og reaksjonen utføres i to trinn. I det nevnte tilfelle oppnåes dette ved at pastaen hurtig avkjøles til 6o°C, blandes med det varmebestandige enzym og derefter forblir i blandebeholderen inntil viskositeten er nedsatt, hvorpå den efter avkjøling til l+ O - 50°C overføres til hovedreaksjonsbeholderen hvor hovedreaksjonen ut-føres under regulerte pH-betingelser.

Det er også mulig å anvende varmebestandige enzymer alene til den innledende reaksjon ved at enzymet tilsettes pastaen som er avkjølt til ca. 60°C, hvorefter dens viskositet nedsettes under oppholdet i blandebeholderen, og der ved hovedreaksjonen ytterligere tilsettes et annet velegnet enzym som er aktivt ved en lavere temperatur, f.eks. det enzym som kan fåes av Pseudomonas.

Som et spesielt eksempel er det videre mulig å blande det enzym som skal anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, med et enzym med andre egenskaper som kan erholdes fra andre stammer, f.eks. å blande enzymet av Pseudomonas med et enzym fra andre stammer, eller å tilsette de to enzymer på forskjellige tidspunkter i den ønskede rekkefølge. Anvendelsen av enzymet av Pseudomonas i kombi nasjon med et enzym fra en annen stamme ex særlig fordelaktig for den efterfølgende behandling.

Den samlede tilsatte enzymmengde er hensiktsmessig i området

20 - 50 enheter/g stivelse,,

Reaksjonen er fullstendig i løpet av 20 - 48 timer, i hvilket tidsrom langkjedede amylosemolekyler utfelles. Størstedelen av amylosen kan fraskilles som bunnfall ved sentrifugering på et passende trinn

i utfelningen og konsentrering av den flytende fase i vakuum til mellom halvdelen og 1/3 av sitt opprinnelige volum. Polymerisasjonsgraden og graden av forgrening i denne amylose kan bestemmes ved henholdsvis periodisk syreoxydasjon og Smith'sk nedbrytning (beskrevet av F.

Smith i J. Am. Chem. Soc„, 2å.. 5910 (1956)). Det viser seg at polymer isas jonsgraden i bunnfallet'og den oppløste del er henholdsvis 700- 800og 100 - 200 slik at sistnevnte del klart inneholder amylosemolekyler med lavere molekylvekt. Derimot viser det seg med hensyn til forgreningsgraden at den utfelte del er fri for forgreninger, mens den oppløste del inneholder 1-2 forgreninger pr. molekyl. Til sammenlinging skjer det ved nedbrytning med p-amylase i fortynnet opp-løsning med konsentrasjon 1 - 0,5% nesten fullstendig nedbrytning uten at det blir forgreninger tilbake. Disse forhold bekrefter at de ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremstilte produkter har den ønskede polymerisasjonsgrad og den ønskede lineære struktur, og at det således er gjort mulig å fremstille ønskelig ren amylose i industriell målestokk.

Oppfinnelsen er derfor spesielt verdifull fra et industrielt synspunkt, da det fremstilte produkt kan anvendes til spesielle formål, f «eks. til fremstilling av s-piselige film og spiselige fine skum-materialer, og produktet er på grunn av sin lettfordøyelighet sær-deles verdifullt i næringsmiddelindustrien og den farmasøytiske indust ri.

Fremstilling av enzym og måling av de ts aktivitet

Enzymer som kan anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er følgende: (3-amylase ekstrahert fra hvetekli (engelsk patentskrift nr. 1130398), a-1,6-glucosidase fremstilt av Pseudomonas amyloderamosa ATCC 21262, Escherichia intermedia ATCC 21073 og andre Actinomycetes-stammer, bl.a. Streptomyces diastatochromogenes IFO 3337, Actinomyces globisporus IFO 12208, Nocardia asteroides IFO 3384,Micromonospora melanospora IFO 12515 og Thermonospora vi rides IFO 12207 samt enzymer fremstilt av Agrobacterium tumefaciens IFO 3058, Azoto-bactcr ind.icus IFO 3744, Erwinia aroideaeIFO 3830, Lactobacillus plantarium ATCC 8OO8, Leuconostoc mesenteroides IFO 3426, Mycobacterium phlei IFO 31-58, Micrococcus lysodeikticus IFO 3333, Pediococcus acidilactici IFO 3884, Serratia indica IFO 3759, Streptococcus fecalis IFO 3128 og Staphylococcus aureus IFO 306l. Aktiviteten av P-amylase bestemmes ved at man omsetter en blanding av 5 ml 1%-ig opp-løsning av oppløselig stivelse, 4 ml 0,1M acetatbuffer og 1 ml enzym-oppløsning i 30 minutter ved 40°C og måler innholdet av det resulterende reduserte sukker som maltose. Aktiviteten av enzymet defineres som 1 enhet når det er produsert 10 mg maltose»

Aktiviteten av a-1,6-glucosidase bestemmes ved at man omsetter en blanding av 1 ml enzymoppløsning, 5 ml 1%-ig oppløsning av opp-løselig glutinøs risstivelse og 1 ml 0.5M acetatbuffer (pH-verdi 6,0) i 30 minutter ved 40°C, hvorpå 0,1 ml av reaksjonsblandingen tilsettes 0,5 ml 0,01M jod-kaliumjodidoppløsning og 15 ml 0,01N svovel-syre, og 15 minutter senere måles den optiske absorpsjon ved 620 nm av den således dannede blåfiolette farvning. Den erholdte verdi sammenlignes med den verdi som måles ved reaksjonstid 0, og aktiviteten av enzymoppløsningen defineres som 1 enhet når forskjellen i absorpsjon er 0,01»

Fremstilling av enzymoppløsning; 1) Escherichia intermedia ATCC 21073 i en mengde på 1 platinaspatel podes til 100 ml dyrkningsmedium inneholdende 0,5% maltose, 0,8% pepton og 0,5% natriumnitrat som er anbragt i en Saka-guchi-kolbe, og som rystes ved frem- og tilbakegående bevegelse,

125 perioder/min» Aktiviteten av a-1,6-glucosidase i dyrkningsblandingen oppnår den maksimale verdi efter dyrkning under rystning ved 30°C i 48 timer, hvorefter mikroorganismen fjernes ved sentrifugering»Herved oppnåes en oppløsning som inneholder enzymet.

Derpå skilles enzymet fra den isoamylaseholdige oppløsning ved awanning av den porsjon som utfelles med ammonium sulfat i kon-sentrasjonsområdet 15 - 48%, og det på denne måte erholdte enzym anvendes i form av en enzymoppløsning med bestemt konsentrasjon. Den optimale pH-verdi er 5,5 - 6,0, og den optimale temperatur for enzymet er 45°C. 2) Pseudomonas amyloderamosa SB-15 ATCC 21262 podes til et sterilisert dyrkningsmedium med pH-verdi 7 inneholdende 2% maltose, 0,2% natriumglutamat, 0,3% (NH^)2HP0^, 0,1% KH2P0^ og 0,05% MgS0^.7H20,

og det dyrkes under rystning i 120 timer ved 30°C„ En måling av aktiviteten efter dyrkningen viser at dyrkningsblandingen er I80 - 220

enhet er/ml, Dyrkningsblandingen sentrifugeres i 10 minutter ved et omdreiningstall på 10„000/min, hvorved der fåes en overstående væske som litt efter litt tilsettes kold aceton til en konsentrasjon på 75% under avkjøling og omrystning til utfeining av enzymet. Det således erholdte bunnfall fraskilles ved sent rifugering og frysetørres i vakuum, hvorved man får pulverisert a-1,6-glucosidase i et utbytte på 80 - 90%o Det på denne måte erholdte produkt er stabilt i tørket tilstand og kan renses ved utsaltning med ammoniumsulfat eller ved andre egnede metodercDette enzym har en optimal pH-verdi på 3>men det er stabilt i et område med pH 3 - 6, og det aktive temperaturom-råde er 40 - 50°C<J 3) Lactobacillus plantarum ATCC 8008 podes til 7 ml av et dyrkningsmedium inneholdende 1% pepton, 0,5% gjærekstrakt, 0,1% K^HPO^, 0,05% NaCl, 0,0002% MgSO^„7H20, 0,7% forvæsket stivelse og 0,5% maltose, hvorefter dyrkning blir foretatt under henstand i 1 dag ved 30°C, hvorpå mediet overføres i 10 liter dyrkningsmedium og henstår ytterligere til dyrkning i 2 dager ved 30°C. Derefter har dyrkningsblandingen en pH-verdi på 4»0, og aktiviteten av intracellulært enzym er l6 enheter/ml, mens aktiviteten av ekstracellulært enzym er 17 enheter /ml, slik at den samlede aktivitet er 33 enheter/ml.

Micrococcus lysodeikticus IFO 3333 i en mengde på 1' platinaspatel fra en frisk skråkultur podes til lOO ml av et dyrkningsmedium med pH-verdi JtO inneholdende 1% maltose, 0,5% pepton, 0,25% gjærekstrakt, 0,2% urea, 0,2% buljong, 0,1% K2HP0^, 0,45% KC1 og 0,05% MgS0^.7H20, og der dyrkes i 1 dag. 4 satser av den på denne måte erholdte dyrkningsblanding overføres til en 20 liters dyrknings-beholder og dyrkes ytterligere under luftning i 3 dager ved 30°C under omrøring ved et omdreiningstall på 200 omdreininger pr0minutt. Til slutt er pH-verdien 8,2.

Aktiviteten i og utenfor bakteriene er henholdsvis 12 og 39, slik at den samlede aktivitet er 51 enheter/ml.

De to ovennevnte dyrkningsblandinger sentrifugeres, hvorved mikroorganismene isoleres, som derefter vaskes én gang med rent vann og derpå suspenderes i et i forhold til dyrkningsblandinger 10 ganger så lite volum buffer med pH-verdi 7,0 inneholdende 0,1% natriumdode-cylsulfat (SDS), hvoreftqr blarrdingen underkastes selvdigerering under rystning i 2 dager ved 30°C og derpå sentrifugeres. Den resulterende overstående væske tilsettes ammoniumsulfat til en met - ningsgrad på 0, 8, og det resulterende bunnfall oppløses i vann, hvorpå det underkastes dialyse med vann i 1 dag og derefter sentrifugeres, hvorved der fåes en overstående væske som anvendes som enzymoppløsning.

Den optimale pH-verdi viser seg å være 5 - 6>5for Lactobacillus og 6 - 7 for Micrococcus, mens den optimale temperatur er ca. 45°C for Lactobacillus og 50 - 6o°C for Micrococcus, hvilket viser at det sistnevnte enzym er mere varmebestandig enn andre enzymer. 4) Stammer av Actinomycetes, nemlig stammer av Streptomyces, Actinomyces, Nocardia, Micromonospora og Thermonospora, podes i en mengde på 1 platinaspatel til dyrkningsmedier med pH-verdi 7 inneholdende 1% forvæsket stivelse, 0,5% pepton, 0,5% buljong og 0,5% NaCl, hvilke dyrkningsmedier er sterilisert på forhånd på vanlig måte ved oppvarmning ved 120°C i 20 minutter, hvorefter dyrkning foretaes under rystning i en 1.000 ml's kolbe i 4 dager ved 30°C.

De erholdte enzymoppløsninger utsaltes med ammoniumsulfat, som tilsettes til metningsgraden 0,4 - 0,6, hvorpå der behandles med 0,02N eddiksyrepuffer ved pH-verdi 7,0, absorberes på DEAE-cellulose og elueres med 0,02N acetatpuffer + 0,5N NaCl-oppløsning, hvorved fåes delvis renset enzym.

Enzymet har optimal pH-verdi 5,0 - 7>0 og optimal temperatur på 50 - 60°C, hvilket er ensbetydende med at det er mere varmebestandig enn andre enzymer. 5) De andre enzymproduserende stammer, nemlig stammer av Agrobacterium, Azotobacter , Bacillus, Erwinia, Leuconostoc, Mycobacterium, Pediococcus, Sarcina, Serratia, Staphylococcus og Streptococcus podes til steriliserte dyrkningsmedier inneholdende 1,0% pepton, 0,5% gjærekstrakt, 0,1% K^HPO^, 0,05% NaCl, 0,05% MgS0^.7H20,

0,01% FeSO^og 0,1% forvæsket stivelse, og der dyrkes under omrystning i 4 dager i en 1.000 ml's kolbe. Den frasentrifugerte mikro-organisme suspenderes i en pufferoppløsning inneholdende 0,1% SDS, hvorefter blandingen underkastes selvdigerering under rystning ved omdreining i 2 dager ved 30°C. Den erholdte overstående væske

(fra mikroorganismene) og væsken fra dyrkningsblandingen renses

ved utsaltning med ammoniumsulfat, som tilsettes til metningsgrad 0,85hvorpå det erholdte bunnfall oppløses i vann, og det dia-lyseres i 24 timer. Den overstående væske som fåes efter sent rifugering, anvendes som enzymoppløsning. Den optimale pH-verdi er 5 - 7, og den optimale temperatur er 45 - 50°C.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen belyses nærmere ved følgende eksempler:

Eksempel

Amylomaisstivelse oppvarmes litt efter litt ved en konsentrasjon på 10% og pit 6,0 under omrøring og under gjennomledning av nitrogengass hvorved man får en pasta med høy viskositet. Den erholdte pasta avkjøles hurtig til 6o°C, hvorpå den tilsettes varmebeståndig enzym produsert av Streptomyces i en mengde på 20 enheter/g stivelse under omrøring. Når viskositeten er blitt nedsatt i 1 time, nedsettes temperaturen til 50°C. Derpå tilsettes Pediococcus-enzym i en mengde på 20 enheter/g stivelse, hvorefter temperaturen nedsettes til 45°C, og blandingen omsettes i 45 timer. Den erholdte reaksjonsblanding konsentreres til halvdelen av det opprinnelige volum og henstår natten over, hvorpå det dannede bunnfall fraskilles ved sentrifugering, suspenderes i en tilsvarende mengde vann, sentrifugeres igjen og tørkes i vakuum. Der oppnåes et utbytte på 80%.

Et ytterligere produktutbytte på 10% kan fåes ved at man på lignende måte konsentrerer og avkjøler væsken efter fraskillelse av bunnfallet. Polymerisasjonsgraden er henholdsvis 550 og 105 i førstnevnte og sistnevnte produkt. Denne fremgangsmåte, som ellers er ganske vanskelig å utføre på grunn av den høye viskositet, lettes betydelig ved at der arbeides i to trinn. Amylosen som er vasket med vann, spraytørkes fra en konsentrasjon på 20 - 30%, hvorved man får et stabilt, porøst krystallinsk pulver.

Ekse mpel 2

Amylomaisstivelse behandles på lignende måte som beskrevet i eksempel 1, hvorefter den avkjøles til 60°C og tilsettes 15 enheter LactobaciHus-enzym, og viskositeten nedsettes ved pH 6,0. Efter av-kjøling ved henstand i 1 time innstilles pastaens pH på 4.0, hvorpå Pseudomonas-enzym tilsettes i en mengde på 20 enheter/g stivelse og omsettes i 48 timer ved 45°C„ Det dannede bunnfall fraskilles ved sentrifugering, og den gjenværende væske konsentreres i vakuum til 1/3 av sitt opprinnelige volum og henstår natten over, hvorpå det dannede bunnfall fraskilles ved sentrifugering og tørkes i vakuum. Utbyttet, er henholdsvis 30 og 60%. Polymer isas jonsgraden av det

førstnevnte produkt er 650.

Også i dette tilfelle lettes fraskillelsen av bunnfallet ved anvendelse av Pseudomonas-enzymet.

Eksempel 3

I dette eksempel forvarmes stivelsessuspensjonen til 50°C, hvorefter den føres gjennom en vakuumavgasningsbeholder for å hindre oxydasjon forårsaket av luften og derefter føres til et fullstendig lukket, kontinuerlig virkende forvæskningsapparat med omrører

(japansk patent nr. 426978). Mere detaljert innstilles en amylomais-suspensjon med konsentrasjon 10% på pH 6,0, hvorpå den forvarmes til 50°C og derpå avgasses og føres under trykk inn i det kontinuerlig virkende apparat. En fullstendig homogen pasta kan fåes efter en oppholdstid på 5 minutter, mens temperaturen av forvæskningsbeholderen innstilles på 100°C ved vanndamp. Derefter avkjøles pastaen til 60°C ved at den sprøytes ut i et vakuumkjøleanlegg, hvorpå den tilsettes varmebestandig enzym fra en Thermonospora-stamme i en mengde på 20 enheter/g stivelse og avkjøles til 45°C under omrøring i 1 time. Pastaen tilsettes ytterligere Escherichia-erizym i en mengde på 15 enheter/g stivelse og omsettes i 40 timer ved pH 6,0 og en temperatur på 45°C. Den dannede reaksjonsblanding konsentreres til halvdelen av det opprinnelige volum og avkjøles i løpet av 12 timer til 5°C. Det dannede bunnfall fraskilles ved sentrifugering, hvorpå det vaskes med en tilsvarende mengde vann og tørkes, hvorved produktet fåes i et utbytte på 75% og med en polymerisasjonsgrad på 750.

Eksempel 4

På samme måte som beskrevet i eksempel 3, forvarmes amylomaisstivelse til 50°C, hvorpå den avgasses, innføres under trykk i et kontinuerlig virkende forvæskningsapparat og forvæskes ved 100°C. Den erholdte pasta avkjøles til 50°C i en vakuumavkjølingsbeholder og tilsettes samtidig Pseudomonas-enzym i en mengde på 30 enheter/g stivelse. Efter avkjøling omrøres blandingen i 1 time i en blandebeholder inntil temperaturen har sunket til 45°C, hvorpå den overføres til en reaksjonsbeholder og omsettes med pH 4 og en temperatur på 45°C Når reaksjonen er avsluttet i løpet av 48 timer, henstår blandingen i 4 timer, hvorefter det dannede bunnfall fraskilles. Morluten konsentreres til halvdelen av det opprinnelige volum og avkjøles i 12 timer, og det resulterende bunnfall fraskilles ved sentrifugering og forenes med det første bunnfalle Det forenede bunnfall vaskes med en tilsvarende mengde vann, hvorpå det sentrifugeres og tørkes. Utbyttet er 78%, og prociuktets polymerisasjonsgrad er 520.

Eks empel 5

Man går frem på samme måte som beskrevet i eksempel 4 med den forskjell at der som enzym anvendes 15 enheter/g stivelse Pseudomonas-enzym og 20 enheter/g stivelse Nocardia-enzym. Reaksjonen utføres i 40 timer ved 45°C, og reaksjonsblandingen konsentreres til halvdelen av det opprinnelige volum, hvorved der fåes amylose i et utbytte på 80%. Produktets polymerisasjonsgrad er 550.

Eks empel 6

I dette eksempel behandles potetstivelse på tilsvarende måte som beskrevet i eksempel 4. En stivelsessuspensjon med konsentrasjon på 10% forvæskes ved pH 4,0, og Pseudomonas-enzym tilsettes i en mengde på 40 enheter/g stivelse. Det bunnfall som fåes efter omset-ning i 48 timer, fraskilles ved sentrifugering, suspenderes i en like så stor mengde vann og sentrifugeres og tørkes i vakuum, hvorved man får et produkt med polymerisasjonsgrad 430 i et utbytte på 17%. Morluten konsentreres til halvdelen av det opprinnelige volum og av-kjøles gradvis i løpet av 12 timer, og det dannede bunnfall fraskilles véd • sentrifugering. Efter en vaskning med vann, tørkes produktet i vakuum, hvorved man får et utbytte på 65%. Polymerisasjonsgraden viser seg å være så lav som 50.

Det i dette eksempel erholdte produkt blandes og spraytørkcs fra en konsentrasjon på 30%, hvorved man får et porøst pulver.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av amylose hovedsakelig bestående av makromolekylær amylose fra preparater av stivelse inneholdende minst 50% amylose, karakterisert vedtrinnene: stivelses-preparatet forvæskes ved en temperatur så lav som mulig innen området fra 70 - 130°C, det forvæskede preparat avkjøles hurtig til en temperatur i området 50 - 6o°C og blandes og behandles med en varmebestandig cC-1,6-glucosidase ved denne temperatur, reaksjonsblandingen avkjøles videre til en temperatur på 40 - 50°C, og blandes og behandles med den samme eller en annen a-1,6-glucosidase ved denne lavere temperatur, og den utfelte amylose skilles fra den dannede oppløsning.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat forvæskningen utføres uten kontakt med luft.

3- Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat der som varmebestandig enzym anvendes en a-1,6-glucosidase produsert av stammer av Lactobacillus (Lactobacillus brevis IFO 3345, Lactobacillus plantarium ATCC 8008), eller Actinomycetes (Streptomyces diastatochromogenes IFO 3337, Actinomyces globisporus IFO 12208, Nocardia asteroides IFO 3384, Micromonospora melanospora IFO 12515 eller Thermonospora viridis IFO 12207)•

4- Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat der ved 40 - 50°C anvendes a-1,6-glucosidase produsert av Pseudomonas amyloderamosa ATCC 21262, Escherichia intermedia ATCC 21073, Agrobacterium tumefaciens IFO 3058, Azotobacter indicus IFO 3744, Erwinia aroideae IFO 3830, Leuconostoc mesenteroides IFO 3426, Mycobacterium phlei IFO 3158, Micrococcus lysodeikticus IFO 3333, Pediococcus acidilactici IFO 3884, Serratia indica IFO 3759, Streptococcus fecalis IFO 3128 eller Staphylococcus aureus IFO 306l.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat den forvæskede blanding og enzymet innføres kontinuerlig i en oppbevaringsbeholder som allerede inneholder en stor mengde reaksjonsblanding på et frem-si/redet nedbrytningstrinn slik at den innførte blanding fortynnes og reaksjonen fremmes under forhindring av oxydasjon.