NO135148B - - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte for separering

av makromolekylær amylose, og fremgangsmåten er karakterisert ved at man utsetter ett av de tre produkter:

a) en avkjølt stivelsegel som er tilberedt ved oppvarmning av en suspensjon av stivelse med høyt innhold av makromolekylær amylose, fortrinnsvis opp til 50-80 vekt%; b) et produkt som er oppnådd ved hydrolyse av ovennevnte gel med a- 1,6-glukosidase; .eller c) et produkt som er oppnådd ved avkjøling og sentrifugering av et stivelsegelhydrolysat som er fremstilt ved hjelp av a-1,6-glukosidase,

for frysning, opptining og deretter en behandling for separering av makromolekylær amylose, idet behandlingen innebærer at det opptinte produkt ved 40-70°C underkastes sentrifugering, filtrering eller pressing, hvorved man eventuelt utvinner lavmolekylær amylose ved konsentrering av det produkt som gjenstår fra separeringen av makromolekylær amylose.

Alle stivelsearter, f.eks. batatstivelse, potetstivelse, maisstivelse, amylomaisstivelse etc. består av rette molekyler av amylose og forgrenede molekyler av amylopektin. Amylopektinmolekylene kan omdannes til rette molekyler ved at gelatinerte stivelseoppløsninger hydrolyseres med a- 1,6-glukosidaser, som selektivt avgrener de a-1,6-glukosidiske bindinger som utgjør pektinets forgreningsbindinger. En slik hydrolysert stivelseoppløsning inneholder amyloser som opprinnelig var til-stede i stivelsematerialet, samt amyloser dannet ved hydrolysen og svarende til amylopektinets forgreningskjeder. De førstnevnte amyloser har en polymeriseringsgrad (DP) på 300-2000 og kalles i det følgende makromolekylære amyloser. De sistnevnte amyloser har en polymeriseringsgrad på 15-50 og kalles i det følgende lavmolekylære amyloser. Innholdet av makromolekylær amylose i vanlige stivelsesorter er 20-25 vekt% (beregnet på tørrvekten) mens innholdet i amylomaisstivelse er 50-80 vekt% (beregnet på tørrvekten). Det er vanskelig å separere makromolekylær amylose fra slike stivelsematerialer, slik som det vanligvis er tilfelle når det gjelder meget hydrofile makromolekyler.

Etter kjøling ay den ovenfor beskrevne amyloseblanding med forskjellige DP-verdier retrograderes de makromolekylære amyloser og fraskilles ved utfelling. Ettersom fellingens fuktighetsinnhold er høyt, nesten 90%, oppløser imidlertid vannet i fellingen den lavmolekylære amylose. i blandingen, og reduserer således innholdet av makromolekylær amylose sterkt. Man kan derfor ikke oppnå tilfredsstillende separering og rensning av amylosene.

De tidligere kjente metoder er 1) utfelling og separering av amylose ved tilsetning av.et salt, som f.eks. magnesium-sulfat etc, i høy konsentrasjon til vannholdige stivelseoppløs-ninger, og 2) utfelling og separering av amylose i form av kom-pleks ved tilsetning av en alkohol, som f.eks. n-butanol. Metode 1) krever en stor mengde salt, og dessuten er det vanskelig å fjerne saltet ved vasking. I metode 2) bør n-butanol tilsettes til en stivelseoppløsning med lav konsentrasjon, og dessuten er fellingens fuktighetsinnhold høytP.hvilket forårsaker vanskeligheter ved etterfølgende dehydratisering og fjerning av alkohol. For.- å eliminere disse vanskeligheter har man studert forskjellige metoder for separering av amylose fra vannholdige stivelseopp-løsninger i form av retrogradert, krystallinsk amylose med lavt fuktighetsinnhold. Man har ved dette klart å utvikle en metode som omfatter kjøling av den vannholdige stivelseoppløsning for utfelling av amylosen som retrograderte krystaller, frysing av oppløsningen for utskillelse av den store mengde hydratvann i form av is, opptining av det resulterende produkt for å lette fraskillelsen av retrograderte amylosekrystaller, og endelig fjerning av vannet i oppløsningen ved sentrifugering eller filtrering. På denne måte kan den porøse, retrograderte stivelse utvinnes. Man har oppdaget at det er mulig å oppnå en reduksjon av fuktighetsinnholdet til 60-70%.

Frysingen etter kjøling medfører imidlertid at den makromolekylære amylose kommer til å inneholde lavmolekylære amyloser eller amylopektin. For'å rense den retrograderte makromolekylære amylose kan man opphete den opptinte stivelseoppløs-ning til en temperatur av høyst 70°C i så kort tid at den retrograderte og krystalliserte makromolekylære amylose ikke gelati-neres og oppløses. Samtidig sentrifugerer, filtrerer eller pres-ser man det resulterende produkt for å fjerne amylopektin og lavmolekylær amylose i form av vannoppløsning, hvorved man får tilstrekkelig renset, retrogradert makromolekylær amylose.

Frysingen utføres fortrinnsvis ned til en temperatur lavere enn -5°c.

Den nevnte effekt oppnåes spesielt når man som utgangsmateriale anvender en stivelse med et innhold av makromolekylær amylose som overstiger 50%. Slik stivelse kan være amylomaisstivelse, amylosestivelse separert fra gelatinert stivelse ved utfelling med salter, og stivelse oppnådd ved fraksjonering. Slik stivelse kan omdannes fullstendig til rette amylosemolekyler ved innvirkning av a-1,6-glukosidaser etter gelatinering av stivelsen ved opphetning. Det resulterende produkt kan deretter fryses, opptines og separeres for utvinning av den makromolekylære amylose. Når det gjelder amylomaisstivelse, kan imidlertid makromolekylær amylose oppnåes ved samme frysebehandling uten at man først hydro-lyserer med a-1,6-glukosidaser. Ettersom stivelse med høyt innhold av amylose, oppnådd ved gelatinering av vanlig stivelse ved opphetning og utvinning av den utfelte del, inneholder en betyde-lig mengde makromolekylær amylose, kan dette produkt også anvendes som utgangsmateriale ved fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen.

Man fremstilte vandige oppløsninger inneholdende 10'.'' vekt% makromolekylær amylose med DP-verdi høyere enn 50, resp. 10 vekt% lavmolekylær amylose med DP-verdi lavere enn 50. De 10%-ige oppløsninger ble kjølet og frosset, ble opptint ved 40°C og opphetet til 60-80°C, hvorpå oppløsningshastighetene ble bestemt. Resultatene viste at etter en opphetning i 10-60 minutter var konsentrasjonen av den oppløste makromolekylære amylose bare 1-2 vekt%, mens konsentrasjonen av den oppløste lavmolekylære amylose var 8-10 vekt%. Forskjellen i oppløsningshastighet var altså be-tydelig.

Man utførte deretter samme forsøk med maisstivelse, amylomaisstivelse etc. hvorved man gelatinerte stivelsesortene, hydrolyserte dem med a-1,6-glukosidaser, frøs, tinte, opphetet og sentrifugerte eller filtrerte hydrolysatene, hvoretter man bestem-te polymeriseringsgraden hos amylosene i utfellingene og i opp-løsningene. Når man anvendte stivelse med et naturlig amyloseinnhold på ca. 25%, som f.eks. maisstivelse, ble det iakttatt en økning av den gjennomsnittlige DP-verdi i utfellingen sammenlig-net med DP-verdien i oppløsningen, hvilket viste at metoden var effektiv. Ettersom imidlertid den utfelte del, som ble oppnådd i et utbytte av ca. 60% tørrstoff, beregnet på utgangsmatérialet, inneholder over 60 vekt% lavmolekylære amyloser med DP-verdier under 50, kan en tilfredsstillende separering .ikke gjennomføres. Formålet med oppfinnelsen kan imidlertid oppnåes med amylomaisstivelse som inneholder 50-80% amylose, hvorved man oppnår utfelling i et utbytte av 60-80%, beregnet på utgangsmatérialet. I utfellingen, "som har et fuktighetsinnhold på 60-70%, finnes det 80-90% amyloser med DP-verdier over 50. Ved anvendelse av naturlig amylomaisstivelse, som ikke utsettes for innvirkningen av a-1,6-glukosidaser, er effekten noe dårligere. Amyloser med et amyloseinnhold på ca. 88% kan imidlertid oppnåes.

Formålet og fordelene meå fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen fremgår av følgende detaljerte beskrivelse. Som utgangsmateriale kan man anvende vanlige stivelsesorter, f.eks. maisstivelse, potetstivelse og batatstivelse, eller spesielle stivelsesorter, f.eks. amylomaisstivelse, som har høyt amyloseinnhold, eller amylose oppnådd fra vanlige stivelsesorter ved fraksjonering, f.eks. amylostivelse fremstilt avAvebe, Veendam, Holland, eller blandinger av disse forskjellige sorter. Ettersom amylomaisstivelse inneholder 50-80% naturlig makromolekylær amylose, er det særlig fordelaktig å anvende slik stivelse som utgangsmateriale ved fremstillingen av makromolekylær amylose. Man oppnår herved makromolekylær amylose med høy renhetsgrad og med et høyt utbytte.

Gelatinering kan gjennomføres med 5-20%ige stivelse-suspensjonér.jGelatineringstemperaturen bør ligge innen området 100-135°C. Fullstendig dispergering av makromolekylære amyloser er ikke nødvendig, mens derimot amylopektinet må dispergeres fullstendig. Hydrolyse av makromolekylære amyloser bør hindres. Stivelseoppslemningen dispergeres derfor homogent til gelatinert ' stivelse under omrøring og opphetning ved 100-135°C. Den gelatinerte stivelse avkjøles deretter raskt til 50-60°C, hvorpå a-1,6-glukosidase tilsettes. Som a-1,6-glukosidase kan man anvende enzymer produsert av Actinomycetes- og Lactobacillus-stammer. Når disse varmebestandige enzymer anvendes, tilsettes

o de til oppløsninger av gelatinert stivelse med temperaturen 60 C.

Blandingen omrøres, hvoretter dens temperatur senkes til 40-50°C alt ettersom viskositeten avtar, og deretter kan man anvende andre vanlige enzymer, som skal beskrives i det følgende.

Blant vanlige a-1,6-glukosidaser er det mest hensikts-messig å anvende det enzym som produseres av Pseudomonas amyloderamosa B 15 ATCC 21262, men andre glukosidaser, isoamylaser eller pullulanaser er også anvendbare. Reaksjonen kan gjennom-føres nesten fullstendig ved pH 3,5-6,0 i løpet av 40-50 timer under anvendelse av 20-50 enheter enzym pr. gram stivelse. Reaksjonsblandingen får kjølne eller kjøles gradvis og fryses senere. Derpå opphetes blandingen indirekte til ca. 40°G for at den skal tine, hvorpå den opphetes og omrøres. En passende opphetnings-temperatur er 50-70°C, og en passende opphetningstid er 20-60 minutter. Ettersom temperaturer som overstiger 80°C frembringer gelatinering av den retrograderte stivelse, bør temperaturen og tiden innstilles i forhold til hverandre på den måte at den etter-følgende separering lettes. Ved å fjerne de eluerte lavmolekylære amyloser ved sentrifugering eller filtrering, fåes utfel-linger med et fuktighetsinnhold på 60-70%. Utfellingene suspen-deres deretter på nytt i varmt vann (40-50°C) eller vaskes med vann av samme temperatur for å fjerne delen med lav DP-verdi. Vaskeoppløsningen og den tidligere fraskilte oppløsning forenes, konsentreres og kjøles, og det blir utvunnet amyloser med lav DP-verdi. Etter denne metode kan man utvinne makromolekylær amylose som inneholder 90% amyloser med en DP-verdi som overstiger 50.

Ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåte, som omfatter gelatinering av vanlig stivelse, hydrolyse av amylopektinet i stivelsen ved hjelp av a-l,6-glukosidase til en blanding av rett-kjedete amyloser, frysing, retrogradering, opptining av blandingen ved opphetning, oppløsning av de lavmolekylære amyloser og sentrifugering, kan man øke renheten av de makromolekylære amyloser.

Ved fryse-retrograderings-metoden kan retrograderingen og utfellingen lettes ved tilsetning av en liten mengde alkohol, f.eks. n-butanol, eller ved at stivelseoppløsningen underkastes en ultralydbehandling.

Oppfinnelsen illustreres ved følgende eksempler.

Alle angivelser i deler og prosent er vektangivelser, hvis intet annet er angitt.

Eksempel 1

Man fremstilte en 15%ig vannsuspensjon av amylomaisstivelse inneholdende 70% amylose. Suspensjonens pH-verdi ble innstilt på 4,0-4,5. Suspensjonen ble gelatinert i en autoklav under omrøring ved 135 C, hvorpå den raskt ble avkjølt til 50°c. Deretter hydrolyserte man ved 45-50°C etter tilsetning av 30 enheter enzym, produsert av Pseudomonas amyloderamosa ATCC 21262 pr. gram stivelse. Hydrolysatet inneholdt 70% amylose med DP-verdi 100-1000, og resten var amylose med DP-verdi 15-50. Hydrolysatet ble opphetet for å inaktivere enzymet, eller det ble kjølt uforandret og plasert i et fryseapparat, som ble holdt ved -15°C for at det skulle fryse. Deretter ble hydrolysatet opptint med varmt vann (30-40°C) og opphetet til 60-65°C under om-røring, hvoretter de retrograderte amyloser ble fraskilt ved sentrifugering. Det resulterende produkt ble deretter vasket én gang med vann. Herunder ble oppnådd makromolekylær amylose med et fuktighetsinnhold på 60%. 90% av tørrstoffet var amylose med en DP-verdi over 50. Den fraskilte vannoppløsning inneholdt amyloser med DP-verdi 15-50. Mengden av utvunnet tørrstoff i det faste produkt resp. i oppløsningen var 73% resp. 2 7%.

Når den frosne stivelseoppløsning ble kraftig omrørt etter opptiningen, ble den svampaktige, opptinte amylose knust. Etter opphetning til 60°C og sentrifugering fikk man en utfelling som inneholdt 95% amylose med en DP-verdi over 50, og molekyl-vektfordelingen var snevrere.

Eksempel" 2

En 10%ig suspensjon av amylomaisstivelse (amyloseinnhold 50% av tørrvekten) ble gelatinert i en autoklav ved 135°c og ble behandlet på lignende måte som beskrevet i eksempel 1. Etter opptining og omrøring sentrifugerte man, hvorpå den oppnådde utfelling ble vasket med varmt vann (40°C). Herved fikk man et produkt inneholdende 80% amyloser med DP-verdier over 50 i et utbytte av 61%, beregnet på tørrvekten. Etter konsentrering av den fraskilte oppløsning til det halve volum ble oppløsningen kjølt til en temperatur under 5°C, hvorpå den dannede utfelling ble fraskilt ved sentrifugering. På denne måte fikk man lavmolekylær amylose^ hovedsakelig inneholdende molekyler med DP-verdier på 15-50, i et utbytte av 91%, regnet på tørrvekten.

Eksempel 3

En 8%ig vannsuspensjon av amylomaisstivelse (amyloseinnhold 70%) ble opphetet til 125°C under omrøring, slik at fullstendig gelatinering ble oppnådd- Derpå ble blandingen retrogradert ved avkjøling, hvorpå den ble bragt til å fryse. Etter 30 minutter ble den frosne suspensjon opptint med varmt vann (40°C), og den svampaktige masse ble knust, opphetet til 60-70°C og sentrifugert. Utfellingen ble suspendert i varmt vann av 30-40°C og ble igjen sentrifugert. Den sentrifugerte felling ble vasket ved dusjing med vann av 40°C. Fellingen besto av amylose i en mengde svarende til 65% av stivelsematerialet, og den inneholdt 85% amylose med DP-verdi over 50. Den overstående væske ble konsentrert til det halve volum, ble kjølt, frosset, dehy-dratisert, opptint og sentrifugert. Den herunder oppnådde felling besto hovedsakelig av amylopektin.

Eksempel 4

En 15%ig vannsuspensjon ble tilberedt av renset maisstivelse. Suspensjonen ble gelatinert ved omrøring og opphetning med frisk damp. Man gjennomførte en fullstendig dispergering ved opphetning til 130°C, hvoretter dispersjonen raskt ble kjølt til 60 o C og pH-verdien ble innstilt pa „ 6,0. Man tilsatte deretter pr. gram stivelse 30 enheter av en varmebestandig a-1,6-glukosidase, produsert av Lactobacillus plantarum ATCC 8008. Blandingen ble omrørt, og temperaturen fikk synke til 50°c alt ettersom viskositeten avtok. Derpå ble blandingen inkubert i 40 timer. Den fullstendig hydrolyserte oppløsning ble frosset i et fryseapparat, som ble holdt ved -20°C, og amylosene ble retrogradert og krystal-lisert i tilstrekkelig grad. Den frosne blanding ble deretter opptint ved 40°C, opphetet til 55°C under omrøring for at de lavmolekylære amyloser skulle oppløse seg og ble derpå umiddelbart sentrifugert. Den med høyt utbytte oppnådde utfelling med et fuktighetsinnhold av 60% utgjorde retrogradert stivelse, inneholdende en større andel makromolekylære amyloser og en mindre andel lavmolekylære amyloser enn reaksjonsblandingen. Den oppnådde felling inneholdt imidlertid fremdeles over 50% lavmolekylære amyloser, og separasjonen var ikke tilfredsstillende.

Den rensede maisstivelse som utgjorde utgangsmatérialet i dette eksempel, inneholdt bare ca. 25% makromolekylær amylose.

Eksempel 5

Den i eksempel 4 oppnådde reaksjonsblanding, dvs. blandingen av lavmolekylære og makromolekylære amyloser i vekt-forholdet 75:25 ble kjølt, og de dannede retrograderte amyloser ble sentrifugert ved 40°C. Man oppnådde herved i et utbytte av 5 7,5% et urent produkt inneholdende ca. 40% makromolekylær amylose. Produktets fuktighetsinnhold var 80-85%. En prøve av produktet ble kjølt og frosset for at de makromolekylære amyloser skulle retrograderes. Derpå ble produktet opptint, opphetet til 70°C og sentrifugert. Herved ble det oppnådd svampaktig, retrogradert makromolekylær amylose. Utbyttet av tørrstoff var 22%, beregnet på tørrvekten og den som utgangsmateriale anvendte stivelse. Produktet inneholdt over 90% amyloser med DP-verdier over 50, og dets renhet var kraftig forbedret.

Eksempel 6

En 20%ig suspensjon av potetstivelse ble fremstilt etter rensing av stivelsen. Suspensjonen ble opphetet til 130°C

og ble gelatinert, hvorpå den ble inkubert i 40 timer ved pH 4,0

og temperatur 45-50°C etter tilsetning av o-l,6-glukosidase produsert av Pseudomonas amyloderamosa ATCC 21262. Reaksjonsblandingen fikk stå urørt i 1 døgn og ble deretter sentrifugert ved 45°C. Den oppnådde felling hadde et fuktighetsinnhold på 79%, og•• utbyttet av tørrstoff var 75% regnet på utgangsmatérialet. Fellingen ble oppløst ved opphetning til 60 C, hvorpå den ble gradvis kjølt og endelig frosset ved -20 oC. Etter opptining ved o o 40 c og opphetning til 60 C fraskilte man ved sentrifugering de oppløste lavmolekylære amyloser og vasket fellingen med varmt vann. Den oppnådde felling hadde et fuktighetsinnhold på 60%,

og utbyttet av tørrstoff var 25%, beregnet på utgangsmatérialet. Produktet inneholdt 90% naturlige makromolekylære amyloser med DP-verdier over 50.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for separering av makromolekylær amylose, karakterisert ved at

a) en avkjølt stivelsegel tilberedt ved oppvarmning av en suspensjon av stivelse med høyt innhold, fortrinnsvis opp til 50-80 vekt%, av makromolekylær amylose, eller b) et produkt som er oppnådd ved hydrolyse av den nevnte gel med a- 1,6-glukosidase, eller c) et produkt som er oppnådd ved avkjøling og sentrifugering av et stivelsegelhydrolysat som er fremstilt ved hjelp av a-1,6-glukosidase, underkastes frysing, opptining og deretter en behandling for separering av makromolekylær amylose, idet behandlingen innebærer at det opptinte produkt ved 40-70 oC underkastes sentrifugering, filtrering eller pressing, hvorved man eventuelt utvinner lavmolekylær amylose ved konsentrering av det produkt som gjenstår fra separeringen av makromolekylær amylose.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at frysingen utføres ned til en temperatur som er o lavere enn -5 C.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at separeringen av makromolekylær amylose fra det opptinte produkt utføres ved 50-70 C.