NO131417B

NO131417B -

Info

Publication number: NO131417B
Application number: NO1519/71A
Authority: NO
Inventors: E S Roberts
Original assignee: Treadwell Corp
Priority date: 1970-05-01
Filing date: 1971-04-23
Publication date: 1975-02-17
Also published as: ZM5171A1; NL7105830A; US3671194A; JPS5221480B1; BE766159A; FR2090591A5; ZA712185B; NO131417C; ES390642A1; AU2827771A; GB1314968A; CA951083A; DE2121034A1; NO131417L

Description

Fremgangsmåte til fra en oppløsning å atskille stoffer med forskjellig molekylstørrelser.

Foreliggende oppfinnelse angår en

fremgangsmåte til fra en oppløsning å atskille stoffer med forskjellige molekylstør-relser, hvor oppløsningen bringes i berø-ring med et lag av gelformig substans i kornform med selektiv evne til fra opp-løsningen å ta opp stoffer alt etter molekyldimensjonene, og fraksjoner av de ut-skilte stoffer suksessivt utvinnes fra gellaget.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen

er karakterisert ved at oppløsningen bringes til å passere gjennom et lag av gelkorn av en i oppløsningsmidlet uoppløselig men deri svellbar, ikke ladet, likeoverfor stoffene som skal utskilles kjemisk indif-ferent organisk substans, bestående av et tredimensjonalt makroskopisk nettverk av molekyler som er sammenbundne ved hjelp av kovalente bindinger i form av eterbroer og som inneholder hydroksylgrupper, hvorved de oppløste stoffer med forskjellig mo-lekylstørrelse fordeler seg forskjellig mellom gelkornene og den omgivende oppløs-ning, beroende på deres forskjellige evne til å trenge inn i gelkornene alt etter mole-kyldimensj onene, og fysikalsk tas opp inne i gelkornene, hvoretter fraksjoner av de atskilte stoffer suksessivt utvinnes fra gellaget ved eluering med en væske.

Fremgangsmåten kan med fordel utfø-res på det vis at den gelformige substans anbringes som et lag av svellede gelkorn, fortrinnsvis i form av en søyle pakket i en kolonne, hvoretter oppløsningen som inneholder stoffer, som skal atskilles, får passere inn i laget, hensiktsmessig i en mengde som høyst tilsvarer volumet av væske som er absorbert i gelkornene, hvorpå væske — elueringsvæske — (vanligvis oppløsningsmidlet) tilføres ovenfor laget og får passere inn i dette og den fra laget uttredende væske — effluenten — oppsamles i fraksjoner, hvorved det først fås fraksjoner som inneholder en høyere konsentrasjon av stoff med større molekyl-størrelse og senere fraksjoner med høyere konsentrasjon av stoff med lavere molekyl-størrelse enn i utgangsoppløsningen.

Oppløsningsmidlet kan enten være vann eller også som hovedkomponent inne-holde vann, i hvilket tilfelle det deri også kan inngå en viss mengde vannoppløselige organiske oppløsningsmidler, som alkoholer eller ketoner, f. eks. lavere alifatiske alkoholer og ketoner. Videre kan elueringsvæs-ken bestå ikke bare av et slikt vannholdig oppløsningsmiddel, men den kan også in-neholde en viss mengde oppløste stoffer, f. eks. salter, for opprettholdelse av en viss ionestyrke, eller pufferstoffer for å få pas-sende pH-verdi. Eksempler på slike salter er natriumklorid og ammoniumacetat og som eksempel på pufferstoffer kan nevnes vannoppløselige acetater, fosfater, klorater, eddiksyre, kloreddiksyrer, klorhydrogensy-re og pyridin.

De ovenfor definerte geler, som anvendes ved utførelsen av fremgangsmåten iføl-ge oppfinnelsen kan fås ved polymerisasjon av ikke ladede organiske hydroksylgrup-peholdige stoffer med bifunksjonelle organiske stoffer som inneholder halogenatomer og/eller oksygrupper, som reagerer med hydroksylgrupper i det organiske stoff under dannelse av eter-artede broer, slik at det fås sampolymeri-sater med den ovenfor angitte struktur. Egnede organiske stoffer som utgangsma-teriale for denne reaksjon er polysakkarider, f. eks. dekstran, stivelse, dekstrin, cel-lullose, polyglykose eller hydroksylgruppe-holdige derivater av disse stoffer, f. eks. etylhydroksyetylcellulose, eller produkter erholdt ved partiell nedbrytning av disse, likesom også fraksjoner derav, videre polyvinylalkohol, sukkeralkoholer, f. eks. sorbitol og kullhydrater, f. eks. sukrose.

Som eksempel på hensiktsmessige bifunksjonelle stoffer for reaksjonen skal først og fremst nevnes bifunks jon elle gly-cerinderivater, som epiklorhydrin, diklor-hydrin, videre 1,2,3,4-diepoksybutan, diepoksypropyleter, diepoksypropyleter av etyl-englykol, 1,4-butandioldiepoksypropyleter og liknende.

Sampolymeriseringen av de nevnte organiske hdroksylgruppeholdige stoffer og de bifunksjonelle stoffer foregår lett i vannoppløsning i nærvær av en alkalisk reagerende substans som katalysator under dannelse av tredimensjonale nettverk av angitt art med eterbroer av typen -O-X-O-, der X f. eks. kan være et alifatisk radikal som inneholder 3 til 10 kullstoff-atomer, samt med et hydroksylgruppeinnhold på minst 12 % av gelproduktet.

Svellingsevnen hos de ovennevnte geler i vannholdig medium beror på nærvæ-ret av hydroksylgruppene og på nærvæ-ret av eterbroene og kan uttrykkes ved den mengde vann i gram, som kan absor-beres av 1 gram av det tørre gelprodukt (engelsk betegnelse: «water regain»). Svellingsfaktoren for gelproduktene, som anvendes ifølge oppfinnelsen, kan ligge innenfor grensene 1—50 g/g av det tørre gelprodukt, men er i alminnelighet 1—20 g/g av det tørre gelprodukt.

Spesif ike eksempler på hensiktsmessige gelprodukter er slike, som fåes ved poly-merisering av dekstran med en midlere molekylvekt innenfor området 50 000— 100 000 med epiklorhydrin, hvorved det erholdte sampolymerisat utgjøres av et tredimensjonalt makroskopisk nettverk som er oppbygget av kjeder av i hovedsaken al-fa-l,6-glykosidisk bundne glukoserester sammenbundet ved hjelp av eterbroer av typen -O-CH2. CH(OH) . CH2-0-, hvilke geler har et hydroksylgruppeinnhold på minst 15 % av den tørre gels vekt og en svellingsfaktor innenfor området 1—50 g/g av det tørre gelprodukt.

Et annet hensiktsmessig gelprodukt

kan på iliknende måte fås av såkalt hvitt

handelsdekstrin med epiklorhydrin, men

i dette tilfelle er det tredimensjonale nettverk oppbygget av kjeder av i hovedsaken alfa-l,4-glykosidisk bundne glukoserester sammenbundet ved hjelp av eterbroer av samme art. Det samme gjelder for stivelse. I begge tilfelle fås det geler med et hydroksylgruppeinnhold av minst 15 % av gelens vekt, men i det førstnevnte tilfelle, altså ved anvendelse av dekstrin som utgangs-materiale, med forholdsvis lav svellings-evne, nemlig 1—20 g/g av det tørre gelprodukt, mens svellingsfaktoren i sistnevn-te tilfelle er 10—50 g/g av det tørre gelprodukt.

Som ytterligere eksempel kan nevnes et gelprodukt som er fått ved reaksjon av sorbitol med epiklorhydrin. I dette tilfelle består det erholdte sampolymerisat av et tredimensjonalt makroskopisk nettverk av sorbitolrester sammenbundet ved eterbroer av angitt slag og med et hydroksylgruppeinnhold av 15 % samt en svellingsfaktor på 1—30 g/g av det tørre gelprodukt. Denne gel er spesielt egnet for anvendelse i slike tilfelle hvor gelen kan komme i be-røring med en væske med forholdsvis høy surhetsgrad, f. eks. ved anvendelse av klor-hydrogensyre som puffersubstans.

For fremstilling av det for atskillelsen anvendte gellag nedmales gelen til en korn - størrelse innenfor området 0,01—2,0 mm, f. eks. innenfor området 0,05—0,5 mm, fortrinnsvis en kornstørrelse tilsvarende 20— 200 masker etter U.S. standardmasker.

Atskillelsesevnen hos gelkornene er på den ene side avhengig av molekyldimensjonene hos stoffene, som skal atskilles, og på den annen side av størrelsen av porene eller maskene i det tredimensjonale nettverk i gelproduktet, som igjen er avhengig av antallet og typen av tverrbindinger i nettet. Alt etter arten av de stoffer man ønsker å atskille, velges en gel med større eller mindre porestørrelse i nettet. Ved atskillelsen kommer de stoffer hvis mole-kyldimensjoner er alt for store til at de skal kunne trenge inn i gelkornene, til å bli tilbake i oppløsningen og passerer gjennom gellaget utenfor gelkornene og oppsamles i den eller de første fraksjoner, mens stoffer med tilstrekkelig små mole-kyldimensjoner til å tillate inntrengning i gelkornene temporært tas opp av disse, hvilket muliggjør en atskillelse av dem fra molekylene med større dimensjoner, samt utvinning i en etterfølgende fraksjon.

Det er tidligere for atskillelse av stoffer med forskjellig molekylstørrelse fra vannoppløsninger blitt foreslått å anvende et lag av native eller i vann svellede sti-velseskorn. Denne fremgangsmåte er imid-lertid beheftet med flere vesentlige ulem-per først og fremst beroende på, at stivelse har en viss oppløselighet i vann, at stivelse som ikke danner et tredimensjonalt nettverk med kovalente stabile bindinger, har liten stabilitet og at et slikt lag byr stor motstand mot gjennomstrømningen. Stivelse fås derfor alltid som forurensning i de atskilte preparater og lagene av sti-velseskorn degenereres hurtig og blir lett en kladdet masse. På grunn derav har denne metode praktisk talt ingen verdi.

Til forskjell derfra er de ifølge oppfinnelsen anvendte sampolymerisateruopp-løselige og det tredimensjonale nettverk med kovalente eterbindinger gir gelen over-ordentlig stor stabilitet og bestandighet. Et slikt lag har derfor stor atskillelseskapasitet, og det er også mulig å variere denne atskillelseskapasitet innenfor vide gren-ser.

Gjennomføringen av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen i praksis ved fraksjonering i kolonne kan f. eks. skje på føl-gende måte, hvor det for enkelhets skyld forutsettes at oppløsningsmidlet og elusjonsmidlet utgjøres av vann.

Apparaturen kan hensiktsmessig bestå av et sylindrisk rør, nedentil begrenset av en porøs plate, f. eks. en sintret glassplate som bærer gellaget, og oventil er forsynt med tilførselsanordninger for oppløsning og elusjonsmiddel.

Gelkornene, hvis størrelse og svellingsfaktor velges med hensyn til det tilsiktede atskillelsesformål, bør pakkes i kolonnen så tett som mulig og i slik mengde, at de opptar den største del av det totale pak-ningsvolumet, dvs. det sammenlagte volumet av mellomrommene mellom gelkornene. Dette kan skje f. eks. på følgende måte: Beregnet mengde gel med jevn korn-størrelsesfordeling får svelle i vann inntil likevekt er oppnådd og røres deretter ut til en jevn suspensjon. Denne helles ned i kolonnen, som tidligere er blitt fylt med vann. Under pakningsprosessen tillates vann å renne ut av kolonnen med jevn hastighet. Under denne prosess kan man iaktta at det pakkede lag vokser oppover med en skarp grenseflate, over hvilken gel-partiklene er i stadig bevegelse ved kon-veksjoner.

Når hele laget er pakket, bør man passe på at den øvre flate er jevnest mulig.

Man lar nu vannet renne gjennom laget, inntil dettes øvre flate nettopp skal til å forsvinne i laget. Da stoppes strøm-ningen, og den oppløsning som skal atskilles skiktes forsiktig ovenpå, hvorpå strøm-ningen gjennom laget åpnes — fra og med nu kalles den utstrømmende væske efflu-ent — inntil oppløsningen nettopp for-svinner inn i laget.

Deretter sjiktes elusjonsmidlet (vann, som eventuelt inneholder pufferstoff) ovenpå laget og gjennomrenningen får be-gynne. Effluenten utgjøres først av vann, inntil et volum omtrent tilsvarende voidvolumet er blitt trengt ut, deretter opptrer de større molekyler, som ikke har evne til å trenge inn i gelkornene og oppsamles i en eller flere fraksjoner, f. eks. ved hjelp av en fraksjonssamler, og deretter — eventuelt etter et intervall hvor effluenten består av vann — de mindre molekyler, som temporært er blitt tatt opp fysikalsk i gelkornene, og disse oppsamles likeledes i en eller flere fraksjoner, og til slutt ut-gjøres effluenten på nytt av vann. Laget er deretter i sin opprinnelige tilstand, og en ny atskillelse kan straks startes.

Det er på denne måte mulig å få fraksjoner som overveiende inneholder eller utelukkende består av stoffet eller stoffene med større molekylstørrelse, og andre fraksjoner, som i hovedsaken eller utelukkende inneholder stoffer med mindre molekylstørrelse.

Som allerede berørt ovenfor, er det for å få en effektiv atskillelse av viktighet at volumet av oppløsningen med stoffene som skal atskilles, bare tilføres gellaget i en mengde volum), som høyst tilsvarer mengden (= volumet) av vann, som er absorbert i de svellede gelkorn. Denne mengde kan uttrykkes ved formelen a.WR, der a betegner vekten av de tørre gelkorn, og WR er sifferverdien av svellingsfaktoren. Fortrinnsvis bør mengden av oppløs-ning være under det nevnte volum a.WR.

Videre er det viktig, at oppløsningens strømningshastighet gjennom laget av gelkorn ikke er for stor. Det har vist seg at alt etter betingelsene kan den lineære strøm-ningshastighet være opp til 10 cm/min., men fortrinnsvis bør den ikke overstige 7 cm/min.

I det ovenfor beskrevne eksempel har det bare dreiet seg om en intermitterende fremgangsmåte, men prosessen kan hensiktsmessig utføres kontinuerlig trinnvis i cykler, f. eks. på følgende måte. Når et volum, likt med voidvolumet, av den fraksjon som inneholder de mindre molekyler, fremdeles er tilbake i kolonnen, kan opp-løsningen av substansene, som skal atskilles i neste syklus, tilføres toppen av gellaget.

Ifølge en utførelsesform bibeholdes stadig en vannsøyle ovenfor gellaget og oppløsningen som inneholder stoffene med forskjellig molekylstørrelse, som skal atskilles fra hverandre, tilføres i den lavere del av den nevnte vannsøyle umiddelbart ovenfor gellagets overflate hvor den danner et sjikt under fortrengning av vann i retning oppover, avhengig av oppløsnin-gens høyere spesifikke vekt.

Det har vist seg at et lag av gelkorn, som det beskrevne selv etter anvendelse i årevis, ikke viser noen tegn på degenera-sjon.

Når fremgangsmåten gjennomføres i teknisk skala, kan det være fordelaktig å bare utføre en partiell atskillelse i hver cyklus og å ta ut bare de fraksjoner som inneholder en ren substans, dvs. bare en av de substanser som skal atskilles, mens de andre fraksjoner, som inneholder en blanding av nevnte stoffer, føres tilbake til kolonnen for på nytt å innføres i denne sammen med en oppløsningsmengde i en senere cyklus.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes for atskillelse av stoffer med i høy grad varierende molekylstørrelse, hvor forskjellen i molekylstørrelse tilsvarer en forskjell i molekylvekt på minst 100. Gelen, som skal anvendes ved atskillelsen, velges som nevnt etter det tilsiktede for-mål, dvs. stoffene som skal atskilles fra hverandre, den ønskede separeringskapa-sitet og strømningshastigheten gjennom laget.

Særlig fordelaktig er fremgangsmåten for atskillelse av kolloidale stoffer fra krystalloide stoffer, f. eks. for atskillelse av salter, som natriumklorid eller ammoniumsulfat, fra oppløsninger som inneholder kolloider, selv labile sådanne, f. eks. kolloider av biologisk opprinnelse, som proteiner, f. eks. enzymer eller virus. Andre eksempler på stoffer som kan renses på denne måte, dvs. atskilles fra forurensninger med annen molekylstørrelse, er uorganiske kolloider, kolloidale fargestoffer og vanndis-persjoner av polymere fremstilt ved såkalt emuls j onspolymerisas j on.

Fremgangsmåten har vist seg spesielt verdifull for atskillelse av stoffer med molekylvekter over 500, f. eks. over 1 000, da slike stoffer ofte er meget vanskelige å atskille ved andre metoder.

Videre kan fremgangsmåten anvendes for fraksjonering av en rekke polymerho-mologer, dvs. atskillelse av polymerhomo-loger med forskjellige molekylvekter (mo-lekyldimensjoner), f. eks. for fraksjonering av vannoppløselige polymere, som dekstran eller partielt nedbrutt dekstran, stivelse og dekstriner, pektin, polyetylenglykoler eller derivater av slike polymere.

Ofte er det verdifullt å kunne gripe til denne atskillelsesmetode for behandling av proteiner eller polypeptider, f. eks. plas-maproteiner, enzymer, f. eks. pepsin eller et pankreasenzym, eller hormoner, f. eks. insulin, eller blandinger som inneholder polysakkarider, f. eks. bakteriepolysakka-rider, som dekstran og animalske polysakkarider, f. eks. heparin, videre vitaminer, antibiotika og alkaloider.

Når fremgangsmåten anvendes på meget kompliserte blandinger, f. eks. oppløs-ninger fra biologisk materiale, kan det under tiden bare være mulig å oppnå en gruppeatskillelse, hvoretter rensning med andre metoder får anvendes.

I visse tilfelle kan det være ønskelig å forandre ionemiljøet for stoffer som ikke har evne til å trenge inn i gelkornene, for å lette en etterfølgende rensning av ved-kommende stoffer eller stoff. Således er det mulig hurtig å forandre pH og ionestyrke for en proteinoppløsning, hvilket er av stor betydning for rensing og atskillelse av slike stoffer. Dette kan skje ved at pro-teinoppløsningen får passere gjennom et gellag nedsenket i vann som inneholder de pufferstoffer som kreves for forandringen av pH-verdien.

Eksempel 1:

En rørformet kolonne med diameter 3,5 cm, høyde 50 cm, ble pakket med 100 g (tørrvekt) i vann svellet pulverformig gelsubstans (partikkelstørrelse i tørr form: 100—200 masker; svellingsfaktor 2,6 g/g av den tørre gel), fremstilt ved reaksjon av dekstran med middelmolekylvekt (Mw = 40 000) med epiklorhydrin. Lagets totale

volum var 390 ml og voidvolumet 130 ml.

5 ml av en oppløsning inneholdende 10 %

klinisk dekstran (Mw = 75 000) og 10 % glukose ble tilført, hvoretter det eluertes med vann med en hastighet av 84 ml/time. Effluenten ble oppsamlet ved hjelp av fraksjonssamlere i ca. 7 ml fraksjoner, som analysertes hver for seg. Det først utstrøm-mende volum av effluenten 130 ml besto av vann, mellom 130 og 170 ml kom dekstran og mellom 240 og 330 ml kom glukose. Ut-byttet var kvantitativt.

Eksempel 2:

Til samme kolonne som i eksempel 1 tilførtes 15 ml av en oppløsning inneholdende 0,18 g hemoglobin og 4,5 g ammoniumsulfat, hvorpå det eluertes med vann med en hastighet av 66 ml/time. Mellom 130 og 230 ml kom hemoglobin og mellom 230 og 340 ml ammoniumsulfat. Kvantitativt utbytte ble oppnådd.

Eksempel 3:

En kolonne med diam. 7,2 cm, høyde 50 cm ble pakket med 300 g (tørrvekt) i vann, svellet pulverformig gelsubstans (partikkelstørrelse i tørr form 50—100 masker; svellingsfaktor 4,9 g/g av den tørre gel), fremstilt ved reaksjon av dekstran (Mw = 40 000) med epiklorhydrin. Lagets totale volum var 2000 ml og voidvolumet 650 ml. Laget tilførtes 100 ml av en 10 %'s oppløsning av en dekstranf raks jon med Mw = 4000, hvorpå det eluertes med vann med en hastighet av 240 ml/time. Av effluenten ble først 650 ml tilsvarende voidvolumet kastet, hvoretter det ved hjelp av fraksjonssamler ble oppsamlet 100 fraksjoner å 17 ml. Mengden av kullhydrat i hver fraksjon ble målt ved reaksjon med antron. Fraksjonene fra og med fraksjon 8 til og med fraksjon 95 inneholdt kullhydrat. Mo-lekylvekten Mn (= tallmiddelverdien <; Mw) bestemtes for hver femte fraksjon, der substansinholdet var stort nok og følgende serie erholdtes: 5000, 4600, 4300, 4300, 3100, 2900, 2200, 1700, 1600, 1300, 950, 610, 400 samt 180.

Eksempel 4:

En kolonne med diam. 2 cm, høyde 40 cm ble pakket med 7 g (tørrvekt) pulverformig gelsubstans (svellingsf aktor 10,0 g/g av den tørre gel), svellet med 0,1 molar natriumfosfatpuffer med pH 7. Gelsubstansen var fremstilt ved reaksjon av etylhydroksyetylcellulose med etylenglykol-bis-epoksy-propyleter. Lagets totale volum var 105 ml og voidvolumet 38 ml. Til laget sattes 5 ml vannoppløsning av 60 mg hemoglobin og 1,5 g ammoniumsulfat i fosfatpuffer, hvoretter det eluertes med fosfatpuffer (0,1 molar; pH 7). Etter 40—55 ml kom hemoglobin i fosfatpuffer og etter 55—105 ml ammoniumsulfat i fosfatpuffer.

Eksempel 5:

En kolonne med diam. 4 cm, høyde 26 cm ble pakket med 15 g (tørrvekt) vann-svellet pulverformig gelsubstans (svellingsfaktor 16,0 g/g av den tørre gel), fremstilt ved reaksjon av polyvinylalkohol med epiklorhydrin. Lagets totale volum var 330 ml og voidvolumet 120 ml. For å finne i hvilken grad det var mulig å fraksjonere dekstran, dvs. å separere polydisperse dek stransubstanser, bestemtes fordelingen av 4 dekstransubstanser i 4 separate forsøk.

Ved hvert enkelt av disse tilførtes 5 ml

10 %'s oppløsning av substansen i vann og

som elusjonsmiddel anvendtes vann. Elue-ringen ble utført i samtlige fire forsøk med en hastighet av 20 ml/time. Effluenten fra kolonnen ble oppdelt i fraksjoner ved hjelp av fraksjonssamlere. Ved de to første for-søk med dekstransubstans av Mw = 1 800 000 resp. Mw = 300 000, kom dekstranet etter voidvolumet.

Ved det tredje forsøk, med dekstransubstans med Mn, = 40 000, kom hoveddelen etter voidvolumet og en mindre del senere. Ved det fjerde forsøk, med dekstransubstans med Mw = 20 000, kom en mindre del etter voidvolumet og hoveddelen senere. Forsøket viser at det er mulig å atskille (fraksjonere) dekstran i i det minste to grupper, en med molekylvékt større enn 20 000—40 000 og en med molekylvékt mindre enn 20 000—40 000.

Eksempel 6:

En kolonne med diameter 4 cm ble pakket med 32 g (tørrvekt) gelkorn (par-tikkelstørrelse 100—200 masker); svellingsfaktor 6 g/g av den tørre gel), fremstilt ved reaksjon av stivelse med glycerin-1,3-diklorhydrin. Lagets totale volum var 314 ml. I kolonnen inførtes 5 ml av en vann-oppløsning som inneholdt 200 mg humanserumalbumin og 200 mg natriumklorid. Laget eluertes med vann med en hastighet av 20 ml/time og fraksjoner å 5,5 ml ble samlet opp. Albumin opptrådte i eluatet mellom 135 og 140 ml og saltet mellom 270 og 330.

Eksempel 7:

En kolonne med 3 cm diameter ble pakket til 45 cm høyde med en svellet, pulverformig gelsubstans (partikkelstørrelse i tørr tilstand 200—400 masker; svellingsfaktor 4,9 g/g av den tørre gel), fremstilt ved reaksjon av dekstran (Mw = 40 000) med epiklorhydrin. Laget ble vasket med fosfatpuffer (ionestyrke 0,03; pH 7,03) inntil likevekt var oppnådd. Effluenten ble oppdelt i 7 ml fraksjoner med fraksjonssamlere, som byttet rør hvert 15.de minutt, hvilket ga en elueringshastighet av 28 ml/ time. Protein (ifølge Folin-Lowry), amino-syrer og peptider (med ninhydrin) og nu-kleotidmateriale (med UV-absorpsjon) ble bestemt i hver fraksjon. Protein erholdtes i fraksjonene 5—12, peptider og amino-syrer i fraksjonene 20—40 og nukleotid-materiale i fraksjonene 42—60.

Eksempel 8:

Et lag med dimensjonene 3 x 22 cm ble pakket av en svellet gelsubstans (svellingsf aktor 4,5 g/g av den tørre gel), fremstilt ved tverrbinding av dekstran med epiklorhydrin. Det ble gjort to forsøk for å finne innflytelsen av insulins assosiasjons-grad på dets uttrengning i gelkornene.

a) Laget ble brakt i likevekt med 0,1 molar acetatpuffer (pH 3,95). 1 ml 0,51%

insulin i puffer ble innført i søylen, hvoretter det eluertes med pufferen. Insulinet kom i effluenten mellom 55 og 65 ml.

b) Laget ble brakt i likevekt med 1 % dikloreddiksyre i vann. 1 ml 0,42 % insulin

i oppløsningen ble innført i laget, hvorpå det eluertes med dikloreddiksyreoppløsnin-gen. I dette tilfelle kom insulinet i effluenten mellom 80 og 100 ml.

Eksempel 9:

Et lag med dimensjonene 4 x 35 cm ble pakket med gelkorn (partikkelstørrelse 100—200 masker; svellingsf aktor 4,2 g/g av den tørre gel), som var blitt fremstilt ved reaksjon mellom dekstran (Mw = 20 000) og epiklorhydrin. Laget ble vasket med 1-molar fosfatpuffer, pH 7,0. Deretter tilfør-tes 5 ml av en vannoppløsning som inneholdt 0,11 % av den antibiotiske substans polymyksin B til laget og deretter 0,1-molar fosfatpuffer med en hastighet av 101 ml/ time. Polymyksinet passerte ut av laget mellom 350 og 400 ml.

Ved et annet eksperiment tilførtes 5 ml av en oppløsning som inneholdt 0,15 % polymyksin og 1 % natriumdekstransulfat (MB. = 1 000 000) til laget og derpå 0,1 % fosfatpuffer med en hastighet av 100 mltime. Polymyksindekstransulfatkomplek-set passerte ut av laget sammen med dek-stransulfat mellom 200 og 250 ml.

Eksempel 10:

En kolonne med en diameter av 1,5 cm og en høyde av 22 cm ble pakket med gelkorn (partikkelstørrelse 100—200 masker; svellingsf aktor 2,7 g/g av den større gel), som var blitt fremstilt ved polymerisasjon av dekstran (Mw = 40 000) og bisepoksypropyleter. Gellagets totale volum var 36 ml. Til laget tilførtes 1 ml av en vannopp-løsning som inneholdt 10 mg humanserumalbumin og 10 mg natriumklorid. Laget eluertes med vann med en hastighet av 95 ml/time og fraksjoner som inneholdt 3 ml hver ble oppsamlet ved hjelp av en frak-sjoneringssamler. Albuminet opptrådte i fraksjonene 5 og 6 og saltet i fraksjonene 8—10.

Eksempel 11:

Samme kolonne som i eksempel 10 ble pakket med gelkorn (partikkelstørrelse

100—200 masker; svellingsfaktor 1,1 g/g

av den tørre gel), som var fremstilt ved reaksjon av dekstrin med epiklorhydrin. Lagets totale volum var 35 ml. I kolonnen inførtes 1 ml av en vannoppløsning som inneholdt 10 mg humanserumalbumin og 100 mg natriumklorid. Laget eluertes med vann med en hastighet av 36 ml/time og fraksjoner som inneholdt 3 ml hver ble

oppsamlet. Albuminet opptrådte i fraksjonene 4—6 og saltet i fraksjonene 8—10.

Eksempel 12:

En kolonne med en diameter av 1,5 cm og en høyde av 22 cm ble pakket med

gelkorn (partikkelstørrelse 30—100 masker; svellingsfaktor 2,2 g/g av den tørre gel), som var blitt fremstilt ved reaksjon av stivelse med bisepoksypropyleter. Gellagets totale volum var 36 ml. I laget ble det innført 1 ml av en vannoppløsning som inneholdt 10 mg humanserumalbumin og

100 mg natriumklorid. Laget eluertes med

vann med en hastighet av 120 ml/time og fraksjoner på 3 ml ble oppsamlet. Albumin opptrådte i fraksjonene 4—6 og saltet i fraksjonene 8—10.

Eksempel 13:

Samme kolonne som i eksempel 12 ble pakket med gelkorn (partikkelstørrelse 50 —270 masker; svellingsfaktor 1,6 g/g av den tørre gel), som ble fremstilt ved reaksjon av dekstran med 1,2,3,4-diepoksybutan. Gellagets totale volum var 35 ml. Til laget ble det tilført 1 ml av en vannopp-løsning som inneholdt 10 mg humanserumalbumin og 100 mg natriumklorid. Laget ble eluert med vann med en hastighet av 7 ml/time og fraksjoner hver inneholdende 3,5 ml ble oppsamlet. Albuminet opptrådte i fraksjonene 4 og 5 og salter i fraksjonene 8—10.

Eksempel 14:

En kolonne med en diameter av 3 cm ble pakket med gelkorn (partikkelstørrelse 100—200 masker; svellingsfaktor 2,1 g/g av den tørre gel), som ble fremstilt ved reaksjon mellom dekstran og 1,4-butandiol-diepoksypropyleter. Gellagets totale volum var 247 ml. Før eksperimentet hadde laget

blitt vasket med 10 %'s oppløsning av eta-nol i vann. Til laget ble det tilført 3 ml av

en oppløsning av 30 mg dekstran (Mw = 40 000) og 30 mg av glukose i 10 %'s vann-alkoholoppløsning. Deretter eluertes med 10 %'s vann-alkoholoppløsning med en

hastighet av 180 ml/time og effluenten ble

oppsamlet i fraksjoner på 5,5 ml. Mellom

103 og 120 ml opptrådte dekstranet i effluenten og mellom 180 og 213 ml glukosen.

Eksempel 15:

En kolonne med en diameter av 3,5 cm

ble pakket med gelkorn (partikkelstørrelse

50—100 masker; svellingsfaktor 9,0 g/g av

den tørre gel), som ble fremstilt ved reaksjon av sorbitol med epiklorhydrin. Gellagets volum var 219 ml. Til laget ble det

tilført 5 ml av en oppløsning som inneholdt

200 mg humanserumalbumin og 100 mg

natriumklorid, hvoretter det ble eluert med

vann med en hastighet av 100 ml/time.

Albuminet opptrådte i effluenten mellom

75 og 110 ml og natriumkloridet mellom

190 og 225 ml.

Claims

1. Fremgangsmåte til fra en oppløsning å adskille stoffer med forskjellige mole-kylstørrelser, hvor oppløsningen bringes i

berøring med et lag av svellbar gelformig substans i kornform med selektiv evne til fra oppløsningen å ta opp stoffer alt etter molekyldimensjonene, og fraksjoner av de adskilte stoffer suksessivt utvinnes fra gellaget ved eluering med en væske, karakterisert ved at den svellbare substans består av et tredimensjonalt makroskopisk nettverk av molekyler som er sammenbundet ved kovalente bindinger i form av eterbroer, fortrinnsvis av den alminnelige type -O-X-O-, der X betegner et alifatisk radikal, som inneholder 3 til 10 kullstoffato-mer, og som inneholder hydroksylgrupper, fortrinnsvis tilsvarende minst 12 % av den tørre gels vekt.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at den gelformige substans anbringes som et lag av svellede gelkorn i form av en søyle pakket i en kolonne, hvoretter oppløsningen som inneholder stoffene, som skal atskilles, føres inn i laget i en mengde som høyst tilsvarer volumet av væske, som er absorbert i gelkornene, hvoretter elueringsvæske tilføres ovenfor laget og får passere inn i dette og den fra laget uttredende væske — effluenten — oppsamles i fraksjoner, hvorved det først fås fraksjoner som inneholder en høyere konsentrasjon av stoff med større mole-kylstørrelse og senere fraksjoner med høy-ere konsentrasjon av stoff med lavere mo-lekylstørrelse enn i utgangsoppløsningen.

3. Fremgangsmåte ifølge påstand 1 eller 2, karakterisert ved at gelsubstansen utgjøres av et sampolymerisat som er blitt fremstilt ved polymerisasjon av polysakkarider f. eks. dekstran, stivelse, dekstrin, cellulose, polyglukose eller hydroksylgrup-peholdige derivater av disse, eller polyvinylalkohol, sukkeralkoholer, f. eks. sorbitol, eller kullhydrater, f. eks. sukrose, med bifunksjonelle organiske stoffer som inneholder halogenatomer og/eller epoksygrup-per, som reagerer med hydroksylgrupper i det organiske stoff under dannelse av eter-artede broer av angitt art.

4. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at gelen har en svellingsfaktor på 1—50 g/g av den tørre gel.

5. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at kornene i gellaget har en kornstørrelse i tørr tilstand innenfor området 0,01—2,0 mm, fortrinnsvis innenfor området 0,05—0,5 mm.

6. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at atskillelsen utføres i nærvær av et pufferstoff.

7. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at gjennomstrømningshas-tigheten gjennom gellaget reguleres til en verdi av høyst 10 cm/min., fortrinnsvis høyst 7 cm/min.

8. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av de foregående påstander, karakterisert ved at en oppløsning av kolloidale stoffer og krystalloide stoffer underkastes atskillelse.

9. Fremgangsmåte ifølge en hvilken som helst av påstandene 1—7, karakterisert ved at en blanding av polymerhomo-loger underkastes atskillelse.