NO130939B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte til fremstilling av langsomt virkende insulinpreparater inneholdende sinkprotamininsulin i krystallinsk form.

Det kjennes tallrike langsomt virkende insulinpreparater. Et av de mest anvendte er sinkprotamininsulin, som er en suspensjon av partikler bestående av protamin, insulin og sinkfosfat. Partiklene i denne suspensjon er ved fremstillingen amorfe, men etter kortere eller lengre tids henstand danner det seg en del krystaller av forskjellig størrelse i den amorfe suspensjon, og disse er sinkprotamin-insulinkry-staller, og svarer antagelig til dem som dan-nes ved den i beskrivelsen til dansk patent

nr. 64 708 angitte fremgangsmåte.

Det har ofte vært fremsatt ønske om

ved blanding av sinkprotamininsulin med

alminnelig oppløst insulin å kunne oppnå

både en hurtig og en langsom virkning,

men dette støter på den vanskelighet at

det tilsatte insulin i stor utstrekning ad-sorberes til de amorfe suspenderte partikler, og virkningen blir derfor i stedet for

den ønskede hurtige og langsomme virkning en middellangsom virkning, som be-gynner senere enn hvis de to preparater

innsprøytes hver for seg. Et usikkerhets-moment er til stede ved at denne adsorb-sjon tar av etterhånden som den delvise

krystallisering skrider frem.

Til det beskrevne formål, så vel som

til anvendelse uten tilsetning av alminnelig oppløst insulin, ville det være en fordel

om man kunne fremstille en krystallsus-pensjon av sinkprotamininsulin, men slik

at dette fra begynnelsen var helt krystallinsk og ensartet og krystallene var i stand

til å bevare deres størrelse uforandret.

Det kjennes riktignok en fremgangsmåte til fremstilling av et insulinpreparat

med langsom virkning som inneholder protamininsulinkrystaller, ved hvilken disse krystaller behandles i et medium, som inneholder sink, hvorved man får et preparat med protamininsulinkrystaller, som er mere sinkholdige enn de protamininsulinkrystaller som anvendes i utgangs-materialet. Dette preparat er langsom-mere virkende enn protamininsulin og likner deri de amorfe sinkprotamininsulinpreparater, men det har den fordel overfor disse at det er krystallinsk og derfor har mindre adsorbsjonsevne, bl. a. overfor insulin. Imidlertid lider denne fremgangsmåte av den ulempe at det fremstilte preparat ikke er anvendelig i forbindelse med fosfatpuffer, idet denne vil forhindre sink i å binde seg til protamininsulinkrystallene og derfor ikke tillate oppnåelsen eller opp-rettholdelsen av et stort sinkinnhold i disse. Preparatene må derfor fremstilles uten anvendelse av denne puffer, dvs. enten uten pufferstoffer eller med anvendelse av andre mindre egnede pufferstoffer.

Denne ulempe er særlig følbar når man ønsker å blande preparatet med i handelen forekommende alminnelige insulinoppløs-ninger, som er sure, idet den mengde av en slik oppløsning, som vil kunne tilblan-des, avhenger av preparatets pufferkapa-sitet. Ulempen ville være mindre følbar hvis det anvendtes en neutral insulinopp-løsning, men sådanne er ikke i handelen.

Den foreliggende oppfinnelse går ut på en fremgangsmåte til fremstilling av et langsomt virkende insulinpreparat, som inneholder sinkprotamininsulin i form av ensartede krystaller, som beholder deres størrelse uforandret, men ikke lider av den ovennevnte mangel.

Ifølge oppfinnelsen består fremgangs-måten i at man til en suspensjon av krystaller av protamininsulin i nærvær av fosfatpuffer tilføyer så vel sink som protamin i slike relative mengder at suspensjonsmediet etter omsetningen er tilnærmet protamin- og sinkfritt.

Omsetningen, som består i opptagelsen av de tilsatte mengder av sink og protamin i de i suspendert form tilstedeværende protamininsulinkrystaller, foregår ved alminnelig temperatur og ved pH-verdier omkring nøytralpunktet, f. eks. ved pH-verdier mellom 6 og 8, og krever ingen sær-skilt henstand for å bli fullstendig. Det er uten betydning om protaminet og sinken tilsettes som oppløsninger av henholdsvis protaminsalt og sinksalt, eller om de f. eks. tilsettes som en i forveien felt suspensjon av sink og protamin med fosfatpuffer. Protaminsinkfosfatet vil i alle tilfeller for-svinne fra suspensjonsmediet når protaminet og sinken bringes sammen med de suspenderte protamininsulinkrystaller, og mengdeforholdene er slike som ville kreves til oppnåelse av preparater av lignende sammensetning som de kjente sinkprotamininsulinpreparater. Det samme vil skje ved anvendelse av et protamintilskudd, og-så når det benyttes sinkmengder som er vesentlig større en svarende til sinkinn-holdet i de kjente sinkprotamininsulinpreparater, f. eks. dobbelt så store eller ved anvendelse av mindre sinkinnhold enn de således kjente.

pH ligger ved sammenblandingen in-nenfor de grenser som gjelder for krystal-liseringen av protamininsulin, nemlig pH = 6—8, men det er hensiktsmessig å gi den ferdige blanding et pH på 7,1—7,4. En slik

fremstillet suspensjon viser seg å adsor-bere fritt insulin i vesentlig mindre grad enn det amorfe sinkprotamininsulin, og ved holdbarhetsforsøk har det ikke kunnet påvises størrelsesforandring hos krystallene. Dyre-eksperimenter såvel som kli-niske forsøk har vist at suspensjonens virkning svarer til virkningen av det alminnelige sinkprotamininsulin, i hvert fall når sink- og protamininnholdet er det samme, mens derimot blandinger med alminnelig insulin i høyere grad utøver det oppløste insulins hurtige virkning.

Også med suspensjoner av krystallinsk protamininsulin kan suspensjoner, fremstillet ifølge den foreliggende oppfinnelse, blandes med det resultat, at blandingen ved injeksjon får en virkning som om de to preparater var innsprøytet hver for seg. Slike blandinger kan være hensiktsmessig, da virkningen av krystallinsk protamininsulin inntrer hurtigere — men opphører tidligere — enn virkningen av det ifølge foreliggende oppfinnelse fremstillede preparat.

Virkningen av preparater fremstillet ifølge foreliggende oppfinnelse, med lavere innhold av sink og protamin enn de kjente sinkprotamininsulinpreparater, f. eks. det halve, er også tydelig forlenget i forhold til den ubehandlede suspensjon av protamininsulinkrystaller. Slike preparater kan derfor i mange tilfeller anvendes med fordel i de ovennevnte blandinger.

I vedlagte tabell er det som eksempel anført sammensetningen av fire forskjel-lige preparater, som er fremstillet ifølge oppfinnelsen, og som alle ved mikroskop-iske undersøkelser viser seg å være helt krystallinske, og ved biologiske forsøk har vist seg å ha de ovenfor beskrevne egen-skaper.

Alle forsøkene er utført ved stuetemperatur.

Fremstillingen av preparatene B, C og D er skjedd på den måte, at det til en opp-slemning av krystallinsk protamininsulin som inneholder en liten mengde sink, er tilsatt en vandig oppløsning av sinkklorid, dels en vandig oppløesning av protamin-sulfat. Ved preparatet A er sink og protamin tilsatt under ett i form av en suspensjon av protaminsinkfosfat, dannet ved tilsetning av protamin- og sinksalt til suspensjonsmidlet, inneholdende fosfatstøt-pute.

pH-verdien er under tilsetningen mellom 6 og 8, og konsentrasjonen av suspen-sjonen av protamininsulinkrystaller med hensyn til insulin er valgt slik, at antall enheter av insulin pr. ml av det endelige produkt, blir som anført i tabellen. Tilsvarende fastsettes konsentrasjonen med hensyn til fosfatpuffer således, at de endelige preparater er 1/75 molare med hensyn til fosfatpuffer, men det er for øvrig intet i veien for, som det fremgår av det følgende, å anvende fosfatkonsentrasjoner som av-viker betydelig fra den nevnte vanlig anvendte verdi, f. eks. halvparten så store eller dobbelt så store eller større. Sammenblandingen er ved fremstillingen av alle preparatene utført ved stuetemperatur. Tabellen viser at såvel forholdet mellom den tilsatte sink- og protaminmengde, som mengdene av tilsatt sink i forhold til in-sulinmengden kan varieres.

Særlig hensiktsmessig tilsettes det ifølge oppfinnelsen protaminmengder som er høyst fem ganger så store som sinkmengden, idet tilsatt insulin da bare gir lite bunnfall med i suspensjonsmidlet værende ubundet protamin.

Til nærmere belysning av protamin- og sinkblandingens natur, og betydningen av mengdeforhold og konsentrasjon, er det utført en rekke forsøk, som nærmere skal beskrives i det følgende, under henvisning til et antall på grunnlag av forsøkene ut-arbeidede kurver, som er vist på tegningen, idet

fig. 1 viser protaminbindingens avhen-gighet av tilføyet sink, idet mengden av resterende ubundet protamin er målt ved den relative uklarhet som fremkommer i det frafiltrerte medium når det til dette tilsettes ekstra insulinoppløsning. Fig. 2 viser protaminbindingens av-hengighet av fosfatkonsentrasjonen på samme måte som i fig. 1, men med mengden av tilføyet sink fastholdt på en av de kurvene i fig. 1 representerte verdier. Fig. 3 viser relasjonen mellom den i en

oppløsning værende protaminmengde, og de i fig. 1 anvendte enheter for «relativ uklarhet», og

fig. 4 viser forholdet mellom sinkmengden og den i krystallene bundne protaminmengde, utledet av fig. 1 og 2 i forbindelse med fig. 3.

Til grunn for fig. 1 ligger følgende

forsøk:

Til en suspensjon av 40 enheter krystallinsk protamininsulin i et suspensjons-medium, som er 1/75 molart med hensyn til natriumfosfat, og hvis pH er justert til 7.3, er det tilføyet de ut fra hver enkelt kurve anførte sinkmengder i form av sinkklorid, og de langs absisseaksen anførte protaminmengder i form av protaminsul-fat. Deretter er krystallene frafiltrert, og til det klare filtrat er det tilsatt oppløst insulin. Den derved fremkommende uklarhet er avsatt langs ordinataksen i arbi-trært mål.

Den relativt plutselige stigning i uklarheten, som inntrer for hver enkelt kurve idet protaminmengden overstiger en viss verdi, er uttrykk for at det inntrer en stigning i den suspensjonsmediet værende protaminmengde, som gir bunnfall ved insulintilsetning. Fig. 2 viser på samme måte den uklarhet, som oppstår ved insulintilsetning til suspensjonsmediene av krystallsuspensjo-ner, som er dannet ved varierende prota-mintilsetning til en suspensjon av krystallinsk protamininsulin, hvortil det også er satt sink. Sinktilsetningen er her konstant, nemlig 0,075 mg pr. ml av en suspensjon inneholdende 40 enheter insulin (som protamininsulin) pr. ml, mens den varierende faktor er fosfatkonsentrasjonen i mediet, idet denne som anført på de tre kurver er henholdsvis 1:37,5 mol, 1:75 mol og 1:150 mol pr. liter. Fig. 3 viser i samme mål som i fig. 1 og 2 sammenhengen mellom uklarheten og mengden av protamin i oppløsningen, like-ledes ved pH 7.3. Ut fra denne kurve er et par verdier for mengden av ubundet protamin pr. milliliter avsatt langs ordinaten i fig. 1. Det sees av fig. 1, at 0,0025 mg ubundet protamin pr. milliliter suspensjonsme-dium, svarer til en desto større mengde av ialt tilsatt protamin pr. ml jo høyere sinkmengden er. Da 0,0025 mg protamin er en meget liten protaminmengde, hvis tilstede-værelse i et preparat ikke øver vesentlig innflytelse på tilsatt oppløst insulin, idet bare en praktisk talt forsvinnende del av dette vil bli felt av en slik protaminmengde, og da denne mengde omtrent faller sammen med «knekkpunktet» på kurvene i fig. 1, er den protaminmengde — ved hvilke kurvene skjærer en mot absisseaksen parallell linje med ordinaten, 0,0025 mg ubundet protamin, i fig. 4 betraktet som den protaminmengde som er bundet av den pågjeldende sinkmengde.

I fig. 4 viser derfor kurven, hvor mange milligram protamin som bindes av et visst antall milligram sink under de i fig. 1 angitte forhold og forutsetninger. I fig. 4 tilsvarer sammenhørende verdier for protamin- og sinkmengdene forsøkene A, B, C og D, som nettopp er utført under disse forhold og forutsetninger, innført som punkter betegnet ved små sirkler.

Kurven i fig. 4 kan såvel oppfattes som angivende den mengde protamin som bindes av en gitt mengde sink ved en fosfatkonsentrasjon som tilsvarer 1:75 molar natriumfosfat når det tillates en mengde fri protamin på 0,0025 mg pr. ml, som angivende den mengde som ved en annen passende fosfatkonsentrasjon bindes under overholdelse av en annen øvre grense for innholdet av fri protamin, hvorved be-merkes at grensen 0,0025 mg pr. ml er arbitrær og lav, og at en høyere grense meget vel er forenelig med oppnåelsen av oppfinnelsens formål. Således fremgår det av fig. 2, at 0,38 mg protamin som ved 0,075 mg sink pr. ml frembringer et bunnfall som inneholder 0,0025 mg protamin når fosfatkonsentrasjonen tilsvarer 1:75 molar natriumfosfat, ved den dobbelte fosfatkonsentrasjon frembringer det mindre bunnfall, som svarer til uklarheten E, ved den halve det større bunnfall, som svarer til uklarheten F, begge stadig tillatelige.

Kurven i fig. 4 kan derfor også sees i forbindelse med fig. 2, og tolkes som ved-rørende disse grenser og de tilsvarende fos-f atkonsentrasj oner.

Som det sees av fig. 4, ligger protaminmengden ved forsøkene A, C og D tett under den av kurven angitte maksimale verdi, som tilsvarer at protaminmengden er ca. fem ganger så stor som sinkmengden, reg-net i mg pr. ml. Større protaminmengder gir større uklarhet ved insulintilsetning, og preparatene blir derfor med stigende pro-tamininnhold mindre tilfredsstillende til blanding med oppløst insulin. Ved forsøk B er protamintilsetningen bare ca. to tredje-deler av den av kurven angitte, men dette preparat har som ovenfor anført vist seg velegnet til blanding med oppløst insulin. Ved fortsatt reduksjon av protamintilsetningen går man til slutt over i preparater som tilsvarer slike bestående av protamin-insulinsuspensjoner, til hvilke det bare er tilsatt sink, men fremstillingen av disse preparater omfattes ikke av foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen skal i det følgende ytter-ligere belyses gjennom noen eksempler på fremstillingen av praktisk brukbare preparater som inneholder de vanlige ytterlig-ere tilsetninger.

Eksempel 1:

Til 50 ml av en suspensjon av protamininsulinkrystaller, inneholdende 80 in-ternasjonale enheter insulin pr. ml, 1,5 mg metakresol pr. ml, 0,6 mg fenol pr. ml, og som er 1/75 mol med hensyn til natriumfosfat og har pH 7,3 settes: 1) 10 ml 1/15 mol natriumfosfatopp-løsning med pH 7,5, samt 2) 40 ml av en oppløsning inneholdende 7,5 mg sink oppløst som sink-oksyd i et minimum av saltsyre, 40 mg protamin,

75 mg metakresol og

30 mg fenol.

Eksempel 2:

Til 50 ml av en suspensjon av protamininsulinkrystaller som inneholder 80 in-ternasjonale enheter insulin pr. ml, 1,5 mg metakresol pr. ml, 0,6 mg fenol pr. ml, og som er 1/75 mol med hensyn til fosfat, og har pH 7,3 isettes: 50 ml av en suspensjon fremstilt ved å

oppløse:

7,5 mg sinkklorid,

40 mg protamin,

75 mg metakresol og

30 mg fenol

i vann, og dette tilsettes natriumfosfat til en sluttkonsentrasj on av 1/75 gram mol pr. 1, hvoretter pH justeres til 7,3.

Eksempel 3:

Til 50 ml av en suspensjon av protamininsulinkrystaller, som inneholder 80 in-ternasjonale enheter insulin pr. ml, 1,5 mg metakresol pr. ml, 0,6 mg fenol pr. ml, og som er 2/75 molar med hensyn til fosfat, og har pH 7,5 settes: 50 ml av en oppløsning som inneholder:

7,5 mg sink,

40 mg protamin,

75 mg metakresol og

30 mg fenol.

Eksempel 4:

Utføres som eksempel 3, dog inneholder den til protamininsulinkrystallsuspensjo-nen føyede oppløsning:

4 mg sink,

20 mg protamin,

75 mg metakresol og 30 mg fenol.

Claims (2)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av langsomt virkende insulinpreparater, inneholdende sinkprotamininsulin i krystallinsk form, samt en sinkfellende fosfatpuffer, karakterisert ved at man til en suspensjon av krystaller av protamininsulin i nær vær av fosfatpuffer tilsetter sink og protamin i slike relative mengder, at suspensjonsmediet etter omsetningen tilnærmet er protamin- og sinkfritt.

2. Fremgangsmåte ifølge påstand 1, karakterisert ved at den tilsatte protaminmengde er høyst fem ganger så stor som den tilsatte sinkmengde.