NO123470B

NO123470B -

Info

Publication number: NO123470B
Application number: NO165323A
Authority: NO
Inventors: J Growich
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1965-11-15
Filing date: 1966-10-24
Publication date: 1971-11-22
Also published as: LU52319A1; DE1617281A1; BE689013A; GB1166681A; CH492019A; FI43721B; ES333366A1; FR1504086A; CH501727A; MC623A1; DK113983B; SE346564B; BR6684265D0; FI43721C; NL6616081A; IL26762A

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av

7-klor-6-demetyltetracyklin.

Denne oppfinnelse angår en forbedret fremgangsmåte

for fremstilling av 7-klor-6-demetyl-tetracyklin ved dyrkning av en stamme av Streptomyces aureofaciens som produserer 7-klor-6-demetyltetracyklin under neddykkede aerobe betingelser i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter. Fremgangsmåten karakteriseres ved at det anvendes en 7-klor-6-demetyltetracyklin-produserende stamme av Streptomyces aureofaciens som produserer 7-klor-6-demetyltetracyklin selektivt og har evnen til å bevirke at en 1:200 vandig fortynning av hele produkt-mediet får en farve som kjennetegnes ved enten

(a) en lineært avsatt refleksjonskurve hvor verdiene

for prosent refleksjon ved 460, 540, 560 og 660 mja gir en positiv verdi for ^R, når de settes inn i formelen:

eller

(b) en refleksjonskurve som er slik at når prosent refleksjon avsettes lineært mot bølgelengden, vil den resulterende kurve mellom 460 og 530 mji ha ett infleksjonspunkt, og den vil ha minst ett punkt med ingen helning, og den vil være konveks oppover på venstre side av infleksjonspunktet, og den vil være konkav oppover på høyre side av infleksjonspunktet, idet hele produkt-mediet er det ubehandlede medium erholdt efter at en fermentering ved anvendelse av det følgende medium:

er utført til det punkt hvor biosyntese av det primære antibiotiske produkt i praktisk henseende er stoppet.

Under de betingelser som er angitt i det følgende vil innholdet av antibiotika i fermenteringsmediet, slik som dette hensiktsmessig kan måles, opphøre å stige nevneverdig etter at fermenteringen har skjedd i fra ca. 140 til ca. 160 timer. Det er imidlertid mulig at under noe forskjellige betingelser kan maksimalt innhold av antibiotika bli nådd noe snarere eller senere.

Det antibiotiske stoff 7-klor-6-demetyltetracyklin ble

først beskrevet sammen med fremgangsmåter for fremstilling derav i U.S. patent nr 2.878.289, hvor en 7-klor-6-demetyl-tetracyklin-produserende stamme av S. aureofaciens ble dyrket i et fermenteringsmedium. Nevnte patent angir også at andre tetracykliner,

så som 6-demetyltetracyklin, 7-klortetracyklin og tetracyklin produseres samtidig i et fermenteringsmedium når fermenterings-betingelsene, innbefattet de deri angitte mikroorganismer, anvendes. Videre angir patentet at 7-brora-6demetyltetracyklin kan være et led-

sagende produkt når brom er en bestanddel av fermenteringsmediet. Ytterligere beskrivelse av produksjonen av mer enn ett tetracyklin

i et fermenteringsmedium i hvilket demétylklortetracyklin.kan fremstilles, er gitt i U.S. patent nr 3.028.311 og U.S. patent nr. 3.061.522 hvor såkalte 6-metyleringsinhibitorer er til stede i et fermenteringsmedium hvor en 7-klortetracyklin-produserende stamme av S. aureofaciens anvendes.

Ytterligere beskrivelse av produksjonen av 7-klor-6-demetyltetracyklin ved dyrkning av 7-klortetracyklin-produserende stammer av S. aureofaciens i nærvær av 6-metyleringsinhibitorer er vist i U.S. patenter nr. 3.019.172 og 3.127.328. Disse fremgangsmåter er også stillet overfor problemet med ledsagende dannelse av andre tetracykliner. Ved hver av disse fremgangsmåter produseres således en blanding av 7-klortetracyklin, tetracyklin, 7-klor-6-demetyltetracyklin og 6-demetyltetracyklin.

Den ledsagende produksjon av 6-demetyltetracyklin (eller andre tetracykliner) er uønsket når 7-klor-6-demetyl-tetracyklin er det tilsiktede hovedprodukt. Selv om 7-klor-6-demetyltetracyklin av farmasøytisk kvalitet kan inneholde små mengder 6-demetyl-tetracyklin, vil tilstedeværelse av en vesentlig mengde 6-demetyl-tetracyklin være uheldig. Tilstedeværelse av 6-demetyltetracyklin (eller andre tetracykliner) i det samme fermenteringsmedium i noen vesentlige mengder medfører også vanskelige separerings-problemer ved raffinering eller ekstrahering når 7-klor-6-demetyl-tetracyklin er det ønskede produkt. Det er selvsagt mulig å ekstrahere de antibiotiske stoffer fra fermenteringsmediet og ved selektive raffineringsmetoder å oppnå en separering av de antibiotiske stoffer. Raffineringsmetodene for oppnåelse av denne separering er imidlertid vanskelig og medfører vanligvis noe tap av totalt innhold av antibiotiske stoffer. I de tilfelle hvor 7-klor-6-demetyltetracyklin er hovedproduktet ved fermenteringen,

er dessuten 6-demetyltetracyklin (eller andre tetracykliner)

uønsket og blir vanligvis fjernet og kassert. Enhver metode som resulterer i øket produksjon av 7-klor-6-demetyltetracyklin og mindre ledsagende produksjon av 6-demetyltetfacyklin (eller andre tetracykliner) representerer således et vesentlig bidrag til teknikken ved antibiotikafermentering.

Det er nu uventet oppdaget at visse nye mutantstammer

av Streptomyces aureofaciens ved en vanlig fermentering vil produ-

sere 7-klor-6-demetyltetracyklin med ikke mer enn 5% 6-demetyl-tetracyklin som ledsagende produkt. Videre forekommer ingen på-viselig produksjon av tetracyklin eller 7-klor-tetracyklin med de nye mutantstammer som her beskrevet. Oppdagelsen av disse nye stammer gjør det unødvendig å anvende kostbare og vanskelige ekstraherings- og rensningsmetoder, da krystallene av 7-klor-6-demetyltetracyklin som oppnåes, er av farmasøytisk kvalitet.

De nye mutantstammer som anvendes ved fremgangsmåten

i henhold til oppfinnelsen, er stammer av arten Streptomyces aureofaciens. De representative S. aureofaciens-stammer som er beskrevet i det følgende, er direkte etterkommere etter det 7-klor-tetracyklin-produserende jordprøveisolat S. aureofaciens A-377 beskrevet i U.S. patent nr. 2.482.055 og deponert i Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, og katalogisert som NRRL 2209. De er frembragt ved mutagene prosesser som er kjent innen teknikken, f.eks. ultrafiolett bestråling, behandling med nikotin og nitrogensennep. Typiske mutantstammer av S. aureofaciens som er i besittelse av de særlig gode egenskaper som her er nevnt, er betegnet som IE-1352, IE-1354, IE-1355 og IE-2322.

Det skal selvsagt forståes at ytterligere mutanter som har denne særlige egenskap at de tilfører en spesiell farve til hele produkt-mediet, kan avledes fra disse stammer ved vanlige metoder. Disse mutanter kan variere noe med hensyn til generelle morfologiske og fysiologiske egenskaper, i likhet med de forskjellige stammer av arten S. aureofaciens. Stammene nr. IE-2803 og IE-2750 ble f.eks. avledet fra henholdsvis stammene nr. IE-1352 og IE-2322 under anvendelse av velkjente metoder, dvs. valg av naturlig forekommende mutanter og valg av mutanter som forekommer som resultatet av tilsiktet behandling med det kjemiske mutagen, nitrogensennep og med ultrafiolett lys. Slike metoder er f.eks. beskrevet i: "Induced Mutagenesis in Selection of Microorganisms" av S. I. Alikhanian, s. 1-50, fra Progess in Applied Microbiology, Vol. 4 (1962) , Academic Press, New York og London.

Levedyktige "representative kulturer av de nye mutantstammer som anvendes i henhold til oppfinnelsen, er deponert hos Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, og har fått de følgende nummere:

Stammene som anvendes ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, har de taksonomiske egenskaper til arten S. aureofaciens og kan lett identifiseres som medlemmer av denne art selv om de adskiller seg fra tidligere beskrevne stammer av S. aureofaciens, ikke bare med hensyn til pigmentering på faste medier, men også

med hensyn til farvene på hele produktmediene som erholdes med disse.

Disse nye stammer (Klassene I og II) og de stammer som

er kjent innen teknikken for å fremstille 7-klor-6-demetyltetracyklin i vanlige medier, kan oppdeles i tre kategorier: 1) S. aureofaciens stammer ATCC 12551, 12552, 12553 og 12554 som er beskrevet i U.S. patent nr 2.878.289 og som produserer varierende mengder av 7-klor-6-demetyltetracyklin, 6-demetyltetracyklin, tetracyklin og 7-klortetracyklin; 2) S. aureofaciens stammer V-138, E-475, E-1311, ED-1723, ED-2047 og ED-2314 som er beskrevet i de følgende patenter: V-138 i U.S. patent nr. 3.037.916, E-475, E-1311, ED-1723 og ED-2047 i U.S. patent nr 3.050.446, ED-2314 iU.S. patent nr. 3.145.154, og som produserer varierende mengder av 7-klor-6-demetyl-tetracyklin og 6-demetyltetracyklin med en faktisk utelukkelse av metylerte tetracykliner; og 3) de nye stammer som anvendes i henhold til oppfinnelsen, IE-1352, IE-1354, IE-1355, IE-2803, IE-2322 og IE-2750 som produserer 7-klor-6-demetyltetracyklin med en faktisk utelukkelse av alle andre tetracykliner.

Klasse I av de nye mutantstammer som anvendes ifølge oppfinnelsen, representert ved stammene nr. IE-1352, IE-1354, IE-1355 og IE-2803, kan adskilles fra de to grupper av tidligere kjente stammer ved en matematisk tolkning av de spektrofotometriske refleksjonsdiagrammer for de respektive hele produkt-medier. Mer presist kan dette uttrykkes slik at når prosent refleksjon for for-tynnede prøver (1:200 vandig fortynning) av hele produktmediene med godt utbytte (slik som angitt i de følgende eksempler) oppnådd med de nye stammer i henhold til oppfinnelsen, måles ved spesielle bølgelengder (460, 540, 560 og 660 mu) og prosent refleksjon ved disse spesielle bølgelengder innføres i formelen får man et bestemt mønster. Hver av disse fire stammer fra Klasse I, IE-1352, IE-1354, IE-1355 og IE-2803 gir en positiv ^R-verdi (større enn 0) , mens hver av de representative stammer som er kjent fra tidligere, gir en negativ ^R-verdi (mindre enn 0). Bokstaven R betegner refleksjonsverdien ved en spesiell bølge-lengde, f.eks. er R^^q refleksjonsverdien ved en bølgelengde på 560 mu.

Klasse II av de nye mutantstammer representert ved stammene nr. IE-2322 og IE-2750, kan adskilles fra de to grupper av tidligere kjente stammer ved at farverefleksjonsområdet (color reflectance scan) for en 1:200 vandig fortynning av hele produkt-mediet, utført under de samme spektrofotometriske betingelser og med det samme apparat som kurvene for de fire andre stammer, har den egenskap at når prosent refleksjon avsettes lineært på et diagram mot bølgelengden, vil den resulterende kurve mellom 460

og 530 mu ha ett infleksjonspunkt, og den vil ha minst ett punkt med null helning, og den vil være konveks oppover på venstre side av infleksjonspunktet og konkav oppover på høyre side av infleksjonspunktet. Den resulterende kurve for en representativ stamme IE-2322, som vist på fig. 14, oppviser f.eks. et maksimum mellom 460 og 520 mu (ved omtrentlig 500 mu), og dette maksimum er et punkt med null helning; den oppviser et infleksjonspunkt ved omtrentlig 510 mu; og den oppviser et minimum ved omtrentlig 520 mu, og dette minimum er et punkt med null helning. Stammene av denne klasse produserer 7-klor-6-demetyltetracyklin med en faktisk utelukkelse av 6-demetyl-tetracyklin.

Fig. 1 til 16 er spektrofotometriske refleksjonskurver for én-centimeter glassceller fylt med en fortynnet prøve (1:200) av hele produkt-mediet erholdt fra fermenteringsmediet av de nye mutantstammer som anvendes i henhold til oppfinnelsen, og de ti tidligere beskrevne kjente stammer angitt i tabell I. Den spektrofotometriske refleksjonskurve for et materiale utgjør en varig nedtegnelse som ikke krever at man oppbevarer en prøve. De enheter som kurven uttrykkes ved, er dessuten internasjonalt forstått og

anerkjent for måling av lys. På fig. 1 til 16 er bølgelengden for lys i millimikron avsatt som abscisse mot refleksjonen som ordinat. Bølgelengden for lys er anerkjent internasjonalt som den fundamen-tale standard for lengde som alle andre lengdestandarder refererer

til. Disse spektrofotometriske refleksjonskurver ble bestemt ved hjelp av et registrerende spektrofotometer kjent som General Electric Hardy Recording Spectrophotometer (General Electric Company, Schenectady, N.Y., USA) hvor prøven har en bakgrunn av magnesiumoksyd, idet referansestandarden er magnesiumoksyd uten forbindelsen som skal undersøkes. Kurvene nedtegnes på General Electric Co. Chart paper NP 62581.

På figurene er abscissen bølgelengden angitt i millimikron, mens ordinaten er prosent refleksjon. Refleksjonskurvene er oppnådd efter dyrkning av de følgende stammer av Streptomyces aureofaciens:

Når det gjelder den ovennevnte spektrofotometriske undersøkelse, skal det legges merke til at fortynning av hele produkt-mediet er nødvendig for å oppnå de angitte matematiske resultater. Hvis hele produkt-mediet anvendes ufortynnet, vil forskjellen i A.R-verdi mellom de nye og de tidligere kjente stammer ikke komme til syne. Det er bare når hele produkt-mediet fortynnes med vann i en grad av 1 del av hele produkt-mediet til 200 deler vann, at de spesielle resultater med en positiv AR-verdi for Klasse I av de nye stammer og en negativ AR-verdi for de tidligere kjente stammer fremkommer.

De nye mutantstammer av S. aureofaciens som anvendes ifølge oppfinnelsen som praktisk talt ikke produserer noe annet tetracyklin enn 7-klor-6-demetyltetracyklin, er i besittelse av de samme morfologiske egenskaper som de stammer som samtidig produserer 7-klor-tetracyklin, tetracyklin, 7-klor-6-demetyl-tetracyklin og 6-demetyltetracyklin, og de stammer som produserer 7-klor-6-demetyltetracyklin og en vesentlig mengde av 6-demetyltetracyklin,

og de skiller seg fra hverandre på samme generelle måte som disse tidligere kjente stammer skiller seg fra hverandre, slik som det er beskrevet i en rekke forskjellige publikasjoner. De følgende data vil tjene til å adskille ytterligere de her beskrevne nye mutantstammer av S. aureofaciens av Klasse i og II fra originalstammen A-377 som er tilgjengelig som NRRL 2209 og McCormick et al. stammen, ATCC nr. 12551 (S-604). Ved de følgende farve-observasjoner på

en rekke forskjellige medier er farveverdiene for stamme S-604

(ATCC 12551) tatt fra U.S. patent nr. 2.878.289.

For å illustrere de visuelle farvevariasjoner blant de

nye mutantstammer av S. aureofaciens som anvendes ifølge oppfinnelsen ble disse stammer dyrket på AP4 agar, og de følgende iakttagelser ble gjort.

3_ xx

Farveobservasijoner<:>S. aureofaciens: AP4 Agar: Seks dager inkubering ved 26,5°C

De typiske nye S. aureofaciens-stammer som anvendes i henhold til oppfinnelsen som her beskrevet, kunne skilles fra S. aureofaciens A-377 (NRRL 2209) ved observasjon av vekstegenskaper på forskjellige medier inkubert ved 26,5°C inntil modenhet.

( 1) GLYCEROL- AS PARAGIN- KJØTTEKSTRAKTAGAR

( 2) DEKSTRIN CZAPEK- DOX AGAR

( 3) AP4 AGAR ( som beskrevet ovenfor)

( 4) Q4 MAIS STØPEVÆSKE AGAR ( 5) ANDRE AGAR- MEDIER

( 6) MIKROSKOPISK UNDERSØKELSE

Mycelium- og sporemorfologi, som sett gjennom lysmikro-skopet, er tilsynelatende den samme for stammene IE-1352, IE-1354, IE-1355, IE-2322, 1E-2750 og IE-2803, som for stammene A-377 og

S-604. Diameterene for typisk mycelium og for sporer av de førstnevnte stammer synes imidlertid å være karakteristisk mindre enn for de sistnevnte. Alle stammer oppviser kontinuerlig, buktet, forgrenet mycelium med en leilighetsvis tendens for luft-hyfene til å utvikle kroker eller løkker eller til å tvinne seg til primitive løse spiraler, slik som det er typisk for arten S. aureofaciens.

Permenteringsbetingelsene er generelt de samme som for tidligere kjente metoder for fremstilling av klortetracyklin ved fermentering. Det vil si at fermenteringsmediet inneholder de vanlige assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter. Egnede næringsstoffer omfatter stivelse, dekstrose, rørsukker, glukose, melasse, soyabønnemel, melketørrstoffer, gjær, kjøttekstrakt, pepton, urinstoff, maisstøpevæske, bomullsfrømel, oppløselige stoffer fra destillasjonsrester fra brennerier, glyceridoljer, fiskemel og andre alminnelige stoffer. De uorganiske salter omfatter slike som kalsiumkarbonat, ammoniumsulfat, ammoniumklorid og salter av de forskjellige sporelementer så som mangan, kobolt, sink, kobber, jern og lignende.

De øvrige generelle betingelser for fermenteringen,

så som hydrogenionekonsentrasjon, temperatur, tid, luftnings-hastighet, fremstilling av podematerialet>sterilisering, podning og lignende, er alminnelige og kan være slik som de som anvendes for fremstilling av 7-klor-6-demetyltetracyklin som angitt i U.S. patent nr 2.878.289.

Utvinningen av 7-klor-6~demetyltetracyklinet fra fermenteringsvæsken utføres på vanlig måte og skal her ikke beskrives nærmere idet en rekke metoder for utvinning av dette produkt fra fermenteringsvæsker er publisert tidligere.

Oppfinnelsen skal i det følgende beskrives i detalj i forbindelse med det følgende eksempel.

EKSEMPEL

Det ble fremstilt et fermenteringsmedium som inneholdt de følgende bestanddeler:

Dette medium ble tilført i passende mengder til kolber inneholdende 3% (vol./vol. av mediet) smultolje og deretter sterilisert. Disse kolber ble deretter oppdelt i seksten omtrentlig like grupper. Hver gruppe ble deretter podet med et vegetativt podemateriale

fra én av de følgende stammer av S. aureofaciens.

S-604 (ATCC 12551)

S-1071 (ATCC 12552)

V-62 (ATCC 12553)

B-740 (ATCC 12554)

V-138

E-475

E-1311 ED-1723

ED-2047

ED-2314

IE-1352

IE-1354

IE-1355

IE-2322

IE-2803

IE-2750

Alle kolbene ble deretter inkubert på en roterende ryster med en 6,5 cm sirkelformig bevegelse med 185-200 omdr. pr. min. ved 25°C i 180 timer. Prøver ble tatt, fortynnet med 199 deler vann, og refleksjonskurvene ble bestemt som angitt ovenfor.

Resultatene er som angitt i fig. 1 til 16. Målingene av produkt-mediet er angitt i den følgende tabell i. Disse målinger ble utført ved anvendelse av de følgende metoder: Måling nr 1: Denne måling er basert på forskjellen i omdannelses-hastighet for 7-klor-6-demetyltetracyklin og 6-demetyltetracyklin til sine respektive anhydroformer ved en syrekatalysert reaksjon av første orden. Omdannelsesgraden til anhydroformen er avhengig . av tid, temperatur og syrestyrke, og omfatter en reaksjon som resulterer i en nedsatt absorpsjon ved 368 mu. og en økning i absorpsjon ved 440 mu.

Måling nr 2: Denne måling er basert på samme grunnprinsipp som måling nr 1, bortsett fra at i dette tilfelle behandles prøven med syre for å avbygge alle tilstedeværende tetracykliner til anhydroformen i det ene tilfelle og sammenlignes med en prøve behandlet med vann i det annet tilfelle.

Måling nr 3: Måleresultatene i denne spalte ble bestemt ved en vanlig papirkromatografimetode under anvendelse av systemet o,3 M natriumfosfat/n-butylacetat, som gir en R^ på 0,30 for 6-demetyl-tetracyklin. Tre lignende systemer, publisert i Journal of the AmericanChemical Society, Vol. 79, s. 4561-4563 (1957),

( McCormick et al.), er angitt i det følgende.

I tabell I er prosent 6-demetyltetracyklin (spalte 4) for de første fire stammer (S-604, S-1071, v-62 og B-740) bestemt ved å finne mengden av 6-demetyltetracyklin ved papir-kromatograf i (spalte 3) og dele dette tall med den totale mengde demetyltetracykliner funnet ved spektrofoto.metrisk undersøkelse (spalte 1) og ved kromatografisk analyse (spalte 3). Prosent 6-demetyltetracyklin (spalte 4) oppnådd ved resten av stammene, er bestemt ved å dele resultatet fra den kromatografiske analyse (spalte 3) med resultatet fra den spektrofotometriske analyse av den totale mengde tetracykliner (spalte 2).

Claims

F remgangsmåte for fremstilling av 7-klor-6-demetyl-tetracyklin ved dyrkning av en stamme av Streptomyces aureofaciens som prpduserer 7-klor-6-demetyltetracyklin under neddykkede, aerobe betingelser i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder for karbon, nitrogen og uorganiske salter, karakterisert ved at det anvendes en 7-klor-6-

demetyltetracyklinproduserende stamme av Streptomyces aureofaciens som produserer 7-klor-6-demetyltetracyklin selektivt og har evnen til å bevirke at en 1:200 vandig fortynning av hele produkt-mediet får en farve som kjennetegnes ved enten

(a) en lineært avsatt refleksjonskurve hvor verdiene for prosent refleksjon ved 460, 540, 560 og 660 mu gir en positiv verdi for ^R, når de settes inn i formelen:

eller (b) en refleksjonskurve som er slik at når prosent refleksjon avsettes lineært mot bølgelengden, vil den resulterende kurve mellom 460 og 530 ima ha ett infleksjonspunkt, og den vil ha minst ett punkt med ingen helning, og den vil være konveks oppover på venstre side av infleksjonspunktet, og den vil være konkav oppover på høyre side av infleksjonspunktet, idet hele produkt-mediet er det ubehandlede medium erholdt efter at en fermentering ved anvendelse av det følgende medium:

er utført til det punkt hvor biosyntese av det primære antibiotiske produkt i praktisk henseende er stoppet.