NL8901159A

NL8901159A - USE OF GONADOLIBERINE DERIVATIVES FOR THE PREPARATION OF TUMOR INHIBITORY PHARMACEUTICAL PREPARATIONS.

Info

Publication number: NL8901159A
Application number: NL8901159A
Authority: NL
Original assignee: Innofinance Altalanos Innovaci
Priority date: 1988-05-10
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1989-12-01
Also published as: BE1004932A3; LU87516A1; FI892275A; KR900017610A; FI892275A0; GB8910724D0; CH678013A5; GR890100315A; HU199694B; IT1229251B; GB2218335B; DE3915317A1; FR2631237A1; IT8920435A0; DK228289D0; SE8901660L; JPH0215097A; DK228289A; IL89998A0; GB2218335A

Description

NL 35950-Kp/vD „NL 35950-Kp / vD „

Toepassing van gonadoliberinederivaten voor de bereiding van tumor-remmende farmaceutische preparaten.Use of gonadoliberin derivatives for the preparation of tumor-inhibiting pharmaceutical preparations.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op de toepassing van gonadoliberinederivaten voor de bereiding van tumor-remmende farmaceutische preparaten.The present invention relates to the use of gonadoliberin derivatives for the preparation of tumor-inhibiting pharmaceutical preparations.

Meer in het bijzonder heeft de uitvinding betrek-5 king op de toepassing van gonadoliberinederivaten met de algemene formule (1),More particularly, the invention relates to the use of gonadoliberin derivatives of the general formula (1),

Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (1) waarin Χ3 een glycylgroep of een D-isomeer van een willekeu- 10 rige natuurlijke of synthetische aromatische D-ami- nozuurgroep voorstelt; X2 een L-aminozuurgroep met een C-^alkyl of L-fenyl- alanyl of L-tryptofylgroep is? X3 een L-aminozuurrest met een C3_4alkyl of C2„4alka- 15 noylamidezijketen voorstelt; terwijl X4 een glycylamide of Ci_4alkylamidegroep is, onder voorbehoud, dat X3 een groep is, die verschillend is van leucyl, wanneer X2 een tryptofylgroep is, terwijl X3 anders is dan een glycylgroep, 20 alsmede additiezouten, gevormd met farmaceutisch aanvaardbare zuren en (metaal)complexen ervan voor de behandeling van diverse benigne en maligne tumoren alsmede klinische condities, terwijl de uitvinding voorts betrekking heeft op de bereiding van dergelijke verbindingen-bevattende farmaceutische 25 preparaten.Glp-His-Trp-Ser-Tyr-X1-X2-X3-Pro-X4 (1) wherein Χ3 represents a glycyl group or a D isomer of any natural or synthetic aromatic D-amino acid group; X2 is an L-amino acid group with a C 1-6 alkyl or L-phenyl-alanyl or L-tryptophyl group? X3 represents an L-amino acid residue with a C3-4alkyl or C2-4alkanoylamide side chain; while X4 is a glycylamide or C 1-4 alkylamide group, provided that X3 is a group different from leucyl, when X2 is a tryptophyl group, while X3 is other than a glycyl group, as well as addition salts formed with pharmaceutically acceptable acids and (metal) complexes thereof for the treatment of various benign and malignant tumors as well as clinical conditions, the invention further relates to the preparation of such compound-containing pharmaceutical preparations.

Bekend is, dat gonadoliberine [andere in de literatuur gebruikte benamingen zijn; gonadotropine-vrijmakend hormoon (GnRH), luteiniserend en follicle-stimulerend hormoon-vrijmakend hormoon (LH/FSH-RH) ] en de agoniste derivaten er-30 van de vrijmaking van het luteiniserende hormoon (LH) en follicle-stimulerend hormoon (FSH) uit de hypofyse stimuleren en tengevolge van deze werking gonadoliberine het basispatroon van de reproductiecyclus reguleert.Gonadoliberin [is known to be other designations used in the literature; gonadotropin-releasing hormone (GnRH), luteinizing and follicle-stimulating hormone-releasing hormone (LH / FSH-RH)] and the agonist derivatives er-30 of the release of the luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) from the pituitary gland and as a result of this action gonadoliberin regulates the basic pattern of the reproduction cycle.

De regulering van de reproductiefuncties is een 35 zeer ingewikkeld systeem, beïnvloed door een aantal diverse 8901 159 ? t - 2 - 0 factoren via de hypothalamo-pituitary-gonadale as. In deze ingewikkelde regulering speelt gonadoliberine een centrale rol, aangezien praktisch elk van de regulerende parameters hetzij de synthese, hetzij de vrijmaking van GnRH uit de 5 hypothalamus beïnvloedt, of zijn werking op de hypofyse.The regulation of the reproduction functions is a very complex system, influenced by a number of diverse 8901 159? t - 2 - 0 factors via the hypothalamo-pituitary-gonadal axis. Gonadoliberin plays a central role in this complex regulation, since practically each of the regulatory parameters influences either the synthesis or release of GnRH from the hypothalamus, or its action on the pituitary gland.

Gonodotropinen (LH en FSH) reguleren de synthese van steroïdale hormonen in de gonads alsmede de rijpingsprocessen van gameten en hun vrijmaking. Bij vrouwen bestaat de primaire functie van FSH uit de bevordering van de ontwikke-10 ling van follicles en de eicellen. Bij hypofysectomiseerde dieren induceert gezuiverde FSH een gewichtstoename van de ovaries en doet het aantal antrum follicles toenemen, terwijl geen ovulatie optreedt. De functie van LH is het reguleren van de steroidogenesis en het induceren van de ovulatie 15 en het daaropvolgende luteinisering. Steroidogenesis wordt in stand gehouden door het basische LH niveau, terwijl ovulatie en voortgezette meiosis van gameten worden geregeld door een preovulatoreLH-piek. Ofschoon algemeen wordt aangenomen, dat LH verantwoordelijk is voor het inleiden van 20 ovulatie neemt men voorts aan dat FSH eveneens nodig is voor het proces, waarbij de geconjugeerde effecten van beide hormonen beschouwd dienen te worden. De verschuiving in de LH/FSH verhouding speelt een regulerende rol in de sexuele cyclus en induceert karakteristieke fenotypische verande-25 ringen in de gonaden.Gonodotropins (LH and FSH) regulate the synthesis of steroidal hormones in the gonads as well as gamete maturation processes and their release. In women, the primary function of FSH is to promote the development of follicles and the eggs. In hypophysectomized animals, purified FSH induces ovarian weight gain and increases the number of antrum follicles without ovulation. The function of LH is to regulate steroidogenesis and to induce ovulation and subsequent luteinization. Steroidogenesis is sustained by the basic LH level, while ovulation and continued meiosis of gametes are controlled by a preovulatory LH peak. Furthermore, although it is generally believed that LH is responsible for initiating ovulation, it is further believed that FSH is also necessary for the process whereby the conjugated effects of both hormones are to be considered. The shift in the LH / FSH ratio plays a regulating role in the sexual cycle and induces characteristic phenotypic changes in the gonads.

De vrijmaking van gonadotropinen verloopt in twee fasen. In de basale toestand is de vrijmaking continu, heeft een pulserend karakter en reguleert de basale functies van de sexuele organen. Ovulatie vereist echter hoge gonadotro-30 pinenconcentraties met een korte duur en is bekend als de preovulatiepiek van gonadotropinen.The release of gonadotropins proceeds in two stages. In the basal state, the release is continuous, pulsating and regulates the basic functions of the sexual organs. However, ovulation requires high gonadotropin-30 pin concentrations with a short duration and is known as the preovulation peak of gonadotropins.

GnRH werd lang beschouwd als een niet-species-specifiek hormoon totdat het in het begin van de tachtiger jaren bekend was geworden, dat de structuur van de gonado-35 liberine van bepaalde vis- en vogelsoorten structureel verschillend was van die van de zoogdieren [J.A. King and R.P. Millar: J. Biol. Chem. 257, 10722 (1982); N.Sherwood et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2794 (1983)]. Deze verschil- 89 0115 9.GnRH has long been considered a non-species-specific hormone until it became known in the early 1980s that the structure of the gonado-liberine of certain fish and bird species was structurally different from that of the mammals [J.A. King and R.P. Millar: J. Biol. Chem. 257, 10722 (1982); N. Sherwood et al .: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 2794 (1983)]. This difference 89 0115 9.

- 3 - len manifesteren zich in de aminozuren op de plaatsen 7 en/of 8 van GnRH.- 3 - are manifested in the amino acids at positions 7 and / or 8 of GnRH.

Er zijn nieuwe GnRH analogen, afgeleid van vis- of vogel-specifiek GnRH analogen ontwikkeld en voor het inlei-5 den van de ovulatie en folliculogenesis bij diverse species van vis en zoogdieren gebruikt [Hongaars octrooischrift nr. 190.207; Amerikaans octrooischrift nr. 4.647.553).New GnRH analogs derived from fish or bird specific GnRH analogs have been developed and used to initiate ovulation and folliculogenesis in various species of fish and mammals [Hungarian Patent No. 190,207; U.S. Patent No. 4,647,553).

Twee van deze analogen [(D-Phe8, Gin®)-GnRH en (D-Phe6, Gln8,desGly10)-GnRH-ethylamide)] bleken in het bij-10 zonder krachtig te zijn bij het stimuleren van de reproductief uncties bij vissen. Onder gebruikmaking van deze twee peptiden kon de geïnduceerde kunstmatige propagatie bij vissen bereikt worden, die vroeger niet kunstmatig konden worden vermenigvuldigd. Dezelfde analogen bleken ook in staat folli-15 culogenesis te induceren alsmede ovulatie bij vissen buiten de rijtijd van (Hongaars octrooischrift nr. 189.394 en het Amerikaanse octrooischrift nr. 4.647.552).Two of these analogs [(D-Phe8, Gin®) -GnRH and (D-Phe6, Gln8, desGly10) -GnRH-ethylamide)] were found to be -10 without being potent in stimulating reproductive function in fish . Using these two peptides, the induced artificial propagation in fish could be achieved, which previously could not be artificially propagated. The same analogs have also been shown to be able to induce folli-15 culogenesis as well as ovulation in fish outside the driving time of (Hungarian Patent No. 189,394 and U.S. Patent No. 4,647,552).

Tengevolge van hun sterke folliculogene werking werd het effect van deze analogen bij diverse dieren onder-20 zocht. Ze waren in staat folliculogenesis en ovulatie te induceren zelfs bij sexueel onrijpe dieren teneinde fysiologische anestrus te overwinnen, verstoringen in spermatogenesis te genezen en andere sexuele afwijkingen bij diverse dieren te behandelen. Het gebruik voor de behandeling van dieren is 25 nader beschreven in het Hongaarse octrooischrift nr. 194.913 en het Amerikaanse octrooischrift nr. 4.753.928.Due to their strong folliculogenic activity, the effect of these analogs has been investigated in various animals. They were able to induce folliculogenesis and ovulation even in sexually immature animals to overcome physiological anestrus, heal spermatogenesis disturbances and treat other sexual abnormalities in various animals. The uses for treating animals are described in more detail in Hungarian Patent No. 194,913 and U.S. Patent No. 4,753,928.

De mogelijkheid van een bijzonder werkingsmechanisme en een direkt gonadale werking werd geopperd door het feit, dat deze nieuwe GnRH-analogen folliculaire rijping en 30 ovulatie hebben geïnduceerd in die gevallen, waar de GnRH-analogen van dieren onwerkzaam waren.The possibility of a particular mode of action and direct gonadal action has been suggested by the fact that these new GnRH analogs have induced follicular maturation and ovulation in those cases where animal GnRH analogs were ineffective.

De aanwezigheid van GnRH-achtige factoren en GnRH receptoren in de gonaden en de ovarium is in de laatste jaren ruim gedocumenteerd en men heeft voorgesteld, dat zij 35 een paracrine systeem kunnen vormen [for review see: A.J.W. Hsueh and J.M. Schaeffer: J. Steroid Biochem. 23, 757 (1985)].The presence of GnRH-like factors and GnRH receptors in the gonads and ovaries has been widely documented in recent years and has been proposed to form a paracrine system [for review see: A.J.W. Hsueh and J.M. Schaeffer: J. Steroid Biochem. 23, 757 (1985)].

Recentelijk werd de toepassing van zeer actieve 89 Of 15 9.' . - 4 -Recently, the application of very active 89 Or 15 9. ' . - 4 -

GnRH-analogen voor de behandeling van diverse hormoongevoe-lige tumoren algemeen geaccepteerd, terwijl de resultaten veelbelovend zijn. De toepassing van superactieve GnRH-analogen strekt zich uit tot het gebied van zowel de benigne 5 als maligne neoplasmen en omvat de prostaat- en borstkanker, chondrosarcomas en osteosarcomas, pancreaskanker, pituitaire tumoren, ovariumkanker en neoplasmen van het vrouwelijke genitale kanaal alsmede andere hormoon-afhankelijke tumoren. Wat betreft het werkingsmechanisme van deze superactieve 10 GnRH-analogen is het bekend, dat een enkelvoudige acute toediening van deze stoffen een aanzienlijke en langdurige vrijmaking van LH en FSH induceert, terwijl een chronische behandeling spectaculaire remmende werking vertoont via een proces van "onder-regulatie" van pituitairmembraanreceptoren 15 voor GnRH, desensibilisering van de pituaire gonadotropen en vermindering in gonadale receptoren voor LH en FSH. Zo leiden herhaalde toedieningen van GnRH agonisten tot een belangrijke afname in LH en FSH concentraties in de circulatie, terwijl de concentratie aan estrogeen, progesteron en testo-20 steron daalt tot castratieniveaus. Deze castratie-achtige sexuele steroïdafname en het elimineren van de stimulatore effecten van estrogeen en testosteron vormen de basis voor de toepassing van superactieve GnRH-analogen bij de behandeling van hormoon-afhankelijke tumoren. Op het ogenblik is er 25 geen GnRH agonist bekend, die een antitumoractiviteit langs een ander werkingsmechanisme uitoefent.GnRH analogues for the treatment of various hormone sensitive tumors are widely accepted, while the results are promising. The use of superactive GnRH analogues extends to the area of both benign 5 and malignant neoplasms and includes prostate and breast cancer, chondrosarcomas and osteosarcomas, pancreatic cancer, pituitary tumors, ovarian cancer and neoplasms of the female genital tract as well as other hormones. dependent tumors. Regarding the mechanism of action of these superactive GnRH analogues, a single acute administration of these substances is known to induce significant and long-lasting release of LH and FSH, while chronic treatment exhibits spectacular inhibitory action through a process of "under-regulation" of pituitary membrane receptors for GnRH, desensitization of the pituitary gonadotropes and reduction in gonadal receptors for LH and FSH. For example, repeated administrations of GnRH agonists lead to a significant decrease in LH and FSH concentrations in the circulation, while the concentration of estrogen, progesterone and testo-20 sterone decreases to castration levels. This castration-like sexual steroid decrease and the elimination of the stimulatory effects of estrogen and testosterone form the basis for the application of superactive GnRH analogues in the treatment of hormone-dependent tumors. Currently, no GnRH agonist is known to exert anti-tumor activity through any other mechanism of action.

Het doel van de onderhavige uitvinding is de toepassing van de GnRH analogen met de algemene formule (1) voor het genezen van hormoon-afhankelijke tumoren zonder het 30 induceren van een volledige hormonale castratie.The object of the present invention is the use of the GnRH analogs of the general formula (1) for curing hormone-dependent tumors without inducing complete hormonal castration.

De uitvinding is gebaseerd op de erkenning, dat het bovengenoemde doel bereikt kan worden, d.w.z. dat de groei van hormoon-afhankelijke tumoren geremd kan worden door gebruikmaking van de verbindingen met de algemene formule 35 (1). Deze erkenning is verrassend, aangezien alle GnRH-analogen, die tot nu toe uit de literatuur bekend zijn en die een antitumorwerking hebben bijzonder actief zijn, d.w.z. 50-200 keer actiever dan het natuurlijke hormoon en zijn werking 89 0115 9.The invention is based on the recognition that the above object can be achieved, i.e. that the growth of hormone-dependent tumors can be inhibited using the compounds of the general formula (1). This recognition is surprising, since all GnRH analogues known so far from the literature and having anti-tumor activity are particularly active, i.e. 50-200 times more active than the natural hormone and its activity 89 0115 9.

- 5 - * uitoefent via desensibilisering [M.A. Eisenberger et al.: J.- 5 - * exercises through desensitization [M.A. Eisenberger et al .: J.

Clin. Oncology 4, 414 (1986); J. Waxman: British Medical Journal 295, 1084 (1987)]. Het desensibilisatiefenomeen, geïnduceerd door superactieve zoogdier GnRH-analogen werd gron-5 dig onderzocht zowel in vitro als in vivo experimenten. Vastgesteld is, dat de gonadotropinecellen van de hypofyse gede-sensibiliseerd waren zelfs door een enkelvoudige hogere dosering superactieve zoogdier GnRH-analogen tegen de LH- of FSH-vrijmakende werkingen van de daaropvolgende GnRH pulsen; ter-10 wijl dit effect optreedt aan de ene kant door de internalisa-tie van de hormoon-receptorcomplex, d.w.z. door de penetratie in het inwendige deel van de cellen en aan de andere kant door een effect, dat de biosynthese of secretie, respectievelijk van de gonadotropinen remt [Kéri et al.: Mol. Cell.Clin. Oncology 4,414 (1986); J. Waxman: British Medical Journal 295, 1084 (1987)]. The desensitization phenomenon induced by superactive mammalian GnRH analogs has been thoroughly investigated both in vitro and in vivo experiments. It has been determined that the pituitary gonadotropin cells were de-sensitized even by a single higher dose of superactive mammalian GnRH analogs against the LH or FSH-releasing actions of the subsequent GnRH pulses; while this effect occurs on the one hand by the internalization of the hormone-receptor complex, ie by the penetration into the internal part of the cells and on the other by an effect that the biosynthesis or secretion, respectively, of inhibits gonadotropins [Kéri et al .: Mol. Cell.

15 Endocrinol. 30, 109 (1983)]. Tegelijkertijd induceren de hoge LH en FSH pulsen na de toediening van de superactieve zoogdier GnRH-analoog eveneens een desensibilisering op het niveau van de gonades tegen de volgende LH en FSH pulsen, die ook ontwikkeld worden als een consequentie van een receptor-20 niveau en intracellulaire werking [J. Waxman: The Releaser 1, 7 (1986)]. Dit dubbele desensibiliseringseffect leidt tot een significante afname in de secretie of biosynthese, respectievelijk van de gonadale steroïden, waarbij de steroidale hormoon-afhankelijke tumoren worden geremd of opgeheven.15 Endocrinol. 30, 109 (1983)]. At the same time, the high LH and FSH pulses after the administration of the superactive mammalian GnRH analog also induce gonad level desensitization against the following LH and FSH pulses, which are also developed as a consequence of a receptor-20 level and intracellular operation [J. Waxman: The Releaser 1, 7 (1986)]. This double desensitization effect leads to a significant decrease in the secretion or biosynthesis of the gonadal steroids, respectively, in which the steroidal hormone-dependent tumors are inhibited or eliminated.

25 Aangezien de aanwezigheid van steroïden een onontbeerlijke noodzakelijkheid is voor de overleving van de tumorcellen van hormoon-afhankelijke tumoren in het competitieve milieu hebben de chirurgische of respectievelijk hormonale desen-sibiliseringscastratie een beslissend therapeutisch belang 30 bij de behandeling van dergelijke tumoren ondanks de nadelige bijwerkingen van de castratiesymptomen. Behandelingen, uitgevoerd met de bekende superactieve zoogdier GnRH-analogen leidden tot de verlaging van de hoeveelheid estradiol, progesteron en andere sexuele steroïden tot het castratie-35 niveau, waarbij remming van de ovariumfunctie en follicle atresia plaatsvond, hetgeen duidelijk kon worden vastgesteld op het histologische plaatje van het ovarium.Since the presence of steroids is an indispensable necessity for the survival of the tumor cells of hormone-dependent tumors in the competitive environment, the surgical or hormonal desibilization concentration has a decisive therapeutic interest in the treatment of such tumors despite the adverse side effects of the castration symptoms. Treatments performed with the known superactive mammalian GnRH analogs led to a reduction in the amount of estradiol, progesterone and other sexual steroids to the castration level, with inhibition of ovarian function and follicle atresia taking place, which could be clearly identified by the histological picture of the ovary.

In het geval dat de farmaceutische preparaten, 8901159.In the event that the pharmaceutical preparations, 8901159.

VV

* - 6 - zoals volgens de onderhavige uitvinding toegepast, zijn de werkzame bestanddelen kippe-GnRH analogen respectievelijk zalm-GnRH analogen, of hun derivaten, die voor zoogdieren niet superactief zijn en derhalve hun werkingsmechanisme 5 niet op desensibilisering is gebaseerd. In het verloop van onderzoekingen, die zijn uitgevoerd op een pituitaire cel-kweek in vitro is gebleken, dat de kippe-GnRH of zalm-GnRH analogen zich niet als superactieve analogen in een ratte-pituitaire celkweek gedragen en dus geen desensibiliserings 10 effect hebben in het overeenkomstige doseringsgebied. Aan de andere kant een nieuw werkingsmechanisme, aangetoond op zoogdieren door de kippe-GnRH respectievelijk zalm-GnRH analogen door ons toegepast hebben aangeduid door het feit, dat jonge dieren door deze analogen gestimuleerd konden worden tot 15 sexuele rijping, of dat oligospermische dieren gestimuleerd konden worden tot het fysiologische niveau onder zoölogische tuinomstandigheden. Tengevolge van de desensibiliserings-fenomenen kon dit niet worden bereikt onder gebruikmaking van superactieve zoogdier GnRH-analogen (zie het Hongaarse 20 octrooischrift nr. 194.913).As used in the present invention, the active ingredients are chicken GnRH analogs or salmon GnRH analogs, or their derivatives, which are not superactive in mammals and therefore their mode of action is not based on desensitization. In the course of studies conducted on in vitro pituitary cell culture, it has been found that the chicken GnRH or salmon GnRH analogs do not behave as superactive analogs in a rat pituitary cell culture and thus have no desensitizing effect in the corresponding dosage range. On the other hand, a novel mode of action demonstrated on mammals by the chicken GnRH and salmon GnRH analogues employed by us has indicated that juvenile animals could be stimulated to sexual maturation by these analogs, or that oligospermic animals could be stimulated. to the physiological level under zoological garden conditions. Due to the desensitization phenomena, this could not be achieved using superactive mammalian GnRH analogs (see Hungarian Patent No. 194,913).

Rekeninghoudend met al die bovengenoemde factoren en op basis van het bekende werkingsmechanisme van de zoogdier superactieve GnRH-analogen in het geval van hormoon-af-hankelijke tumoren is de niet-desensibiliserende eigenschap 25 van de antitumoractiviteit, uitgeoefend op zoogdieren door de kippe-GnRH respectievelijk zalm-GnRH analogen, gebruikt als actieve bestanddelen in het proces volgens de uitvinding onverwacht en nieuw is. Ofschoon deze preparaten de estra-diolspiegel verlagen (van 85 pmol/1 - 34 pmol/1 in een dose-30 ring, die effectief is uit het oogpunt van antitumoractiviteit wordt de progesteronspiegel niet alleen verlaagd doch zelfs aanzienlijk gestimuleerd (van 19 pmol/1 - 38 pmol/1), terwijl de progestronspiegel verlaagd wordt tot de castra-tiespiegel (10 pmol/1) door Zoladex [(DSer/BuV/ AzGly10)-35 GnRH]. Het is zelfs belangrijker, dat na een langdurige behandeling met superactieve zoogdier GnRH-analogen, het histologische beeld van de ovarium remming van de ovarium-functie en folliculaire atresia te zien geeft, terwijl een 6901159.Taking into account all of the above factors and based on the known mechanism of action of the mammalian superactive GnRH analogs in the case of hormone-dependent tumors, the non-desensitizing property of the anti-tumor activity is exerted on mammals by the chicken GnRH, respectively. salmon GnRH analogs, used as active ingredients in the process of the invention is unexpected and new. Although these preparations lower the estradiol level (from 85 pmol / 1 - 34 pmol / 1 in a dosage, which is effective from the point of view of anti-tumor activity, the progesterone level is not only lowered but even significantly stimulated (from 19 pmol / 1 - 38 pmol / 1), while the progestron level is lowered to the castration level (10 pmol / 1) by Zoladex [(DSer / BuV / AzGly10) -35 GnRH]. It is even more important that after long-term treatment with superactive mammalian GnRH analogues, showing the histological picture of the ovarian inhibition of ovarian function and follicular atresia, while a 6901159.

- 7 - · « efficiënte dosering van de kippe- respectievelijk de zalm GnRH-analoog niet resulteert in een remming van het his-tologische beeld van het ovarium maar leidt tot de ontwikkeling van follicles, terwijl gele lichamen kunnen worden 5 waargenomen. Dit effect kan niet worden verklaard op grond van onze huidige kennis maar het is in elk geval gebaseerd op een nieuw werkingsmechanisme.Efficient dosing of the chicken or salmon GnRH analog does not inhibit the historical image of the ovary, but leads to the development of follicles, while yellow bodies can be observed. This effect cannot be explained by our current knowledge, but it is in any case based on a new mechanism of action.

De bereiding van de verbindingen met de algemene formule 1 is bekend [zie Amerikaans octrooischrift nr.The preparation of the compounds of the general formula I is known [see US patent no.

10 4.410.514; Horvdth et al.: BBRC 138. 419 (1986)].4,410,514; Horvdth et al .: BBRC 138, 419 (1986)].

De uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor de bereiding van farmaceutische preparaten, die geschikt zijn voor de behandeling van hormoon-afhanke-lijke tumoren. Volgens de werkwijze van de uitvinding wordt 15 een GnRH-analoog met de algemene formule 1 of een zout of een metaalcomplex ervan, bereid op een op zichzelf bekende wijze, gemengd met dragers en/of toevoegsels, die gewoonlijk in de farmaceutische industrie worden gebruikt en vervolgens omgezet in een farmaceutisch preparaat, dat geen hormonale 20 castratie induceert.The invention therefore relates to a process for the preparation of pharmaceutical preparations suitable for the treatment of hormone-dependent tumors. According to the method of the invention, a GnRH analog of the general formula 1 or a salt or a metal complex thereof, prepared in a manner known per se, is mixed with carriers and / or additives commonly used in the pharmaceutical industry and then converted into a pharmaceutical preparation, which does not induce hormonal castration.

Voorts heeft de uitvinding betrekking op het gebruik van de verbindingen met de algemene formule 1 of hun zouten of metaalcomplexen voor de behandeling van tumoren en clinische condities.Furthermore, the invention relates to the use of the compounds of the general formula 1 or their salts or metal complexes for the treatment of tumors and clinical conditions.

25 De verbindingen met de algemene formule 1 worden bij voorkeur gebruikt in de vorm van farmaceutische preparaten, bijv. in de vorm van een oplossing, poeder, injectie of in een vertraagde afgiftevorm. Deze preparaten kunnen intra-musculair, subcutaan, intraperitoneaal of intraveneus worden 30 toegediend.The compounds of the general formula 1 are preferably used in the form of pharmaceutical preparations, eg in the form of a solution, powder, injection or in a delayed release form. These preparations can be administered intramuscularly, subcutaneously, intraperitoneally or intravenously.

De farmaceutische preparaten volgens de uitvinding worden gemakshalve gebruikt in een dagelijkse dosering van 0,5 - 5000 /ug/kg, bij voorkeur in een dosering van 1 - 500 /ug/kg en liefst in een hoeveelheid van 5-150 /ug/kg 35 lichaamsgewicht. Het is geschikt tenminste 8 uur tussenpozen te hebben tussen de herhaalde behandelingen. De toediening wordt gemakshalve voortgezet totdat de groei van de tumorstop en een verbetering wordt bereikt.The pharmaceutical preparations according to the invention are conveniently used in a daily dose of 0.5-5000 µg / kg, preferably in a dose of 1-500 µg / kg and most preferably in an amount of 5-150 µg / kg 35 body weight. It is appropriate to have at least 8 hours intervals between repeated treatments. The administration is conveniently continued until the growth of the tumor stop and an improvement is achieved.

8901159.8901159.

* - 8 -* - 8 -

Het farmaceutische preparaat, bereid door toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding, remt de tumor-groei door remming van de celdeling (mitosis) in hormoon-afhankelijke tumoren. Waarschijnlijk wordt dit effect ten 5 dele bereikt door stimulering van de specifieke differen-tiëringsfuncties van deze hormoon-gevoelige tumorcellen.The pharmaceutical preparation, prepared using the method of the invention, inhibits tumor growth by inhibiting cell division (mitosis) in hormone-dependent tumors. This effect is probably partly achieved by stimulation of the specific differentiation functions of these hormone-sensitive tumor cells.

De belangrijkste voordelen van de werkwijze volgens de uitvinding kunnen als volgt worden samengevat: a) De groei van zowel benigne als maligne tumoren 10 kan geremd worden en verdwijning van het tumor kan worden bereikt.The main advantages of the method according to the invention can be summarized as follows: a) The growth of both benign and malignant tumors can be inhibited and tumor disappearance can be achieved.

b) De werkwijze volgens de uitvinding is geschikt om de tumorgroei te remmen zonder volledig verlies van sex-steroïden uit de bloedcirculatie, d.w.z. zonder het indu- 15 ceren van "hormonale castratie". Dit betekent, dat de behandeling niet wordt begeleid door de nadelige fysiologische en fysiologische effecten van hormonale castratie.b) The method of the invention is suitable for inhibiting tumor growth without complete loss of sex steroids from the circulation, ie without inducing "hormonal castration". This means that the treatment is not accompanied by the adverse physiological and physiological effects of hormonal castration.

c) De GnRH-analogen, die in het proces worden gebruikt, oefenen hun antitumorwerking uit langs een werkings- 20 mechanisme, dat verschillend is van dat van de tot nu toe gebruikte superactieve GnRH-analogen. Dit betekent, dat de werkwijze kan hetzij alleen hetzij als een alternatieve therapie worden gebruikt.c) The GnRH analogs used in the process exert their anti-tumor activity through a mechanism of action different from that of the superactive GnRH analogs used hitherto. This means that the method can be used either alone or as an alternative therapy.

d) In het geval van borstkanker en gonadale tumo- 25 ren wordt de remming van de tumorgroei mogelijk zonder enige afname in het ovariumgewicht en remming van de folliculaire rijping, e) In tegenstelling tot een behandeling met superactieve zoogdier GnRH-analogen, doet de geclaimde werkwijze 30 de libido en spermatogenises niet afnemen.d) In the case of breast cancer and gonadal tumors, inhibition of tumor growth becomes possible without any decrease in ovarian weight and inhibition of follicular maturation, e) In contrast to treatment with superactive mammalian GnRH analogues, the claimed method 30 does not decrease the libido and spermatogenises.

f) De tumorgroei wordt verlaagd zelfs in gevallen waar de tumorcellen steroidereceptor negatief zijn, hetgeen betekent, dat door gebruikmaking van de volgens de onderhavige werkwijze bereide preparaten borstkanker en gonadale 35 tumoren in een veel ruimere wijze kunnen worden behandeld dan door gebruikmaking van de tot nu toe bekende preparaten; er kunnen ook steroïde-negatieve tumoren, die in de meeste gevallen meer aggressief zijn, worden behandeld.f) Tumor growth is reduced even in cases where the tumor cell steroid receptor is negative, which means that using the preparations prepared according to the present method, breast cancer and gonadal tumors can be treated in a much broader manner than using the heretofore known preparations; steroid negative tumors, which are more aggressive in most cases, can also be treated.

89 01 15 9 .' * - 9 - ï g) De tumorgroei wordt geremd en de vermindering gestabiliseerd. Derhalve kan de geclaimde werkwijze worden gebruikt als aanvullende therapie te zamen met andere geneesmiddelen, zoals cis-platina [Pt(NH3>2CI2]t dat de mito-5 sis remt, doch gepaard gaat met toxische bijwerkingen.89 01 15 9. ' * - 9 - ï g) The tumor growth is inhibited and the reduction stabilized. Therefore, the claimed method can be used as adjunctive therapy in conjunction with other drugs, such as cis-platinum [Pt (NH3> 2CI2] t) that inhibits the mitos-5is, but is associated with toxic side effects.

De werkwijze volgens de uitvinding wordt nader geïllustreerd aan de hand van de volgende niet limitatieve Voorbeelden.The method according to the invention is further illustrated by the following non-limitative Examples.

VOORBEELD IEXAMPLE I

10 Toepassing tegen dimethylbenzanthraceen- (DMBA-) geïnduceerde borstkanker_ 15-20 weken oude vrouwtjes Sprague-Dawley ratten (elk met een gewicht van ca. 200 g) lijdend aan DMBA-geïndu-ceerde borsttumor werden intramusculair (i.m.) behandeld 2 15 keer per dag gedurende 3 weken met 10 /ug/dag van het (D-Phe6, Gln8,desGly10)GnRH-ethylamide-analoog. Het gewicht en karakteristieke afmetingen van de tumoren werden gemeten direkt vóór de behandeling en dan 1, 2 en 3 weken na de aanvang van de behandeling. 16 uur na de eindinspuiting werden 20 de dieren ovarium-ectomiseerd, terwijl de bloedmonsters voor hormoonbepalingen werden getrokken. De ovaria werden gewogen en voor histologie klaargemaakt.Use against dimethylbenanthanthene (DMBA) induced breast cancer. 15-20 week old female Sprague-Dawley rats (each weighing approx. 200 g) suffering from DMBA-induced breast tumor were treated intramuscularly (15) times. day for 3 weeks with 10 µg / day of the (D-Phe6, Gln8, desGly10) GnRH ethylamide analog. The weight and characteristic dimensions of the tumors were measured immediately before the treatment and then 1, 2 and 3 weeks after the start of the treatment. 16 hours after the final injection, 20 animals were ovarian ectomized while blood samples were taken for hormone determinations. The ovaries were weighed and prepared for histology.

De behandeling van vrouwtjesratten met (D-Phe6,-Gln8,-desGly10)GnRH-ethylamide leverde een tijds-afhankelijke 25 afname in de afmeting van de ovarium-afhankelijke borst-tumoren, geïnduceerd door DMBA. Aan het eind van de 3-weken behandelingsperiode nam het gemiddelde volume van de tumoren met 10% van hun oorspronkelijke volumen af. De afname in de tumorgrootte, teweeggebracht door (D-Phe6,Gin8,desGly10)GnRH-30 ethylamide bleek equivalent te zijn in snelheid en mate van vermindering met die welke werd waargenomen, 3 weken na chirurgische castratie, of ten opzichte van de verbetering, waargenomen bij dieren die dezelfde dosering [D-Ser(But)6.Treatment of female rats with (D-Phe6, -Gln8, -desGly10) GnRH-ethylamide resulted in a time-dependent decrease in the size of the ovarian-dependent breast tumors induced by DMBA. At the end of the 3-week treatment period, the mean volume of the tumors decreased by 10% from their original volumes. The decrease in tumor size induced by (D-Phe6, Gin8, desGly10) GnRH-30 ethylamide was found to be equivalent in rate and extent of reduction to that observed 3 weeks after surgical castration, or relative to the improvement, observed in animals receiving the same dose [D-Ser (But) 6.

Azgly10]-GnRH (IC 118630), een zoogdier GnRH agonist, ge-35 bruikt voor de behandeling van borstkanker in een ver gevorderd stadium.Azgly10] -GnRH (IC 118630), a mammalian GnRH agonist, used for the treatment of advanced breast cancer.

Evaluatie van de ovarium-histologie en sexsteroïd-hormoonspiegels bij dieren, behandeld met (D-Phe6,Gin8, 8901159.Evaluation of ovarian histology and sex steroid hormone levels in animals treated with (D-Phe6, Gin8, 8901159.

h * - 10 - desGly10)-GnRH-EA wees op een normale folliculaire rijping en ontwikkeling van corpora lutea alsmede op de continue handhaving van de ovariumfunctie. Ofschoon de concentratie van het circulerende estradiol afnam vergeleken met de in-5 tact zijnde onbehandelde controles bleek de mate van deze afname niet zo uitgesproken te zijn als in het geval van langs chirurgische weg gecastreerde dieren. De progesteron-spiegel en ovariumgewicht bleken niet af te nemen na behandeling met (D-Phe6,Gin8,desGly30)GnRH-ethylamide. In tegen-10 deel bleek ICI 118630 de folliculaire rijping significant te vertragen, de ovariumgewichten te verminderen en de plasma-concentraties van zowel estradiol en progesteron tot de cas-tratieniveaus te verlagen.h * - 10 - desGly10) -GnRH-EA indicated normal follicular maturation and development of corpora lutea as well as continuous maintenance of ovarian function. Although the concentration of circulating estradiol decreased compared to intact untreated controls, the extent of this decrease was found not to be as pronounced as in the case of surgically castrated animals. Progesterone level and ovarian weight did not appear to decrease after treatment with (D-Phe6, Gin8, desGly30) GnRH-ethylamide. In contrast, ICI 118630 has been found to significantly delay follicular maturation, reduce ovarian weights, and reduce plasma concentrations of both estradiol and progesterone to crest levels.

Uit de bovengenoemde gegevens blijkt dat (D-Phe6, 15 Gln8,desGly10)GnRH-ethylamide een effectief antitumormiddel is tegen borsttumoren, geïnduceerd door DMBA; dit antitumor-effect gaat niet gepaard met de volledige remming van de ovariumf unctie.The above data show that (D-Phe6, 15 Gln8, desGly10) GnRH-ethylamide is an effective anti-tumor agent against breast tumors induced by DMBA; this anti-tumor effect is not associated with the complete inhibition of the ovarian function.

VOORBEELD IIEXAMPLE II

20 Toepassing voor het remmen van celproliferatie in een cellijn van humane borstkanker_ MDA MB 231 humane tumorcellijn afkomstig van een humane borstcarcinoma is een wel-gedocumenteerde estrogeen-receptor negatieve cellijn. De cellen van deze cellijn wer-25 den gekweekt in een RPMI medium, aangevuld met 10% foetale kalfserum (FCS) (geproduceerd door GIBCO, Hoofddorp, Nederland), 24 uur na "plating" in een exponentiële groeifase werden de cellen behandeld met respectievelijk 5, 10 en 25 /ug/ml (D-Phe6,Gin8,desGly10)GnRH-ethylamide in aanwezigheid 30 van 1 /uCi 3H-thymidine. De cellen werden gedurende 24 uur geïncubeerd, waarna het medium werd verwijderd en de cellen twee keer werden gewassen met een fysiologische zoutoplossing, en vervolgens gebufferd door fosfaat en dan neergeslagen door toevoeging van 10% trichloorazijnzuur (TCA). Het 35 TCA-onoplosbare materiaal werd opgelost in geconcentreerd mierezuur, waarna de radio-activiteit werd bepaald in een scintillatieteller.Use for inhibiting cell proliferation in a human breast cancer cell line MDA MB 231 human tumor cell line from a human breast carcinoma is a well-documented estrogen receptor negative cell line. The cells of this cell line were grown in an RPMI medium supplemented with 10% fetal calf serum (FCS) (produced by GIBCO, Hoofddorp, The Netherlands), 24 hours after plating in an exponential growth phase, the cells were treated with respectively 5, 10 and 25 µg / ml (D-Phe6, Gin8, desGly10) GnRH-ethylamide in the presence of 1 µCi 3H-thymidine. The cells were incubated for 24 hours, after which the medium was removed and the cells were washed twice with physiological saline, then buffered with phosphate and then precipitated by addition of 10% trichloroacetic acid (TCA). The TCA insoluble material was dissolved in concentrated formic acid, after which the radioactivity was determined in a scintillation counter.

Het opnemen van 3H-thymidine in de zuuronoplosbare 89 01 15 9 .' - 11 - ' fractie van 106 cel/ml werd met 32% verlaagd onder gebruikmaking van 5 /ug peptide, met 65% onder gebruikmaking van 10 /ug peptide en met 71% onder gebruikmaking van 25 /ug peptide.Incorporation of 3 H-thymidine into the acid insoluble 89 01 15 9. -11- fraction of 106 cell / ml was reduced by 32% using 5 µg peptide, by 65% using 10 µg peptide and by 71% using 25 µg peptide.

5 Deze resultaten laten duidelijk zien, dat (D-Phe6,5 These results clearly show that (D-Phe6,

Gln8,desGly10)-GnRH-ethylamide de proliferatie van deze es-trogeen-onafhankelijke humane borsttumorcellen remmen.Gln8, desGly10) -GnRH-ethylamide inhibit the proliferation of these estrogen-independent human breast tumor cells.

VOORBEELD IIIEXAMPLE III

Toepassing voor het remmen van de cel-proliferatie 10 in een cellijn van humane borstkanker_Use for inhibiting cell proliferation in a human breast cancer cell line_

De cel-proliferatie remmende werking van respectievelijk (Gln8)-GnRH, (D-Phe6,Gin8)-GnRH, (D-Phe6,Gln8,-desGly1^)-GnRH-ethylamide en (Trp7,Leu8)-GnRH werd onderzocht aan een tumorcellijn, afkomstig van MDA-MB 231 humane borst-15 carcinoma volgens de in Voorbeeld II beschreven experimentele condities, behalve dat de incubatie gedurende 72 uur werd uitgevoerd.The cell proliferation inhibiting activity of (Gln8) -GnRH, (D-Phe6, Gin8) -GnRH, (D-Phe6, Gln8, -desGly1 ^) -GnRH-ethylamide and (Trp7, Leu8) -GnRH was investigated on a tumor cell line, derived from MDA-MB 231 human breast 15 carcinoma according to the experimental conditions described in Example II, except that the incubation was carried out for 72 hours.

Alle peptiden werden toegediend in een 10 /ug dosis. De mate van remming van het inbouwen van 3H-tymidine 20 volgens de bovengenoemde peptiden was als volgt: (Gin8)-GnRH 36% (D-Phe6,Gin8)-GnRH 60% (D-Phe6,Gin8,desGly10)-GnRH-EA 70% (Trp7,Leu8)-GnRH 38% 89 01 159.'All peptides were administered in a 10 µg dose. The degree of inhibition of the incorporation of 3H-tymidine 20 according to the above peptides was as follows: (Gin8) -GnRH 36% (D-Phe6, Gin8) -GnRH 60% (D-Phe6, Gin8, desGly10) -GnRH- EA 70% (Trp7, Leu8) -GnRH 38% 89 01 159. '

Claims

A process for the preparation of pharmaceutical preparations containing a gonadoliberin derivative of the general formula 1, Glp-His-Trp-Ser-Tyr-Xx-X2-X3-Pro-X4 (1) 5 in which Χχ is a glycyl group or a D- isomer of a natural or synthetic aromatic D-amino acid group; X2 is an L-amino acid group, which is a Cx-4alkyl or L-phenylalanyl or L-tryptophyl group? X3 is an L-amino acid residue having a C 1-4 alkyl or C 2-4 alkanoylamide side chain; while X4 is a glycylamide or C1-4alkylamide group with the proviso that X3 is a different group than leu-15 cyl, when X2 is a tryptophyl group and Χχ is different from a glycyl group, its addition salts formed with pharmaceutically acceptable acids or metal complexes, characterized in that the compound of the general formula 1, its acid addition salt or metal complex, prepared in the known manner, is mixed with carriers and / or additives commonly used in the pharmaceutical industry, after which they are converted into a pharmaceutical composition suitable for the treatment of hormone-dependent tumors without inducing any hormonal castration.

2. Process according to claim 1, characterized in that as a pharmaceutical preparation a dosage unit is prepared containing 0.0035 to 350 µg of a compound of the general formula 1, wherein Χχ, X2, X3 and X4 have meanings defined in claim 1.

Use of gonadoliberin derivatives of the general formula 1, wherein Χχ, X2, X3 and X4 have the meanings defined in claim 1 for the preparation of pharmaceutical preparations suitable for curing tumors and clinical conditions.

4. Application of gonadoliberin derivatives with 99 01 15 9. ' 13 - general formula 1, wherein Χχ, X2, X3 and X4 have the meanings defined in claim 1 for the treatment of tumors and clinical conditions. 89 01 159.