NL8801888A - Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere f1-hybridepopulatie van planten. - Google Patents
Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere f1-hybridepopulatie van planten. Download PDFInfo
- Publication number
- NL8801888A NL8801888A NL8801888A NL8801888A NL8801888A NL 8801888 A NL8801888 A NL 8801888A NL 8801888 A NL8801888 A NL 8801888A NL 8801888 A NL8801888 A NL 8801888A NL 8801888 A NL8801888 A NL 8801888A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- plants
- parent
- phytotoxic
- parent plants
- resistant
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 53
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 claims description 63
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 claims description 63
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 claims description 63
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 claims description 63
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 231100000208 phytotoxic Toxicity 0.000 claims description 40
- 230000000885 phytotoxic effect Effects 0.000 claims description 40
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 34
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 claims description 26
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 claims description 21
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 16
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 15
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 11
- 230000002363 herbicidal effect Effects 0.000 claims description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 7
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 6
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 4
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 3
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 78
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 24
- 230000010153 self-pollination Effects 0.000 description 24
- 241000208133 Nicotiana plumbaginifolia Species 0.000 description 13
- 230000010152 pollination Effects 0.000 description 11
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 10
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 10
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 10
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 5
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 description 4
- 241001573881 Corolla Species 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 4
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 244000291564 Allium cepa Species 0.000 description 3
- 235000002732 Allium cepa var. cepa Nutrition 0.000 description 3
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 3
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 241000219198 Brassica Species 0.000 description 2
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 description 2
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 2
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 230000012447 hatching Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 244000180534 Berberis hybrid Species 0.000 description 1
- 235000011331 Brassica Nutrition 0.000 description 1
- 239000005496 Chlorsulfuron Substances 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N D-Octopin Natural products OC(=O)C(C)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N IMXSCCDUAFEIOE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N D-octopine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H](C)[NH2+][C@H](C([O-])=O)CCCNC(N)=[NH2+] IMXSCCDUAFEIOE-RITPCOANSA-N 0.000 description 1
- 108010066133 D-octopine dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 1
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 description 1
- 241000208818 Helianthus Species 0.000 description 1
- 235000003222 Helianthus annuus Nutrition 0.000 description 1
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 1
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 241001632422 Radiola linoides Species 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 235000011684 Sorghum saccharatum Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- 241000187132 Streptomyces kanamyceticus Species 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108010006873 Threonine Dehydratase Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- KRWTWSSMURUMDE-UHFFFAOYSA-N [1-(2-methoxynaphthalen-1-yl)naphthalen-2-yl]-diphenylphosphane Chemical compound COC1=CC=C2C=CC=CC2=C1C(C1=CC=CC=C1C=C1)=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 KRWTWSSMURUMDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 229960004261 cefotaxime Drugs 0.000 description 1
- AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M cefotaxime sodium Chemical compound [Na+].N([C@@H]1C(N2C(=C(COC(C)=O)CS[C@@H]21)C([O-])=O)=O)C(=O)\C(=N/OC)C1=CSC(N)=N1 AZZMGZXNTDTSME-JUZDKLSSSA-M 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N chlorsulfuron Chemical compound COC1=NC(C)=NC(NC(=O)NS(=O)(=O)C=2C(=CC=CC=2)Cl)=N1 VJYIFXVZLXQVHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 244000038559 crop plants Species 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000010159 dioecy Effects 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000008124 floral development Effects 0.000 description 1
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 1
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- XVQUOJBERHHONY-UHFFFAOYSA-N isometheptene Chemical compound CNC(C)CCC=C(C)C XVQUOJBERHHONY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 108010083942 mannopine synthase Proteins 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000003375 plant hormone Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012021 retail method of payment Methods 0.000 description 1
- 238000005204 segregation Methods 0.000 description 1
- 230000008771 sex reversal Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8287—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for fertility modification, e.g. apomixis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H1/00—Processes for modifying genotypes ; Plants characterised by associated natural traits
- A01H1/04—Processes of selection involving genotypic or phenotypic markers; Methods of using phenotypic markers for selection
Description
*
S 6762-1 Ned P & C
%
Korte aanduiding: Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere F^-hybridepopulatie van planten.
De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een verbeterde werkwijze voor de produktie van hybridezaad. Meer in het bijzonder heeft hij betrekking op de toepassing van een tegen fytotoxische chemicaliën resistent gen in een mannelijke ouder bij een hybridisatieproces, gevolgd door 5 behandeling van de verkregen hybriden met het fytotoxische chemische middel om planten te elimineren, die afkomstig zijn van ongewenste verontreinigende zaden.
Voor de commerciële produktie van hybridezaad worden de mannelijke en vrouwelijke ouder in het algemeen in een alternerend patroon uitgezet 10 en zaad wordt slechts van de vrouwelijke ouder geoogst. Een belangrijk probleem tijdens de produktie van hybridezaad is het verzekeren, dat alle stuifmeel, waarmee de vrouwelijke ouder bevrucht wordt, afkomstig is van de mannelijke ouder. Zaad afkomstig van enige andere stuifmeelbron vormt een verontreiniging voor de populatie van hybridezaad. Potentiële bronnen 15 van verontreinigend stuifmeel zijn stuifmeel van de vrouwelijke ouder, dat zelfbestuiving veroorzaakt, of stuifmeel van een naburig veld.
Er zijn 6 manieren om vruchtbaar stuifmeel van de vrouwelijke ouder uit te schakelen (Simmonds, Principles of Crop Improvement, 1979): 1. mechanisch (bijv. tomaten): het met de hand emasculeren van de 20 vrouwelijke ouder, gevolgd door bestuiving; 2. tweehulzigheid ("dioecy") (bijv. spinazie) - verwijdering van de mannelijke plant van het genotype, waaruit zaad geoogst wordt, uit een gewas met afzonderlijke mannelijke en vrouwelijke ouders; 3. auto-onverenigbaarheid (bijv. brassicasoorten) - door elkaar plan-25 ten van twee met zichzelf onverenigbare, maar kruislings verenigbare ouders en oogsten van alle zaad, of toepassing van een met zichzelf onverenigbaar genotype als vrouwelijke ouder met een met zichzelf verenigbare stuifmeel-leverancier en oogsten van het zaad van uitsluitend de vrouwelijke ouder; 4. nucleaire mannelijke steriliteit (vele gewassen) - scheiding 30 van vrouwelijke ouder op mannelijke steriliteit (ms ms) en fertiliteit (Ms ms); verwijdeirng van mannelijke vruchtbare planten en bestuiving van mannelijke steriele planten met stuifmeel van de mannelijke ouder (Ms Ms); 5. cytoplasmische mannelijke steriliteit (bijv. uien) - toepassing 35 van mannelijke steriele lijnen als de vrouwelijke ouder en 6. chemicaliën: (a) mannelijke gametociden (bijv. tarwe) - besproeiing van vrouwe- ‘. 880 1 888 * - 2 - lijke ouders met een chemische stof, die mannelijke steriliteit veroorzaakt; (b) omkering van sexe (bijv. "curcurbits") - besproeiing van vrouwelijke ouders met plantehormonen om mannelijke bloemen om te zetten in vrouwelijke bloemen.
5 Er bestaan echter verscheidene problemen in verband met dergelijke benaderingen: (1) de fysische scheiding van de vrouwelijke en mannelijke ouders in afwisselende blokken in het veld maakt de doelmatige overdracht van stuifmeel van mannelijke naar vrouwelijke ouders niet gemakkelijk en kan 10 tot minder dan een maximale produktie van hybridezaad leiden.
(2) Geen van deze benaderingen kan de absolute uitschakeling van vruchtbaar stuifmeel van de vrouwelijke ouder (en derhalve zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder) garanderen. Er bestaan hierbij twee komponenten: (a) Er kunnen menselijke fouten optreden tijdens het emasculeren 15 met de hand en de verwijdering van mannelijke vruchtbare planten bij toepassing van tweehulzigheid en nucleaire mannelijke steriliteit. Voorts is de bij deze methoden betrokken arbeid zeer kostbaar.
(b) Wanneer men chemische sproeimiddelen toepast om de expressie van de sexe te regelen, is het moeilijk een gelijkmatige toepassing te 20 verkrijgen om produktie van stuifmeel bij vrouwelijke ouders geheel te voorkomen. Verder kan vaak instabiliteit optreden in kombinatie met de expressie van genen voor auto-onverenigbaarheid en mannelijke steriliteit.
Zo is bijv. bekend, dat verhoogde temperaturen of een hoge vochtigheidsgraad de auto-onverenigbaarheid verminderen, wat leidt tot een hoog 25 gehalte aan door zelfbestuiving ontstaan zaad, in het bijzonder bij brassica-soorten (Frankel en Galun,pollination Mechanisms, Reproduction and Plant Breeding (1977)). Dit heeft geleid tot het vrijkomen van een aantal "ruwe hybriden", die vele door zelfbestuiving verkregen planten bevatten (Simmonds). Herstel van de fertiliteit bij bepaalde mannelijke steriele 30 lijnen van uien heeft het oneconomisch gemaakt hybridezaad te produceren van overigens uitmuntende kruisingen (Grant, Onions, Plant Breeding in New Zealand (1983)).
3. Bij een poging contaminatie door vreemd stuifmeel van een naburig veld te omzeilen, worden blokken hybridezaad gekweekt in geïsoleerde bed-35 den. De aanbevolen isolatieafstanden lopen van gewas tot gewas uiteen, afhankelijk van zijn wijze van bestuiving en deze kunnen uiteenlopen van 200 m bij sorghum, mais en tarwe tot 6,4 km bij zonnebloemen (Wright,
Commercial Hybrid Seed Production, Hybridisation of Crop Plants (1980)).
Er worden pogingen gedaan alle bronnen van verontreinigend stuifmeel binnen deze afstanden te verwijderen.
.8801888 .........4 - 3 - *
Een oplossing voor het bovenstaande probleem (1) is voorgesteld in de Amerikaanse octrooischriften 4517763, 4658084 en 4658085 (alle op naam van Beversdorf c.s.).
Al deze voorstellen omvatten het vormen in dezelfde vrouwelijke 5 ouder van een kombinatie van cytoplasmisch geërfde mannelijke steriliteit en hetzij cytoplasmisch geërfde bestandheid tegen herbicide (4517763) of homozygositeit voor een dominant, nucleair overgeërfd, tegen herbicide resistent gen (4658084). Dit concept maakt het mogelijk de twee ouders willekeurig te mengen voor de produktie van hybridezaad, waardoor over-10 dracht van stuifmeel van de mannelijke naar de vrouwelijke ouder bevorderd wordt.
Als de vrouwelijke ouder mannelijk steriel en bestand tegen herbicide is en de mannelijke ouder mannelijk fertiel en gevoelig voor herbicide is, kan het uit dergelijke planten geproduceerde zaad tot twee types behoren: 15 (1) waar hybridezaad van de vrouwelijke ouder (bestand tegen herbi cide) ; en (2) niet-hybridezaad afkomstig van zelfbestuiving van de mannelijke ouder.
Het niet-hybridezaad afkomstig van zelfbestuiving van de mannelijke 20 ouder kan geëlimineerd worden door besproeien met het herbicide, hetzij na de bestuiving maar voor het oogsten van het zaad (waardoor de mannelijke ouder gedood wordt), hetzij na het uitzaaien van zaad van de massa-oogst (waardoor de niet-hybride zaailingen na ontkieming gedood worden).
Deze bron van niet-hybride zaad treedt niet op bij standaardproduktie van 25 hybridezaad, aangezien bij de standaardproduktie van hybridezaad de vrouwelijke en mannelijke ouders fysisch gescheiden zijn in afwisselende blokken in het veld en slechts zaad geoogst wordt van de vrouwelijke blokken. Derhalve vormt de produktie van een niet-hybride zaadkomponent een inherent deel van de genoemde octrooischriften, veroorzaakt door het gemengd zaaien 30 van de beide ouders.
Ook wordt in de Amerikaanse octrooischriften 4658084 en 4658085 de toepassing geclaimd van bestandheid tegen twee verschillende herbiciden, om het gemengd willekeurig uitzetten mogelijk te maken van de cytoplasmische, mannelijk steriele, vrouwelijke ouder, zijn instandhoudingslijn, en de 35 mannelijke ouder. Planten van de instandhoudingslijn en niet-hybridezaad afkomstig van zelfbestuiving van de mannelijke ouder worden geëlimineerd door hun gevoeligheid voor verschillende herbiciden.
Een mogelijke oplossing voor het bovenstaande probleem 2(a) is voorgesteld door Wiebe (A proposal for Hybrid Barley, Agronomy Journal (1960)).
. 8601 888 r % - 4 -
Wiebe suggereert de mogelijke vondst van een nauw verband tussen het mannelijke fertiliteitsgen en de ontvankelijkheid voor een fytocide (DDT).
Dit maakt een vroege identificatie mogelijk van mannelijke vrucht-5 bare planten (Msms) in populaties van vrouwelijke ouders, die gescheiden worden op hun mannelijke fertiliteit (Msms) en mannelijke steriliteit (msms) bij toepassing van nucleaire mannelijke steriliteit. Dergelijke planten kunnen derhalve uit de populatie van de vrouwelijke ouder verwijderd worden vóór de bloei en de mogelijke afgifte van stuifmeel, die 10 tot zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder kan leiden.
Eenzelfde voorstel werd gesuggereerd in de Europese octrooiaanvrage no. 86104213.3 (Advanced Genertic Sciences Ine.). Deze benadering omvat echter het willekeurig invoeren van merkingsgenen via transformatie in het genoom van mannelijke vruchtbare planten (MsMs of Msms) en vele on-15 afhankelijk getransformeerde planten worden genetisch geanalyseerd om een individu te vinden met een nauw verband tussen het markeringsgen en de plaats van de mannelijke fertiliteit. Er wordt bijzonder de nadruk gelegd op de toepassing van suicidegenen, die leiden tot gevoeligheid voor bepaalde chemicaliën. De vruchtbare planten kunnen daarna worden uit-20 geschakeld door een eenvoudige besproeiing met een chemisch middel in het stadium van de zaailingen.
Bij de vier bovenbeschreven octrooipublikaties blijven echter toch alle problemen bestaan, die verband houden met contaminatie door vreemd stuifmeel en contaminatie door zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder 25 ten gevolgde van een teloor gaan van de mannelijke steriliteit (de bovenstaande problemen 2 (b) en 3) .
Het is een doel van de uitvinding de beide bovengenoemde nadelen van de stand der techniek te overwinnen. Deze en andere doeleinden van de onderhavige uitvinding zullen aan de deskundigen duidelijk worden uit 30 de onderstaande beschrijving en voorbeelden.
De onderhavige uitvinding verschaft een werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere F^-hybridepopulatie van planten, welke werkwijze tot kenmerk heeft, dat men: (a) afwisselende bedden van mannelijke en vrouwelijke ouderplanten 35 uitzet, waarbij de mannelijke ouderplanten resistent zijn voor een fyto- toxisch chemisch middel, welke bestandheid uitsluitend toe te schrijven is aan een homozygoot, dominant, nucleair markeringsgen, welk resistentie-gen afwezig is in de vrouwelijke ouderplanten; (b) de vrouwelijke planten bevrucht met stuifmeel van de mannelijke ,.880 1 888 - 5 - planten; (c) bevrucht zaad van de bedden van uitsluitend de vrouwelijke planten oogst; en (d) bij stap (c) geoogst bevrucht zaad behandelt met het fytotoxiche 5 chemische middel.
Stap (d) kan uitgevoerd worden vóór het planten of na het uitkomen van de zaailingen. Het fytoxische chemische middel elimineert zodoende planten, die ontstaan zijn door zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder of door vreemde stuifmeelbronnen en hierdoor wordt een praktisch homogene 10 F^-hybridepopulatie bereikt.
De bovenstaande werkwijze kan toegepast worden voor plantensoorten, waarvan de beide ouders auto-verenigbaar zijn of waarbij slechts een ouder auto-onverenigbaar is.
Bij voorkeur is het fytotoxische middel een herbicide van een of 15 andere klasse. In plaats daarvan kan men als fytotoxisch chemisch middel een antibioticum gebruiken, bij voorkeur kanamycine (een antibiotisch complex geproduceerd door Streptomyces kanamyceticus).
De onderhavige uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere F^-hybridepopulatie van planten, waarbij 20 de beide ouders auto-onverenigbaar zijn, welke werkwijze tot kenmerk heeft, dat men: (a) alternerende bedden of een willekeurig mengsel van eerste en tweede ouderplanten uitzet, waarbij de eerste ouderplanten resistent zijn voor een fytotoxisch chemisch middel A en de tweede ouderplanten resistent 25 zijn voor een fytotoxisch chemisch middel B, terwijl de resistentie voor het fytotoxische middel A of B bij iedere plant uitsluitend toe te schrijven is aan een homozygoot dominant nucleair markeringsgen, terwijl het gen, dat bestand is tegen chemisch middel A afwezig is bij de tweede ouderplanten en het gen, dat bestand is tegen chemisch middel B, afwezig is bij de eerste 30 ouderplanten; (b) de eerste ouderplanten bevrucht met stuifmeel van de tweede planten en de tweede ouderplanten bevrucht met stuifmeel van de eerste ouderplanten; (c) bevrucht zaad van de eerste ouderplanten en van de tweede ouder-35 planten oogst; en (d) het bij stap (c) geoogste, bevruchte zaad behandelt met de beide fytotoxische chemicaliën A en B.
Stap (d) kan uitgevoerd worden vóór het planten of na het uitkomen van de zaailingen, teneinde planten te elimineren, die ontstaan zijn door .8801888 - 6 - zelfbestuiving van de eerste of de tweede ouderplant of uit vreemde stuif-meelbronnen. Daardoor wordt een praktisch homogene F^-hybridepopulatie verkregen.
Bij voorkeur zijn de fytotoxische chemicaliën A en B herbiciden van een of andere klasse.
In plaats daarvan kunnen de fytotoxische chemicaliën antibiotica zijn, en bij voorkeur is een van de antibiotica kanamycine.
Bij voorkeur worden de nucleaire markeringsgenen ingevoerd door een transformatietechniek voor planten.
Bij voorkeur is de toegepaste transformatietechniek voor planten de transformatiemet behulp van Agrobacterium.
Enkele aspekten van door middel van Agrobacterium tot stand gebrachte overdracht van genen in planten zijn beschreven in de Europese octrooiaanvrage no. 116718 (P. Zambryski); en de Europese octrooiaanvrage no. 84116036.9 (Plant Genetic Systems N.V., blz. 3, regel 33); of geciteerd in de Europese octrooiaanvrage no. 861042133 (kolom 16, regel 37), The Embo Journal, vol. 6 (1987)).
Een alternatief voor de omzettingstechniek van planten is een direkte transformatie door DNA opname (in de protoplast of cellen, plantenweefsels of bloemstelsels) .
Volgens een andere mogelijke methode wordt het kern-markeringsgen geselekteerd in een somatische cellencultuur. De octrooien op naam van Beversdorf c.s. verwijzen naar een dergelijke methode. Bij een nog andere mogelijke methode wordt het kern-markeringsgen geselekteerd bij een over-dracht-protoplastfusie. Bij nog een andere mogelijke methode wordt het kern-markeringsgen geselekteerd na induceren van plante-mutagenese. In plaats daarvan kan het kern-markeringsgen aanwezig zijn door keuze van een mannelijke of eerste of tweede ouderplant, die het gewenste gen bezit.
De onderhavige uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het onderzoeken van de zuiverheid van F^-hybridepopulaties van planten, waarbij de beide ouders auto-verenigbaar zijn of een ouder auto-onverenigbaar is, welke werkwijze tot kenmerk heeft, dat men: de stappen (a) tot (c) van de eerste hierboven beschreven methode uitvoert; een kleine hoeveelheid als monster van dit zaad uitzet; de zaailingen na het opkomen behandelt met het fytotoxische chemische middel; en het percentage zaailingen bepaalt, dat resistent is voor het fytotoxische chemische middel.
Verder verschaft de uitvinding een werkwijze voor het onderzoeken van de zuiverheid van F^-hybridepopulaties van planten, waarbij de beide ouders auto-onverenigbaar zijn, welke werkwijze tot kenmerk heeft, dat men: 6 880 1 Öb ~ - 7 - de stappen (a) tot (c) van de tweede bovenbeschreven methode uitvoert; een kleine hoeveelheid als monster van de zaden uitzet; de zaailingen na het opkomen behandelt met de fytotoxische chemicaliën A en B; en het percentage zaailingen bepaalt, dat resistent is voor de fytotoxische chemicaliën 5 A en B.
De uitvinding wordt hieronder nader toegelicht, mede aan de hand van de bijgevoegde tekening, waarin:
Figuur 1 een schemaische voorstelling is van de erfelijkheid van de bestandheid tegen een fytotoxisch middel in relatie tot de vorming van 10 hybridezaad volgens een eerste voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding; en
Figuur 2 een schematische voorstelling is van de toepassing van de resistentie voor fytotoxische chemicaliën voor de produktie van hybridezaad volgens een tweede voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding.
15 Voor wat betreft figuur 1, betekent (RE) homozygote bestandheid; (Rr) betekent heterozygote bestandheid; (rr) betekent homozygoot gevoelig.
De onderhavige uitvinding omvat volgens een eerste voorkeursuitvoeringsvorm het invoeren van een dominant markeringsgen, dat bestandheid voor de fytotoxisch chemisch middel verleent, in de mannelijke ouder van 20 een hybride cultuurvarieteit (RR). De beide ouders zijn auto-verenigbaar of slechts een ouder is auto-onverenigbaar. Om de doelmatigheid van deze beandering maximaal te maken dient de mannelijke ouder homozygoot voor een dergelijk gen te zijn. Bij deze uitvoeringsvorm zal alle ware hybridezaad, dat geoogst wordt van de vrouwelijke ouder (rr) heterozygoot zijn voor 25 het dominante markeringsgen en resistent zijn tegen het overeenkomstige fytotoxische chemische middel. Als het gewas van het hybridezaad in het stadium van de zaailingen besproeid wordt met het geschikte chemische middel, zullen slechts zaailingen afkomstig van het ware hybridezaad (Rr) overleven en alle zaailingen, die afkomstig zijn van contaminerend 30 stuifmeel, zullen uitgeschakeld worden.
De produktie van een waar hybridezaad (Rr) wordt voorgesteld door de in (A) van figuur 1 weergegeven weg. Zaad, dat gevormd is door verontreinigend stuifmeel (rr) is weergegeven in (B) van figuur 1. Hybridezaad is gewoonlijk overwegend van ware F^-oorsprong met wisselende hoeveelheden 35 verontreinigend zaad. Verontreinigend zaad kan geëlimineerd worden op basis van de gevoeligheid voor een fytotoxisch chemisch middel.
Na het oogsten van zaad van de vrouwelijke ouder in een blok met hybridezaad kan een klein zaadmonster (bijv. 1.000 zaden) behandeld worden met het geschikte chemische middel of men kan het laten ontkiemen en de c 880 1 888 - 8 - zaailingen met het juiste chemische middel besproeien, teneinde het percentage contaminatie te bepalen. Daarna kunnen aanbevelingen gedaan worden voor de vereiste toename van de mate van uitzaaien om het effekt tegen te gaan van de hoeveelheid contaminerende zaailingen, die vervolgens uitge-5 schakeld zullen worden.
Zoals blijkt uit figuur 2, wordt bij een tweede voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding auto-onverenigbaarheid bij beide ouders toegepast voor de produktie van hybridezaad en er wordt van beide ouders zaad geoogst. Iedere ouder moet derhalve homozygoot zijn voor verschillende mar-10 keergenen voor chemische bestandheid. Hybridezaailingen moeten daarna besproeid worden met de beide dienovereenkomstige chemische middelen om zaailingen uit te schakelen, die ontstaan zijn uit verontreinigend stuifmeel.
De eerste ouder (AAbb) is bestand tegen het chemische middel A en de tweede ouder (aaBB) is bestand tegen het chemische middel B. Zuivere 15 hybridezaden (AaBb) zullen bestand zijn tegen beide chemische middelen A en B. Niet-hybridezaad, afkomstig van verontreinigend stuifmeel (Aabb of aaBb) zullen slechts bestandheid dragen tegen alleen middel A of middel B.
Omdat de werkwijzen volgens de uitvinding de stap omvatten van het 20 uitschakelen van niet-hybridezaad tijdens de produktie van hybridezaad, bestaat er veel minder behoefte aan het isoleren van bedden van de ouder-planten van bronnen van verontreinigend stuifmeel. Deze methoden maken het mogelijk de produktie van hybridezaad meer efficiënt te maken. Ook kan men nu vele uitmuntende vrouwelijke ouders gebruiken, die eerst wegens 25 onregelmatige terugkeer naar mannelijke fertiliteit tot dusver niet voor de commerciële produktie van hybridezaad gebruikt konden worden.
Mits bronnen van kiemplasma beschikbaar zijn, kan men gebruikelijke methoden voor het kweken van planten toepassen om resistentie tegen fyto-toxische chemicaliën over te brengen in mannelijke ouders of hybriden.
30 Resistentiegenen kunnen direkt aan specifieke genotypen van planten worden toegevoegd door gebruik te maken van recente vorderingen in de genetica van de plantecel. Toepassing van somatische celselektie, protoplast-fusie en transformatie hebben de genetische manipulatie van planten mogelijk gemaakt om bestandheid tegen specifieke chemicaliën in te voeren (Conner 35 and Meredith, Genetic Manipulation of Plant Cells, The Biochemistry of Plants, A comprehensive treatise vol. 15, Molecular Biology (1988)).
In de meeste gevallen leiden dergelijke technieken tot individuele planten, die heterozygoot zijn voor wat betreft de resistentie en die aan zelfbestuiving onderworpen moeten worden, waarna het nageslacht onder- <.880 1 888 β - 9 - zocht wordt om homozygote planten te vormen. Hoewel genen voor resistentie tegen ieder fytotoxisch chemisch middel gebruikt zouden kunnen worden, omvat de meest geschikte benadering de toepassing van genen voor resistentie tegen herbiciden. Met behulp van Agrobacterium uitgevoerde transformatie 5 biedt een bijzonder geschikte werkwijze, aangezien verscheidene potentieel bruikbare genen gecloond zijn en resistentie verlenen tegen specifieke herbiciden, wanneer zij in planten geïntegreerd worden.
De vorming van tegen herbicide resistente planten via trans formatie kan bijv. resistentie tegen glyfosaat induceren (Shah c.s., Engineering 10 Herbicide Tolerance in Transgenic Plants, Science, vol. 233 (1986);
Comai c.s.. Nature, vol. 317 (1985); Amerikaans octrooischrift no.
4.535.060 (Comai); Fillatti c.s., Bio/Technology, vol. 5 (1987)) of resistentie tegen chloorsulfuron (Haughn c.s., Molecular and General Genetics, vol. 211 (1988)); of resistentie tegen fosfinotriun/bialofos (De Block).
15 Voorbeeld 1
De toepassing van dominante markeergenen met resistentie tegen een fytotoxisch chemisch middel voor het verhinderen van besmetting met vreemd stuifmeel tijdens de produktie van hybridezaad wordt toegelicht aan de hand van Nicotiana plumbaginifolia planten, die resistent zijn voor kanamycine.
20 A. Onderzoek op kanamycine resistentie
Kanamycine resistentie kan geschikt bestudeerd worden in N.plumbaginifolia door uitsorteren van zaailingen met groene zaadlobben (kanamycine-resistent) tegenover witte zaadlobben (kanamycine-gevoelig), die bij aanwezigheid van kanamycine groeien. De zaden werden gedurende een nacht geweekt in 1 mM 25 gibberellienzuur, 5 minuten aan het oppervlak gesteriliseerd met 3 % natrium-hypochloriet en grondig gespoeld in steriel gedestilleerd water. Daarna werden zij uitgezet op 1/2 MS zouten (Murashige en Skoog, a Revised Medium for Rapid Growth and Bioassays with Tobacco Tissue Culture,
Physiologia Plantarum, vol. 15 (1962)) plus 0,8 % agar, aangevuld met 30 300 mg/1 kanamycine.
Het cultuurmedium werd 20 minuten in een autoclaaf bij 121 kPa behandeld en met een filter gesteriliseerd kanamycine werd na de autoclaafbehandeling toegevoegd. Ontkiemende zaailingen werden bij 26° C onder koel -2 -1 wit fluorescerend licht geïncubeerd (100 pmol. m . sec ; 16 uur licht 35 en 8 uur donker per dag). Groene tegenover witte zaailingen kunnen na 7-10 dagen geselekteerd worden.
Met behulp van deze methode werd een enkele groene, tegen kanamycine resistente zaailing van N.plumbaginifolia waargenomen onder vele duizenden witte, voor kanamycine gevoelige zaailingen. Deze zaailing werd overgebracht in een kanamycinevrij medium. Na 8 weken werd hij overgebracht naar de bodem.
'.'Jilin, „8801888 - 10 -
Er werden geregelde bestuivingen uitgevoerd bij de bloei en het ontstane nageslacht werd gesorteerd op resistentie voor kanamycine.
De oorspronkelijk geïsoleerde zaailing (NpKR) was heterozygoot op een enkele plaats voor spontane mutatie t.o.v. resistentie voor kanamycine. Dit blijkt uit het door zelfbestuiving en terugkruising verkregen nageslacht, dat bij segregatie respectievelijk 3:1 en 1:1 vertoonde voor tegen kanamycine resistente en voor kanamycine gevoelige zaailingen (Tabel 1).
Uit het door zelfbestuiving verkregen nageslacht werd een enkele plant geïdentificeerd, die inderdaad verder kweekte voor kanamycine resistentie (Tabel 1). Kennelijk was deze plant op een enkele plaats voor resistentie tegen kanamycine homozygoot.
Tabel 1: Erfelijkheid van kanamycine resistentie bij een spontane kanamycine resistente mutant van Nicotiana plumbaginifolia (Np KR). Het zaailingen nageslacht werd onderzocht op resistentie tegen 3Q0 mg/1 kanamycine.
Gekruist Aantal zaailingen Verhouding Chi
Si b (vrouwelijk x mannelijk) groen_wit van onderzochte kwadraat
Wild-type (zelfbestuiving) 0 1.165 — -
NpKR (zelfbestuiving) 1.150 367 3:1 0:53
Wild-type x NpKR 292 266 1:1 1:21
NpKR x wild-type 256 281 1:1 1:16
NpKR B (zelfbestuiving 808 0 - a) kanamycine-resistent b) voor kanamycine gevoelig B. Produktie van hybridezaad
De produktie van hybridezaad werd gesimuleerd onder toepassing van een N.plumbaginifolia plant van het wilde type als vrouwelijke ouder en NpKR B (homozygoot voor kanamycine resistentie) als mannelijke ouder.
Er werden drie niveaus van bestrijding tegen besmetting met vreemd stuifmeel gecreërd door de geëmasculeerde vrouwelijke ouder te bestuiven met: 1.Stuifmeel van uitsluitend NpKR (strenge controle), 2.Stuifmeel primair van NpKR B met een kleine hoeveelheid van een plant van het wilde type (minder strenge controle) en 3.aanzienlijke hoeveelheden stuifmeel van zowel NpKR B als van een plant van het wilde type (lichte controle).
Als men NpKR B toepast voor het bestuiven van bloemen van planten van het wilde type met deze wisselende niveaus van bestuivingscontrole, kunnen groene, tegen kanamycine resistente, ware F^-hybride-zaailingen gemakkelijk onderscheiden worden van de witte, kanamycine-gevoelige zaai- * 8801 - 11 - lingen, die afkomstig zijn van het "vreemde" stuifmeel van het wilde type (Tabel 2). Zoals verwacht, neemt het percentage besmettend zaad toe, naar mate men de controle over het vreemde stuifmeel lichter maakt. Dit experiment toont het principe aan van het uitschakelen van niet-hybridezaden, 5 wanneer de dreiging bestaat van verontreiniging van het stuifmeel tijdens de produktfevan het hybridezaad.
Voorbeeld 2
De toepassing van dominante markeergenen met resistentie tegen een fytotoxisch chemisch middel voor het omzeilen van zelfbestuiving bij 10 de vrouwelijke ouder tijdens de produktie van hybridezaad wordt toegelicht aan de hand van Nicotiana plumbaginifolia planten, die genetisch gemanipuleerd zijn voor bestandheid tegen kanamycine.
Tabel 2; De toepassing van kanamycine resistentie voor het uitschakelen van zaad afkomstig van besmettend stuifmeel tijdens de produktie van 15 hybridezaad bij Nicotiana plumbaginifolia. Vrouwelijke ouder = voor kanamycine gevoelige plant van het wilde type met wisselende maten van zelfbestuiving. Mannelijke ouder = NpKR B (homozygoot voor kanamycine resistentie) . Het nageslacht van zaailingen onderzocht op bestandheid tegen 300 mg/1 kanamycine.
20 Controle over besmetting Aantal onder- Procent ware Procent veront- 3 b met vreemd zetmeel zochte zaden hybridezaden reinigend zaad c __ ___ __ van zelfbestuiving
Streng 341 100 0
Minder streng 273 86 14 25 Licht 229 57 43 3zie boven groene overlevende zaailingen, heterozygoot voor kanamycine resistentie
Q
witte stervende zaailingen, gevoelig voor kanamycine.
A. Transformatie 30 Een binair vectorsysteem, omvattende Agrobacterium tumefaciens (stam LBA 4404, Hoekema c.s., A binary plant vector stratecy based on separation of vir and T. region of the Agrobacterium tumefaciens Tiplasmid,
Nature, 303, blz. 179-180 (1983)), dat het plasmide pKÏWI 6 bezat, werd voor transformatie gebruikt. Dit plasmide bevat de linker en rechter grenslijn 35 van het T-DNA ,2 chimerische genen, die in staat zijn in plantecellen tot expressie te komen. Een daarvan verleent weerstand tegen het antibioticum kanamycine en bestaat uit het codeergebied van het neomycinefosfotransferase II gen (van het bacteriële transposon Tn5) onder de controle van de octo-ine synthase promotor en poly A signaal (OCS-NPTII-OCS). Het andere geeft .8801888 f - t - 12 - chlooramfenicol-acetyl-transferase (CAT) aktiviteit en bestaat uit het codeergedeelte van CAT (van bacterieel transposon Tn9) onder de controle van de mannopine synthase promotor en octopine synthase poly A signaal.
Bladsegmenten van in vitro gekweekte planten van N.plumbaginifolia 5 werden in een suspensie van A. tumefaciens gedompeld (een cultuur van een nacht in MG/L vloeistof - Garfinkel en Nester, Agrobacterium tumefaciens Affected in Crown Gall Tumourigenesis and Octopine Metabolism, Journal of Bacteriology, vol. 144 (1980)), met vloeipapier gedroogd en gekweekt op RMOP medium (Sidorov c.s., ïsoleucine-requiring Nicotiana Plant Deficient 10 in Threonine Deaminase, Nature, vol. 294 (1981)). Na 2 dagen werden de bladsegmenten overgebracht in hetzelfde medium, aangevuld met 500 mg/1 cefotaxime (om een te sterke groei van Agrobacterium te voorkomen) en 300 mg/1 kanamycine (om getransformeerde plantecellen te selekteren). Men liet geregenereerde, kanamycine-resistente spruiten wortel schieten op 15 MS zouten (Murashige & Skoog, 1962) plus 3% saccharose en 0,8 % agar en bracht ze daarna over naar een bodem. Geregelde bestuivingen werden uitgevoerd bij de bloei en het ontstane nageslacht werd onderzocht op kana-mycinerresistentie, als beschreven in voorbeeld 1.
B. Onderzoek op kanamycine-resistentie 20 De overerving van kanamycine resistentie kan geschikt bij N.plumbaginifolia bestudeerd worden door het sorteren van zaailingen met groene zaadlobben (kanamycine-resistent) tegenover witte zaadlobben (voor kanamycine gevoelig), 7-10 dagen na het zaaien op een medium, dat 300 mg/1 kanamycine bevat. De overerving werd bestudeerd bij 10 getransformeerde planten; slechts van 25 een van deze planten (NpT 17) worden de resultaten hier vermeld.
De oorspronkelijk getransformeerde plant van NpT 17 was heterozygoot voor invoeging op een enkele plaats van de kanamycine-resistente genen.
Dit blijkt uit het door zelfbestuiving en terugkruisen verkregen nageslacht, dat een scheiding vertoont van respectievelijk 3:1 en 1:1 voor kanamycine-30 resistente en -gevoelige zaailingen (Tabel 1). Uit het door zelfbestuiving verkregen nageslacht werd een enkele plant (NpT 17 D) geïdentificeerd, die een waar kweekprodukt was voor kanamycine-resistentie (Tabel 3). Kennelijk was deze plant homozygoot op een enkele plaats voor de kanamycine-resistentie.
NpT 17D werd teruggekruist naar het wilde type teneinde een grote 35 populatie Van zaailingen (meer dan 5.000) te vormen, die heterozygoot was voor ingevoegde kanamycine-resistente genen. Iedere genetische instabiliteit van de kanamycine-resistentie zou herkenbaar zijn door het verschijnen van zeldzame, witte, kanamycine-gevoelige zaailingen binnen een dergelijke populatie. Alle zaailingen bleken kanamycine-resistent te zijn (Tabel 3), ,8801888 - 13 - t wat wijst op een hoge genetische stabiliteit. Derhalve zijn genen met resistentie tegen fytotoxische chemicaliën, die via transformatie met behulp van Agrobacterium in planten zijn ingevoerd, voldoende stabiel om als genetische markeringen gebruikt te worden voor het bewaken van de 5 zuiverheid van het zaad van cultuurvariëteiten van gewassen.
Tabel 3: Erfelijkheid van kanamycine-resistentie bij een getransformeerde plant van Nicotiana plumbaginifolia (NpT 17).
Het zaailingen nageslacht werd onderzocht op bestandheid tegen 300 mg/1 kanamycine.
10 Kruising Aantal zaailingen Onderzochte Chi cl (vrouwelijk x mannelijk) _wit verhouding kwadraat
Wild type (ze]ftestuiving) 0 1.693
NpT 17 /zelfbestuiving) 409 141 3:1 0:12
Wild type x NpT 17 586 552 1:1 1:02 15 NpT 17D feelfbestuiving) 1.240 0 -
NpT 17D x wild type 5.339 0 - a) kanamycme-resistent voor kanamycine gevoelig 2Q C. Produktie van hybridezaad
De produktie van hybridezaad werd gesimuleerd onder toepassing van een N.plumbaginifolia plant van het wilde type als vrouwelijke ouder en NpT 17D (homozygoot voor kanamycine-resistentie) als mannelijke ouder.
Er werden verschillende maten van controle over verontreiniging met vrouwe-25 lijk stuifmeel tot stand gebracht door emasculatie van de vrouwelijke ouder in verschillende stadia van de ontwikkeling van de bloem. N.plumbaginifolia is cleistogaam en de bloemen vertonen zelfbestuiving vlak voor de opening van de corolla en de ontwikkeling van de corolla pigmentatie. Er werden drie niveaus van controle over zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder 30 tot stand gebracht.
1. Strenge controle werd uitgeoefend door emasculatie van 2-3 cm lange bloemknoppen, ruim voordat stuifmeel wordt afgegeven, 2. minder strenge controle werd uitgeoefend door emasculatie van de 4-5 cm lange bloem, juist op het tijdstip van het bereiken van de 35 maximale lengte van de corolla en wanneer stuifmeel begint afgegeven te worden en 3. lichte controle werd uitgeoefend door "emasculatie" na de ontwikkeling van corolla-pigment en juist toen de bloemen zich openden. In dit stadium had aanzienlijke zelfbestuiving plaatsgehad.
.6801888 4 - 14 -
Als NpT 17D gebruikt wordt voor het bestuiven van bloemen van planten van het wilde type met deze verschillende maten van bestuivingscontrole, kunnen groene kanamycine-resistente ware F^-hybride-zaailingen gemakkelijk onderscheiden worden van de witte, voor kanamycine gevoelige zaailingen, 5 die afkomstig zijn van zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder (Tabel 4). zoals verwacht, neemt het percentage besmettend zaad toe, naar mate de controle over zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder verminderd wordt.
Dit experiment toont het principe aan van het uitschakelen van niet-hybride-zaden, wanneer de dreiging bestaat van verontreiniging van het stuifmeel 10 door zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder tijdens de produktie van hybridezaad.
Zaad van NpKR B (voorbeeldden NpT 17D (voorbeeld 2) is gedeponeerd of beschikbaar bij de Crop Germplasm Resource Centre, Crop Research Division, DSIR, Private Bag, Christchurch, Nieuw Zeeland. Het is op ver-15 zoek verkrijgbaar bij de curator van de collectie.
Tabel 4: toepassing van kanamycine-resistentie voor het uitschakelen van zaad afkomstig van zelfbestuiving van de vrouwelijke ouder bij Nicotiana plumbaginifolia. Vrouwelijke ouder = voor kanamycine gevoelige plant van het wilde type met wisselende maten van zelfbestuiving. Mannelijke ouder 20 = NpT 17 D (homozygoot voor kanamycine-resistentie). Het zaailingen nageslacht werd onderzocht op resistentie tegen 300 mg/1 kanamycine.
Controle over zelfbestuiving Aantal onderzochte % ware F - % verontrei- a b nigend, door van ouder zaden hybridezaden zelfbestuiving _ _ _ verkregen zaad 25 Streng 3.110 100 0
Minder streng 3.854 92 8
Licht 6.039 43 57 azie boven 3Q groene overlevende zaailingen, heterozygoot voor kanamycine-resistentie Cwitte stervende zaailingen, gevoelig voor kanamycine.
. 88 0 1 88 8"
Claims (21)
1. Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere F.^-hybride populatie van planten, met het kenmerk, dat men: (a) afwisselende bedden van mannelijke en vrouwelijke ouderplanten uitzet, 5 waarbij de mannelijke ouderplanten resistent zijn voor een fytotoxisch chemisch middel, welke bestandheid uitsluitend toe te schrijven is aan een homozygoot dominant kern-markeringsgen, welk resistantiegen afwezig is in de vrouwelijke ouderplanten; (b) de vrouwelijke planten bevrucht met stuifmeel van de mannelijke planten; 10 (c) bevrucht zaad van uitsluitend de bedden van vrouwelijke planten oogst; en (d) bij stap (c) geoogst, bevrucht zaad behandelt met het fytotoxische chemische middel.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat beide ouders auto-verenigbaar zijn.
3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat slechts een ouder auto-onverenigbaar is.
4. Werkwijze volgens een van de voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat het fytotoxische chemische middel een herbicide is.
5. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-3, met het kenmerk, dat 20 het fytotoxische chemische middel een antibioticum is.
6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het antibioticum kanamycine is.
7. Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere F^-hybride populatie van planten, waarbij de beide ouders auto-onverenigbaar zijn, 25 met het kenmerk, dat men: (a) alternerende bedden of een willekeurig mengsel van eerste en tweede ouderplanten uitzet, waarbij de eerste ouderplanten resistent zijn voor een fytotoxisch chemisch middel A en de tweede ouderplanten resistent zijn voor een fytotoxisch chemisch middel B, welke bestandheid tegen het 30 fytotoxische middel A of B bij iedere plant uitsluitend toe te schrijven is aan een homozygoot, dominant, kern-markeringsgen en waarbij het tegen chemisch middel A resistente gen afwezig is bij de tweede ouderplanten en het tegen chemisch middel B resistente gen afwezig is bij de eerste ouderplanten; 35 (b) de eerste ouderplanten bevrucht met stuifmeel van de tweede planten en de tweede ouderplanten bevrucht met stuifmeel van de eerste ouderplanten; (c) bevrucht zaad van de eerste ouderplanten en de tweede ouderplanten oogst; en I 880 1 888 tr A. - 16 - (d) het bij stap (c) geoogste, bevruchte zaad behandelt met de beide fytotoxische chemicaliën A en B.
8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de fytotoxische chemicaliën herbiciden zijn.
9. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, dat de fytotoxische chemicaliën antibiotica zijn.
10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het antibioticum kanamycine is.
11. Werkwijze volgens een van de voorafgaande conclusies, met het ken-10 merk, dat men stap (d) uitvoert v6ór het uitzetten van het zaad.
12. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-10, met het kenmerk, dat men stap (d) uitvoert na het opkomen van zaailingen uit het zaad.
13. Werkwijze voor het onderzoeken van de zuiverheid van F^-hybride populaties van planten, met het kenmerk, dat men: 15 (a) afwisselende bedden van mannelijke en vrouwelijke planten uitzet, waarbij de mannelijke ouderplanten resistent zijn voor een fytotoxisch chemisch middel, welke resistentie uitsluitend toe te schrijven is aan een homozygoot, dominant, kern-markeringsgen, waarbij dit resistentiegen afwezig is bij de vrouwelijke ouderplanten; 20 (b) de vrouwelijke planten bevrucht met stuifmeel van de mannelijke planten; (c) bevrucht zaad van uitsluitend de bedden van vrouwelijke planten oogst; (d) een kleine hoeveelheid als monster van de zaden uitzet; 25 (e) de zaailingen na het opkomen behandelt met het fytotoxische chemische middel; en (f) het percentage zaailingen bepaalt, dat resistent is voor het fytotoxische chemische middel.
14. Werkwijze voor het onderzoeken van de zuiverheid van F^-hybride 30 populaties van planten, waarbij de beide ouders auto-onverenigbaar zijn, met het kenmerk, dat men: (a) alternerende bedden of een willekeurig mengsel van eerste en tweede ouderplanten uitzet, waarbij de eerste ouderplanten resistent zijn voor een fytotoxisch chemisch middel A en de tweede ouderplanten resistent 35 zijn voor een fytotoxisch chemisch middel B, terwijl de resistentie voor het fytotoxische chemische middelAof B bij iedere plant uitsluitend toe te schrijven is aan een homozygoot dominant kern-markeringsgen, en waarbij het voor chemisch middel A resistente gen afwezig is bij de tweede ouderplanten en het voor chemisch middel B resistente gen afwezig is bij de .8*01888 % - 17 - eerste ouderplanten; (b) de eerste ouderplanten bevrucht met stuifmeel van de tweede planten en de tweede ouderplanten bevrucht met stuifmeel van de eerste ouderplanten; 5 (c) bevrucht zaad van de eerste ouderplanten en de tweede ouder planten oogst; (d) een kleine hoeveelheid als monster van deze zaden uitzet; (e) de zaailingen na het opkomen behandelt met de fytotoxische chemicaliën A en B; en 10 (f) het percentage zaailingen bepaalt, dat resistent is voor de fytotoxische chemicaliën A en B.
15. Werkwijze volgens een van de voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat het kern-markeringsgen wordt ingevoerd met behulp van een plante-transformatietechniek.
16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de plante- transformatietechniek een met behulp van Agrobacterium uitgevoerde overdracht is.
17. Werkwijze volgens conclusie 15, met het kenmerk, dat de plante-transformatietechniek een transformatie door direkte DNA opname is.
18. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-14, met het kenmerk, dat het kern-markeringsgen geselekteerd wordt in een somatische cellencultuur.
19. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-14, met het kenmerk, dat het kern-markeringsgen geselekteerd wordt bij overdracht door protoplast-fusie.
20. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-14, met het kenmerk, dat het kern-markeringsgen geselekteerd wordt na inducering van plante-mutagenese.
21. Werkwijze volgens een van de conclusies 1-14, met het kenmerk, dat het kern-markeringsgen aanwezig is door een ouderplant te kiezen met het 30 gewenste gen. --—--J .8801888
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NZ22126787 | 1987-07-30 | ||
| NZ22126787A NZ221267A (en) | 1987-07-30 | 1987-07-30 | Hybrid seed production using a phytotoxic chemical to eliminate undesirable seeds |
| NZ22137587 | 1987-08-07 | ||
| NZ221375A NZ221375A (en) | 1987-07-30 | 1987-08-07 | Hybrid seed production using a phytotoxic chemical to eliminate undesirable seeds |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8801888A true NL8801888A (nl) | 1989-02-16 |
Family
ID=26650756
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8801888A NL8801888A (nl) | 1987-07-30 | 1988-07-27 | Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere f1-hybridepopulatie van planten. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02402A (nl) |
| AU (1) | AU615460B2 (nl) |
| CA (1) | CA1313153C (nl) |
| DE (1) | DE3825492A1 (nl) |
| DK (1) | DK390288A (nl) |
| FR (1) | FR2618640A1 (nl) |
| GB (1) | GB2208346B (nl) |
| IT (1) | IT1229991B (nl) |
| NL (1) | NL8801888A (nl) |
| NZ (1) | NZ221375A (nl) |
| SE (1) | SE8802764L (nl) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0436467A3 (en) * | 1989-12-29 | 1992-10-21 | Ciba-Geigy Ag | Expression of s-locus specific glycoprotein gene in transgenic plants |
| GB9014090D0 (en) * | 1990-06-25 | 1990-08-15 | Zaadunie Bv | Improvements in or relating to organic compounds |
| GB9313975D0 (en) * | 1993-07-06 | 1993-08-18 | Sandoz Ltd | Improvements in or relating to organic compounds |
| US5717129A (en) * | 1995-02-16 | 1998-02-10 | Pioneer Hi-Bred International, Inc. | Methods for maintaining sterility in plants |
| CA2285579A1 (en) * | 1997-04-28 | 1998-11-05 | Wengui Yan | Crop heterosis and herbicide |
| JP3261455B2 (ja) * | 1999-10-08 | 2002-03-04 | 独立行政法人 農業技術研究機構 | イネ科植物の花粉飛散防止方法 |
| FR2802768B1 (fr) * | 1999-12-23 | 2002-03-01 | Limagrain Sa | Procede de determination du pourcentage de semences porteuses d'au moins un gene d'interet |
| US6646186B1 (en) * | 2000-07-26 | 2003-11-11 | Stine Seed Farm Inc. | Hybrid soybeans and methods of production |
| KR100849166B1 (ko) * | 2005-02-07 | 2008-07-30 | 인제대학교 산학협력단 | 유디피-글루쿠로노실트랜스퍼라제 1에이4 유전자의단일염기 다형성 및 그 용도 |
| KR100816018B1 (ko) * | 2007-01-19 | 2008-03-21 | 한국과학기술원 | Ｆｏｃｕｓｓ 알고리듬을 이용한 고해상도 영상 복원 방법 |
| KR20210013180A (ko) * | 2018-05-25 | 2021-02-03 | 필립모리스 프로덕츠 에스.에이. | 식물 재료를 분류하는 방법 |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| HU165923B (nl) * | 1972-03-13 | 1974-12-28 | ||
| EP0090033A1 (en) * | 1981-10-01 | 1983-10-05 | International Plant Research Institute | Process for the genetic modification of cereals with transformation vectors |
| EP0116718B2 (en) * | 1983-01-13 | 1996-05-08 | Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Process for the introduction of expressible genes into plant cell genomes and agrobacterium strains carrying hybrid Ti plasmid vectors useful for this process |
| US4517763A (en) * | 1983-05-11 | 1985-05-21 | University Of Guelph | Hybridization process utilizing a combination of cytoplasmic male sterility and herbicide tolerance |
| US4570380A (en) * | 1984-11-28 | 1986-02-18 | Ciba-Geigy Corporation | Route to hybrid cotton production |
| US5180873A (en) * | 1985-04-16 | 1993-01-19 | Dna Plant Technology Corporation | Transformation of plants to introduce closely linked markers |
| US4658085A (en) * | 1985-11-14 | 1987-04-14 | University Of Guelph | Hybridization using cytoplasmic male sterility, cytoplasmic herbicide tolerance, and herbicide tolerance from nuclear genes |
| US4658084A (en) * | 1985-11-14 | 1987-04-14 | University Of Guelph | Hybridization using cytoplasmic male sterility and herbicide tolerance from nuclear genes |
-
1987
- 1987-08-07 NZ NZ221375A patent/NZ221375A/xx unknown
-
1988
- 1988-07-12 DK DK390288A patent/DK390288A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-07-19 GB GB8817191A patent/GB2208346B/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-26 CA CA000573069A patent/CA1313153C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-07-27 NL NL8801888A patent/NL8801888A/nl not_active Application Discontinuation
- 1988-07-27 DE DE3825492A patent/DE3825492A1/de not_active Withdrawn
- 1988-07-27 IT IT8821521A patent/IT1229991B/it active
- 1988-07-27 JP JP63187959A patent/JPH02402A/ja active Pending
- 1988-07-28 FR FR8810189A patent/FR2618640A1/fr active Pending
- 1988-07-29 AU AU20210/88A patent/AU615460B2/en not_active Ceased
- 1988-07-29 SE SE8802764A patent/SE8802764L/ not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2021088A (en) | 1989-02-02 |
| IT1229991B (it) | 1991-09-20 |
| DE3825492A1 (de) | 1989-02-09 |
| GB8817191D0 (en) | 1988-08-24 |
| FR2618640A1 (fr) | 1989-02-03 |
| GB2208346B (en) | 1991-07-03 |
| CA1313153C (en) | 1993-01-26 |
| DK390288D0 (da) | 1988-07-12 |
| JPH02402A (ja) | 1990-01-05 |
| DK390288A (da) | 1989-01-31 |
| NZ221375A (en) | 1990-09-26 |
| AU615460B2 (en) | 1991-10-03 |
| SE8802764D0 (sv) | 1988-07-29 |
| SE8802764A0 (sv) | 1989-01-31 |
| GB2208346A (en) | 1989-03-30 |
| SE8802764L (sv) | 1989-01-31 |
| IT8821521A0 (it) | 1988-07-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Maluszynski et al. | Application of in vivo and in vitro mutation techniques for crop improvement | |
| EP0160692A1 (en) | Method for the transfer of exogenous genes in plants using pollen as a vector | |
| Bird et al. | Induced mutations in maize | |
| NL8801888A (nl) | Werkwijze voor het vormen van een praktisch zuivere f1-hybridepopulatie van planten. | |
| JPH0646697A (ja) | 外部から誘導し得るプロモーター配列を用いた小胞子形成の制御 | |
| Sanchez et al. | Chromosomal location of some marker genes in rice using the primary trisomics | |
| CN113993373A (zh) | 生长性被改良的细胞质雄性不育芜菁植物 | |
| Sage | Nucleo-cytoplasmic relationships in wheat | |
| US6057496A (en) | True breeding transgenics from plants heterozygous for transgene insertions | |
| EP0214601A2 (en) | Creation of cytoplasmic male sterility maintainer line trough protoplast fusion | |
| Earle et al. | Somaclonal variation in progeny of plants from corn tissue cultures | |
| Chupeau et al. | A Lactuca universal hybridizer, and its use in creation of fertile interspecific somatic hybrids | |
| Wang et al. | Effect of X‐ray Irradiation on Maize Inbred Line B73 Tissue Cultures and Regenerated Plants | |
| US6476291B1 (en) | True breeding transgenics from plants heterozygous for transgene insertions | |
| Van der Veken et al. | Cichorium intybus L.× Cicerbita alpina Walbr.: doubled haploid chicory induction and CENH3 characterization | |
| Zubko et al. | Self-fertile cybrids Nicotiana tabacum (+ Hyoscyamus aureus) with a nucleo-plastome incompatibility | |
| Dale et al. | Variation in some agronomically important characters in a germplasm collection of beet (Beta vulgaris L.) | |
| Deimling et al. | 10. Haploidy in rye | |
| Lasa et al. | Male sterility | |
| US5959173A (en) | Hybrid seed production | |
| Westwood et al. | Characterization and breakdown of self-incompatibility in field bindweed (Convolvulus arvensis L.) | |
| US20230389497A1 (en) | Methods for cereal crop hybrid test cross evaluation | |
| Morrison et al. | Haploid plants from tissue culture application in crop improvement | |
| Van der Veken | Tools for hybrid breeding in industrial chicory (Cichorium intybus L.) | |
| McGuire | Status of an attempt to transfer the barley yellow dwarf virus resistance gene Yd2 of barley to hexaploid wheat |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A1A | A request for search or an international-type search has been filed | ||
| BB | A search report has been drawn up | ||
| BV | The patent application has lapsed |