JPH02402A - ハイブリッド種子の改良された生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はハイブリッド種子生産の改良法に関する。更に
詳細に言えば、本発明はハイブリディゼーション法にお
ける雄親の植物毒性化合物に抵抗性を有する遺伝子の利
用に関するものであるが、この場合ハイブリデイゼーシ
ョン法に引き続き植物毒性薬品で生じたハイブリッドを
、望ましくない汚染種子から生じる植物を消失するため
に与える。

（従来の技術〕 ハイブリッド種子を商業的に生産するためには普通雄親
及び雌親を交互配置パターンで植え、そして種子は雌親
以外から収穫する。

ハイブリッド種子生産時の重大な問題は、雌親を受精さ
せる花粉が全て雄親に由来するものであるようにするこ
とである。これ以外の花粉から生じた種子はハイブリッ
ド種子を汚染する。汚染性花粉の発生源として考えられ
るものは、雌親からの花粉であり、これは自己汚染の発
生源となる。或は近傍の畑からの花粉が汚染性花粉の発
生源として考えられる。

雌親からの繁殖力ある花粉を除去するには六つの方法が
ある。シモンズによる「農作物改良の原理Ｊ　（Ｓｉｎ
ｎ＋ｏｎｄｓ、Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆＣｒｏｐ　
ｌ１ｐｒｏｖｅｎｅｎｔ　　（１９７９）　）　：１、
物理的方法（例トマト）−手でｆ１１親を除雄し、次い
で受粉する； ２１１異株（例ホウレンソウ）−遺伝子型の雄植物を分
離する。こうした雄植物からの種子は、セパレートした
雄及び雌親の収穫物（ｃｒｏｐ）から得られる。

３、自家不和合（例アブラナ属蹟菜）−自家不和合性で
あるが他家和合性である二つの親を混植し、そして全種
子を収穫する。或は自家和合性ボリネーターと共に雌親
とじて自家不和合性遺伝子型を用い、そしてｍ親のみか
らの種子を収穫する。

４、核雄性不稔性（多くの作物類）−雌親を雄性不稔性
（ｍｓａ＋ｓ）と稔性（８３ｍｓ　）とに分割する；雄
性稔性植物を分離する。そして雄性不稔性植物は雄親（
８３８３）からの花粉で受粉する。

５、Ｉｌｌｌｌ飽性雄性不稔性タマネギ）−雄性不稔性
系を雌親として使用する。そして ６、化学薬品類： （ａ雄性生殖子撲滅剤（例小麦）−雌親に対し、雄の不
稔性を誘発する薬品をスプレーする； ＋ｂ＋性の逆転（例ｃｕｒｃｕｒｂｉｔｓ）　−＠親に
対し、雄花を雌花に添加する植物ホルモンをスプレーす
る。

しかしこのような方法には若干の問題が伴う： （１）雌親と雄親を、畑における交互に配置されたブロ
ックに分けると、雄親からｐ１親へ花粉を効果的に移す
ことが困難となり、ハイブリッド種子の最大生産量が得
られなくなる。

（２）これらの方法はいずれも１１親からの稔性花粉を
完全に除去することを保証するものではない（従って、
雌親が自己受粉する）。これには二つの要因がある＝ （Ｊ雌雄異株と核雄性不稔性を利用する場合、雄性稔性
植物を手で除雄し除去す る際に人間がミスを冒すことがある。

＜ｂ＋性の発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を抑えるため
に薬品スプレーを行なう場合、＃Ｌ親による花粉生産を
全体的に抑止するよう に均一にスプレーすることは困難であ る。更に、自己不和合性と雄性不稔性 遺伝子の発現には安定性が欠けること がしばしばある。例えば、温度が高か ったり又は湿度が高かったりすると、 自己不和合性が低下して自家受粉種子 の割合が高くなると、特にアブラナ属 蹟菜の場合そうであることが知られて いる。７ランケル及びガランによる 「受粉のメカニズム、生殖及び植物の 品種改良Ｊ　（Ｆｒａｎｋｅｌ　ａｎｄ　Ｇａ１ｕｎＰ
ｏｌｌｉｎａｔｉｏｎ　Ｈｅｃｈａｎｉｓｍｓ　ａｎｄ
　Ｐｌａｎｔ８ｒｅｅｄｉｎａ　（１９７７）　）　、
この結果、多くの自家受粉植物を有する［不純なハイ ブリッド」が生ずる〔シモンズ （Ｓｉｍｍｏｎｄｓ）　）　、一部の不稔性雄タマネギ
の稔性を回復させると、他の優れ た交雑種からハイブリッドを生産する ことが不経済になってしまうことがあ る。グランドによる、「タマネギ、ニ ューシーラントにおける植物の品種改 良Ｊ　（Ｇｒａｎｔ、０ｎｉｏｎｓ、Ｐｌａｎｔ　Ｂｒ
ｅｅｄｉｎｇｎ　Ｈｅｗ　Ｚｅａｌａｎｄ　（１９８３
）　）。

（３）近傍の畑の異種の花粉による汚染を避けるために
、隔離したプロットでハイブリッド種子のブロックを生
育させた。作物から作物までの好ましい隔離距離は受粉
方法によって異なり、モロコシ属、コーン及び小麦の２
（１０ｍから最大ヒマワリの６．４にｍまでに達してい
る。ライトによる［ハイブリッド種子の商業的生産」 （Ｗｒｉｇｈｔ、Ｃｏ１１ｅｒｃｉａｌ　Ｈｙｂｒｉｄ
　５ｅｅｄＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎ、Ｈｙｂｒｉｄｉｓａ
ｔｉｏｎ　ｏｆ　ＣｒｏｐＰｌａｎｔｓ　　（１９８０
）　）　、こうした別離内にある、汚染性花粉の全ての
発生源を取り去る試みが行なわれている。

上記問題（１）に対する解決法が米国特許第　４５１７
７６３．　４６５８０８４及び　４６５８０８５号〔い
ずれもベバースドルフはか （Ｂｅｖｅｒｓｄｏｒｆ　ｅｔ　ａｌ）　）に開示され
ている。

同一のｆｉ親から生まれ、いずれも細胞質的に遺伝した
雄性不稔性と、ｍ胞質的に遺伝した除草剤抵抗性（米国
特許第 ４５１７７６．３＠）又は核遺伝した除草剤抵抗性遺伝
子（米国特許第４６５８０８４号）との組み合せからな
っている。本概念は両親をランダムに混合してハイブリ
ッド種子の生産を行なうものであり、これによって雄親
から雌親への花粉の移動が容易になる。

雌親が雄性不稔性であり、かつ除草剤 抵抗性を有し、一方雄親が雄性稔性であり除草剤感受性
を有する場合には、このような植物から生産された種子
には二種類がある。

（１１１１親（除草剤抵抗性）からの真のハイブリッド
；及び （２）雄親の自家受粉による非ハイブリッド種子。

ｍａの自家受粉によって生じた非ハイ ブリッド種子は、受粉後でしかも種子の収穫（それによ
ってＭ１親を殺す）竹に、或は集団収穫（それによって
発芽後の非ハイブリッド実生を殺す）した種子を播いた
後に、除草剤をスプレーすることによって消失させるこ
とができる。この非ハイブリッド種子の源は標準的なハ
イブリッド種子の生産に基づくものではない。

その理由は、標準的なハイブリッド種子生産の場合、雌
親及び雄親は畑の中の交互に配置されたブロックに機械
的に分けて割り当てられ、そして種子は雌１０ツク以外
からのみ収穫する。従って非ハイブリッド種子コンポー
ネントは、両親の混合播種に基づいて生じたこれら両親
の固有的部分である。

又米国特許第４６５８０８４及び４６５８０８５号のク
レームにおいては、二種類の除草剤に対する抵抗性を利
用して、細胞質雄性不稔性雌親、そのｍａｉｎｔａｉｎ
ｅｒ　１ｉｎｅ及び雄親を混合してランダム植えつけを
行なった。ｎ＋ａｉｎｔａｉｎｅｒ　１ｉｎｅから生じ
た植物と雄親の自家受粉から生じた非ハイブリッド種子
は、各種除草剤に対して感受性があるので消失される。

上記問題（２に対する実行性ある解決法をビーム（Ｗｉ
ｅｂｅ　）が見出した。［ハイブリッド大麦に対する提
案」 （Ａ　ｐｒｏｐｏｓａｌ　ｆｏｒ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ｂａ
ｒｌｅｙ　。

Ａａｒｏｎｏｎ＋ｙ　Ｊｏｕｒｎａｌ　（１９６０）　
）ビーム（１４ｉｅｂｅ　）は雄性稔性遺伝子と除草剤
（ＤＤＴ）に対する感受性の間には密接な関係があるこ
とを示唆している。

これによって、核雄性不稔性を用いる 時に、雄性稔性（Ｈｓ　ａｓ　）と雄性不稔性（ｎ＋ｓ
　＋ｍｓ　）とに分離される雌親の個体群中の雄性稔性
植物を早期に同定することができる。従ってこうした植
物は、開花し花粉を撒いて雌親に対して受粉を行なう前
に、雌親個体群から分離できる。

同様の案がヨーロッパ特許出願番号箱 ８６１（１４２１３、３号〔アドバンスト　ジエネティ
ク　サイエンシズ　インコーポレーション（Ａｄｖａｎ
ｃｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｉｎｃ、
）〕に提案されている。しかしこの方法では、形質転換
を経て標識遺伝子を雄性稔性植物（ＨｓＨｓ又はＨｓ　
ｍｓ　）のゲノム中へランダムに導入し、又多くの独立
的に形質転換した植物を遺伝的に分析することにより標
識遺伝子と稔性座とが緊密に連鎖している個体を発見し
ている。特に、特定の化合物に感受性を示す自滅遺伝子
を利用することを強調している。そして芽生え期に簡単
な薬品スプレーをすることによって稔性植物を消失させ
ることができる。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかし前記四つの特許には異種花粉による汚染に関連し
た問題、並に雄性不稔性のブレークダウンによる雌親の
自家受粉による汚染に関連した問題が残っている。

本発明では従来技術の上記二つの欠点を克服することを
目的としている。

本発明の本目的と他の目的は、次に示す説明と実施例、
並に前述の特許請求の範囲を読むことによって当業者に
は明らかになるであろう。

〔課題を解決するための手段〕 本発明は実質的に純粋なＦ＋ハイブリッド植物個体群を
形成する方法を提供するものであるが、前記方法におい
て： （ａ）交互に配置されたプロットに雄親植物と雌親植物
を植えること（但し、本雄親植物は植物毒性薬品に抵抗
性を有し、前記抵抗性は同型接合優性核標識遺伝子のみ
に起因し、前記抵抗性遺伝子は前記雌親植物には存在し
ない）と： （ｂ）前記雌植物を前記雌植物の花粉で受精するここと
と； （ｅ）前記プロットの雌植物のみから生じた受精した種
子を収穫することと； ＋ｄ＋ステップ（ｃ）で収穫した受精した種子に前記植
物毒性薬品を与えること からなることを特徴とする方法。

ステップ＋ｄ＋は、植える前か或は実生が発生した後に
実施することができ、こうして植物。

毒性薬品によって、Ｉ親の自家受粉又は他の花粉源から
生じた植物が消失され、そして実施的に同型接合Ｆ＋ハ
イブリッド個体群が植得られる。

上記方法は、両親が自家和合性であるか、或は一方の親
のみが自家不和合性である種の植物に対して適用できる
。

望ましくは前記植物毒性薬品は任意の種類の除草剤であ
る。さもなければ、前記植物毒性薬品は抗生物質であり
、望ましくはカナマイシン（ストレプトマイセス　カナ
マイセティクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｋａｎａ
ｍｙｃｅｔｉｃｕｓ）によって生産された抗生物質〕で
ある。

更に、本発明は両親が自家不和合性である実質的に純粋
なＦ１ハイブリッド植物個体群を形成する方法を提供す
るものであるが、前記方法において： （田第１代の親及び第２代の親を交互に配置したプロッ
トで植えるか或はランダムに混合して植えること（但し
、第１代の親植物は植物毒性薬品Ａに対して抵抗性を有
し、第２代の親植物は植物毒性薬品Ｂに対して抵抗性を
有し、前記植物毒性薬品Ａ又はＢに対する前記抵抗性は
８親において同型接合優性核標識遺伝子のみに起因し、
薬品Ａに対する前記遺伝子の抵抗性は前記第２代の親植
物には存在せず、そして薬品Ｂに対する前記遺伝子の抵
抗性は前記第１代の親植物には存在していない）と； ＋ｂ）前記第１代の親植物を前記第２代の植物の花粉で
受精すること及び前記第２代の親植物を前記第１代の親
植物の花粉で受精することと； （ｃ）第１代の親植物の種子と第２代の親植物の種子を
収穫することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で収穫した受精した種子に前記植
物毒性薬品化合物Ａと８の双方を与えることとからなる
ことを特徴とする方法。

ステップ＋ｄ＋は植える前か或は実生が発生した後に実
施することができ、こうして前記の第１代又は第２代親
植物の自家受粉で生じた植物を、或は他の花粉源から生
じた植物を消失することができる。そして実質的に同型
接合Ｆ＋ハイブリッド個体群が得られる。

望ましくは、前記植物毒性薬品Ａ及びＢは任意の種類の
除草剤である。

さもなければ、前記植物毒性薬品は、抗生物質であり、
望ましくは前記抗生物質の一つはカナマイシンである。

核標識遺伝子は植物形質転換法によって挿入するのが望
ましい。

適用する植物形質転換法はアグロバクテリウム媒介転移
（＾ＱｒＯｂａＣ１ｅｒｉＵｌｌｌ−１１ｅｄｉａｔｅ
ｄｔｒａｎｓｆｅｒ　）が望ましい。

植物に対する遺伝子のアグロバクテリウム媒介転移の幾
つかの局面が、ヨーロッパ特許出願用１１６７１８ｑ　
（ビー・ザムブリスキー（ＰＺａｍｂｒｙｓｋｉ　）　
）　；及びヨーロッパ特許出願用８４１１６０３６、９
＠　（プラント　ジェネエティックシステム（Ｐｌａｎ
ｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｙｓｔｅｌｓ　）　Ｎ、Ｖ、、
３頁３３行〕に開示されており、或はヨーロッパ特許出
願用８６１（１４２１３３Ｍ　（コラム１６、第３７行
）に引用されている（ザ　イーエムビーオー　ジャーナ
ル（Ｔｈｅ　ＥＨＢＯＪｏｕｒｎａｌ）第６巻１９８７
年〕に開示されている。

また別の前記植物形質転換法はＤＮＡアップテーク形質
転換（原形質体又は細胞へ、植物の組織又は花序へ）で
ある。

また別の方法においては、前記核標識遺伝子を体細胞培
養から選択している。ベベルスドルフ（Ｂｅｖｅｒｓｄ
ｏｒｆ　）ほかによる特許においてこの方法が述べられ
ている。更に別の方法の場合、前記核標識遺伝子をプロ
トプラスト融合から選択している。更に別の方法の場合
、前記核標識遺伝子を植物突然変異生成後に選択してい
る。また別の方法では、前記核標識遺伝子を、所望の遺
伝子を有する雄の第１代または第２代親植物から選択し
ている。

本発明は更に、両精が自家和合性であるか或は一方の親
が自家不和合性である、Ｆ＋ハイブリッド植物個体群の
純度の試験法を提供するものであるが、前記純度試験法
において：上述の最初の方法のステップ（ａ）からステ
ップ（ｃ１までを実施することと；サンプルとして前記
種子を少量生育することと一発芽後に実生に対して前記
植物毒性薬品を与えることと；更に前記植物毒性薬品に
対して抵抗性を有する実生の百分率を求めることからな
ることを特徴とする方法。

本発明はまた両親が自家不和合性である、Ｆ１ハイブリ
ッド植物個体群の純度の試験法を提供するものであるが
、前記試験法において：上述の二番目の方法のステップ
（ａ）から（ｃ）までを実施することと；サンプルとし
て前記種子を少Ｇ生育することと；発芽後に実生に対し
て前記植物毒性薬品Ａ及びＢを供与することと：更に前
記植物毒性薬品Ａ及びＢに対して抵抗性を有する実生の
百分率を求めることからなることを特徴とする方法。

本発明は添付図面を参照することによって更に充分に理
解することができるであろう。

添付図のうち： 図１は、本発明の最初の好適な実施例に関するものであ
って、ハイブリッド種子を生産する場合における植物毒
性薬品に対する抵抗性の遺伝を図式的に示したものであ
る：また図２は、本発明の今一つの好適な実施例に関す
るものであって、ハイブリッド種子を生産する場合にお
ける植物毒性薬品の利用を図式的に示したものである。

図１を説明すると、（ＲＲ）は同型接合抵抗性を意味し
；（Ｒｒ）は異型接合抵抗性を意味し；（ｒｒ）は同型
接合感受性を意味する。

本発明の最初の好適な実施例の場合、植物毒性薬品に対
する抵抗性を与えるために優性標識遺伝子をハイブリッ
ド栽培品種（ＲＲ）の雄親に誘導する。両親が自家和合
性であるか或は一方の親のみが自家不和合性である。本
方法の効率を最高にするためには、このような遺伝子に
対し雄親は和合性でなければならない。本実施例の場合
、雌親（ｒｒ）から収穫した真のハイブリッド種子はい
ずれも、優性標識遺伝子に対して異型接合性であり、そ
して対応する植物毒性薬品に対して抵抗性を有する。も
しハイブリッド種子収穫物を実生期に適当な薬品でスプ
レーすると、真のハイブリッド種子（Ｒｒ）から実生の
みが生残り、汚染性花粉からの実生はいずれも消失する
。

真のハイブリッド種子（Ｒｒ）の生産は、図１の（Ａ）
に図示した経路で示されている。

汚染性花粉（ｒｒ）によって生産された種子は図１の（
Ｂ）に図示されている。

ハイブリッド種子は普通真のＦ１起原のものが大半であ
るが、汚染性種子を様々な割合で含んでいる。汚染性種
子は植物毒性薬品に対する感受性を利用して消失させる
ことができる。

ハイブリッド種子ブロック内の雌親からの種子を収穫し
た後、少量の種子サンプル（例えば１（１００粒の種子
）を適当な薬品で処理し、または発芽させることができ
る。そして適当な薬品をスプレーした実生を用いて汚染
の百分率を求める。更に実質的に消失する汚染性実生の
比率を少なくするために、播種割合をどのくらい多くす
る必要があるかを勧告することができる。

図２について説明すると、本発明の今一つの好適な実施
例においては、両親の不和合性はハイブリッド種子生産
に利用され、そして種子は両親外で収穫される。８親は
従って種々の耐薬品性４１識に対して同型接合性でなけ
ればならない。従ってハイブリッド実生は、汚染性花粉
から生ずる実生を消失するために対応する両薬品でスプ
レーしなければならない。

第１代親（ＡＡｂｂ）は薬品Ａに対して抵抗性を有し、
第２代親（ａａ８Ｂ＞は薬品Ｂに対して抵抗力を有して
いる。真のハイブリッド種子（ＡａＢｂ）は両薬品△及
びＢに対して抵抗性を有している。汚染性花粉（Ａａｂ
ｂ又はａａＢｂ　）から生じる非ハイブリッド種子は、
薬品Ａまたは薬品Ｂに対してのみ抵抗性を有している。

本発明の方法には、ハイブリッド種子生産時に非ハイブ
リッド種子を消失させるステップがあるので、親植物の
プロットを汚染性花粉源から隔離する必要は殆んど無い
。こうした方法によってハイブリッド種子生産が一層効
率的になる。更に、雄性稔性に対する不規則な復帰性が
あるためハイブリッド種子の商業的産生を行なう場合に
従来は使用不可能であった多くの優れた雌親が今や使用
可能となった。

生殖質源が利用できるならば、従来の植物育種方法を利
用して植物毒性薬品に対する抵抗性を雄の親またはハイ
ブリッドに移すことができる。抵抗遺伝子は、植物細胞
遺伝学の最近の進歩によって直接特定の植物遺伝子型に
与えることができるようになった。体細胞の選択、原形
黄体融合及び形質転換を利用することによって特定の薬
品に抵抗性を有する植物の遺伝子操作が可能となった。

コナー及びメレディスによる［植物Ｉ胞の遺伝子操作Ｊ
（ｃｏｎｎｅｒ　　ａｎｄ　　Ｈｅｒｅｄｉｔｈ、Ｇｅ
ｎｅｔｉｃ　　Ｈａｎｉｐｕｌａ−ｔｉｏｎ　　ｏｒ　
　Ｐｌａｎｔ　　Ｃｅ１ｌｓ、丁ｈｅ　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ　　ｏｆＰｌａｎｔＳ、＾ｃｏｍｐｒｅｈ
ｅｎｓｉｖｅ　ｔｒｅａｔｉｓｅ　Ｖｏｌ、１５Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　（１９８８）　）。

大抵の場合、こうした方法だと、個々の植物は抵抗に対
して異型接合となり、同型接合体を生ずるためには自家
受粉し、次いで後代を試験しなければならない。どのよ
うな植物毒性薬品に対しても抵抗性を有する遺伝子が使
えるとしても、最も有効な方法は、除草剤に対して抵抗
性を有する遺伝子を使用することである。アグロバクテ
リウム媒介形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍ
ｅｄｉａｔｅｄ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　）に
よってとりわけ便利な方法が得られるが、これは、若干
の潜在的に有効な遺伝子がクローン化されているからで
あり、植物中に組込んだとき、特定の除草剤に対して抵
抗性を与えるからである。形質転換によって除草剤をに
対して抵抗性を有する植物を生産すると、グリホセート
（ｇ＋ｙｈｏｓａｔｅ　）抵抗が生じ、シ工−ほかによ
る、［形質転換植物における除草剤の工学的許容度Ｊ　
　（Ｓｈａｈ　ｅｔ　ａｌ、Ｅｎｇｉ−ｎｅｅｒｉｎｇ
　Ｈｅｒｂｉ−ｃｉｄｅ　Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｉｎ　
Ｔｒａｎｓ−ａｅｎｉｃ　Ｐｌａｎｔｓ、５ｃｉｅｎｃ
ｅ、Ｖｏｌ、２３３．　　（１９８６）　）　；コーメ
イほかによる「ネイチャー誌」 （ｃｏｍａｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、Ｖｏｌ、３
１７　（１９８５）　）　；米国特許第４５３５０６０
号〔コーメイ（ｃｏｍａｉ　）　）；フィラッチーほか
による［バイオ／テクノロジー誌Ｊ　（Ｆｉｌｌａｔｔ
ｉ　ｅｔ　ａｌ、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ−ｏｖ、　
Ｖｏｌ、５　　（１９８７）　）またはクロルスルフロ
ン抵抗性が生じ、ホーフンほかによる［モレキュラーア
ンドジェネラル　ジエネティックス誌Ｊ　（）Ｉａｕｇ
ｈｎ　ｅｔ　ａｌ、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａｎｄＧｅｎ
ｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ、２１１．　（１
９８ｇ）　）　：またはホスフィノスリラム／パイアラ
ホス　抵抗性〔デ　ブロックによる（Ｄｅ　Ｂｌｏｃｋ
）が生ずる。

（実施例） 実施例　１ ハイブリッド種子を生産する時の周囲の他の花粉による
汚染に対して植物毒性薬品に抵抗性を有する優性標識遺
伝子を利用することを、カナマイシンに抵抗性を有する
ニコチアナ　プラムバギニフオーリア（旧ｃｏｔ　１ａ
ｎａｐｌｕｉｂａａｉｎｉｆｏｌｉａ　＞によッテ説明
する。

Ａ、カナマイシン抵抗の試験 カナマイシン抵抗性は、ニコチアナ　プラムバギニフオ
ーリアを用い、カナマイシン存在下で生育する緑色の子
Ｍ（カナマイシン抵抗性）の実生と白色の子葉（カナマ
イシン感受性）の実生とをスクリーニングすることによ
り手軽に研究できる。種子を一晩１１ＩＩＨのジベレリ
ンＭ　（ｇｉｂｂｅｒｅｌｌｉｃ　ａｃｔｔｉ）浸漬し
、表面を５分間３％の次亜塩素酸ナトリウムで減菌し、
次に減菌した蒸留水で徹底的に洗浄した。次に１／２　
Ｈ８壇上にまき（ムラシゲとスクーグによる［タバコ組
織培養の急速成長と生物検定に対す６改良培地Ｊ　　（
Ｈｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄＳｋｏｏｇ、Ａ　　Ｒｅｖ
ｉｓｅｄ　　Ｈｅｄｉｕｌ　ｆｏｒ　　Ｒａｐｉｄ　Ｇ
ｒｏｗｔｈａｎｄ　　Ｂｉｏａｓｓａｙｓ　　　ｗｉｔ
ｈ　　丁ｏｂａｃｃｏ　　Ｔｉ５ｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ
、Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ　　Ｐｌａｎｔａｒｕｍ、Ｖ
ｏｌ、１５（１９６２）　）　、これに寒天を加え、３
（１０　ｍＱ／Ｌのカナマイシンを追加した。

この培地を１２１　ｋｐａの圧力で２０分間オートクレ
ーブで処理し、オートクレーブ処理債にフィルターで滅
菌処理したカナマイシンを加えた。発芽用の実生は冷白
色蛍光 （１（１０ｕｍｏｌｔ　−２−５ｅｃ−１：　１日当り
１６ｈ照射し８ｈ暗所）下で２６℃で培養する。緑色対
白色の実生のスクリーニングは７乃至１０日後に可能と
なった。

この方法を適用することにより、ニコチアナ　プラムバ
ギニフォーリアの単一な緑色のカナマイシン抵抗性の実
生が多数の白色のカナマイシン感受性実生にまじってい
るのが観察された。この実生をカナマイシンの無い培地
に移した。８週間後に土壌に移した。開花期に管理しな
がら受粉を行ないカナマイシン抵抗を有する子孫をスク
リーニングして求めた。

単離したオリジナルの実生（ＮｐＫＲ）は、単一の座に
おいて、カナマイシン抵抗に基づく自然突然変異に対し
て異型接合である。このことは自家受粉した子孫と戻し
交配した子孫が、カナマイシン抵抗性実生とカナマイシ
ン感受性実生に対してそれぞれ３：１と１：１に分離す
ることから明らかである（表１）。

自家受粉した子孫から、一種類の植物（ＮｐＫＩｌ）が
カナマイシン抵抗性に対して耗種であることが確認され
た（表１）。明らかにこの植物は単一の座においてカナ
マイシン抵抗に対し同型接合であった。

表１：ニコチアナ　プラムバギニフオーリア（Ｎｐ　Ｋ
Ｒ）のカナマイシン抵抗に基づく自然突然変異における
、カナマイシン抵抗性の遺伝。３（１０　ｍｇ／Ｌのカ
ナマイシンに抵抗性を有する実生をスクリーニングして
求めた。

ａ）カナマイシン抵抗性 ｂ）カナマイシン感受性 Ｂ、ハイブリッド種子の生産 ハイブリッド種子の生産のシミュレーションを、ｔａｘ
ｉとして野生型のニコチアナ　プラムバギニフオーリア
を用い、雄親としてＮＩＩＫＲ８（カナマイシン抵抗に
対し同型接合性である）を用いて行なった。他の花粉に
よる汚染に対して３水準の管理を次のようにして行なっ
た。即ち除雄した雌親に対し： １、ＮｐＫＲＢのみの花粉を用い（きびしい管理）、２
、主としてＮｐＫＲＢの花粉と少量の野生型植物の花粉
とを用い（ゆるい管理）、 ３、　ＮｐＫＲＢと野生型植物の相当陽の花粉を用いて
（非常にゆるい管理）受粉することにより管理した。

これらの受粉管理水準に従って野生型植物の花を受粉す
るのにＭｌ）ＫＲＢを使用する場合には、緑色のカナマ
イシン抵抗性を有する真のＦ＋ハイブリッド実生は、「
他の」野生型花粉から生じた白色のカナマイシン感受性
を有する実生から容易に識別できる（表２）。

予想通りに、汚染性種子の百分率は他の花粉に対する管
理がゆるくなるのに従って増大している。本実験により
、ハイブリッド種子を生産する際に花粉汚染のおそれが
ある場合、非ハイブリッド種子が消失してゆく原理が明
らかにされた。

実施例　２ ハイブリッド種子の生産中に雌親の自家受粉を避けるた
めに植物毒性薬に対して抵抗性を有する優性標識遺伝子
を利用することに対する説明を、カナマイシンに対する
抵抗性を遺伝子工学的に与えられたニコチアナ　プラム
バギニフオーリア（Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　ｐｌｕｍ−ｂ
ａｇｉｎＨｏｌｉａ　）植物を用いて行なった。

表２：ハイブリッド種子生産時に汚染性花粉によって生
ずる種子を消失させるための、ニコチアナ　プラムバギ
ニフオーリアのカナマイシン抵抗の利用。雌親一種々の
自家受粉水準の、野生型カナマイシン感受性植物。雌親
＝ＮｐＫＲＢ（カナマイシン抵抗に対し同型接合体）。

３（１０　ｍｇ／Ｌのカナマイシンに対して抵抗性をも
つようにスクリーニングした実生の子孫。

ａ）上記を参照のこと。

ｂ）緑色の残存実生であり、カナマイシン抵抗に対し異
型接合性である。

Ｃ）　白色の瀕死状態の実生であり、カナマイシン感受
性である。

Ａ、形質転換 プラスミドｐＫＩＷＩ　６を有するアグロバクテリウム
　チュームフエイシエンス（ストレイン　ＬＢＡ　４４
（１４）　　（ヘーケマほかによる［アグロバクテリウ
ム　チュームフェイシェンスチブラスミドのｖｉｒ−及
びＴ−領域の分離に基づくバイナリ　プラント　ベクト
ル戦略」（ｌｌｏｅｋｅｎａ　ｅｔ　ａｔ、Ａ　ｂｉｎ
ａｒｙ　ｐｌａｎｔ　ｖｅｃｔｏｒＳｔｒａｔｆｉ（Ｉ
Ｖ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　５ｅｐａｒａｔｒｏｎ　Ｏｒ　
ｖｉｒ−ａｎｄＴ−ｒｅｇｉｏｎ　　ｏｒ　　ｔｈｅ　
　ＡＧｒｏｂａＣｔｅｒｉＵａ＋　　ｔｕｍｅ−ｒａｃ
ｉｅｎｓ　Ｔｉｐｌａｓｌｉｄ　、　Ｎａｔｕｒｅ、Ｖ
ｏｌ、３０３　Ｐ１７９−１８０　　（１９８３）　）
　）を含むバイナリ　ベクトルシステム（ｂｉｎａｒｙ
　ｖｅｃｔｏｒ　ｓｙｓｔｅｍ）を形質転換に使用した
。このプラスミドにはＴ−ＤＮＡの左右の境界の間に植
物細胞として表現できる二つのキメラ遺伝子がある。こ
のうちの−方の遺伝子は抗生物質カナマイシンに対する
抵抗性を与え、しかも、オクトバイン合成プロモーター
とポリＡ信号（０Ｃ３−ＮＰＴＩＩ−ＣＯ３”）のコン
トロールを受けながら、ネオマイシンホスホドラスフア
ーゼ■遺伝子からのく細菌性トランスボゾン丁Ｎ５から
の）暗号付は領域を構成している。そして今一つの遺伝
子は、クロラムフェニコールアセチルトランスフアーゼ
（ｃＡＴ）活性を与え、しかもマノバイン合成プロモー
ターとオクトバイン合成ポリＡ信号のコントロールを受
けながらく細菌性トランスボゾンからの）　ＣＡＴの暗
号付は領域を構成している。

ニコチアナ　プラムバギニフォーリアのインビトロ植物
からの葉の切片をアグロバクテリウム　チュームフエー
シエンスの懸濁液に浸漬した〔−晩ＨＧ／Ｌのブイヨン
で培養−ガーフィンケル及びネスターによる、［根こぶ
病！！！痕形酸形成クトバイン代謝に冒されたアグロバ
クテリウム　チュームフェーシエンス」（Ｇａｒｆｉｎ
ｋｅｌ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ
ｉｕｎ＋ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　ＡＨｅｃｔｅｄ　ｉ
ｎ　Ｃｒｏｗｎ　ＧａｌＴｕｍｏｕｒｉｇｅｎｅｓｉｓ
　ａｎｄ　０ｃｔｏｐｉｎｅ　ＭｅｔａｂｏｌｉｓｍＪ
ｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｖｏ
ｌ、１４４．　（１９８０）　）〕次に拭って乾燥し更
にＲ）４０ＰＪ１８地でｊ８養した。

シドロフほかによる、「スレオニン脱アミノ酵素が不足
したイソロイシンが必要なニコチアナ植物Ｊ　　（Ｓｉ
ｄｏｒｏｖｅｔ　ａｌ、Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｅｑ
ｕｉｒｉｎｇ　　Ｎ１ｃｏｔｉａｎａ　Ｐｌａｎｔ　Ｄ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　１ｎＴｈｒｅｏｎｉｎｅ　　Ｄｅ
ａｍｉｎａｓｅ、Ｎａｔｕｒｅ　Ｖｏｌ、２９４　　（
１９８１）〕。２日後に葉片を、５（１０１１１（１／
Ｌのセフォタキシム（アグロバクテリウムの異常増殖防
止のため）を追加し、３（１０　ｍ（１／Ｌのカナマイ
シン（形質転換した植物ｍｒｒａを選択するため）を追
加した前記と同一の培地に移した。

再生したカナマイシン抵抗の苗条を、Ｈ８塩（ムラシゲ
及びスクーグ（Ｈｕｒａｓｈｉｇｅ＆５ｋｏｏＯ）　、
　１９６２年）プラス３％の蔗糖及び０．８％の寒天に
植え、次いで土壌に移した。実施例１でのべたように、
開花期に管理しながら受粉を行ない、その結果得られた
子孫をスクリーニングしてカナマイシン抵抗のあるもの
を得た。

Ｂ、カナマイシン抵抗の試験 カナマイシン抵抗の遺伝は、ニコチアナプラムバギニフ
ォーリアを用い、３（１０１１１（＋／Ｌのカナマイシ
ンを含有している培地に播種後７〜１０日で緑色の子葉
（カナマイシン抵抗性）の実生と白色の子葉（カナマイ
シン感受性）の実生をスクリーングすることにより手軽
に研究できる。遺伝を１０の形質転換した植物を用いて
研究したが、ここではこれら植物のうちただ一種類のも
の（８９丁、　１７）の結果について報告する。

形質転換したオリジナルの植物Ｎ１）Ｔ　１７は、カナ
マイシン抵抗性遺伝子の単一の座への挿入に対し異型接
合であった。このことは、自家受粉した子孫と戻し交配
した子孫が、カナマイシン抵抗性実生とカナマイシン感
受性実生に対しそれぞれ３：１と１：１に分離すること
から明らかである（表１）。自家受粉した子孫から、一
種類の植物（ＮＤＴ　１７Ｄ　）がカナマイシン抵抗性
に対して純種であることが確認された（表３）。明らか
にこの植物は単一の座においてカナマイシン抵抗性に対
し同型接合であった。

挿入したカナマイシン抵抗性遺伝子に対し異型接合性で
ある大量の個体群（ｓ、ｏｏｏ以上）の実生を生成する
ためにＮｐＴ　１７０を野生型に戻し交配した。カナマ
イシン抵抗の遺伝的不安定性は全てこのような個体群の
中の生焼けで白色のカナマイシン感受性の出現によって
認識できる。全ての実生がカナマイシン抵抗性であり（
表３）、高い遺伝的安定性を示している。従って、アグ
ロバクテリウムを媒介として形質転換によって植物中へ
導入した植物毒性薬品抵抗性を有する遺伝子は、安定性
に富み、作物栽培品種の種子の純度を監視する遺伝標識
として使用できる。

表３：ニコチアナ　プラムバギニフォーリアの形質転換
植物（、Ｎｐ丁１７）におけるカナマイシン抵抗の遺伝
。３（１０１１（１／Ｌのカナマイシン抵抗性のある実
生子孫をスクリーニングした。

ａ）カナマイシン抵抗性 ｂ）カナマイシン感受性 Ｃ，ハイブリッド種子の生産 ハイブリッド種子生産のシミュレーションを、雌親とし
て野生型ニコチアナ　プラムバギニフォーリア植物を用
い、雄親として８１１丁１７Ｄ（カナマイシン抵抗に対
し同型接合）を用いて行なった。様々な開花段階におい
て雌親を除雄することによって雌花粉汚染の管理水準を
変化させた。ニコチアナ　プラムバギニフオーリアは開
花受精性であり、花冠が開きかつ花冠の色素形成がすす
む直前に花が自家受粉する。雌親の自家受粉に対し３水
準の管理水準が設定された。

１、きびしい管理は、花のつぼみの長さが２〜３　ｃｍ
になり花粉が飛散しはじめる時期よりも充分前に除雄す
ることによって実施され、２、ゆるい管理は、花冠がま
さに最大長に達し、かつ花粉が飛散しはじめる時に、長
さ４〜５ｃｍの花を除雄することによって実施され、そ
して ３、非常にゆるい管理は、花が丁度間いている最中であ
って、しかも花冠の色素形成が終了後に「除雄」するこ
とによって実施された。

野生型植物の花をこれらの受粉管理水準に従って受粉す
るためにＮｐ丁１７０を使用するならば、緑色のカナマ
イシン抵抗性を有する真のＦ１ハイブリッド実生を、ａ
ｍの自家受粉によって生ずる白色のカナマイシン感受性
の実生から容易に識別できる（表４）。予想通り、汚染
性種子の百分率はＮ親の自家受粉の管理がゆるくなるに
つれて増大している。本実験により、ハイブリッド種子
生産中に自家受粉に基づく花粉汚染の危険がある場合、
非ハイブリッド種子が消失してゆく原理が明らかにされ
た。

ＮｐＫＲＢ（実施例１）とＮｐＴ　１７０　　（実施例
２）の種子が、ニューシーラント、クライストチャーチ
市　（ｃｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ、Ｎｅｗ　２ｅａｌａ
ｎｄ）のザ　クロップ　ジ１！−ムダラズム　リゾース
センター　クロップ　リサーチ　デイビジョン　ＤＳＩ
Ｒ（化学技術研究庁）、（ｔｈｅ　ＣｒｏｐＧｅｒｍｐ
ｌａｓｍ　Ｒｅ５ｏｕｒｃｅ　Ｃｅｎｔｒｅ、Ｃｒｏｐ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＤｉｖｉｓｉｏｎ、ＤＳＩＲ，Ｐｒ
１ｖａｔｅ　Ｂａｇ　）に保管されており、入手できる
。そして収集物の管理者から依頼次第入手できる。

表４二ニコチアナ　プラムバギニフォーリアの雌親の自
家受粉から生じた種子を消失させるためのカマナイシン
抵抗の利用。雌親＝色々な自家受粉水準の野生型カナマ
イシン感受性植物。雄親−８９丁１７Ｄ　　（カマナイ
シン抵抗に対し同型接合体）。３（１０　ｕ／Ｌのカナ
マシンに対し抵抗性をもつようにスクリーニングした実
生子孫。

ａ）上記を参照のこと。

ｂ）緑色の残存実生であり、力犬マイシン抵抗に対し異
型接合性である。

Ｃ）白色の瀕死状態の実生であり、カナマイシン感受性
である。

【図面の簡単な説明】

以下に図面について簡単に説明する。 図１（ｒｉｇ、１）は、ハイブリッド種子を生産する場
合における、植物毒性薬品に対する抵抗性の遺伝を図式
化したものである。 １・・・同型接合感受性、２・・・同型接合抵抗性、３
・・・ハイブリッド第１代、４・・・異型接合抵抗性、
５・・・交配を表わす記号 図２（Ｆｉ（＋、２）はハイブリッド種子を生産する１
今に、９ける、植物毒性薬品の利用を図式化したもので
ある。 １・・・第１代親、２・・・交配を表わす記号、３・・
・第２代親、４・・・真のハイブリッド種子、５及び６
・・・非ハイブリッド種子。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）実質的に純粋なＦ＿１ハイブリッド植物個体群に
   を形成する方法において、前記方法は： （ａ）交互に配置されたプロットに雄親植物と雌親植物
   を植えること （但し、雄親植物は植物毒性薬品に抵抗性を有し、前記
   抵抗性は同型接合優性核標識遺伝子のみに起因し、前記
   抵抗性遺伝子は前記雌親植物には存在しない）と； （ｂ）前記雌植物を前記雄植物の花粉で受精することと
   ； （ｃ）前記プロットの雌植物のみから生じた受精した種
   子を収穫することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で収穫した受精した種子に前記植
   物毒性薬品を与えること からなることを特徴とする方法。 （２）両親が自家和合性であることを特徴とする請求項
   （１）記載の方法。 （３）一方の親のみが自家不和合性であることを特徴と
   する請求項（１）記載の方法。 （４）前記植物毒性薬品が除草剤であることを特徴とす
   る請求項（１）乃至（３）記載の方法。 （５）前記植物毒性薬品が抗生物質であることを特徴と
   する請求項（１）乃至（３）記載の方法。 （６）前記抗生物質がカナマイシンであることを特徴と
   する請求項（５）記載の方法。 （７）両親が自家不和合性である場合の、実質的に純粋
   なＦ＿１ハイブリッド植物個体を形成する方法において
   、前記方法は： （ａ）第１代の親と第２代の親を交互に配置したプロッ
   トで植えるか或はランダムに混合して植えること（但し
   、第１代の親植物は植物毒性薬品Ａに抵抗性を有し、第
   ２代の親植物は植物毒性薬品Ｂに抵抗性を有し、前記植
   物毒性薬品Ａ又はＢに対する前記抵抗は、各親において
   、同型接合優性核標識遺伝子のみに起因し、薬品Ａに対
   する前記遺伝子の抵抗性は前記第２代の親植物には存在
   せず、そして薬品Ｂに対する前記遺伝子の抵抗性は前記
   第１代の親植物には存在しない）と； （ｂ）前記第１代の親植物を前記第２代の植物の花粉で
   受精すること及び前記第２代の親植物前記第１代の親植
   物の花粉で受精することと； （ｃ）第１代の親植物の受精した種子と第２代の親植物
   の受精した種子を収穫することと； （ｄ）ステップ（ｃ）で収穫した受精した種子に前記植
   物毒性薬品ＡとＢの双方を与えること からなることを特徴とする方法。 （８）前記植物毒性薬品が除草剤であることを特徴とす
   る請求項（７）記載の方法。 （９）前記植物毒性薬品が抗生物質であることを特徴と
   する請求項（７）記載の方法。 （１０）前記抗生物質がカマナイシンであることを特徴
   とする請求項（９）記載の方法。（１１）前記種子を植
   える前にステップ（ｄ）を実施することを特徴とする（
   １）乃至（１０）記載の方法。 （１２）前記種子から実生が生じた後にステップ（ｄ）
   を実施することを特徴とする請求項（１）乃至（１０）
   記載の方法。 （１３）Ｆ＿１ハイブリッド植物個体群の純度の試験方
   法において、前記試験方法は； （ａ）交互に配置されたプロットに雄親植物と雌親植物
   を植えること（但し、雄親植物は植物毒性薬品に抵抗性
   を有し、前記抵抗性は同型接合優性核標識遺伝子のみに
   起因し、 前記抵抗性遺伝子は前記雌親植物には存在しない）と； （ｂ）前記雌植物を前記雄植物の花粉で受精することと
   ； （ｃ）前記プロットの雌植物のみから生じた受精した種
   子を収穫することと； （ｄ）サンプルとして少量の前記種子を植えることと； （ｅ）発生後の実生に前記植物毒性薬品を与えることと
   ； （ｆ）前記植物毒性薬品に対して抵抗性を有する実生の
   百分率を求めること からなることを特徴とする試験方法。 （１４）両親が自家不和合性である場合のＦ＿１ハイブ
   リッド植物個体群の純度の試験方法において、前記方法
   は； （ａ）第１代の親と第２代の親を交互に配置したプロッ
   トで植えるか、或はランダムに混合して植えること（但
   し、第１代の親植物は植物毒性薬品Ａに抵抗性を有し、
   第２代の親植物は植物毒性薬品Ｂに抵抗性を有し、 前記植物毒性薬品Ａ又はＢに対する前記抵抗は、各親に
   おいて、同型接合優性核標識遺伝子にのみに起因し、薬
   品Ａに対する前記遺伝子の抵抗性は前記第２代の親植物
   には存在せず、そして薬品Ｂに対する前記遺伝子の抵抗
   性は前記第１代の親植物には存在しない）と； （ｂ）前記第１代の親植物を前記第２代の植物の花粉で
   受精することと前記第２代の親植物を前記第１代の親植
   物の花粉で受精することと； （ｃ）第１代の親植物の受精した種子と第２代の親植物
   の受精した種子を収穫することと； （ｄ）サンプルとして少量の前記種子を植えることと； （ｅ）発生後の実生に前記植物毒性薬品Ａ及びＢを与え
   ることと； （ｆ）前記植物毒性薬品Ａ及びＢに対して抵抗性を有す
   る実生の百分率を求めること からなることを特徴とする試験方法。 （１５）前記核標識遺伝子を植物形質転換法で挿入する
   ことを特徴とする請求項（１）乃至（１４）記載の方法
   。 （１６）前記植物形質転換法がアグロバクテリウムで媒
   介された転位（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ−ｍｅｄｉ
   ａｔｅｄｔｒａｎｓｆｅｒ）であることを特徴とする請
   求項（１５）記載の方法。 （１７）前記植物形質転換法が直接的ＤＮＡ取り込み形
   質転換であることを特徴とする請求項（１５）記載の方
   法。 （１８）前記核標識遺伝子が体細胞培養から選ばれるこ
   とを特徴とする請求項（１）乃至（１４）記載の方法。 （１９）前記核標識遺伝子がトランスファー原形質体融
   合から選ばれることを特徴とする請求項（１）乃至（１
   ４）記載の方法。 （２０）前記核標識遺伝子が植物突然変異生成を誘導し
   た後に選ばれることを特徴とする請求項（１）乃至（１
   ４）記載の方法。 （２１）前記核標識遺伝子が、所望の遺伝子を有する親
   植物を選択することによって存在することを特徴とする
   請求項（１）乃至（１４）記載の方法。 （２２）実質的にはここ以降で、しかも二つの実施例と
   添付図面のうちの図１について説明するような、実質的
   に純粋なＦ＿１ハイブリット植物個体を形成する方法。 （２３）実質的にはここ以降で、しかも添付図面の図２
   について説明するような、両親が自家不和合であること
   を特徴とする実質的に純粋なＦ＿１ハイブリット植物個
   体を形成する方法。 （２４）実質的にはここ以降で、しかも二つの実施例と
   添付図面について説明するような、Ｆ＿１ハイブリッド
   植物個体群の純度の試験方法。