NL8701451A - Preparaat voor de bestrijding van mastitis bij herkauwers, werkwijze voor de bereiding daarvan en werkwijze voor het behandelen van herkauwers. - Google Patents

Description

« o *

Nw- 9159

Titel: Preparaat voor de bestrijding van mastitis bij herkauwers, werkwijze voor de bereiding daarvan en werkwijze voor het behandelen van herkauwers»

De uitvinding heeft betrekking op een preparaat voor het bestrijden van mastitis (ontsteking van de melkklier) bij herkauwers, zoals koeien, schapen, geiten, enz. Gram-positieve bacteriën, waaronder 5 streptococcen, staphylococcen en corynebacteriën, zoals Str. agalactiae, Str» dysgalactiae, Str» uberis,

Str» bovis, Str» zooepidemicust Staph, aureus, Staph, epidermidis en Corynebacterium pyogenes, enz. veroorzaken mastistis of vervullen een pathogene rol in de 10 melkklier bij herkauwers. De ziekte is nadelig voor melkproduktie en -kwaliteit en voor de gezondheid van het dier. Deze aandoening veroorzaakt daardoor grote economische schade in de melkveehouderij en de veeteelt (1, 5, 6).

15 Mammaire infecties ontstaan als een aantal bacteriën via de tepelingang de melkklier binnendringt en zich vermenigvuldigt in de melk die zich in het lumen bevindtj van daaruit kunnen de bacteriën eventueel het mammaire weefsel invaderen. De infecties 20 zijn gewoonlijk chronisch van aard; het ziekteverloop is meestal sub-klinisch en kent zo nu en dan oplevingen met klinische verschijnselen. Bacteriesoorten en -stammen die over sterke toxines beschikken veroorzaken vaker klinische ziekteverschijnselen (1).

25 Bij de interactie tussen gram-positieve bacteriën en de gastheer kunnen verschillende mechanismen van verworven immuniteit een rol spelen. Een antitoxine-antilichaam, zoals dat bijvoorbeeld geïnduceerd kan worden door een vaccin waarin een toxoïde 30 is opgenomen, vermindert zo de schade die wordt veroorzaakt door bacteriën die dit toxine produceren, en helpt de functionele integriteit van andere mechanismen Ö70145 1 ir * -2- van immuniteit te bewaren. Het belang van opsonine-type antilichamen bij door gram-positieve bacteriën veroorzaakte infecties is duidelijk vastgesteld (7, blz. 627-665) en preparaten die opsonines induceren 5 verschaffen een betrekkelijke bescherming tegen infec-tieuze mastitis.

Het is merkwaardig dat er in het lumen van niet-ontstoken melkklieren meestal slechts zeer weinig fagocyten aanwezig zijn, evenals slechts lage 10 concentraties immunoglobulines en zeer lage niveaus van C|42 -complement-activiteit, allen factoren die een sleutelrol vervullen in aangeworven immuniteit tegen gram-positieve bacteriën. Ontsteking van de melkklier is een gecompliceerd verschijnsel en omvat 15 een toegenomen migratie van immunoglobulines, complement-factoren en leucocyten door de endotheel- en epitheel-barrières naar het lumen. Er is gevonden, dat een vooraf bestaande geringe ontsteking van de klieren een zekere bescherming tegen infectie verschaft en 20 in sommige gevallen heeft een vroege ontstekings- respons tegen binnendringende bacteriën de verwijdering van de infecties bevorderd (2). Een kunstmatige relatieve versterking van de ontstekingsreactie kan ook bijdragen tot eliminatie van gevestigde infecties (17) .

25 De meeste antigenen (uitzonderingen zijn bijvoorbeeld toxines) veroorzaken geen ontsteking wanneer zij in het lumen van normale klieren worden toegediend. Bij tevoren experimenteel gevoelig of overgevoelig gemaakte dieren, d.w.z. gevaccineerd 30 met de antigenen onder omstandigheden die een toestand van overgevoeligheid induceren die aangeduid wordt met "Acquired Mammary Hypersensitivity" (AMH), leidt intramammaire toediening van de homologe antigenen tot een vroege, voorbijgaande en verlengde ontsteking 35 (3). Er bestaan aanwijzingen dat lymfocyten die specifiek zijn voor de antigenen van het vaccin en die in de melk en de klier van de gevoelig gemaakte dieren 370 ί 45 1 -3-

Sr aanwezig zijn, voorname effectoren van AMH zijn, zij het in gecompliceerde interactie met andere cellen en mogelijk humorale factoren, en dat zij geactiveerd worden door intramammaire antigenen en dan het optreden 5 van een ontsteking bemiddelen (3, 4).

Men heeft daarom verondersteld dat indien dieren door vaccineren gevoelig gemaakt zouden kunnen worden tegenover bacteriële antigenen, de aanwezigheid van homologe bacteriën in de melkklier een immuun-10 bemiddelde ontstekingsreactie zou ontketenen die heilzaam zou werken, in het bijzonder in dieren die beschikken over ook andere immuniteiten zoals antitoxine en opsonine-type immuniteit. De overgevoeligheidsreactie is vooral dan wenselijk, wanneer de anergische immuni-15 teitsmechanismen niet in staat zijn om af te rekenen met de aanwezige bacteriën (3, 4, 9).

Tot nu toe zijn er diverse vaccins en vaccine-ringswerkwijzen toegepast of onderzocht voor het bestrijden van mastitis bij herkauwers, waarbij diverse 20 antigene preparaten van bacteriën, zoals bacterinen, cel-lysaten, somatische componenten, toxoïdes, of combinaties van deze, levende verzwakte bacteriën of geïnactiveerde volledige in vitro cultures gebruikt werden. Deze hebben in enkele gevallen een relatieve 25 bescherming gegeven die veelal te meten was in termen van lagere frequentie en/of geringere intensiteit van klinische verschijnselen eerder dan in termen van bescherming tegen colonisatie of infectie.

Mammaire infecties en antigenisch gecompliceer-30 de vaccins induceren op een ongeordende en niet selectieve wijze zeer uiteenlopende immuunresponsen tegen een verscheidenheid aan bacteriële antigenen. Deze responsen omvatten in een aantal gevallen bijvoorbeeld de vorming van voordelige opsonines en antitoxines, 35 d.w.z. immunoglobulines van het correcte isotype tegen geschikte oppervlakte antigenen (opsoninogenen) 870145 1 Λ -4- en toxines, en veelal niet ter zake dienende en pathogene humorale en cellulaire responsen tegen dezelfde en andere antigenen, waarbij bijvoorbeeld overgevoeligheidsreacties tegenover peptidoglycan en cytofiele antigenen 5 in dit opzicht berucht zijn. Somatische antigenen in het bijzonder induceren in die omstandigheden cellulaire responsen en het adjuvant effect van peptidoglycan is in dit verband bekend, terwijl oplosbare exoantigenen slechts humoraal immunogeen zijn of 10 zelfs tolerogeen qua cellulaire immuniteit of qua bepaalde immunoglobuline isotypes. Deze gecompliceerde reacties verhogen gewoonlijk de vatbaarheid voor volgende infecties en het pathogene karakter van deze infecties. De pathogenese van bacteriële mastitis 15 vindt daardoor oorsprong deels in de direkte effekten van de micro-organismen en deels in verworven immunologische reacties tegen antigenen ervan (1,10,11,12).

Volgens de uitvinding is nu gevonden, dat bacteriële antigenen van een bepaalde groep dienst 20 kunnen doen als signalen om immunologisch gemediëerde mammaire ontsteking uit te lokken die uitsluitend beschermend werkt. De uitvinding geeft aan welke antigenen of antigene determinanten gebruikt moeten worden in de preparaten om verworven mammaire overgevoe-25 ligheid te induceren en, omgekeerd, welke daarvan moeten worden uitgesloten. Verworven mammaire overgevoeligheid kan uitsluitend beschermend en niet pathogeen zijn als zij immunospecifiek is voor oplosbare exoantigenen van levende, bij mastitis betrokken gram-30 positieve bacteriën, d.w.z. voor antigene determinanten van moleculen die onder in vivo omstandigheden door levende bacteriën worden uitgescheiden of afgescheiden en oplosbaar zijn.

Terwijl antigenen met deze eigenschappen 35 verrassenderijze nuttig blijken te zijn door te kunnen dienst doen als een snel en fysiologisch signaal 37 0145 1 9 -5- in kunstmatig gesensitizeerde dieren, zijn equimolaire hoeveelheden van somatische antigenen inefficiënt gebleken in dit verband en blijken onoplosbare antigenen zoals bijvoorbeeld cytofiele antigenen en slechts 5 langzaam afbreekbare produkten, zoals onoplosbare peptidoglycanen uit de celwand of bijvoorbeeld na celdood vrijkomende somatische antigenen, zich op plaatsen in weefsel af te zetten en/of een bron te vormen die verworven overgevoeligheidreacties uitlokken 10 die in de tijd niet in juist verband staan met een beschermende functie.

Ook die oplosbare antigenen volgens de uitvinding die in feite geen directe virulentiefactoren -zijn en die voorheen geen rol vervulden in immuniteit 15 of die indirekt pathogeen bleken te zijn bijvoorbeeld door binding van complement-fixerend antilichaam en complementfixatie in eerder geïnfecteerde of op ongeschikte wijze gevaccineerde dieren, blijken efficiënt de aanwezigheid te kunnen signaleren van homologe 20 bacteriën in de melkklier na kunstmatige inductie van overgevoeligheid door correcte vaccinatie van de gastheer. Infecties in de melkklier of in ander weefsel daarentegen induceren geen ongecompliceerde AMH tegenover deze antigenen.

25 De uitvinding maakt het mogelijk om- verbeterde vaccins te ontwerpen; er kunnen vaccin-preparaten worden samengesteld en ontworpen om selectief AMH op te wekken die specifiek is voor oplosbare exo-antigenen. Dergelijke preparaten kunnen worden geïnte-30 greerd in vaccins die ook humorale en/of andere cellulaire immuniteiten induceren, bijvoorbeeld humorale antitoxine en opsonine-type immuniteit.

T- en B-lymfocyten vormen in een gecompliceerde interactie met andere celtypen en humorale factoren 35 een regelsysteem voor cellulaire overgevoeligheid in het algemeen en voor AMH in het bijzonder. Aangezien 87ö145 1 > ΊΜρ -6- oplosbare niet deeltjesvormige, niet geaggregeerde, niet cytofiele antigenen die vrij in de lichaamsvloeistoffen kunnen diffunderen immunogeniciteit missen met betrekking tot T- of B-cel afhankelijke overgevoeligheid, 5 hetgeen de basis voor AMH is, en omdat antigenen tolerogeen zijn onder omstandigheden waarin ze niet immunogeen zijn (7, blz. 578), dienen cellulaire overgevoeligheid bevorderende werkwijzen, preparaten en adjuvantia te worden toegepast. Hoewel lage concentra-10 ties antilichamen van bepaalde isotypen tegen de moleculen die een rol vervullen in AMH mogelijk een coöperatieve of modulerende effectorfunctie kunnen hebben bijvoorbeeld bij signaalverwerking in vivo, is het gebruik van op humorale respons gerichte werkwij-15 zen, preparaten of adjuvantia af te raden. Overmatige concentraties van bijvoorbeeld complement-fixerende signaal-antigenen-specifieke antilichamen zouden de signaalfunctie kunnen dempen en zouden door vorming van antigeen-antilichaam complexen en complement 20 activering incoördinatie van chemotaxis veroorzaken en op ongewenste wijze leiden tot het bezetten van de Fc en C receptoren van effector-fagocyten (8).

Er zijn ook aanwijzingen dat Arthus-type overgevoeligheid niet in staat is in normale of in ontstoken melkklieren 25 de gezochte immigratie van immuunfactoren te bemiddelen.

Bovendien hebben werkwijzen, preparaten en adjuvantia die de synthese van antilichamen specifiek bevorderen de neiging om selectief de inductie van cellulaire overgevoeligheid te remmen (7, blz. 562). De vaccinering 30 moet daarom een immuun-respons tegen signalerende antigenen oproepen die zeer verschillend is van de bijvoorbeeld tegen toxines gewenste humorale respons.

De preparaten volgens de uitvinding bevatten derhalve één of meer oplosbare exo-antigenen van 35 bij mastitis betrokken gram-positieve bacteriën of immunochemische homologa daarvan, in een gemodificeerde 870 M5 1 -7- vorm welke het vermogen tot opwekken van een verworven mammaire overgevoeligheid creëert of vergroot. Onder "gemodificeerd1'' wordt hier elke geschikte vorm verstaan die tot verworven mammaire gevoeligheid leidt. Geschikte 5 vormen zijn onder meer deze met covalent gebonden lipiden of met niet covalent gebonden ionische oppervlakte-actieve stoffen. Ook wordt hieronder verstaan de combinatie met een geschikt adjuvans, waarbij de keuze van het adjuvans en de geschikte dosis van 10 de exo-antigenen het mogelijk maken om de ongewenste humorale reeponsen te vermijden.

Met de term "immunochemische homologa daarvan" wordt onder andere gedoeld op delen van de exo-antigenen die een of meer geschikte antigene determinanten 15 bevatten, op antigenisch homologe structuren, en op synthetisch bereide moleculen die een in essentie overeenkomstige struktuur bevatten.

De door Freund ontwikkelde water-in-olie-emulsies (Freunds Adjuvantia) zijn zeer werkzame 20 adjuvantia voor humorale en cellulaire immuniteit in herkauwers, waarbij de dosis van het toegediende antigeen bepalend is voor het sturen van de respons: geringe doses in de orde van microgrammen voor een gemiddeld eiwit-antigeen leiden tot een intense cellulaire 25 overgevoeligheid, terwijl hoeveelheden van milligrammen slechts leiden tot een krachtige vorming van antilichamen. Anorganische adjuvantia in gelvorm, aluin, aluminiumhy-droxyde of aluminiumfosfaat helpen slechts bij de vorming van antilichamen en remmen zelfs selectief 30 de vorming van cellulaire overgevoeligheid (7, blz. 562).

Bepaalde antigenen die in natieve toestand antilichamen opwekken en weinig of geen cellulaire overgevoeligheid, wanneer zij worden toegediend in oplosbare vorm in een inerte drager (bijvoorbeeld 35 eiwitten in een fysiologische zoutoplossing) kunnen door chemische conjugatie met bijvoorbeeld lipiden, 870 1451

Pfyu, -8- zoals dodecanoylgroepen gemodificeerd worden en stimuleren dan selectief een sterke langdurige cellulaire overgevoeligheid, zelfs na éénmalige toediening in een microgrammendosis zonder adjuvans (13), en dergelij-5 ke conjugaten zijn bruikbaar voor het opwekken van verworven mammaire overgevoeligheid bij herkauwers.

Vele soorten lipiden, variërend van eenvoudige koolwaterstoffen tot gecompliceerde derivaten zijn bruikbaar voor het inbouwen van cellulaire overgevoeligheid 10 bevorderende adjuvans werking bij antigenen. Ionische oppervlakte-actieve lipiden, zoals dimethyldioctadecyl-ammoniumbromide, die niet covalent aan de antigenen binden, werken op eenzelfde manier. Een dubbele conjugatie van heterologe dragermoleculen, zoals eiwitten, 15 met bijvoorbeeld vetzuren en antigene determinanten of haptenen, bijvoorbeeld afgeleid van niet immunogene of van repetitieve exo-antigenen zoals polysacchariden -die als dusdanig en in zuivere vorm niet immunogeen zijn qua cellulaire immuniteit - kunnen complexen 20 geven die verworven mammaire overgevoeligheid kunnen induceren die specifiek is voor de oorspronkelijke antigenen (18, 13).

De oplosbare bacteriële exoprodukten die als signaal nuttig zijn in AMH moeten als zodanig 25 niet immunogeen zijn in termen van AMH maar moeten kunstmatig immunogeniseerbaar zijn; de constante voorwaarde is dat zij antigenisch zijn.

De antigene determinanten waartegen AMH moet worden opgewekt bevinden zich op oplosbare exo-30 antigenen die in vivo door bacteriën in de melkklier worden geproduceerd tijdens het verloop van de besmetting of infectie. Hoewel de aard en de hoeveelheid van deze antigenen die door de bacteriën tot expressie worden gebracht onder genetische regulering staan, 35 en mede afhankelijk zijn van de levens-en groeifase van de bacteriën (logaritmische groei, groeistop, 870 ik5 1 -9- onevenwichtige groei), van het stadium van de bacterie-gastheer relatie waarin zij zich bevinden en ook van bestaande immuniteiten van hun gastheer, kunnen de in vivo-omstandigheden in vitro worden nagebootst 5 voor het voortbrengen van een complex exoprodukt waaruit de relevante antigenen kunnen worden verkregen. Het is volgens de uitvinding mogelijk op dit gebied verdere methoden te ontwikkelen en een gedetailleerde immunoche-mische karakterisering van de relevante antigene XO determinanten maakt het voor de deskundige mogelijk om ook immunochemische homologa ervan in natieve, gemodificeerde of gederivatiseerde vorm toe te passen, of de determinanten via alternatieve methoden zoals organische synthese of genetische manipulatie te 15 bereiden.

Antigenen verschillen sterk in hun intrinsiek immunogeen vermogen en de optimale dosis voor een bepaald antigeen om verworven mammaire overgevoeligheid op te wekken is afhankelijk van de immunochemische 20 aard, van de mate waarin en de wijze waarop het eventueel gederivatiseerd is en van de daarbij eventueel gebruikte adjuvantia, van de diersoort waarbij het gebruikt moet worden, van de toedieningsroute en van andere variabelen.

25 Het is bekend dat variaties in de toedienings route van het antigeen een belangrijke invloed hebben op de aard van de immuunrespons. Het uitblijven van een respons of tolerantie of gespleten tolerantie (split-tolerance) met betrekking tot cellulaire overge-30 voeligheid kunnen zich voordoen wanneer men oplosbare antigenen in een inerte drager toedient via de intraveneuze, perorale, interstitiële of intraluminale weg (in de melkklier), terwijl de intradermale weg in het algemeen de cellulaire overgevoeligheid bevordert.

35 De aard van het gekozen adjuvans kan eveneens de fysiologisch aanvaardbare toedieningswegen beperken.

870 f451 -10-

Er bestaat nog geen overtuigend bewijs voor het bestaan van een afzonderlijk en locaal, melkkliergebonden systeem van cellulaire overgevoeligheid in herkauwers.

De intramammaire weg kan niettemin gunstig zijn en 5 kan worden toegepast door geschikte preparaten en toedieningsschema's te gebruiken.

Het is onwaarschijnlijk dat afzonderlijke oplosbare exo-antigenen of de set van oplosbare exo-antigenen aanwezig in een complex totaal exoprodukt 10 qua specificiteiten en kwantitatieve verhoudingen optimaal zijn voor inductie en voor latere elicitatie van verworven mammaire overgevoeligheid, maar de uitvinding maakt het mogelijk oplosbare exo-antigenen individueel en in combinaties kwantitatief te onderzoeken .. 15 op hun potentie in de inductiefase en in de elicitatie-fase tijdens het verloop van een infectie en het is daardoor mogelijk om antigeenpreparaten kunstmatig samen te stellen voor het opwekken van optimale AMH die eventueel multi-antigeen-specifiek is. Evenzo 20 kan men preparaten volgens de uitvinding geheel of gedeeltelijk aanpassen aan de verscheidenheid qua ipnunospecificiteit van de exo-antigenen onder de verschillende isolaten en stammen en zelfs soorten bacteriën, door in één of meer vaccins gemeenschap-25 pelijke antigenen of gemeenschappelijke antigene determinanten op te nemen of door verschillende antigenen te combineren zodat de vaccins multivalent worden.

De selectieve druk voor genetische diversificatie en de feitelijk tot expressie gebrachte verscheidenheid 30 kunnen voor functioneel verschillende antigenen, bijvoorbeeld signaal-antigenen en toxines verschillend zijn en aangezien vaccins soms moeten bestaan uit een stel van twee of meer inocula met daarin functioneel verschillende antigenen of incompatibele formuleringen, 35 kunnen deze inocula verschillen in valentie. Wat betreft de bestaansduur van AMH na inductie is bekend 870145Ί -11- dat cellulaire overgevoeligheid in veel gevallen langdurig is en soms langer blijft bestaan dan humorale immuniteit. Dit schept verdere mogelijkheden om enerzijds cellulaire en anderzijds humorale immuniteit inducerende 5 inoculaties in tijd onafhankelijk uit te voeren om een langdurende geïntegreerde immuniteit in stand te houden door booster-injecties.

Het uitvindingsconcept is ook van toepassing bij de ontwikkeling van aangepaste preparaten voor 10 vaccinatie van dieren die besmet zijn of geweest zijn en wier immuunsysteem mogelijk reeds op ongewenste wijze geïnstrueerd is door dit eerder contact met de relevante antigenen en ook kunnen preparaten en formuleringen ontwikkeld worden voor curatieve doeleinden. 15 Technieken van genetische manipulatie van de antigenen volgens de uitvinding kunnen leiden tot nuttige resultaten, zoals homologe of heterologe micro-organismen die in staat zijn als vaccin in vivo gebruikt te worden en rechtstreeks AMH te induceren tegenover 20 de gewenste antigenen (16).

De uitvinding zal nu nader worden toegelicht aan de hand van een voorbeeld, dat echter geenszins als beperkend mag worden opgevat. Equivalente uitvoeringen voor andere soorten bacteriën, voor andere gastheer-25 soorten, voor antigenen van andere aard en in andere modificatie worden functioneel beschreven in de tekst.

Voorbeeld

Bij deze toepassing volgens de uitvinding 30 werd gebruik gemaakt van het micro-organisme Streptococcus agalactiae in het rund als model. Het betreft een Groep B streptococcenisolaat van het serotype II, plaatselijk verkregen uit een natuurlijk geïnfecteerde melkklier bij een koe. Analoge werkwijzen kunnen 35 voor andere modellen toegepast worden. Het micro-organisme Streptococcus agalactiae werd gekweekt 870 H5 1 5 -12- op een semi-synthetisch medium waarvan de samenstelling wordt gegeven in tabel A. Dit medium bleek geschikt te zijn voor de in vitro produktie van bruikbare antigenen. Het bevat uitsluitend laagmoleculaire 5 bestanddelen en maakt het daardoor mogelijk om na het kweken van de bacteriën en het daarop volgende isoleren van het supernatans van de kweek, om de aanwezige macromoleculaire produkten te verzamelen en af te scheiden van de bestanddelen van het medium 10 door middel van ultrafiltratie en dialyse. Voor het isoleren van laagmoleculaire antigenen bijvoorbeeld peptiden en sacchariden, die op zichzelf al dan niet immunogeen zijn maar langs kunstmatige weg immunogeen gemaakt kunnen worden, zal het gebruik van een volledig-15 synthetisch medium aangewezen zijn.

Het Streptococcus agalactiae isolaat werd in het medium gekweekt in volumes van 10 liter bij 37°C zonder beluchting en de pH van het medium werd gehandhaafd op 6,5-7,0 door titratie met 8 normaal 20 natriumhydroxydeoplossing. Het supernatant van de kweek werd geoogst in de late logaritmische groeifase.

Er werden ultrafiltratiemembranen gebruikt met een nominaal moleculair afsnijpunt van 10.000 dalton om de macromoleculaire antigenen te verzamelen en 25 het zo verkregen exo-produkt-concentraat te dialyseren. Bij gebruik van een volledig-synthetisch medium zijn membranen met lager afsnijpunt aangewezen voor het oogsten van produkten met laag moleculair gewicht.

Het hierna als totaalconcentraat aangeduid preparaat 30 werd verkregen door het supernatant van de kweek 100 maal te concentreren en het tegen fosfaat-gebufferde zoutoplossing te dialyseren (0,01 molair natriumfosfaat, 0,15 molair natriumchloride, pH 7,00).

Dit totaal concentraat is een mengsel van 35 exo-produkten en omvat antigenen, o.a. enzymen, eiwitten, nucleïnezuren en polysacchariden zoals de streptococcus 8701451 -13-

Groep B en type II - specifieke polysacchariden en produkten van gemengde aard. Analyse van het totaal-concentraat door middel van immuno-elektroforese, gebruikmakende van een aantal beschikbare experimentele 5 hyperimmune polyklonale antisera, toonde de aanwezigheid aan van een aantal exo-antigenen. Elektroforetische analyse van het totaal concentraat onder eiwit-denature-rende en -dissociërende omstandigheden (natriumdodecyl-sulfaat/polyacrylamide gelelektroforese), gevolgd 10 door coomassie blauw-kleuring op eiwitten toonde de aanwezigheid aan van mee.r dan 30 afzonderlijke polypeptiden. Gevoeligere kleurtechnieken zouden wellicht nog meer banden hebben aangetoond. De antigenen waar het hier om gaat kunnen niet op omvattende wijze 15 in fysisch-chemische of immunochemische termen worden gedefinieerd. De genetisch gebaseerde variabiliteit van geproduceerde exo-antigenen is, zelfs bij isolaten en stammen binnen één enkele soort, bekend.

Uit het totaalconcentraat kunnen afzonderlijke 20 oplosbare exo-antigenen worden geïsoleerd en gezuiverd door gebruikelijke technieken. Ook kunnen de ongewenste produkten en/of antigenen selectief uit totaalconcentraat worden verwijderd, zoals de in sommige soorten voorkomende cytofiele extracellulaire lipoteichoxde zuren.

25 Ook kan men oplosbare exo-antigenen die als zodanig niet immunogeen zijn voor het opwekken van verworven mammaire overgevoeligheid (bijvoorbeeld peptiden, polysacchariden) uit totaal concentraat verkrijgen en kunstmatig immunogeen maken. Er werden door middel 30 van ionenwisselingschromatografie en gelfiltratiechromato-grafie twee eiwitten gezuiverd, die verder worden aangeduid als antigeen "a" en antigeen "ClO-ll11.

100 ml totaalconcentraat werd gedialyseerd tegen 0,01 molair tris(hydroxymethyl)aminomethaan-hydrochlori-35 debuffer bij pH 7,00 en gechromatografeerd op een ionenwisselaarkolom (2,6 x 30 cm) van diëthylami- 870 1 451 '"^^•5^5881 » -14- noëthyl-Sephacel (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala,

Zweden) in dezelfde buffer. De werkwijze werd uitgevoerd bij 4°C en fracties van 5,40 ml werden verzameld.

De niet gebonden componenten werden doorgespoeld 5 met dezelfde buffer en de gebonden componenten werden geëlueerd met een lineaire natriumchloridegradiënt in 0,01 molair tris-HCl bij pH 7,00. Het eluaat werd gecontroleerd op koolhydraatgehalte met de fenol zwavelzuurtest van Dubois et al. (14) en op eiwit 10 met de test volgens Lowry et al. (15), gebruikmakende van runder-serumalbumine als standaard.

Fig. 1 geeft het verkregen elutiepatroon weer. De antigenen werden geïdentificeerd en opgespoord met behulp van immunoelektroforese, gebruikmakende van 15 hyperimmune konijnen-sera, die verkregen werden na vaccinatie met totaal concentraat in Freunds compleet adjuvans. Antigeen a verscheen in de ongebonden fracties en antigeen C10-11 elueerde van de kolom in buffer die 0,13 molair NaCl bevatte (zie Fig. 1). Het hieronder 20 voor immunisatie gebruikte preparaat van antigeen C10-11 bestond uit de samengevoegde fracties 167-173. Het preparaat bevatte op gewichtsbasis gelijke hoeveelheden van het eiwit C10-11 en het streptococcus Groep B-specifiek koolhydraat. Antigeen a werd verder 25 gezuiverd en gekarakteriseerd met behulp van gelfiltratie.

De fracties 30-55 die werden verkregen door ionenwisse-lingschromatografie en antigeen a bevatten (zie fig. 1) werden samengevoegd en geconcentreerd door verdamping in vacuo. Het concentraat werd onderworpen aan chromato-30 grafie op een kolom (1,6 x 94 cm) Sephadex G75 SF (Pharmacia F.C.) in 0,01 molair natriumfosfaat, 1,0 molair NaCl, pH 7,00. De werkwijze werd uitgevoerd bij 4°C, bij een vloeisnelheid van 4 ml per uur en fracties van 2,25 ml werden verzameld. Het verkregen 35 elutiepatroon wordt weergegeven in fig. 2. De gemiddelde verdelingscoëfficient (Kgem) van het antigeen a was 870 1 451 -15- 0,57. Het void volume (Vo) en het totale volume (Vt) van de kolom werden respectievelijk bepaald met behulp van blue dextran 2000 (Pharmacia F.C.) en glucose.

Het hieronder voor immunisatie gebruikte preparaat 5 van antigeen a bestond uit de samengevoegde fracties 58-62.

De antigenen a en ClO-ll werden in microgram-hoeveelheden opgenomen in het incomplete adjuvans van Freund en het totaal concentraat werd eveneens 10 in microgram hoeveelheden per samenstellend antigeen, opgenomen in het complete adjuvans van Freund (Tabel B). De immunogeniciteit van de preparaten C10-11 en van het totaal concentraat in termen van verworven mammaire overgevoeligheid was daardoor beperkt tot eiwit-15 antigenen en voor totaal concentraat tot die eiwit antigenen die toevallig in kwantitatief gepaste doses aanwezig waren.

De verkregen preparaten werden langs subcutane weg geïnjecteerd in koeien. Het tijdstip van vaccineren 20 in de levensloop en de lactatiecyclus van de dieren werd in dit voorbeeld ingegeven door praktische overwegingen en er werd gekozen voor een tijdstip vroeg in de eerste lactatie. De dieren werden slechts 1 keer gevaccineerd.

25 Om te testen of de dieren na de vaccinatie een mammaire overgevoeligheid hadden verworven werden de antigenen a en C10-11, opgelost in 100 microliter natriumfosfaat gebufferde zoutoplossing (0,01 molair, 0,15 molair, pH 7,00) op een tijdstip tussen 3 en 30 5 weken na de immunisatie intramammair geïnfuseerd.

De koeien 17 en 18 ontvingen 0,5 microgram antigeen a en de koeien 19 en 20 ontvingen 0,5 microgram eiwit C10-11 in één enkele klier en de koeien 23 en 26 ontvingen identieke doses van beide antigenen in 35 afzonderlijke klieren. Deze antigene uitlokkingen veroorzaakten een vroege en verlengde voorbijgaande 870H51 -16- ontsteking in de specifiek gevoelig gemaakte koeien (no. 17 en 19) en koe 23 reageerde op beide antigenen.

Het verloop van de ontstekingsreacties was nagenoeg identiek aan de gepubliceerde gegevens (3). De controle-5 koeien waren anergisch.

De beschermende waarde van de verkregen toestand van mammaire overgevoeligheid kan worden onderzocht door een infectieproef met bacteriën. Omdat beschermend immuniteit een geïntegreerde functie 10 is van verschillende immuunmechanismen, bijvoorbeeld verworven mammaire overgevoeligheid, antitoxische en opsonische immuniteit, kan de waarde van het afzonderlijke mechanisme van verworven mammaire overgevoeligheid kwantitatief slechts juist getest worden tegen de 15 achtergrond van het perfect functioneren van alle andere mechanismen. Dit geldt voor alle bacteriën en in het bijzonder voor bacteriën die beschikken over gecompliceerde en krachtige virulentie-functies. Preparaten voor industriële toepassing moeten de 20 diverse immuun-responsen tegen de verschillende relevante antigenen induceren en een optimale integratie van deze immuniteiten kan preparaten behelzen die voor verschillende antigeenklassen of voor individuele antigenen waartegen diverse immuunresponsen gewenst 25 zijn bijvoorbeeld immunochemisch incompatibel zijn in één inoculum of die verschillende toedieningswe-gen vereisen. In dit opzicht is het micro-organisme Streptococcus agalactiae van het rundertype een pathogeen betrekkelijk geringe virulentie en in deze voorbeelden 30 kon alhoewel geen andere immuniteiten dan verworven mammaire over toediengevoeligheid werden geïnduceerd bescherming in termen van besmetting worden aangetoond; noch antigeen a, noch het C10-11 antigeen preparaat bleken toxisch of opsoninogeen en het totaal concentraat 35 was evenmin opsoninogeen. Voorafgaande inductie van bijvoorbeeld opsonines zou het verloop van de besmetting in de proefdieren gemilderd hebben.

8701451 Λ -17-

Twee tot zes weken na de mammaire antigeenuit-lokking werden de gevoelig gemaakte en de controle-koeien besmet in één enkele klier die niet eerder was blootgesteld aan de bacteriële antigenen en die 5 vrij was van infectie en ontsteking, door inoculatie van 70-270 kolonievormende eenheden (colony forming units, CFU, gewassen en gesuspendeerd in natriumfosfaat gebufferde fysiologische zoutoplossing) van het voor de vaccinbereiding gebruikte homologe organisme.

10 De tabellen C, D en E geven schematisch het aanvankelijke verloop weer van de infecties en van de gastheerreac-ties aan de hand van twee parameters: 1. de bacterieconcentratie in de uitgescheiden melk, gemeten als CFU op schapenbloed-agarplaten en 15 2. de concentratie van polymorfonucleaire leucocyten in de afgescheiden melk.

De eerste parameter geeft het lot weer van de bacteriepopulatie en de tweede parameter weerspiegelt de op zichzelf zeer gecompliceerde reactie van de gastheer.

20 De controle-koeien bleven chronisch geïnfecteerd en ontwikkelden een chronische mastitis en de gevoelig gemaakte koeien elimineerden de infecties binnen 60 uur. De leucocytenprofielen geven de anergie van de controle-koeien en de allergie en verworven immuniteit 25 van de gevoelig gemaakte koeien weer.

8701451 -18-

Tabel A: Samenstelling van het kweekmedium

Concentratie per liter zoutvrij caseïne-zuur-hydrolysaat 20 gram lactose 40 gram KH2PO4 440 mg ^2H^°4*^H2° 400 mg ammoniumsulfaat 600 mg

natriumfosfaat 0.08 M

natriumacetaat 6 gram natriumcitraat 225 mg L-glutamine 300 mg L-asparagine 300 mg L-tryptofaan 200 mg L-cystine 200 mg L-cysteïnehydrochloride.monohydraat 1.3 gram riboflavine 1.6 mg D,L.-panthoteenzuur 3.44 mg thiaminehydrochloride 1.6 mg para-aminobenzoezuur .32 mg nicotinamide 8 mg biotine .04 mg pyridoxaminedihydrochloride 4.6 mg foliumzuur .4 mg adeninesulfaat 43.5 mg guaninehydrochloride 15.5 mg uracil 12.5 mg magnesiumsulfaat.heptahydraat 400 mg natriumchloride 20 mg ferrosulfaat.heptahydraat 20 mg mangaansulfaat.monohydraat 15.1 mg

Het waterige medium werd op pH 7,2 gebracht met 8 N natriumhydroxyde-oplossing en werd gesteriliseerd door filtratie.

870 145 1 -19-

Tabel B Vaccinatieschema

Koe No. Adiuvans Antiqeen Dosis 17 IPA a 200 18 IPA controle 19 IPA C1Q-11 230 20 IPA controle 23 CFA totaal conc. 1700 26 CFA controle

De antigenen, in 2 ml fosfaat-gebufferde zoutoplossing, werden geëmulgeerd met gelijke volumes van incompleet Freunds adjuvans (IFA) of compleet Freunds adjuvans (CFA). De doses zijn uitgedrukt in microgram eiwit, zoals bepaald met behulp van de colometrische test volgens Lowry, met runderserumalbumine als standaard.

8701/(51

Tabel C. Infectieproef -20-

Ti id Koe No. 17: antigeen a Koe No. 18: controle pmn cfu pmn cfu 0 9 0 0 0 10 177 1.000.000 97 54.000 20 54.000 860 5900 300 44 41.000 0 443 0 72 22.000 0 44 720 96 9900 0 257 3480

De tijd is uitgedrukt als uren na de inoculatie met de bacteriën.

PMN: aantal polymorfonucleaire leucocyten per ml melk (in duizenden), zoals bepaald met behulp van de microscoop. Metingen beneden de gevoeligheidsgrens van de methode (9000 per ml), zijn aangegeven als 0.

CFU: kolonie-vormende eenheden (colony forming units) per ml melk, zoals bepaald op schapenbloed-agarplaten.

870 1 45 1

Tabel D. Infectieproef -21-

Tijd Koe No. 19: antigeen C10-11 Koe No. 20: controle PMN CPU PMN CFÜ 0 27 0 9 0 9 80 41.000 3.989 26.600 20 50.000 20.000 7.545 300 33 50.000 2.000 3.273 20 44 43.000 20 2.198 40 57 31.000 0 62 20 68 18.000 0 35 1.640 92 9.400 0 160 100.000

Legenda: zie Tabel C.

870 1 45 1

Tabel E: Infectieproef -22-

Tijd Koe No. 23ï totaal conc. Koe No. 26: controle

PMN CFU PMN CFU

0 0 0 9 0 12 2.243 80.000 53 112.000 18 50.000 140 638 720 24 41.333 20 576 80 36 18.125 0 860 160 48 13.714 0 230 4.800 60 7.200 0 142 10.000 72-0 - 40.000 96 - 0 - 3.840

Legenda: zie Tabel C.

8701^51 -23- ft

Ref erentxes: 1. Schalm O.W., Carrol E.J. and N.C. Jain. "Bovine Mastitis",

Lea and Febiger, Philadelphia, Pa, 1971.

2. De Cueninck B.J. 1979. Perspective for a role of vaccination in the control of bovine mastitis caused by Streptococcus agalactiae. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 48, No 5, p 417-433.

3. De Cueninck B.J. 1979. Immune-mediated inflammation in the lumen of the bovine mammary gland. Int. Archs. Allergy appl. Immun. 59, No 4, p 361-372« 4. De Cueninck B.J. 1982. Expression of cell-mediated hypersensitivity in the lumen of the mammary gland in guinea pigs.

Am. J. Vet. Res, 43, No 9, p 1696-1700.

5. Bovine Mastitis. Symposium. J. Dairy Sci. 1979, 62, No 1, p 117.

6. Report of the Panel of the Colloquium on Bovine Mastitis.

J. Am. Vet. Med. Assoc. 1977, 170, p 1119.

7. Davis B.D., Dulbecco R., Eisen H.N., Ginsberg R.S.,Wood W.B. , and M. McCarty ."Microbiology'. 2nd Ed. 1973. Harper and Row New York.

8. Targowsky S.P. and W. Klucinski. 1985. Effect of immune complexes from mastitic milk on blocking of Fc receptors and phagocytosis. Infection and Immunity, 47, No 2, p 484-488.

9. Colditz I.G. and D.L. Watson. 1982. Effect of immunization on the early influx of neutrophils during staphylococcal mastitis in ewes. Res. Vet. Sci. 33,p 146-151.

10. Lascelles A.K. 1979. The immune system of the ruminant mammary gland and its role in the control of mastitis. J. Dairy Sci. 62, p 154-160.

11. Norcross N.L. 1977. Immune response of the mammary gland and role of immunization in mastitis control. J. Am. Vet.Med. Assoc. 170, No 10, pl228-1231.

12.Spencer G.R. and D. Murray Angevine. 1950. Pathogenesis of bovine mastitis. III. The significance of hypersensitivity in streptococcic infection. Am. J. Vet. Res. Π_, p 317-323.

13.Coon J. and R. Hunter. 1973. Selective induction of delayed hypersensitivity by a lipid cojugated protein antigen which is localized in thymus-dependent lymphoid tissue. J. Immunol.

110,No 1,p 183-190.

8701451 5 * -24- 14. Dubois, Μ., K.A. Gilles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers and F. Smith, 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28: 350-356.

15. Lowry, O.H., N.J. Rosebrough, A.L. Farr and R.J.

Randall, 1951, Protein measurement with the folin Phenol reagent; J. Biol. Chem. 193: 265-275.

16. Curtiss III Roy, European Patent Application 0 080 806.

17. Schalm O.W. en G. Ziv-Siberman, 1968. Reactions following intramammary infusion of E. coli Endotoxin.

The Veterinary Record. 1968: 100-103.

18. Godfrey H.P. and P.G.H. Gell, 1978. Cellular and , molecular events in the delayed-onset hypersensitivities. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 84: 1-92.

870 145 1

Claims (6)

1. Preparaat voor het opwekken bij herkauwers van verworven mammaire overgevoeligheid tegen bij mastitis betrokken gram-positieve bacteriën, welk preparaat één of meer oplosbare exo-antigenen van 5 deze bacteriën of immunochemische homologa daarvan bevat in een gemodificeerde vorm, welke het vermogen tot opwekken van een verworven mammaire overgevoeligheid creëert of vergroot.

2. Preparaat volgens conclusie 1, dat oplosbare >: 10 exo-antigenen bevat van een aantal verschillende bij mastitis betrokken bacteriën.

3. Preparaat volgens één of meer van de conclusies 1-2, dat bovendien één of meer antigenen of immunochemische homologa daarvan bevat waartegen één of meer 15 humorale en/of cellulaire immuunresponsen, andere dan verworven mammaire overgevoeligheid, worden gewenst, in elke geschikte vorm, drager of adjuvans die deze immuniteiten induceren.

4. Werkwijze voor de bereiding van een preparaat 20 volgens één of meer van de conclusies 1-3, doordat men een mastitis-veroorzakende bacteriestam kweekt, het kweekmedium van de bacteriecellen afscheidt en eventueel fractioneert ter verkrijging van de oplosbare exo-antigenen, deze exo-antigenen zodanig modificeert 25 dat het vermogen tot opwekken van een verworven mammaire overgevoeligheid wordt gecreëerd of vergroot, en het verkregen preparaat eventueel combineert met één of meer antigenen of immunochemische homologa daarvan waartegen één of meer humorale en/of cellulaire 30 immuunresponsen, andere dan verworven mammaire overgevoeligheid, worden gewenst, in elke geschikte vorm, drager of adjuvans die deze immuniteiten induceren. 870 1 451 1* TB*1 i -26-

5. Werkwijze voor het behandelen van herkauwers, waarbij men verworven mammaire overgevoeligheid tegen mastitis veroorzakende gram-positieve bacteriën opwekt door aan de dieren een preparaat toe te dienen volgens 5 één of meer van de conclusies 1-3.

870 H51