NL8503413A - Preparaten ter bestrijding van diarrhee. - Google Patents

Description

&

Preparaten ter bestrijding van diarrhee.

De belangrijkste verwekkers van neonatale diarrhee bij zowel mens als dier zijn de enterotoxische E. coli stammen. Bij zuigelingen of zeer jonge kinderen en bij pasgeboren vee heeft deze infectie vrijwel zonder uitzondering een lethaal verloop; 5 Uit recente cijfers van de WHO blijkt dat jaarlijks 500 miljoen baby's en jonge kinderen (voornamelijk in de ontwikkelingslanden) last hebben van diarrhee met meer dan 5 miljoen slachtoffers.

Naast V. cholerae blijkt E. coli de belangrijkste verwekker. Bij slachtvee zijn geen betrouwbare cijfers bekend maar het verlies 10 loopt zeker in de miljarden per jaar.

Enterotoxische E. coli stammen onderscheiden zich van commensale niet-pathogene stammen door het bezit van een tweetal belangrijke virulentie factoren te weten: de produktie van enterotoxinen en de aanwezigheid van adhesie-antigenen. De adhesie-15 antigenen van E. coli bestaan uit elektronen-microscopisch zichtbare draadachtige aanhangsels op het bacterie oppervlak aangeduid als fimbriae of pili. Deze fimbriae blijken te zijn opgebouwd uit honderden identieke eiwit sübeenheden met een moleculairgewicht in de orde van grootte van 25.000. Middels de 20 fimbriae blijkt de bacterie in staat het darmepitheel te koloniseren en op deze wijze de darm.te prolifereren. Zodra de kolonisatie tot stand is gekomen zorgt het geproduceerde en uitgescheiden entero-toxine voor het ontstaan van de diarrhee.

Experimenten met gemuteerde stammen die hetzij geen adhesie-25 antigenen, hetzij geen enterotoxine meer kunnen produceren hebben uitgewezen dat deze stammen of geen of een zeer lichte, voorbijgaande, vorm van diarrhee opwekken.

Reeds geruimte tijd houden diverse onderzoeksgroepen zich bezig met de vraag of preventie van dit type infecties middels 30 inductie van beschermende antilichamen mogelijk is. Gebleken is dat toediening van toxoid weliswaar antitoxine immuunglobulinen opwekt C54 Π -i '*·% - 2 - maar dat deze antilichamen geen of slechts gedeeltelijke bescherming geven.

Een tweede benadering berust op het induceren van antilichamen gericht tegen de adhesie-an tig en en·. Deze benadering is succesvol 5 gebleken. Vaccinatie met gezuiverde adhesine preparaten blijkt in de meeste gevallen een voldoend hoge respons van beschermende antilichamen op te leveren om pasgeboren nakomelingen tegen de infectie te beschermen. Al deze experimenten betreffen infecties bij biggen, kalveren of lammeren. Meerdere firma's brengen dit 10 type vaccins op de markt.

Een probleem bij de vaccinatie van slachtvee met gezuiverde antigeenpreparaten is de omstandigheid dat E. coli meerdere verschillende adhesie-antigenen kan produceren zodat nu reeds duidelijk is dat aan commerciële vaccins steeds meer verschillende 15 adhesie-antigenen moeten worden toegevoegd.

Sommige stammen produceren slechts één, andere kunnen 2 of zelfs 3 adhesie-antigenen tegelijkertijd synthetiseren.

Een tweede probleem samenhangend met dit type bestrijding is dat vaccinatie van de ouder-dieren (runderen, zeugen) weliswaar 20 preventief werkt en de nakomelingen beschermt, maar gezien de daaraan verbonden kosten doorgaans slechts wordt toegepast op probleembedrijven. Therapeutisch heeft vaccinatie op het moment dat de infectie zich openbaart uiteraard geen enkele zin.

Gezien het feit dat vaccinatie doorgaans slechts wordt 25 toegepast in geval problemen te verwachten zijn wordt op grote schaal diarrhee nog steeds bestreden met antibiotica, met alle nadelen van dien (kosten, neveneffecten, etc.). Gezocht wordt daarom naar andere vormen van therapie.- De benadering die daarbij wordt gekozen is gericht op het voorkómen van kolonisatie d.w.z.

30 van aanhechting van de bacteriën aan het darmpitheel. Het is mogelijk gebleken diarrhee te bestrijden door orale toediening van (monoclonale) antilichamen gericht tegen de adhesie-antigenen op het bacterie-oppervlak. Een eerste preparaat ter bestrijding 3 o C 3 4 1 3 ψ· _ - 3 - van neonatale diarrhee bij kalveren is thans commercieel verkrijgbaar (Molecular Genetics) maar er is nog betrekkelijk weinig over het succes bekend. Nadelen zijn onder andere de kosten en de houdbaarheid van het preparaat.

5 Bovengenoemde therapeutische benadering is gericht tegen het infecterend micro-organisme. Gebleken is nu, dat een nieuwe therapie kan worden gericht op het blokkeren van de adhesine-receptoren aanwezig op het darmepitheel.

Tot voor kort was nog van geen enkel adhesine van entero-10 toxische Ξ. coli-stammen bekend welk structuuronderdeel (of onderdelen) van belang zijn voor de receptorherkenning.

Verrassenderwijs is nu gebleken, dat het hier ruimtelijk zeer beperkte structuren betreft.

Eén van de adhesie-antigenen bij enterotoxische E. coli-stam-15 men uit biggen wordt aangeduid als K88. Van het K88 adhesine zijn drie varianten bekend die immunologisch goed te onderscheiden zijn.

Van elk van deze varianten is de primaire structuur van de subeenheid waaruit het adhesine is opgebouwd door ons volledig opgehelderd. Naast geconserveerde gebieden (identieke aminozuur-20 sequenties in de subeenheidvarianten) blijken op bepaalde plaatsen variabele aminozuursequenties voor te komen waarmee de drie varianten zich van elkaar onderscheiden. Bij digesties van gedenatureerde subeenheden met proteolytische enzymen is nu gebleken, dat van elke variant fragmenten geïsoleerd kunnen worden die de 25 binding van de adhesine-dragende bacteriën aan erythrocyten (haemagglutinatie reactie) of aan darmepitheelcellen reeds in lage concentraties kunnen blokkeren. Deze fragmenten zijn afkomstig uit de geconserveerde delen van de subeenheid varianten. Analyse van drie geïsoleerde fragmenten heeft uitgewezen, dat het hier om de 30 volgende tripeptiden gaat: serine-leucine-phenylalanine, isoleucine-alanine-phenylalanine en alanine-isoleucine-phenylalanine. Deze peptiden zijn bestand tegen afbraak door proteolytische enzymen uit het maag-darmkanaal.

6303413 -i - - 4 -

Alle drie de geïsoleerde en geïdentificeerde tripeptiden zijn synthetisch nagemaakt. De synthetische peptiden bezitten dezelfde werkzaamheid en activiteit als de uit het adhesine geïsoleerde peptiden.

5 In het K88 adhesine komen derhalve op bepaalde plaatsen bekende aminozuursequenties voor die sterke affiniteit vertonen voor de adhesine-receptoren. Deze aminozuursequenties vormen daarom mogelijkerwijs een essentieel onderdeel van de natuurlijke receptorbindingsplaats.

10 Voorlopig onderzoek aan het adhesine-antigeen K99 van enterotoxische E. coli-stammen uit kalveren en lammeren wijst erop, dat ook hier ruimtelijk zeer beperkte structuren verantwoordelijk zijn voor aanhechting aan de receptor.

Aangezien bovengenoemde peptiden als het ware een 15 imitatie vormen van de natuurlijke receptorbindingsplaats zoals die voorkomt op het adhesine aan het bacterie-oppervlak, zullen deze peptiden in de darm met de bacterie competeren voor aanhechting aan het darmepitheel. Ook eenmaal gebonden bacteriën zullen door de peptiden van het darmepitheel verwijderd kunnen worden.

20 Gezien de korte duur van de infectie (1-2 dagen) zal blokkade van de darmepitheelreceptoren slechts van korte duur behoeven te zijn. Deze inperking van de blokkade in de tijd wordt door de gastheer zelf bewerkstelligd aangezien darmepitheel-cellen (enterocyten) in snel tempo (doorgaans binnen 24 uur) door 25 nieuwe aanmaak worden vervangen en losgelaten.

Op grond van bovenstaande uitvinding zal men in voedsel of in therapeutische preparaten stoffen met de bedoelde ruimtelijk zeer beperkte structuren opnemen.

De mogelijk optredende opname van deze stoffen door het 30 darmepitheel kan voorkómen worden door de stoffen aan inerte macromoleculaire dragers te koppelen.

De bovengenoemde ruimtelijk zeer beperkte structuren zoals tripeptiden zijn goedkoop te isoleren of te synthetiseren en goed 8303413 - 5 - *** houdbaar. Zij hebben, geen nadelige effecten op de gastheer.

Naast toepassing bij pasgeboren nakomelingen kunnen de therapeutische preparaten volgens de uitvinding ook bij volwassenen gebruikt worden ter bestrijding van diarrhee veroor-5 zaakt door enterotoxische E. coli-stammen.

3303413 i

Claims (7)

1. Therapeutisch preparaat ter bestrijding en voorkoming van diarrhea gekenmerkt door de aanwezigheid van één of meer stoffen, die op het darmpitheel aanwezige adhesinereceptoren blokkeren.

2. Preparaat volgens conclusie 1, gekenmerkt door de aan wezigheid van stoffen, die specifiek adhesinereceptoren blokkeren.

3. Preparaat volgens conclusie 1 of 2, gekenmerkt door de aanwezigheid van één of meer stoffen./ waarvan de moleculen één of meer aminozuureenheden of derivaten bevatten.

4. Preparaat volgens conclusie 3, gekenmerkt door de aan wezigheid van één of meer peptiden.

5. Preparaat volgens conclusie 3 of 4, gekenmerkt door de aanwezigheid van één of meer stoffen met in hun moleculen tenminste één aminozuureenheid behorende tot de groep bestaande uit 15 serine, leucine, isoleucine, alanine en fenylalanine.

6. Preparaat volgens conclusie 5, gekenmerkt door de aanwezigheid van serine-leucine-fenylalanine, isoleucine-alanine-fenylalanine en/of alanine-isoleucine-fenylalanine.

7. Preparaat volgens één van de voorafgaande conclusies 20 daardoor gekenmerkt dat de adhesinereceptoren blokkerende stoffen gekoppeld zijn aan een inerte macromoleculaire drager. P 7. Λ { <! ^ - w v ~ s j ïj