NL8320256A - Breed spectrum platenbescherming tegen pathogenen. - Google Patents

Description

V0 6209

e ?; 2 ο· ί;;; R

Titel: Breed spectrum plantenbescherming tegen pathogenen.

De uitvinding heeft betrekking op de bescherming van leden van het plantenrijk tegen ziekten en in het bijzonder op het gebruik van complete interferon (IFN) moleculen van een willekeurige fylogenetische bron, en/of vooroudercomponenten daarvan, teneinde virusinfecties van 5 de planten te verhinderen of tot staan te brengen.

De alomtegenwoordigheid van plantenvirussen levert een bijdrage aan het wereldomvattende probleem van de voedselvoorziening op een kosten-effectieve wijze. Geen deel van deze aarde blijven de verwoestingen bespaard die plantenvirussen uitrichten aan de voedseloogsten en 10 zelfs de sierplanten. Denk bijvoorbeeld aan het feit dat viraal geïnduceerde plantenpathologie in staat, is tot een lethals ziekte van kokospalmen in de tropen alsook een verwoesting van tarwe, gerst en andere granen in het Noorden van Canada. Momenteel bestaat er geen bekende therapeutische benadering of remedie behalve de primitieve kunst 15 van het "uitselecteren", waarbij de boer of kweker het geïnfecteerde plantenmateriaal verwijdert voordat een besmettende verspreiding naar tevoren niet-geïnfecteerde planten plaatsvindt. Wanneer men de microscopische aard van de infecterende virale organismen in aanmerking neemt en daarmede de duidelijke onmogelijkheid om de infectie met het 20 blote oog waar te nemen voordat het te laat is om "uit te selecteren", wordt het onmiddellijk duidelijk dat een fundamenteel andere benadering nodig is.

Nodig is (1) een mogelijkheid om plantenzaadplasma op een specifieke wijze zodanig te veranderen dat de intrinsieke weerstand van de 25 plant tegen virussen wordt versterkt, en (2) een mogelijkheid om exogeen aan reeds geïnfecteerd plantencelmateriaal een veilige stof of stoffen toe te voeren, die een brede bescherming van de plantencel tegen een geheel spectrum van verschillende plantenvirussen geven, waardoor een verdere beschadiging van de oogst wordt verhinderd en de voortgaande 30 verspreiding van de infecteuse middelen tot staan wordt gebracht. De onderhavige uitvinding voldoet aan deze behoeften door methoden te verschaffen waarmee de gunstige fysiologische effecten van IFN kunnen worden gerealiseerd in leden van het plantenrijk.

8320256 - 2 -

Onderzoeken met betrekking tot het plaatsen van exogeen menselijk interferon (HuIFN) in planten zijn uitgevoerd, zie Orchansky et al,

Proc. Natl. Acad. Sci. USA _79, 2278, (1982). Een soortgelijk onderzoek is ook uitgevoerd met betrekking tot het exogeen plaatsen van een zoge-5 naamde intracellulaire mediator (2'-5' oligoadenylaat synthetase) in planten, zie Devash et al, Science 216, 1415 (1982) .

De uitvinding is een gevolg van de vaststelling van de uitvinder dat bepaalde essentiële aminozuursequenties of biochemische fragmenten van een natuurlijk voorkomende klasse eiwitten, aangeduid als interfero-10 nen (IFNs), in staat zijn om zowel de plantenvirusgroei en celbeschadi-ging wanneer een plant eenmaal is geïnfecteerd, tot staan te brengen, alsook de verspreiding van verscheidene chronische of latente planten-virussen naar normale niet-geinfecteerde planten te verhinderen, dat wil zeggen infectie in eerste instantie ;te verhinderen. Dit tweevoudig ver-15 mogen wordt in de conclusies aangeduid als het "beschermen" van een plant tegen virussen.

De bovenstaand bedoelde essentiële aminozuursequenties worden in de beschrijving en in de conclusies ook wel aangeduid als "voorouder"-sequenties. Een vooroudersequentie is een sequentie die door de ontwikke-20 lingsgeschiedenis heen bewaard is gebleven, dat wil zeggen in een periode van tenminste millioenen en waarschijnlijk zelfs tientallen of honderden millioenen jaren zonder verandering is gebleven. Voor doeleinden van deze uitvinding wordt een "vooroudersequentie" of "voorouderfragment" gedefinieerd als een aminozuursequentie die niet per se normaal vrij in 25 de natuur voorkomt, en die in en uit zichzelf het vermogen bezit om een plant een anti-virale reactie (respons) te doen vertonen. De uitvinder heeft vastgesteld dat vooroudersequenties ten minste gedeeltelijk verantwoordelijk zijn voor het verlenen van IFN eigenschappen aan complete moleculen of grotere fragmenten die de vooroudersequentie (of-sequenties) 30 bevatten.

De uitvinding kan op vele verschillende wijzen in de praktijk worden gebracht, afkomstig van (a) het genetisch niveau, dat wil zeggen opname van de genetische informatie die codeert voor (programmeert) de biosynthese binnen de 35 plantencel van een vooroudersequentie of een molecuul (bijvoorbeeld 13 2 0 2 5 6 .............................._ __ .......................

- 3 - compleet (HuIFN) dat een of meer vooroudersequenties bevat; of (b) het mechanische niveau, dat wil zeggen de fysische toevoer van IFN(s) of fragmenten daarvan op een exogene wijze, dat wil zeggen topicaal op reeds geïnfecteerde plantenweefsels of plantenweefseis waar-5 bij het gevaar van een virale infectie dreigt.

Daarbovenop kunnen dubbelstrengs RNAs (dsRNAs) van natuurlijke (een willekeurige fylogenetische bron) of synthetische oorsprong hetzelfde resultaat bewerken (mits de als doel gekozen plantencellen een programmeerbaar IFN genetisch element bevatten) en inderdaad zelfs het 10 therapeutische resultaat onder verscheidene plantencel-virusinteracties vergroten.

Een van de belangrijkste vaststellingen welke tot deze uitvin--ding heeft geleid, is dat niet geheel complete IFN moleculen voldoende zijn om een anti-virale respons te geven. Met andere woorden heeft de 15 uitvinder vastgesteld, zoals ook hierna in detail zal worden uiteengezet, dat bepaalde sequenties van aminozuren binnen een IFN molecuul een anti-virale respons geven die vrijwel equivalent is aan die welke door het totale IFN molecuul zou worden gegeven. De uitvinder heeft verder vastgesteld dat de sequenties voorouderlijk zijn - dat zij, zoals vermeld, 20 waarschijnlijk in de loop der eeuwen zijn geëvolueerd en verder eigen zijn aan moleculen in vele organismen, zowel planten als dieren.

Deze vaststelling houdt heel eenvoudig in, dat de onderhavige uitvinding ver buiten de omvang van totale IFN moleculen in praktijk kan worden gebracht. Dat wil zeggen dat elk molecuul dat een (voorouder-25 lijke) aminozuursequentie als hierna zal worden beschreven, bevat, topicaal kan worden aangebracht teneinde een anti-virale respons te geven. Verder kan elke plant welke een gen bevat dat codeert voor de produktie van een voorouderlijke sequentie, of codeert voor een molecuul dat een voorouderlijke sequentie bevat, worden "geïnduceerd" tot de produktie 30 van dia sequentie of dat molecuul. Dit wil zeggen dat sommige planten, zonder dat ze genetisch worden gewijzigd voor het produceren van totale IFN moleculen, niettemin kunnen worden geïnduceerd om op een IFN-achtige wijze te reageren, dat wil zeggen alsof de plant genetisch geprogrammeerd was voor het produceren van zijn eigen IFN, of alsof hij topicaal behan-35 deld was met totale IFN moleculen. Opgemerkt wordt dat "IFN-achtig" deze 8320256 - 4 - betekenis in de gehele beschrijving en conclusies bezit. Wanneer een plant genetisch gewijzigd is zodat hij een gen bevat dat codeert voor (totale moleculen van) IFN, kan de plant natuurlijk ook op kunstmatige wijze worden geïnduceerd tot het produceren van totaal IFN.

5 Verder heeft de uitvinder vastgesteld dat planten zelf stoffen produceren die voorouderlijke sequenties bevatten, dat wil zeggen dat planten planteninterferon (P1IFN) leveren, een niet eerder gedane vaststelling. Derhalve omvat de uitvinding ook het genetisch wijzigen van plantenzaadplasma zodat het een werkend gen bevat dat een planteninterfe-10 ronexpressie brengt, ook al is het gen van plantaardige oorsprong.

Deze uitvinding voorziet derhalve in het tot staan brengen of verhinderen van virale infecties in planten door de planten een IFN-achtige respons te doen ontplooien. De modus operandi om dit te realiseren kan één van drie verschillende sporen volgen.

15 1. Genetisch wijzigen van het plantenzaadplasma zodat het een of meerdere kopieën van IFN genen bevat waardoor de plant feitelijk zijn eigen IFN produceert. De geïmplanteerde genen kunnen hetzij de novo worden aangezet hetzij door gebruik- van inducerende stoffen worden aangezet. Genetische wijziging is bijzonder bruikbaar in planten die in het geheel 20 geen IFN genen bezitten of slechts gebrekkige IFN genen hebben.

2. Het topicaal aanbrengen van moleculen die een voorouderlijke sequentie bevatten, op de plant.

3. Het induceren van een plant, die niet noodzakelijkerwijze genetisch gewijzigd is, tot het produceren van een molecuul dat een voor- 25 ouderlijke sequentie bevat. Deze modus "zet aan" of activeert P1IFN genen die anders latent of slapend zijn.

Middelen voor uitwendige behandeling van de plant, die in de uitvinding bruikbaar zijn als typisch toepasbare bronnen voor virale bescherming (dat wil zeggen bruikbaar voor het produceren van een IFN-achtige 30 respons) omvatten derhalve verscheidene totale IFNs, voorouderlijke (dat wil zeggen essentiële) molecuulfragmenten daarvan, of IFN induetiemiddelen (met inbegrip van, maar niet uitsluitend dsRNAs), alsmede de specifieke oligonucleotiden ("mediatie") stoffen, die de molecuulveranderingen binnen de plantencel, verbonden aan virusresistentie die specifiek tot 35 stand gekomen is door blootstelling van de cel aan de voorouderlijke . 83 2 0 2.56 ...........................

- 5 - IFN bioaktieve fragmenten, kunnen uitvoeren.

De. topicale applicatie of behandeling kan worden uitgevoerd volgens een grote verscheidenheid van benaderingen, als gevolg van de biologische potentie van de middelen. Dergelijke behandelingsbenaderingen 5 omvatten, maar zijn niet beperkt tot, het onderdompelen van planten of zaden, het besproeien, of het bestuiven van gewassen.

"IFN" omvat Ca) alle natuurlijke vormen van dierlijk IFN, met inbegrip van menselijk interferon alfa, beta of gamma, (b) "synthetische" vormen van dierlijk interferon, geproduceerd in non-menselijk organismen 10 waaraan dierlijk (bijvoorbeeld menselijk) interferon genen of stukken daarvan (hetgeen resulteert in hybride genen) zijn toegevoegd, en (c) chemische derivaten van dergelijke interferonen met bijvoorbeeld gemodificeerde polypeptide ketens of gemodificeerde glycosyl eenheden.

De uitvinding bezit natuurlijk een significante en ruime toepas-15 baarheid, waarvan het meest direkte en economisch belangrijke is bescherming van hoofdgewassen die op nationale en zelfs wereldschaal worden geproduceerd. Verder maakt de uitvinding door bijvoorbeeld een versterking van het intrinsieke verdedigingsmechanisme van de planten zelfs..mogelijk dat de planten door de omgeving onder druk worden gezet zonder dat ze 20 bezwijken aan hun virale infectie, iets wat algemeen voorkomt wanneer bijvoorbeeld de boer een natuurlijke geografische groeizone voor planten-celmateriaal probeert te wijzigen. Denk aan het feit dat vele tropische planten niet in niet-tropische gebieden kunnen worden gekweekt omdat de daarmee gepaard gaande spanning kennelijk de gevoeligheid voor pathogenen 25 met inbegrip van virussen vergroot; bij wijze van voorbeeld lopen papaya planten, die normaal betrekkelijk virusvrij zijn in de tropen, vrijwel uniform lethale virale infecties op wanneer men ze in Californië probeert te kweken. De uitvinding is derhalve niet alleen van direkte toepasbaarheid, maar zal ook extra landbouwkundige voordelen tot gevolg 30 hebben - die zelfs voor de getrainde waarnemer op het gebied van de agronomische biotechnologie duidelijk zijn - in de loop van de tijd naarmate de uitvinding in toenemende mate in praktijk wordt gebracht.

Verder worden ook andere phatogene organismen dan virussen, waarvan de levenscyclus het gebruikmaken van intracellulaire produkten 35 van plantencellen omvat, door IFN zoals in deze uitvinding geopenbaard, 8320256 - 6 - tot staan gebracht. De andere pathogene organismen omvatten bepaalde bacteriën en prot02oen. Zie "Selective Inhibitors of Viral Functions", W.A. Carter, Ed.; Chemical Rubber Company Press; Cleveland, Ohio; 1973; dat een uitgebreide bespreking van verscheidene non-virus pathogene .5 middelen bevat die voor het IFN effect gevoelig zijn, in het bijzonder bij een hoge IFN concentratie, en welke publikatie hier door verwijzing opgenomen moet worden geacht.

De figuren la en lb tonen een vergelijkende driedimensionale structuur van menselijk IFN beta één (HuIFN SI) en menselijk IFN gamma 10 (HuIFN-γ).

I. Detectie en therapeutische exploitatie van de essentiële voorouderlijke IFN bioaktieve gebieden en resulterende voorouderlijke IFN fragmenten.

De vaststelling van IFN structurele homologie (dat wil zeggen 15 dat de-meeste zo niet alle IFNs gemeenschappelijke structurele elementen bezitten in de vorm van aminozuursequenties) over de reusachtige evolutie-tijd kan worden bewezen zoals geïllustreerd door de nieuwe constructie van driedimensionale modellen zoals getoond in fig. 1. De modellen tonen sterke tertiaire (driedimensionale) overeenkomsten die uiteindelijk het 20 algemeen zijn van gebieden openbaren welke de bioaktieve plaats omvatten, dat wil zeggen dat deel van het IFN molecuul dat de biologische aktivi-teit van het totale molecuul geeft aan de doelcel, zij het een van een zoogdier afkomstige cel of een cel van plantaardige oorsprong.

Figuur 1 is een tweedimensionale weergave van driedimensionale 25 modellen die bij gebruik van de in tabel A getoonde gegevens ontstaan.

8320256 - 7 -

TABEL A

STRUCTURELE- KENMERKEN VAN IFN. ^ EN

[Pfc] [P ] [P ]

Reverse wendingen 5 γ3-6 1,29 0,88 0,99 69-12 1,35 0,77 0,75 γ27-30 1,38 1,01 0,86 632-35 1,14 0,92 1,00 γ43-46 1,21 0,91 0,79 10 γ65-68 1,33 0,98 0,84 871-74 1,44 0,84 0,74 Y86-89 1,39 0,83 0,69 6110-113 1,12 0,80 0,91 Y132-135 1,08 0,86 0,81 15 8136-139 1,18 0,85 1,01

Alfa helix Y8-16 1,13 1,01 816-22 1,27 1,01 γ31-42 1,23 0,93 20 640-55 1,29 0,92 Y51-65 1,03 1,10 859-68 1,17 1,18 Y95-100 1,10 0,89 891-107 1,22 0,87 25 8116-121 1,09 0,89

Beta plaat Y103-121 1,14 1,15 6123-135 0,89 1,15 6141-161 0,86 1,16 30 Y47-60 1,04 1,25 859-68 1,17 1,18 § t % 2. ^ - 8 -

Er werden vier aminozuren tegelijk genomen en de waarschijnlijkheid voor het bestaan van bepaalde conformatiestructuren binnen het totale IFN molecuul werd berekend. Bijvoorbeeld werd het bestaan van reverse wendingen berekend met de formules van Chou en Fasman (Annual Reviews 5 of Biochemistry, vol. 47, biz. 251-276, 1978). Het bestaan van alfa-helices en beta-geplooide platen werd afgeleid voor gemiddelde stukken van tien tot twintig opvolgende aminozuren met gebruik van dezelfde formules, p duidt op de waarschijnlijkheid van een reverse wending; P duidt op de waarschijnlijkheid van alfa-helix vorming en P duidt op de 10 waarschijnlijkheid van de vorming van een beta-geplooide plaat. De getallen in de linkerkolom duiden op de relatieve positie van de aminozuur-resten, uitgaande van het aminoeindpunt van het IFN molecuul.

De totale en verreikende deductie van IFN structurele homologie is nooit eerder afgekondigd of gepubliceerd omdat het een creatief samen-15 smelten van bepaalde, eerder bekende en geïsoleerde feiten plus extra inzicht te danken aan de nieuwe benadering van de uitvinder, met zich meebrengt*.Deze benadering waarbij vergelijkende nucleotidesequentie-gegevens, vergelijkende eiwitsequentiegegevens, mutatiefrequentiegegevens, conformatiegegevens, en Markov ketenanalyse (alle voor verschillende 20 vormen van IFN), worden gebruikt, heeft geleid tot de vaststelling van de voorouderlijke of oervoorvadersequenties van IFN die een anti-virale aktiviteit kunnen verschaffen in alle hedendaagse levensvormen , met inbegrip van verspreide species van het plantenleven. Uit deze voorvader-sequenties is een verdere bepaling verricht naar de samenstellende 25 aminozuurbestanddelen. Om het opnieuw te benadrukken, worden deze voorvader (voorouderlijke) sequenties, die binnen grotere moleculen worden aangetroffen, niet geïsoleerd in de natuur gevonden en kunnen in en uit zichzelf een biologische aktiviteit vertonen en virale resistentie aan planten verlenen, dat wil zeggen resistentie tegen virale vermenigvuldi-30 ging. De uitvinder heeft vastgesteld dat de tertiaire structuur in de sequenties zelfs behouden blijft wanneer bepaalde aminozuren worden gemuteerd bij het bereiken van het voorouderlijke of voorvader IFN molecuul dat uit de.aard-der zaak niet langer in de natuur bestaat, aangezien het millioenen jaren geleden is weggemuteerd. Alleen de rudimenten daarvan 35 in de vorm van de biologisch aktieve essentiële aminozuursequenties 83 2 0 2 5 6 .........................................

- 9 - bestaan in het hedendaagse planten- en dierenleven, met inbegrip van de mens.

De gewenste moleculaire plaatsen (dat wil zeggen de biologisch aktieve aminozuursequenties) van IFNs kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd 5 door een reeks van beschikbare technieken en de sequentie kan worden bepaald in hetzij de genomische vorm (J.. Bresser en D. Gillespie in Analytical Biochemistry, vol. 129, blz. 357, 1983), hetzij de eiwitvorm waarin het genomische produkt op nitrocellulosepapier tot expressie is gebracht (Bresser et al. in Proceedings National Academy Science, U.S., 10 in press, 1983; Bresser et al., DNA, in press, 1983). Daarna kunnen vele beschikbare variaties in de vastefase synthese van peptiden worden ondernomen om de aktieve fragmenten van IFN met de hierin beschreven therapeutische waarde te produceren.· De synthetische produktie volgens een willekeurige route (vastfase synthese of recombinant DNA technologie in 15 bacteriën, gist of dierlijke cellen) van dergelijke aminozuursequenties met het doel om de plantencelfunctie gunstig te beïnvloeden en de virale pathologie te beëindigen, valt derhalve zeker binnen de omvang van de uitvinding.

De essentiële aminozuursequenties bedragen typerend ongeveer 20 10 tot 15% van de normale moleculaire lengte van IFNs, te weten min of meer 25 - 45 aminozuren in lengte in plaats van de gebruikelijke ongeveer 162 samenstellende aminozuren. De vaststelling van deze essentiële aminozuur (peptide) stukken werd mogelijk gemaakt door de deducties van de uitvinder en vergemakkelijkt door computeranalyse van tienduizenden van de 25 theoretisch mogelijke sequenties van bepaalde gebieden van vele verschillende IFNs die tijdens de evolutie van gewervelde dieren behouden zijn gebleven. De absolute lokatie van deze gebieden zal van IFN molecuul tot IFN molecuul variëren omdat sommige IFNs (bijvoorbeeld menselijk IFN-) met ongeveer 10 - 15% in hun lengte zijn verkort. Belangrijk aan de 30 aktieve fragmenten is hun driedimensionale aktiviteit, niet hun relatieve lokatie ten opzichte van het aminoëinde van het intakte molecuul.

Behalve gewenste fysisch chemische eigenschappen zijn de IFN stukken of sequenties ook bruikbaar vanuit het oogpunt van kosteneffectiviteit doordat hun kleine afmetingen een produktie op grote schaal moge-35 lijk zullen maken tegen een fractie van de kosten van de volledige IFN

8320256 - 10 - moleculen, alsmede volgens verscheidene bereidingsmethoden, zoals door recombinant DNA methodologie, vastfase synthese, enz., zoals bovenstaand is opgemerkt.

De uitvinding kan natuurlijk ook in de praktijk worden gebracht 5 met alle in de natuur voorkomende of synthetische (recombinant DNA technologie in bacteriën, gist of dierlijke cellen) complete IFN moleculen, mits deze de noodzakelijke biologisch.aktieve gebieden bevatten en ook vrij zijn van eventuele moleculaire franje (gewoonlijk suiker of kool-hydraatgroepen) die de biologisch aktieve plaats kunnen verbergen voor 10 het plantenceloppervlak of anderszins, bijvoorbeeld door conformatie-verstoring, het gebied van de biologisch aktieve plaats relatief of volledig inert kunnen maken op plantencelmateriaal. Gewoonlijk zal de aanwezigheid van volumineuse zijketens van kern- of periferie oligo-sacharidegroepen transspeciesexpressie van IFN aktiviteit verhinderen.

15 door een dergelijk direkt of conformatie mechanisme (zie bijvoorbeeld W. Carter, in Life Sciences, vol. 25, blz. 717-728, 1979 en ook in Pharmacology and Therapeutics, vol. 8, blz. 359,355, 1980).

II. Aktieve interferon gebieden

Genen die coderen voor interferon zijn gedoneerd (bijvoorbeeld 20 Derynk, et al, Nature, Volume 285 blz. 542-547, 1980). De sequentie van deze genen is bepaald (Goeddel et al, Nature, Volume 290, blz. 20-26, 1980; Derynk et al, Nature, Volume 285, blz. 542-547, 1980) en de primaire structuur van negen van de verschillende interferons is vastgesteld. Met behulp van computerprogramma's heeft de uitvinder gebieden vastgesteld 25 die nodig zijnvxr bepaalde biologische eigenschappen (Gillespie en

Carter, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, in press.) van het interferon systeem.

Voorouderlijke interferon aminozuursequenties die de anti-virale respons oproepen, omvatten de sequenties 25-40 en 115-141. Door analyse 30 van gepubliceerde gensequenties (Derynk et al en Goeddel et al, supra) is het mogelijk om het bestaan van tenminste deze twee voorouderlijke sequenties in elk van menselijk IFN .. en .. vast te stellen. Soortgelijke analyses als bovenstaand zijn toepasbaar op andere dierlijke IFNs.

Het interferongebied, waarvan bepaald werd dat het essentieel was 8320256 - 11 - voor het binden aan specifieke celreceptoren, omvat aminozuren 115-141 (Gillespie en Carter, 1982). De positie van dit gebied wordt gedeeltelijk bepaald of vergemakkelijkt door de homologie met een gebied van de B subeenheid van choleratoxine (Lai, Journal Biol. Chem. Volume 252 5 blz. 7249-7256, 1977), een stof die met interferon strijdt om de binding aan celreceptoren.

Benadrukt wordt dat andere voorouderlijke fragmenten, die verschillen van de bovenstaand geïdentificeerde fragmenten, in de natuur voorkomen, en de uitvinding dient niet zodanig te worden geconstrueerd 10 dat deze beperkt is tot slechts de hierin beschreven voorouderlijke fragmenten. Het inventieve concept ligt in de behandeling van planten met moleculen die voorouderlijke fragmenten bevatten of met de fragmenten zelf. Identificatie van additionele fragmenten behoort tot de mogelijkheden van een deskundige.

15 III. Bereiding van stukken interferon met gekozen gebieden.

Stukken interferon kunnen op verscheidene wijzen worden bereid. Bij wijze van voorbeeld zal thans één geschikte werkwijze worden beschreven. Andere middelen zoals een chemische modificatie van natuurlijk interferon of een chemische modificatie van gedoneerd (synthetisch) 20 compleet interferon, interferon induetiemiddelen, enz., zijn eveneens gemakkelijk kenbaar en behoren tot de omvang van de uitvinding.

Gedoneerde interferon genen kunnen op specifieke plaatsen met specifieke restrictie endonucleasen worden doorgesneden. Het resulterende interferon genfragment, dat codeert voor een stuk van het interferon 25 polypeptide, kan worden gefuseerd met een expressievector die RNA poly-merasepromotor, ribosoombindingsplaats, initiatiecodon en eventuele andere nodige signalen, bevat. Dit recombinant DNA kan in geschikte gastheercellen worden gebracht met het doel van synthese van het stuk interferon.

30 Als voorbeeld werd de volgende procedure voor de expressie in een gastheer van een HuIFN genfragment uitgevoerd. 5 g van het gen voor menselijk interferon beta, voorzien van een polyA.dT staart, en gedoneerd in pBR322, werd gedurende twee uur bij 37°C geincubeerd met 50 eenheden EndoR'P 1 in 20 mM tris, pH 7,4 10 mM MgC^, 50 mM (NH^^SO^ 35 en 100 mg/ml. runderserum albumine om het interferon gen door te snijden, 8320256 - 12 - waarbij een enkelstrengs uiteinde van de basen 203-206 overbleef. Het DNA werd op 0,3 M gebracht in kaliumacetaat en uit ethanol neergeslagen. Het DNA werd opgelost in 100 ml 50 mM kaliumfosfaat, pH 7,4, 6,7 mM MgC^· 1 mM mercaptoethanol, 35 mM deoxyadenosine en deoxycytidine, 5 en 25 eenheden van het Klenow fragmenteinde van Escherichia coli DNA polymerase. Het DNA werd op 0,3 mM in kaliumacetaat gebracht en uit ethanol neergeslagen. Het precipitaat werd opgelost in 100 ml 30 mM natriumacetaat, pH 4,6, 50 mM NaCl, 1 mM ZnSO^, 5% glycerol en 25 eenheden SI nuclease en gedurende 1 uur bij 37°C geincubeerd. Dit gaf een 10 interferon genfragment met een stomp uiteinde volledig tot aan nucleotide 204, de eerste gebaseerd in het codewoord voor leucine op positie 45. Natriumacetaat werd toegevoegd tot 0,3 M en het DNA werd uit ethanol neergeslagen.

Afzonderlijk werden 5 g van het gen voor menselijk interferon 15 beta (voorzien van een polydAldT staart en gedoneerd in pBR322) gedurende twee uur bij 37°C geincubeerd met 50 eenheden Endo R MboII in 10 mM tris, pH 7,9, 6 mM KC1, 10 mM MgC^, 1 mM dithiothreitol en 100 mg/ml runderserum albumine. Het DNA werd uit ethanol neergeslagen en behandeld met SI nuclease als bovenstaand beschreven. Het 288 base-20 paren bevattende fragment met stompuiteinde, dat de nucleotiden 401-688 van het interferon gen bevatte, werd door elektroferese door„3% agarose gezuiverd. Een portie van 0,25 mg van dit fragment werd opgenomen met 5 g Pst 1 - behandeld, DNA polymerase - behandeld en SI nuclease -behandeld DNA.

25 Het aldus gevormde recombinant DNA bevatte een interferon gen dat de nucleotide 205-400 miste, welk gen zal coderen voor een interferon polypeptide dat de aminozuren 46-111 mist.

Dit recombinant interferonfragment kan in vele geschikte vectoren voor expressie in bacteriële of zoogdiercellen volgens conventionele 30 technieken worden ingevoegd. Interferon of stukken interferon kunnen met standaardmethoden worden gezuiverd hoewel de uitvinding in praktijk kan worden gebracht met interferonen die minder dan 1% zuiver zijn, mits geen anderszins schadelijke stoffen aanwezig zijn. Bijvoorbeeld worden eiwitten in oplossingen die interferon bevatten, in Cibachrom 35 blauw sefarose in afwezigheid van ethyleen of propyleenglycol gebonden.

8320256 - 13 -

De kolom wordt gewassen met verscheidene oplossingen die de meeste eiwitten verwijderen, behalve interferon, en het interferon wordt geêlueerd met oplossingen die ethyleen- of propyleenglycol of andere geschikte elutiemiddelen bevatten (Carter et al, Pharmacology and Therapeutics, 5 Volume 8 blz. 359-377, 1980). Desgewenst kan een verdere zuivering van Cibachrom blauw fracties of andere materialen worden uitgevoerd door interferon houdende oplossingen te leiden over kolommatrices anti-interferon antilichamen bevatten, waarbij conventionele condities voor het binden en elueren worden gebruikt.

10 Het bovenstaand beschreven recombinant DNA kan worden bereid door sommige van dezelfde enzymen of al dezelfde enzymen onder andere omstandigheden of in verschillende volgorden of door varianten van de bovenstaand vermelde enzymen of interferon genen te gebruiken. Andere geschikte recombinant DNAs kunnen worden gevormd met andere enzymen en 15 andere protocollen. Tenslotte is het gebruik van recombinant DNA..voor het verkrijgen van stukken interferon slechts een voorbeeld voor een manier om een stuk interferon te produceren. Andere manieren zoals vaste-stof synthese, proteolytisch splitsen van intact materiaal of genetisch doneren van interferon dat in bacteriën en gist is bereid, kunnen op 20 equivalente wijze worden toegepast.

IV. Verandering van plantenzaadplasma om planten te verkrijgen met een erfelijke resistentie tegen virale infecties.

De uitvinder heeft vastgesteld dat planten die verhoogde concentraties van planten of mensen interferon produceren, resistent zullen 25 zijn tegen een breed spectrum van pathogenen. Derhalve verschaft de uitvinding een werkwijze voor het vormen van een dergelijke plant. De door de volgende werkwijze gecreëerde nieuwe plant is genetisch nieuw.

De werkwijze omvat A. het doneren van menselijke en planten interferon genen in 30 recombinant DNA; B. het invoegen van dit recombinant DNA in protoplasten en het isoleren van cellen die verhoogde concentraties van planten of mensen interferon synthetiseren; en G. het produceren van een rijpe plant uit de protoplasten.

8 3-2025-6 ............-........... - -.....-.......................................-..... ............

- 14 -

Bij wijze van voorbeeld is de tabaksplant Nicotiana gebruikt en wordt deze hieronder als prototype beschreven.

A. Het doneren van menselijk en planten interferon.

Zoals eerder vermeld zijn menselijke interferon genen gedoneerd 5 (bijvoorbeeld Derynck et al, supra). Verscheidene conventionele procedures kunnen worden gebruikt om planten interferon genen op soortgelijke wijze te doneren; wat men nodig heeft is een geschikte "probe" voor het vinden van het recombinant DNA. Bar probe die voor dit doel kan worden gebruikt, is het in hoge mate bewaardgebleven deel van het menselijk 10 interferon of. gen dat zich bevindt binnen maar niet beperkt is tot de nucleotiden 345-423 (Gillespie en Varter 1982, Handbook of Experimental Pharmacology of Interferon, in press). Andere geschikte probes kunnen eveneens bestaan. Van belang is dat de uitvinding niet stamt uit een keuze van methoden die gebruikt worden voor het doneren van de planten 15 interferon genen, maar veeleer stamt uit het genetisch unieke en de verhoogde wenselijkheid van de uiteindelijke plant.

B. Het invoegen van het recombinant DNA in Nicotiana protoplasten en het isoleren van cellen die verhoogde concentraties van planten en menselijk interferon synthetiseren.

20 Door de hierin voor HuIFN beschreven analytische processen kan men gemakkelijk vergelijkbare voorouderlijke sequenties in verscheidene dierlijke of plantaardige IFNs vaststellen. De hierin voor het isoleren van genfragmenten beschreven methodologieën en resulterende invoeging en expressie zullen gebruik maken van een methodologie die vergelijk-25 baar en in sommige gevallen identiek is met die welke voor voorouderlijke sequenties is beschreven in HuIIF .. en .. Protoplasten kunnen worden gevormd en DNA kan daarin worden gebracht volgens conventionele technieken (Bourgin et al 1979. Physiol. Plant. 45:288-292; Caboche, M.1980. Planta 149:7-18; Cocking et al 1981. Nature 293:265-270). De moeilijk-30 heid is dat weinig . recombinant DNAs zichzelf in plantenchromosomen invoegen, met als gevolg dat ze niet een stabiel deel van het genetische materiaal van de plant worden. Het Ti DNA plasmide van Agrobacter (Davey et al 1980. PI. Sci. Lett. 18:307-313; Wullems et al 1979. In Adv. Protoplast Res. Proc. Sth. Symp: 407-424) is een uitzondering hierop ...........................................................................-......-.................................

- 15 - maar dit DNA plasmide heeft verscheidene ongunstige eigenschappen. Tot de problemen behoren dat het Ti plasmide DNA te groot is, de DNAs die in dit plasmide zijn ingevoegd, niet de juiste eiwitten tot expressie brengen en dat door dit plasmide geïnfecteerde cellen zich niet goed 5 ontwikkelen. Het Ri DNA plasmide van Agrobacter staat toe dat planten zich goed ontwikkelen, maar behoudt de andere ongewenste eigenschappen.

Om vreemd DNA in te voegen in Nicotiana chromosomen kan het volgende plasmide worden gebruikt: pBR 322 plasmide van E. coli kan worden gemodificeerd zodat het twee geïnverteerde tandemcopieën van een 10 Nicotiana kort, verstrooid herhaald DNA bevat. Dit plasmide zal slechts één Eco Rl plaats bevatten: gelegen op de grens tussen de twee Nicotiana herhaalde sequenties. Het plasmide zal met Eco Rl worden geopend, daarna kunnen planten en/of menselijk interferon genen in het plasmide worden ingevoegd. Anderzijds kunnen andere plantensequenties bevattend 15 pBR322. of andere vectoren zoals Ti en Ri plasmiden van Rhizobium worden gebruikt.

Vele copieën van het plasmide dat een planteninterferon bevat, kunnen in Nicotiana protoplasten worden gebracht door microinjectie, calciumfosfaatprecipitatie, infectie met Agrobacter, protoplastfusie enz. 20 Getransformeerde protoplasten kunnen als plantencellen worden vermenigvuldigd en kunnen door in situ moleculaire hybridisatie aan chromosoom DNA met een pBR 322 probe worden gedetecteerd. Dergelijke cellen, geïnduceerd met poly I:C kunnen worden getest op verhoogde concentraties van planteninterferon mRNA produktie door in situ hybridisatie, gebruikmakend 25 van een zuiver planteninterferon gen als probe. Dergelijke cellen die verhoogde concentraties van planten mRNA produceren, kunnen worden getest op een verhoogde synthese van planteninterferon door de conventionele biologische test voor anti-virale groeifactor.

Nicotiana cellen die verhoogde concentraties van planteninter-30 feron produceren, kunnen opnieuw in protoplasten worden omgezet en als bovenstaand worden getransformeerd door genoemde vectoren die nu menselijke interferon genen bevatten. Getransformeerde protoplasten kunnen als plantencellen worden vermenigvuldigd en getest op verhoogde concentraties van planteninterferon plus menselijk interferon mRNA en eiwit 35 door in situ moleculaire hybridisatie respectievelijk de biologische 8320256 - 16 - test voor anti-virale groeifactor. Deze getransformeerde protoplasten kunnen vervolgens tot rijpe tabaksplanten worden gekweekt.

Meer specifiek kan de werkwijze als volgt worden uitgevoerd: Protoplasten kunnen worden geïsoleerd uit Nicotiana spp. volgens 5 Chupeau et al (C.R. Acad. Sci. Ser. D (Paris) 278:1656-1568, 1974). Gesteriliseerde bladeren kunnen worden gepeld en gelncubeerd in Tq medium 10,3 mM NH^NO^, 9,4 en mM KNO^, 1,5 mM CaCl2.7H20, 0,75 mM MgS04.7H20, 0,62 mM KH2PC>4 0,1 mM FeSC>4.7H20, 0,1 mM Na2EDTA, 16 mM H3B03> 0,6 mM MnS04.H20, 3,5 mM ZnS04.7H20, 0,2 mM CuS04.5H20, 0,22 mM 10 AlCly 0,13 mM NiCl2.6H20, 8 uM Nicotinezuur, 2 uM Ca panthothenaat, 0,04 mM Biotine, 16,1 uM naftaleenazijnzuur, 4,4 uM 6-benzyladenine, 58 mM sucrose, 440 mM mannitol) zonder sucrose en met 0,02% Macerozyme R10, 0,1% cellulase Onozuka R10 en 0,05% Driselase. De vrijgemaakte protoplasten kunnen door centrifugatie met lage snelheid in medium Tq 15 worden gewassen. Andere methoden van protoplast isolatie kunnen hiervoor in de plaats worden gebruikt zoalng levensvatbare enkele cellen zonder aanzienlijke hoeveelheden van hun celwand kunnen worden geïsoleerd.

Nicotiana spp protoplasten kunnen worden gelncubeerd met trans-formatievector: DNA dat interferon genen draagt, of met bacteriën die 20 dergelijk DNA bevatten, gebruikmakend van één van een aantal standaard-transformatieprocedures (Davey et al 1980. PI. Sci. Lett. 18:307-313; Willems et al 1979. In Adv. Protoplast Res. Proc. 5th symp.: 407-424. Dergelijk vector DBA kan het _E. coli plasmide zijn, dat herhaalde plantensequenties bevat, zoals bovenstaand beschreven, of elk ander 25 vector DNA, dat in een microörganisme kan worden vermenigvuldigd en in protoplastchromosomen kan intregeren.

Getransformeerde protoplasten kunnen worden gekweekt in Tq medium bij 25°C in het donker gedurende vier dagen en vervolgens onder fluorescente lampen (2500 lx, 16 uur per dag) worden overgebracht.

30 Nadat 30-60% van de protoplasten éénmaal gedeeld heeft, kunnen ze door centrifugatie worden verzameld en éénmaal worden gewassen in medium AG (10 mM KN03, 3 mM CaCl2.2H20, 3 mM MgS04-7H20, 1 mM KH2P04, 0,1 mM FeS04.7H20, 0,1 mM Na2EDTA, 49 mM H3BC>3, 1,8 mM MnSC>4.H20, 10,4 mM ZnSO,,. 7H„0, 0,04 mM CoCl„ .6Η„0, 0,36 uM CuSO. .5H_0, 0,41 uM NaMoO. .2EL0, 4 l 2. I Q 2. 4 Δ 35 0,66 uM A1C13, 0,40 mM NiCl2.6H20, 0,18 uM KI, vitamines als in Tq medium -.f 3 2..0 k S t).............................-.....-------------------------------------------------;--------------------- - 17 - 0,53 uM naftaleenazijnzuur, 4,4 uM 6-benzyladenine, 58 mM sucrose, 440 mM mannitol, 1 mM glutamine. Cellen kunnen worden uitgeplaat op petri schalen in medium AG (Caboche, Planta 149:7-18, 1980) . De schalen kunnen vervolgens onder standaard lichtcondities bij 25°C worden geincu-5 beerd in goed gesloten, transparante boxen onder welke condities de getransformeerde protoplasten kolonies vormen.

Individuele kolonies kunnen vervolgens worden uitgepikt, terug worden omgezet in suspensies van enkele protoplasten en worden geënt op replica petri schalen in AG medium. Replica platen kunnen worden onder-10 zocht op vector of recombinant interferon genexpressie door analyses van: •1) de aanwezigheid van specifieke DNA sequenties door moleculaire hybridisatie .(Robins et al 1981 J. Molec. Appl. Gen. 1:191-203,

2) de aanwezigheid van specifieke RNA transcripts door moleculaire .15 hybridisatie (Brahic and Haase. 1978. Proc. Nat. Acad. Sci., USA

75:6125-6129 en/of 3) de aanwezigheid van overmaat interferon eiwit door.inmunologische of biologische analyses (Sela. 1982. Interferon Sci. Memo., Memo number Iall34, januari). Andere analyses voor overmaat interferon produktie 20 kunnen geschikt zijn.

C. Het produceren van een rijpe tabaksplant uit genetisch gemanipuleerde plantencellen.

Kolonies die de aanwezigheid en expressie van nieuwe interferon genen laten zien, kunnen gedurende 1-2 maanden in AG medium worden ge-25 kweekt, vervolgens worden uitgeplaat op vast R4 medium voor knoppen- regeneratie (Bourgin et al. 1979. Physiol. Plant. 45:288-292). De geproduceerde knoppen kunnen worden overgebracht op wottelmedium B voor de vorming van plantjes (Bourgin et al. 1979. Physiol. Plant, 45:288-392). Plantjes met wortels kunnen worden gepot en in een kas tot rijpheid 30 worden opgekweekt. Andere methoden voor het omzetten van enkele getransformeerde plantencellen in rijpe plantjes kunnen in de plaats hiervan worden gebruikt.

De plantjes kunnen vervolgens worden getest op hun produktie van interferon en op hun resistentie tegen tabaksmozalekvirus, -Jy Ο f-·. (j'1' t- .· i.- - 18 - (Sela. 1981. Adv. Vir. Res. 26:201-234) of tegen andere vreemde middelen onder toepassing van standaard evaluatiemethoden. Tegen ziekte resistente stammen met een hoge interferonproduktie kunnen worden geselecteerd en sexueelworden vermenigvuldigd op elke geschikte en effectieve wijze.

5 Het bovenstaande protocol wordt slechts bij wijze van illustratie van de uitvoerbaarheid van de werkwijze voor het construeren van deze genetisch nieuwe plant met gewenste eigenschappen gegeven. Het zal duidelijk zijn dat in dit snel veranderende gebied vele modificaties van deze werkwijze succesvol verwacht mogen worden zonder dat daarmede de omvang 10 van de uitvinding wordt verlaten.

V. Topicale applicatie

Zoals vermeld kunnen de therapeutische middelen volgens de uitvinding topicaal worden aangebracht door myriaden technieken variërend van het aardse (bijvoorbeeld met behulp van een plantengieter in een kas) 15 tot het gecompliceerde (bijvoorbeeld gewasbestuiving van honderden of duizenden hectaren).

De geprefereerde manier om de uitvinding in praktijk te brengen zal afhangen van biologische en mechanische factoren op het moment dat behandeling van de plant gewenst is; bijvoorbeeld zal permanente be-20 scherming van een zaaigewas bij voorkeur worden uitgevoerd door middel van zaadplasmaverandering via een verhoogd IFN copie-aantal (planten en/of dierlijke IFN genen). Anderzijds zou voor het beschermen van reeds op het veld staande planten die een groot oppervlak in beslag nemen, gewasbestuiving een gewenste uitvoeringsvorm zijn. Hier moeten bijvoor-25 beeld speciale topologische omstandigheden (denk aan de moleculaire stabiliteit, het windschuif effect,enz., wanneer voor ouderlijke IFN componenten uit laagvliegende vliegtuigen worden uitgelaten) evenals biochemische omstandigheden (denk aan de opname efficiency door jonge versus rijpe of oudwordende bladcelstructuren) in aanmerking worden 30 genomen. In dergelijke gevallen zal de voorkeursuitvoeringsvorm bestaan uit componenten met een laag molecuulgewicht aangezien deze in het algemeen een grote thermische en fysische stabiliteit en een verhoogde cellulaire opname/receptorbinding verschaffen. De voorouderlijke IFN-gerichte oligonucleotiden en IFN fragmentpeptiden zijn voorbeelden van 83 2 0 2 5 6 ...... ............................. ................

- 19 - relatief warmtebestendige en tegen werveling bestand zijnde aktieve delen die van de basisuitvinding afstammen.

Voor topicale applicatie zal tenminste één IFN of andere stof die een voorouderlijke sequentie (of.inductiemiddel) bevat, worden ge- 5 dispergeerd in een geschikte, in de landbouw aanvaardbare drager zoals water, dat wil zeggen dat de applicatie geschiedt in de vorm van een oplossing. De concentratie kan variëren van ongeveer 0,0001-tot 100.000 IRU (International Reference Unit) per milliliter oplossing.

Indien het gewenst is dat IFN als een droog poeder wordt verspreid om 10 door verstuiving te worden aangebracht, is een concentratiegebied per gewicht van ongeveer 1 dpm (delen per millioeh) tot ongeveer één deel 13 16 op 10 -10 delen doeltreffend wanneer het interferon wordt toegevoegd aan een droge, in de landbouw aanvaardbare drager. Geschikte dragers zijn op het gebied van de gewasbestuiving wel bekend. Het interferon 15 kan worden gemengd of gecombineerd met andere plantbehandelingsmiddelen - pesticiden, herbiciden, kunstmesten, enz., mits geen van de additionele middelen de biologische aktiviteit van de voorouderlijke sequentie aantast.

De uiteindelijke concentratie van IFN of andere voorouderlijke 20 stof zal afhangen van het te beschermen gewas, het virus waartegen beschermd wordt, en de veldcondities. De uiteindelijke concentratie kan ook variëren afhankelijk van de moleculaire fractie ( fractie van het molecuul), die niet voorouderlijk is. Bijvoorbeeld zou in het synthetische IFN fragment, dat hoofdzakelijk alleen uit de aminozuursequentie 115-141 25 bestaat, de moleculaire fractie van niet-voorouderlijk materiaal de waarde nul benaderen, in complete IFN moleculen is daarentegen de moleculaire fractie van niet-voorouderlijk materiaal ongeveer 0,6, dat wil zeggen ongeveer 60% van een totaal IFN /bijvoorbeeld HuIFN) molecuul is niet voorouderlijk.

30 Een typerende applicatie van IFN op gewassen zou bijvoorbeeld zijn in een concentratie van één deel per biljoen (dpb; opgemerkt wordt g dat voor HuIFN 1 mg ongeveer 10 IRU is). Voor applicatie op het oppervlak (welke in de buurt van 100 gallons per acre, dat wil zeggen 378,5 liter per 4047 m2 vereist), zou typerend minder dan een halve milligram 35 van compleet HuIFN per acre vereist zijn. Gewasbestuiving, waarvoor f320256.............._.........................__...............__...............................

,-20- typerend een vijfde tot een tiende van het volume voor oppervlakte-applicatie nodig is, zou vergelijkbare hoeveelheden interferon vereisen, of misschien afhankelijk van de doelmatigheid van de topicale applicatie.

In sommige gevallen kan het echter gewenst zijn dat een additio-5 nele stabiliteit aan IFN of zijn voorouderlijke fragmenten wordt toegevoegd zodat dit beter bestand is tegen de belastingen bij de applicatie en mogelijk langdurige blootstelling aan de elementen in de omgeving.

Dit zal thans worden beschreven.

Interferon is evenals andere eiwitten een betrekkelijk labiele 10 chemische stof. Hij hangt af van een zeer specifieke driedimensionale oriëntatie van zijn verschillende lineair gerangschikte aminozuren voor oplosbaarheid in waterige oplossingen en voor biologische aktiviteit (zie fig. 1). In het bijzonder moeten gebieden van het interferon molecuul die verantwoordelijk zijn voor binding aan cellen en voor het 15 oproepen van complexe biologische responsen, op een juiste wijze worden gepresenteerd en gerangschikt zijn. Er is echter ook een omvangrijke hoeveelheid alternatieve non-functionele oriëntaties mogelijk die vrijelijk gevormd kunnen worden. Deze alternatieve toestanden worden bevorderd door verwarming, bepaalde externe chemicaliën en langdurige opslag. 20 Een oplossing gericht op het verhinderen van de vorming van inaktieve alternatieve toestanden, is het bouwen van moleculen die IFN aktiviteit vertonen, maar die slechts een beperkt aantal alternatieve toestanden hebben, zoals de bovenstaand beschreven interferon fragmenten. Een andere oplossing, die door de uitvinder is ontwikkeld, is het beper-25 ken van de vorming van alternatieve toestanden door het interferon op een dragermolecuul of structuur te immobiliseren.

Aktieve enzymen worden vaak aangetroffen als deel van complexe structuren, verbonden aan celmembranen, nucleinezuren, eiwitten, enz., en de enzymen zijn gewoonlijk stabieler in de gecomplexeerde toestand.

30 Om de uitvoerbaarheid van een dergelijke benadering te onderzoeken heeft de uitvinder verscheidene kolommatrices geconstrueerd die verschillende liganden bevatten welke effectieve stabilisatoren zouden kunnen zijn (zie figuur 2, Carter et al, 1980, Pharmac. Ther. 8:359-377. De kolom werd gekarakteriseerd met daaraan verbonden albuminen. 100 ml van een 35 niet-gedialyseerd· interferonpreparaat, dat 11.500 eenheden en 0,99 mg 83 2 0 2 5 6......................... _.............................

- 21 - eiwit per ml bevatte, werd aangebracht op een kolom met behulp van een peristaltische pomp met een stroomsnelheid van 60 ml per cm2 per uur.

De albuminekolom werd geëquilibreerd met een 0,02 M natriumfosfaat (pH 7,4) oplossing die 0,15 M NaCl bevat.. Het eluent uit de kolom werd 5 verdeeld door een stroomopdeelinrichting in een verhouding van 1:9.

Het 10% deel van het eluent werd verzameld in 1 ml van een 1%-ige oplossing van runderserumalbumine, welke 0,02M natriumfosfaat en 0,15 M NaCl bevatte, en gebruikt om de interferonaktiviteit te analyseren.

Het 90% deel van het eluent werd gebruikt voor het meten van de eiwit-10 concentratie. De doorbraakfracties bevatten ongeveer 48% van het aangebrachte eiwit en minder dan 1% van de aangebrachte interferonaktiviteit. Verder elueren van de kolom werd uitgevoerd met 50% (v/v) ethyleenglycol en 50% 0,.04 M fosfaat, (pH 7,4) en 0,30 M NaCl. De rest (86%) van de interferonaktiviteit werd teruggewonnen met zeer weinig,(minder dan 2%) 15 van het oorspronkelijke eiwit. Sommige van deze experimenten zijn recent gepubliceerd,(Carter, W.A., Methods in Enzymology 78:576-582, 1981).

Het bovenstaande experiment toonde aan dat interferon gekoppeld kan worden met serumalbumine terwijl dat bij de meeste andere cellulaire 20 eiwitten niet kon. Experimenten met andere geïmmobiliserende eiwitten zoals cytochroom C lieten zien dat interferon een algemene eigenschap had van combineren met eiwitten. Een hypothese van de uitvinder is dat de sterk hydrofobe aard van interferon dwingt tot interacties met gewoonlijk gesequestreerde hydrofobe zakken van andere eiwitten, en dit 25 experiment suggereert dat de hypothese correct is. Wat het mechanisme ook is, het bovenstaande experiment gaf een aansporing tot de ontwikkeling van complexen met eiwitten om interferon te stabiliseren.

De door de uitvinder voor dit doel ontwikkelde procedure is als volgt: menselijk interferon kan op elke conventionele wijze worden bereid 30 uit elke biologische bron τ uit menselijke cellen, uit recombinant micro-organismen, enz. Na zuivering kan menselijk serumalbumine of een andere eiwithoudende drager in overmaat worden toegevoegd, gewoonlijk tot 3 mg/ml. De oplossing kan worden gedialyseerd tegen fosfaatgebufferde zoutoplossing of een andere geschikte buffer, waarna het materiaal kan 35 worden gevriesdroogd. In een typerend voorbeeld werd 1 millioen eenheden 83 2 0 2 5 6 ............................. ............................................................

- 22 - gezuiverd interferon gevriesdroogd met 3,46 mg natriumfosfaat.

Verschillende wijzigingen van deze procedure zijn aanvaardbaar in dit snel veranderende gebied. Andere dragereiwitten dan albumine of cytochroom C zijn aanvaardbaar. Andere dragermoleculen of structuren 5 kunnen eveneens aanvaardbaar zijn, zoals lipiden, kleine hydrofobe liganden, membraanfragmenten, of zelfs vaste deeltjes. Andere bevestigingsmiddelen zoals ionogene of covalente bindingen kunnen eveneens geschikt zijn. Andere zouten of buffers of andere concentraties van zout of buffer (met inbegrip van de afwezigheid van zout of buffer) kunnen 10 eveneens aanvaardbaar zijn. De procedure stabiliseert echter duidelijk IFN voor externe conformatie veranderingen, met inbegrip van denature-ring tegen de effecten van bijvoorbeeld windwrijving en invloeden uit de omgeving.

Topicale applicatie van HuIFN op planten is in het algemeen 15 effectief voor het bestrijden van de verspreiding van virus van de ene plant naar de andere. Om dit aan te tonen werden jonge aardappelbladeren systemisch geïnfecteerd met aardappelvirus N of tabaksbladrolvirus.

Uit de bladeren werden schijven geponst en gedurende 7-10 dagen bij 25°C geweekt in een voedingsmedium dat menselijk interferon alfa miste 20 of bevatte. Na deze incubatie werden de bladeren in 1% Brij 35 gemalen en deeltjesvormend materiaal werd door centrifugeren verwijderd. Virale eiwitten werden kwantitatief bepaald door middel van een immunoanalyse (SLISA), waarbij optische dichtheid als maat voor het virus werd gebruikt. Hoge optische dichtheidswaarden corresponderen met verhoogde hoeveelheden 25 virus. De resultaten worden in de onderstaande tabel B getoond.

Tabel B - tot staan brengen van de verspreiding van aardappelvirus door HuIFN - aantal dagen eenheden/ml HuIFN-virus Incubatie 0_ 100 1000 30 aardappelvirus N 7 0,519 0,342 0,184 aardappelvirus N 10 1,331 0,702 0,838 bladrolvirus 10 0,673 0,298 0,254 8320^56 - 23 -

Zoals de gegevens laten zien, vertoont IFN een uitgesproken anti-viraal effect in planten, ofschoon het blijkt dat het tot staan brengen van het virus een plateau bereikt,dat wil zeggen dat het tot staan brengen van het virus over het geteste bereik niet lineair toenam 5 met een toenemende interferon concentratie. Hoewel topicale applicatie een dramatische vertraging van het virus bewerkt, daalt deze invloed bovendien met verloop van tijd enigszins,hetgeen aangeeft dat herhaalde applicaties na regelmatige tussenpozen, bijvoorbeeld elke 10 tot 15 dagen, nodig zijn. Van belang is dat de uitvinder heeft vastgesteld dat 10 een periodieke applicatie van interferon op met virus geïnfecteerde planten de verspreiding van virussen in die planten zal verhinderen en ook de overbrenging van virussen van deze planten naar niet-geïnfecteerde planten zal verhinderen. De uitvinder verkreeg fotoreeksen van de bladeren tijdens de bovenstaand vermelde HuIFN experimenten en heeft opgemerkt 15 dat de bladeren op hetzelfde moment groeiden en bloeiden dat de viruslevenscyclus tot staan werd gebracht.

Gegeven de grote opbrengsten van gewassen als gevolg van topicale applicatie, gekoppeld met het feit dat zeer lage zuiverheden van IFN voldoende zijn (dat wil zeggen er zijn geen kostbare zuiverings-20 procedures nodig), zijn herhaalde applicaties economisch zeer goed haalbaar. Bijvoorbeeld schat de uitvinder, gebaseerd op zijn experimenten, dat een kas met een grootte van ongeveer 9,3 m2 voor ongeveer tien dollar per maand tegen gangbare prijzen kan worden beschermd. Het IFN van wat voor zuiverheid dan ook kan worden toegediend, mits het voldoet 25 aan het criterium dat het vrij is van besmettende levende organismen (bacteriën enz.) of intacte virale middelen die plantencytopathologie zouden kunnen induceren of pathologie in de uiteindelijke gebruikers, of het nu mensen of dieren zijn, zouden kunnen induceren. Na gepaste ontsmettingsprocedures zoals het met een filter tegenhouden van levende 30 organismen, zouden dergelijke IFN partijen voor de uitvinding bruikbaar zijn, hoewel ze voor klinische toepassingen bij de mens zouden worden verworpen.

De term "topicale applicatie" omvat verder de applicatie van stoffen, die aangeduid worden als "inductiemiddelen", die, hoewel ze 35 zelf geen IFN moleculen zijn, de eigenschap hebben dat ze als een biolo- 8320256 - 24 - gische prikkel dienst doen waardoor een IFN-producerend organisme wordt gedwongen om zijn eigen IFN te produceren in een interval dat kort is ten opzichte van het interval dat vereist zou zijn in afwezigheid van aangebracht inductiemiddel. Belangrijk hiervan zijn de zogenaamde 5 "verkeerd gepaarde dsRNAs", die potente IFN inductiemiddelen zijn, maar weinig toxische neveneffecten bij mensen vertonen. De biologische werkingswijze van deze stoffen „samen met een opsomming daarvan, wordt volledig gegeven in het Amerikaanse octrooischrift 4.103.641 van de onderhavige uitvinder.

10 dsRNAs zijn ook effectief in leden van het plantenrijk, en kun nen op dezelfde wijze als bovenstaand voor IFN moleculen of biologisch aktieve fragmenten daarvan vermeld, worden aangebracht. De plant hoeft niet noodzakelijk genetisch gemanipuleerd te zijn. Vereist is slechts dat een bepaald dsRNA de vorming van een molecuul induceert dat een 15 biologisch aktieve essentiële (aminozuur) sequentie heeft welke een interferonachtige respons oproept. Zoals eerder vermeld betekent deze eis dat de plant een polynucleotidesequentie moet bevatten die codeert voor een biologisch aktieve aminozuursequentie. Of een bepaalde plantensoort aan deze eis voldoet, kan worden bepaald door middel van eenvou-20 dige experimenten, dat wil zeggen het topicaal aanbrengen van een of meerdere dsRNAs op planten van belang en testen op een op zichzelf bekende wijze van de anti-virale groeifactor. Anderzijds kan een test van de induceerbaarheid van IFN worden uitgevoerd met behulp van de in situ hybridisatietechniek die de uitvinder bovenstaand voor Nicotiana 25 heeft toegelicht.

Daarnaast bestaat een reeks stoffen die worden aangeduid als intracellulaire mediators en waarvan 2'f5'-oligoadenylzuur en/of een functioneel aktief derivaat daarvan typerende voorbeelden zijn, welke stoffen eveneens als topicale applicatiemiddelen bruikbaar zijn. Het 30 exacte biochemische mechanisme volgens welk deze verbindingen functioneren is niet bekend, maar bekend is dat ze het door blootstelling aan een virus veroorzaakte IFN effect nabootsen, waardoor in essentie de behoefte aan IFN wordt vervangen. De uitvinder heeft vastgesteld dat deze nabootsing kan worden uitgebreid tot planten. Ook kunnen analoga 35 worden gebruikt, met inbegrip van kern (gedefosforyleerd) 2'-5' oligo- 13 2 0 2 5 1 __ .

- 25 - adenylaat, kern 3'-5' oligoadenylaat, en kern 2'-5' oligoadenylaat-cordecypine (3'-deoxyadenosine).

Het concentratiebereik dat bruikbaar is bij het aanbrengen van dsRNAs (zoals Ampligen, een merkprodukt van HEM Research, Rockville, 5 Maryland, or Poly I.Poly C) ligt tussen ongeveer 0,01 g/ml en 1000 g/ml in waterige oplossing. Het bruikbare concentratiebereik voor applicatie van de intracellulaire mediators ligt tussen ongeveer 0,01 and 100.000 nanomol per ml in waterige oplossing.

Een voorkeursuitvoeringsvorm met betrekking tot topicale appli-10 catie ligt in de combinatie, in het algemeen als een fysisch mengsel, hoewel ook afzonderlijke applicaties voldoende zullen zijn, van een IFN, of een essentieel fragment of inductiemiddel daarvan, met een stof die insecten, in het bijzonder luizen, afhoudt van het landen op de plant en het fungeren als vector die het virus verspreidt. Insecten zoals -15 luizen vertegenwoordigen wellicht een belangrijke manier voor het overbrengen van virussen, doordat ze zich op vele planten binnen betrekkelijk korte tijdsruimten voeden en geïnfecteerd materiaal uitwisselen voor gezond plantweefsel dat de luis daarna opnieuw infecteert,uitwisselt met andere gezonde planten, enz. in een zich steeds herhalende cyclus.

20 Door een stof die een IFN-achtige respons kan produceren, te combineren met een stof die insecten blokkeert (dat wil zeggen afschrikt), kan op effectieve wijze een tweeledige aanval tegen virusverspreiding worden gelanceerd. De eerste weg van de aanval is te verhinderen dat insecten de behandelde plant uitkiezen. Mocht deze weg falen, wordt vervolgens 25 alle door virus geïnfecteerde plantenmateriaal dat door het insect is uitgewisseld met een gezonde plant, tegengewerkt door de stof die een HuIFN respons produceert.

In het bijzonder zijn stoffen, die bijzonder werkzaam zijn voor het blokkeren van insecten (en in het bijzonder luizen) vectoren en die 30 chemisch verenigbaar zijn met IFNs, hormoonstoffen, aangeduid als pyrethrums en feromonen. Pyrethrums zijn bekende natuurlijke stoffen, die bijvoorbeeld afgeleid zijn van chrysanthemums. Feromonen zijn eveneens natuurlijke stoffen, afgeleid van wilde aardappelen.

Interferon gemengd met of afzonderlijk maar gelijktijdig aange-35 bracht met een van deze natuurlijke hormonale stoffen of beide, vormt ΐ:Cj ΐ: o __ - 26 - een combinatie die insecten op de eerste plaats effectief blokkeert, of de verspreiding van virus vanuit insecten die ondanks de blokkerende stof contact maken met gezonde planten, verhindert. Het blokkeringsmid-del en het anti-virale middel versterken elkaar dus op een biochemisch 5 niveau en laten in hun uiteindelijke biologische afbraak geen omgevings-schadelijke resten of verontreinigingen achter.

Interferon kan in combinatie worden toegediend in de eerder vermelde gehaltes (bijvoorbeeld 0,0001-100.000 IRU/ml oplossing).

Pyrethrums en/of feromonen worden toegediend in gehaltes die typerend 10 in de orde van 0,005-10 pounds/acre bedragen. Een procedure is het simpel combineren van de gewenste gehaltes van IFN (of fragment, inductieipiddel, enz.) met het pyrethrum of feromoon en een geschikte drager (bijvoorbeeld water of een droge landbouwkundig aanvaardbare drager) en het aanbrengen daarvan in de vorm van een oplossing.

15 Hoewel slechts een paar voorbeelden van uitvoeringsvormen van de uitvinding bovenstaand in detail zijn beschreven, zullen de deskundigen inzien dat vele modificaties in de als voorbeeld gegeven uitvoeringsvormen mogelijk zijn zonder dat daarmede de uitvinding en de voordelen daarvan worden verlaten. Het wordt dan ook beoogd dat al dergelijke 20 modificaties binnen de omvang van de uitvinding zoals gedefinieerd in de volgende conclusies zullen vallen.

8320256

Claims (25)

1. Werkwijze voor het beschermen van planten tegen pathogenen, waarbij men genoemde planten een IFN-achtige respons doet vertonen.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin genoemd pathogeen een virus is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin genoemde respons wordt ver kregen door genoemde planten genetisch te wijzigen zodat ze tenminste één stof produceren die genoemde IFN-achtige respons opwekt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarin genoemde stof gekozen wordt uit de groep bestaande uit complete IFN moleculen en moleculaire 10 fragmenten die voorouderlijke aminozuursequenties bevatten.

5. Werkwijze volgens conclusie 3, waarin genoemde genetische wijziging wordt bewerkt door in plantencellen een menselijk gen in te voegen, dat codeert voor de produktie van tenminste één verbinding welke tenminste één voorouderlijke aminozuursequentie bevat.

6. Werkwijze volgens conclusie 4, welke verder de stap omvat van het invoegen in genoemde plantencellen van een planten-gen, dat codeert voor de produktie van planteninterferon of een molecuul, dat een voorouderlijke aminozuursequentie bevat.

7. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin genoemde respons wordt op-20 gewekt door topicaal aanbrengen op genoemde planten van een stof, welke tenminste één verbinding omvat die een voorouderlijke aminozuursequentie bevat.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin genoemde tenminste ene verbinding tegen denaturering wordt gestabiliseerd.

9. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin genoemde stof als genoemde verbinding complete IFN moleculen omvatten.

10. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin genoemde stof als genoemde verbinding een deel van een HuIFN molecuul omvat.

11. Werkwijze volgens conclusie 7, waarin genoemde stof wordt aan-30 gebracht in de vorm van een oplossing en in een concentratiebereik dat equivalent is aan 0,0001 tot 100.000 IRU/ml.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, waarin genoemde oplossing een waterige oplossing is. 8 3 2 0 2 5 § ......................... .............. < ·> V - 28 -

13. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin genoemde respons wordt opgewekt door topicaal aanbrengen op genoemde planten van een stof welke tenminste één non-IFN verbinding omvat die in staat is tot het induceren van genoemde respons.

14. Werkwijze volgens conclusie 13, waarbij genoemde verbinding de produktie van een tweede verbinding induceert, welke een voorouderlijke aminozuursequentie bevat.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarin genoemde inducerende verbinding een dsRNA is.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarin genoemde tweede verbin ding compleet HuIFN is.

17. Werkwijze volgens conclusie 14, waarin genoemde tweede verbinding een HuIFN fragment is.

18. Werkwijze volgens conclusie 13, waarin genoemde verbinding een 15 intracellulaire mediator is.

19. Werkwijze volgens conclusie 18, waarin genoemde mediator 2'.5'-oligodenylzuur of een derivaat daarvan is.

20. Werkwijze voor het beschermen van planten tegen virusssen, omvattende een topicale applicatie in combinatie van een eerste verbinding, 20 die genoemde plant een IFN-rachtige respons doet vertonen, en van een tweede verbinding, die virusvectoren blokkeert.

21. Werkwijze volgens conclusie 20, waarin genoemde eerste verbinding gekozen wordt uit de groep bestaande uit dsRNAs en intracellulaire mediators.

22. Werkwijze volgens conclusie 20, waarin genoemde tweede verbinding gekozen wordt uit de groep bestaande uit pyrethrums en feromonen.

23. Samenstelling, omvattende een eerste verbinding, gekozen uit de groep bestaande uit dsRNAs en intracellulaire mediators, gemengd met een tweede verbinding, gekozen, uit de groep bestaande uit pyrethrums en 30 feromonen.

24. Plant, beschermd met de methode volgens conclusie 1.

25. Plant, beschermd met de methode volgens conclusie 20. 8320256