NL8104818A - Geneesmiddel voor het behandelen van suikerziekte en werkwijze voor de toediening van het preparaat. - Google Patents

Description

....-——* · -......." ....... ....... ·~~........... ....... .................... ......... * j" - *** ·> -1- 22184/Vk/mb

Korte aanduiding: Geneesmiddel voor het behandelen van suikerziekte en werkwijze voor de toediening van het preparaat.

De uitvinding heeft betrekking op een geneesmiddel voor het 5 behandelen van suikerziekte, diabetesmellitus. De uitvinding heeft verder betrekking op een werkwijze voor de toediening van het preparaat.

In zijn algemeenheid heeft de uitvinding betrekking op het behandelen van diabetes mellitus en in het bijzonder op een werkwijze voor het behandelen van suikerziekte, diabetes mellitus onder toepassing van 10 de stof d-biotine, welke stof alleen kan worden toegediend of samen met insuline.

Meer in het bijzonder, doch zonder de uitvinding hiertoe te beperken, betreft de uitvinding een nieuwe en verbeterde werkwijze voor het behandelen van diabetes mellitus, waarbij een dagelijks afgemeten 15 dosering wordt toegediend van d-biotine, welke stof alleen wordt toegediend of samen met insuline, zodat hyperglycemia en glycosuria bij de diabetische patient wordt verminderd en de syraptonen van de ziekte effectief worden bestreden.

Diabetes mellitus is een ernstige ontregeling van het kool-20 hydraatmetabolisme en wordt in wezen gekenmerkt door een onvoldoende produktie, secretie of activiteit van insuline door polyuria, hyperglycemia en glycosuria. Op biochemische basis komen de bovenvermelde lesies tot uitdrukking door de onmogelijkheid om vetzuren te synthetiseren uit glucose de novo, de onmogelijkheid om glucose te gebruiken door periferale 25 weefsels en door een overproduktie van glucose door de lever. Deze biochemische afwijkingen leiden tot een accumulatie van zogenaamde keton-lichamen, lagere pH en mogelijkheid van hoge eholesterolsynthese en andere metabolische produkten van acetaat. Een slechte bestrijding van deze ziekte of chronische diabetes kan onder andere resulteren in blind-30 heid, beschadiging van de zenuwen, hartziekte, coma en dood.

Normaal wordt diabetes mellitus bestreden door een regeling van het dieet of door de toediening van insuline of andere anti-diabetische geneesmiddelen.

De chemische stof d-biotine, soms bekend als vitamine H, is in 35 het verleden onderzocht op basis van een aantal overwegingen. Zo is een onderzoek bijvoorbeeld gericht geweest op het feit dat bepaalde voedingsmiddelen grote hoeveelheden biotine bevatten, waarbij de mogelijkheid van de chemische of fysiologische activiteit is beperkt. Er is waargenomen dat 8 1 0 4 8 1 8 l -2- 22184/Vk/mb de biobeschikbaarheid van microbiologisch bepaalde biotine in voedsel varieert van nagenoeg 0 tot 100?. De biotine in graan of maïs is volledig beschikbaar, in kafferkoren of milo, gerst of haver varieert de beschikbaarheid van 5 tot 30? en in tarwe is deze erg laag, waarbij af en toe 5 0? beschikbaar is. Er is ook waargenomen dat zelfs bij de voedingsmiddelen die rijk zijn aan voedingsstoffen het biotinegehalte laag is. Lever, nieren, eigeel en bepaalde groente worden aangegeven als een goede bron, terwijl vlees, fruit, graan en brood arm hieraan zijn. Ondanks de bovenvermelde vindingen van de beperkte beschikbaarheid van biotine is aange-10 geven door the United States Food and Drug Administration dat: 1) biotine op ruime schaal aanwezig is in de natuur in kleine hoeveelheden en dat het gemiddelde Amerikaanse dieet een opname bewerkstelligt van 100 tot 300 microgram biotine per dag. Zodoende lijkt de normale dagelijkse opname meer te zijn dan in feite nodig voor het 15 lichaam; 2) biotine wordt door micro-organismen in de darm gesynthetiseerd en de totale execretie in de urine en faeces kan worden overtroffen door de opname via het dieet; de microbiologisch gesynthetiseerde biotine in de dikke darm wordt geschikt geacht voor absorptie,en 2Q 3) gebrek aan biotine bij de mens wordt primair bewerkstelligd door de toevoer van ruw eiwit of door zeldzame genetische biotine-afhankelijkheidssyndromen of in zeldzame gevallen door infantiele sebor-rhische dermatitis.

Zoals verder zal worden besproken lijkt de voorgestelde op-25 lossing volgens de uitvinding in tegenstelling te staan tot het bovenvermelde, omdat er een voldoende toevoer is van biotine via het dieet bij bepaalde personen, met name bij diabetische patiënten.

Via een andere benadering werd een metabolische afwijking in het biotine-metabolisme bij diabetische patiënten en alloxan diabetische 3° ratten bewerkstelligd. Bij een algemeen onderzoek naar leverziekten werd waargenomen dat de urine-excretie van biotine opmerkelijk was verhoogd bij diabetische patiënten. Bij deze studie werd de intrarausculaire injectie van biotine gevolgd door een extra excretie van biotine in een verhoogde hoeveelheid in vergelijking met waarden die ter vergelijking 35 dienden. Bovendien was de verhoging in de excretie van biotine na de injectie in goede samenhang met de verhoging van de bloedsuikerspiegel. Hoewel dit volledig kan worden uitgelegd door een osmotisch diuretisch effect door een verhoogde bloedsuikerspiegel, werd door onderzoekingen met 8104818 -3- 22184/Vk/mb alloxan-diabetische ratten een ander alternatief aangegeven. Bij een afzonderlijke studie naar het biotinegehalte van de lever van alloxan-diabetische ratten werd een scherpe daling waargenomen in het gehalte aan gebonden biotine. De uiteindelijke concentratie werd bepaald en deze 5 bleek ongeveer één-zevende te zijn van de normale waarde, die in het algemeen wordt beschouwd als zijnde ongeveer 3,0 ^jg/g. Bovendien is bij deze onderzoekingen gebleken dat het injecteren van insuline de verlaagde concentratie van gebonden biotine weer herstelde tot de normale waarde.

Hoewel de bovenvermelde onderzoekingen referenties omvatten met betrekking tot het concept van de biobeschikbaarheid van biotine en enkele indicaties, door inferentie, van een verlaagd biotinegehalte in de lever dan diabetische ratten, zijn deze onderzoeksresultaten zodanig dat men hieruit niet heeft gevonden dat er een direct verband zou bestaan tussen het biotinegehalte en de insultine-activiteit bij diabetische 15 patiënten. Verder hebben deze onderzoekingen niet de significantie aangegeven van de biobèsehikbaarheid van biotine in het bloedserum van diabetici. In het Canadese octrooischrift 996.027, is het gebruik van . biotine aangegeven om diabetes mellitus te behandelen. Deze methode die is vermeld in het Canadese octrooischrift is echter niet bruikbaar omdat 20 er geen kritische waarde is aangegeven voor de dosering van biotine, hetgeen noodzakelijk is voor een succesvolle behandeling van diabetes mellitus. Bovendien is in dit Canadese octrooischrift niet aangegeven dat biotine kon worden gebruikt voor het behandelen van diabetes mellitus in slechts specifieke gevallen.

25 Zodoende is een van de doelstellingen volgens-de uitvinding om de behandeling te verbeteren van de ziekte diabetes mellitus.

Een andere doelstelling volgens de uitvinding is het behandelen van diabetes mellitus door toepassing van de orale toediening van medicamenten aan een patient. Verder wordt gestreefd naar het behandelen van diabetes 3° mellitus door toediening van chemisch d-biotine aan de patient.

Ook wordt gestreefd naar het behandelen van diabetes mellitus door het toedienen van chemisch d-biotine in afhankelijkheid van het serum insulinegehalte waargenomen bij diabetici die niet van insuline afhankelijk zijn of in afhankelijkheid van insuline die door injectie wordt 35 toegediend bij diabetici die afhankelijk zijn van insuline.

Deze en andere doelstellingen worden bewerkstelligd volgens de uitvinding, waardoor een geneesmiddel is verkregen voor het behandelen van suikerziekte met name diabetes mellitus, met het kenmerk, dat dit 8104313 I * r ι -4- 22184/Vk/mb d-biotine bevat in een hoeveelheid die voldoende is om de concentratie van het serum biotine van de patient te verhogen binnen een kwantitatief gebied waarin hyperglycemia en glucosuria van de patient worden verminderd. Verder heeft de uitvinding betrekking op een verbeterde behandeling van 5 diabetes mellitus door het toedienen van een afgemeten hoeveelheid van chemische d-biotine aan diabetici, waarbij deze stof enkelvoudig wordt toegepast of samen met insuline, waarbij hyperglycemia en glycosuria van de patient worden verlaagd en als resultaat hiervan wordt de ziekte behandeld in een effectievere wijze dan tot nu toe is gebeurd.

10 De uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van de volgende beschrijving, waarbij is verwezen naar de bijgevoegde tekening.

In deze tekening is aangegeven: fig. 1 is een driedelige grafiek die de respons weergeeft van gezonde personen, NIDDM-type diabetici en IDDM-type diabetici in af-15 hankelijkheid van de vraag naar glucose. De ordinaat geeft afzonderlijk het biotinegehalte weer in picomol per liter en het insulinegehalte in picomol per liter en de abscis geeft de tijd weer in minuten tijdens een glucosetoleratie-onderzoek, fig. 2 geeft een grafische voorstelling weer van de resultaten 20 van experimenten bij gezonde patiënten, NIDDM-patienten en IDDM-patiénten en met name de gegevens die vermeld zijn in tabel H, waarbij de abscis de tijd in uren weergeeft en de ordinaat de procentuele vergelijkende tolerantie, fig. 3 is een grafiek in drie gedeelten die bepaalde resultaten 25 weergeeft voor de IDDM-type diabetici waarbij een ter vergelijking dienende placebo-biotinebehandeling werd uitgevoerd. De ordinaat geeft afzonderlijk het serum glucosegehalte in mg? weer, het serum biotinegehalte in ng/ml en urineglucose in g/dag en de abscis geeft de tijd aan in dagen j 30 fig. 4 is een grafiek die vergelijkbaar is met fig. 3 voor IDDM- diabetici waarbij een controle-biotineplacebo-behandeling is uitgevoerd met behulp van een dieet; fig. 5 is een grafiek vergelijkbaar met fig. 3 voor NIDDM-dia- betici; 35 fig, 6 geeft een vergelijking weer van de resultaten van alle patiënten die behandeld zijn met een vergelijkend biotine-placebodieet ten opzichte van de resultaten van alle patiënten behandeld met een ter vergelijking dienend placebo-biotinedieet, 8104818 -5- 22184/Vk/mb * » t fig. 7 is een grafiek die serumglucose, serurabiotine en urine-glucose aangeeft voor een NIDDM-diabetische patient langs de ordinaat en de tijd uitgedrukt in dagen langs de abscis, waarbij een ter vergelijking dienend placebo-biotinebehandeling als dieet werd uitgevoerd, 5 fig, 8 is een grafiek die serumglucose, serurabiotine en urine- glucose aangeeft voor een IDDM-diabetische patient langs de ordinaat en de tijd uitgedrukt in dagen langs de abscis, waarbij een ter vergelijking dienende biotine-placebobehandeling als dieet werd uitgevoerd, fig. 9 is een grafiek vergelijkbaar met fig. 7 voor een IDDM-10 type diabetische patient, waaraan 2ii eenheden insuline zijn toe gediend, fig. 10 geeft een grafiek weer vergelijkbaar met fig. 9 voor dezelfde patient waaraan 31 eenheden insuline dagelijks worden toegediend en fig. 11 is een grafiek die de serurabiotine-concentratie weergeeft min de serurainsuline-concentratie op de ordinaat en de tijd uitge-15 drukt in uren op de abscis voor normale en insuline-afhankelijke diabetische groepen.

De uitvinding is gericht op een nieuwe werkwijze voor het behandelen van diabetes mellitus en ook op een verbeterd farmaceutisch produkt dat wordt toegepast bij deze behandeling. De methode volgens de 20 uitvinding omvat de toediening van een bepaalde dosis aan chemisch d- biotine in overeenstemming met het gehalte aan serum insuline waargenomen bij niet van insuline-afhankelijke diabetische patiënten of in overeenstemming met de hoeveelheid insuline die wordt geïnjecteerd bij insuline-afhankelijke diabetici.

25 Het is gebleken dat volgens'de uitvinding NIDDM effectief kan worden behandeld door het verlagen van de verhouding insuline/GuE/ml) tot biotine (ng/ml) in serum tot 4-10 in tegenstelling tot de normaal gevonden verhouding van ongeveer 150-200.

Het is ook gebleken dat bij IDDM de ziekte effectief kan worden 30 behandeld door het oraal toedienen van biotine in combinatie met insuline-injectie zodat de verhouding van de vervangen insuline/(E/dag) tot toegevoegde biotine (mg/dag) is 2-6.

In het algemeen kan deze werkwijze worden uitgevoerd door aan de patient oraal biotine toe te dienen in de hoeveelheid van ongeveer 35 5 tot 20 rag bij een lichaamsgewicht van 68 kg.

Zoals aangegeven, werden onderzoekingen verricht met betrekking tot de werkwijze volgens de uitvinding waarbij twee soorten suikerziekten in beschouwing werden genomen te weten de insuline-afhankelijie diabetici 8104818 i y -6- 22184/Vk/mb (IDDM) en de niet van insuline afhankelijke diabetici (NIDDM). De insuline-afhankelijke diabetici (IDDM) worden gekenmerkt door een verwaarloosbare of zonder insuline respons-afvoer uit de pancreas, na een calorische of glucose-opwekking, en een verminderde toleratie ten aanzien van glucose.

5 Niet-insuline afhankelijke diabetici (NIDDM) worden primair gekenmerkt door een evenredige tot verhoogde respons aan insuline tot dezelfde calorische opwekking, gekoppeld met een verlaagde toleratie ten aanzien van glucose, (challence = opwekking).

In fig. 1 is het verband aangegeven tussen gezonde mensen, niet-10 insuline afhankelijke diabetici en insuline afhankelijke diabetici. Hierbij moet worden opgemerkt dat hoewel de insulineniveau*s hoger zijn bij de niet-insuline afhankelijke diabetici ten aanzien van gezonde mensen een glucosebelasting niet als effectief wordt behandeld. Ook bij de insuline afhankelijke diabetici is de insulinerespons zeer laag ten aanzien 15 van een glucosebelasting of toediening en de glucoseniveau1s die worden bereikt tijdens een tolerantie, zijn hoog in vergelijking met de NIDDM-waarden. Het is gebleken zoals'kan worden afgeleid uit tabel A, waaruit de gegevens voor fig. 1 zijn afgeleid, dat de verhouding biotine tot insuline een belangrijke onderscheidende factor is tussen NIDDM, gezonde 20 en IDDM-personen.

TABEL A

Verhouding biotine in picomol/1 tot insuline in picomol/1

NIDDM gezond IDDM

25 B 2,5 4,5 18

D I

*

piek insulineniveau1s = B/I

Met andere woorden kan worden gesteld dat bij verhoogde glucosegehaltes een lagere dan normale verhouding NIDDM ontstaat terwijl een 30 hogere dan normale verhouding wordt verkregen bij IDDM.

Verder blijkt uit de tabellen B en C het resultaat van additionele metingen aan biotine bij gezonde mensen en diabetici. Naast de verhoogde serumgehaltes door vasten, gevonden bij diabetici, zoals weergegeven in fig. 1 wordt door diabetici ook ongeveer twee keer zo veel biotine afgeschei-35 den per dag in de urine in vergelijking met gezonde mensen (tabel B), Bovendien is uit een afzonderlijk experiment gebleken (tabel C) dat normale mensen ongeveer 390 keer meer biotine behouden dan diabetici na een orale dagelijkse dosering van ongeveer 30 mg gedurende zeven dagen. Deze 8104818 • » -7- 22184/Vk/mb gegevens wijzen er sterk op dat diabetici een gebrek hebben aan een "biotine bindende stof" die noodzakelijk is voor het vasthouden van biotine.

Deze mogelijkheid zal hierna verder worden besproken.

TABEL B

5 Biotinegehalte in serum en urine bi.1 gezonden en diabetici.

gezonde mensen serum-biotine (pg/ml) urine-biotine ^tig/dag) n = 14 424 +62 24 + 12 10 diabetici 697 +72 54+7

TABEL C

Biotinegehalte

serum bij urine bij . serum na urine na t J

15 nuchter zijn nuchter zijn dosering *1) dosering *1) _(jug/24 uren) (mg/1)_(mg/24 urm) (dagen) gezonde mensen 415 24 39 15 4,7 ,0 diabetici 812 61 0,1 J 30 1,2 *1) gebaseerd op toediening van ongeveer 30 mg/dag gedurende zeven dagen 25 *2) ongeveer 100 keer serumgehalte bij diabetici met een voorbehandeling.

Voor het/verkrijgen van een vergelijkende groep werd de respons ten aanzien van de biotinetherapie gemeten bij 6 gezonde patiënten. Bij 30 een experiment werd het plasmaglueose en insulinegehalte dagelijks gemeten gedurende zeven dagen tijdens het toedienen van biotine in een hoeveelheid van 0,18 mg/0,45 kg lichaamsgewicht per dag. De resultaten van deze experimenten zijn samengevat in tabel D. Zoals blijkt uit tabel D werd de immunoreactieve insuline (IRI) als insuline gemeten door een dubbele anti-35 lichaamtechniek, die het serumgehalte van insuline betreft .uitgedrukt in micro-eenheden per milligram, waarbij 24 eenheden insuline-activiteit aanwezig zijn per milligram insuline. Het is duidelijk dat er geen significante veranderingen zijn waargenomen bij plasmaglueose of IRI-gehaltes 8104018 r * * -8- 22184/Vk/mb bij "fasting"(is nuchter zijn of vasten) gedurende zeven dagen dat deze zes patiënten werden onderworpen aan de biotine-therapie . Het gehalte van de plasmaglucose en insuline van de zes normale patiënten werd ook gemeten als functie van de tijd tijdens de glucosetolerantietest, beide voor en 5 na de zeven dagen van de biotine-therapie. De gemiddelde resultaten van deze experimenten zijn weergegeven in tabel E. Zoals blijkt uit tabel E is er een lichte achteruitgang vande glucosetolerantie na de biotine-therapie duidelijk. Zoals later zal worden aangegeven zijn deze gegevens waarschijnlijk terug te voeren op het belang van de verhouding biotine 10 tot insuline in serum bij het glucosemetabolisme.

TABEL D

normale blanco: plasma glucose en IRl-waarden dagelijks bepaald bij een biotine-therapie.

15 glucose (mg/100 ml)

BIOTINE-THERAPIE

. , . , blanco . . .

patient dag 1 2 3 4 5 6 7 8 on 1 88 92 91 90 80 84 88 94 2 88 90 91 92 91 88 86 84 3 94 81 100 97 93 100 98 94 4 98 100 103 106 103 97 90 94 25 5 98 98 99 99 100 97 94 100 6 81 94 91 88 93 92 94 92 gemiddelde 91 93 96 95 93 93 92 93 30 s.d. 7 5 ρ. ζ n.s. (niet significant) n*s· -VERVOLG TABEL D- 8104818 -9- 22184/Vk/mb TABEL D (vervolg) IRI tyuE/ral)

5 BIOTINÉ-THERAPIE

. . , blanco patienfc_dag 1 2 3 4 5 6 7 8 1 13 15 16 12 14 13 14 13 2 13 14 14 14 12 19 13 11 10 3 12 11 16 15 13 17 21 17 4 12 12 13 13 10 18 10 11 5 20 23 26 29 22 32 26 32 6 12 15 17 16 14 20 16 16 Ί5 - - - - - - - - gemiddelde 14 15 17 16 14 20 16 11 s.d. 3 8 p. ^ n.s.

20.

TABEL E

normale blanco: plasma glucose en insulinegehalte tijdens glucose-tolerantie-test voor en na biotine-therapie 25 0_30_60_90_120_180 (minuten) glucose (mg/dl) voor biotine 91 132 120 105 95 71 30 na biotine 93 160 148 106 98 71 p ^ ns 0,05 ns ns ns ns IRI (yuE/ml) 35 voor biotine 14 66 78 75 46 16 na biotine 16 73 124 71 68 18 P ζ ns 0,05 0,05 ns ns ns *D gemiddelde van 6 aangegeven en ter vergelijking dienende personen.

8104818 • t -10- 22184/Vk/mb

Vervolgens werd het plasmaglucoseniveau bepaald als functie van de tijd gedurende een glucose-opwekking in een groep van vijf insuline-afhankelijke diabetici. Deze resultaten zijn weergegeven in de tabellen F-1 en F-2. Tabel F-1 geeft de resultaten weer vóór de biotine-therapie en 5 tabel F-2 geeft de resultaten weer van hetzelfde experiment na toediening van ongeveer 40 eenheden insuline plus biotine in een hoéveelheid van 0,18 mg/0,45 kg lichaamsgewicht per dag gedurende zeven dagen. De aangegeven metingen werden uitgevoerd onder vasten en met tussenpozen van een uur na de toediening van het opwekkingsmiddel. De opwekking aangegeven als 10 100 g betrof de toediening aan de patient, van 100 g van een met smaakstoffen behandelde soda-drank. De opwekking aangegeven als ADA is een maaltijd aangegeven door de American Diabetes Association, bevattende stoffen met de werking van 100 g glucose. Bij deze patiënten, zoals blijkt uit tabel F, resulteerde de biotine-therapie in een neiging voor glucose-15 tolerantie die enigszins slechter is dan in de normale vergelijkende groep aangegeven in tabel E. Deze resultaten moeten worden beschouwd in het licht van de bepaalde toegepaste dosis en zal hieronder nader worden besproken waarbij de toediening van biotine aan IDDM-personen die ook een bepaalde dosis insuline ontvingen, de gemiddelde dagelijkse hyperglycemia en 20 glycosuria van de patient bleken te verbeteren. Ook is het gehalte aan circulerende insuline bij deze patiënten zeer laag (fig. 1), hetgeen wijst op een zeer hoge biotine tot insuline-verhouding na de behandeling.

-TABEL F- 8104818 -11- 22184/Vk/mb

TABEL F

insuline-afhankelijke diabetici plasma glucose-gehaltsitijdens een opwekking voor en na de biötine-therapie.

5 TABEL F-1 voor de biotine plasma-glucose (mg?) 10 patient_F_1_2_3_4_opwekking

1 131 151 177 147 137 ADA

2 158 288 293 253 169 100 g 15 3 133 323 377 278 183 100 g 4 311 300 346 365 350 100 g

5 237 411 360 318 292 ADA

gemiddelde 194 295 311 272 226 20 TABEL F-2 na de biotine plasma-glucose (mg?) patient_F_1_2_3_4_opwekking

1 133 227 180 166 135 ADA

30 2 166 267 326 283 199 100 g 3 138 346 466 311 236 100 g 4 244 465 417 315 322 100 g

5 332 483 438 372 358 ADA

gemiddelde 203 358 365 289 250 8104318 35 -12- 22184/Vk/mb * * f

Verder werd het serum glucose-gehalte van zes niet-insuline afhankelijke diabetici gemeten als ftmctie van de tijd gedurende een glucose-opwekking, toegediend zowel vóór de biotine-behandeling als na zeven dagen biotine-toediening in een hoeveelheid van 0,18 mg/0,4.5 kg 5 lichaamsgewicht per dag. Deze resultaten zijn samengevat in tabel G en tabel H. Bij de patiënten 1 en 2 was de radio-bepalingstechniek voor insuline niet geschikt en daarom is de eenheid CP (ng/ml) aangegeven.

CP, verbindend (connecting) peptide, is een maat voor de insulinesecretie door de pancreas. De waarden van de patiënten 1 en 2 zijn niet inbegrepen 10 in de berekening van de gemiddelde waarden voor de groep. De gegevens vermeld in tabel G geven een. significante verbetering aan voor de glucose-tolerantie van de patiënten narde biotine-behand'eling, met name wanneer vergeleken met de normale vergelijkende groep (zie tabel E) en de insuline-afhankelijke groep (zie tabel F). Verder geven de resultaten weergegeven 15 in tabel H aan dat er geen significante verhoging is met betrekking tot de insuline-respons bij de zes niet-insuline afhankelijke patiënten na de biotine-therapie. Dit kan er op wijzen dat toediening van biotine de activitèit van de endogëen geproduceerde -insuline verhoogt. Deze mogelijkheid zal hierna verder worden besproken. Ook geldt dat in 20 tegenstelling tot de normale en de IDDM-groepen, zoals boven vermeld, de insuline-gehaltes tamelijk hoog zijn in deze NIDDM-groep. Dit wijst er -opnieuw op dat de verhouding biotine tot insuline een belangrijke parameter kan zijn.

-TABEL G- 8104818 -13- 22184/Vk/mb

TABEL G

niet van insuline afhankelijke diabetici plasma glucose-gehalte tijdens een opwekking voor en na de 5 biotine-therapie.

TABEL G-1 voor de biotine-therapie < plasma-gluoose (ragjS) 10 patient_F_1_2 3_4_opwekking

1 111 275 267 188 163 ADA

2 185 252 221 198 166 ADA

15 3 144 349 320 198 111 100 g 4 118 284 213 99 74 100 g 5 119 314 300 173 109 100 g 6 95 199 191 164 101 100 g ?n gemiddelde 129 279 252 170 121 TABEL G-2 na de biotine-therapie 25 plasma-glucose (mg?) patient_F_1_2_3 4_opwekking

1 97 243 178 120 82 ADA

2 145 201 154 154 121 ADA

30 3 127 312 315 224 103 100 g 4 117 275 198 108 67 100 g 5 113 269 240 153 65 100 g 6 103 214 157 135 68 100 g 35 ' gemiddelde 117 252 207 149 84 -TABEL H- 8104818 -14- 22184/Vk/mb

TABEL H

niet insuline afhankelijk plasma 'insuline-gehalte tijdens een opwekking voor en na de 5 biotine-therapie.

TABEL H-1 voor biotine-therapie *1) plasma insuline (juE/ml) of CP (ng/ml) patient_ F__1_ 2___3_4_ 1*1) 2,0 3,0 3,0 3,6 3,2 2*1) 3,5 4,5 5,4 4,8 4,0 15 3 29 148 202 72 28 4 13 148 160 32 16 5 21 95 128 63 51 6 24 170 300 250 104 20‘ gemiddelde 22 140 198 104 50 TABEL H-2 na biotine-therapie

Zo plasma insuline (juE/ml) patient F · 1_2_3_.· 4 1 *1) 2,2 3,6 3,6 3,0 2,3 30 2 *1) 5,0 5,8 6,9 5,1 4,3 3 22 147 224 152 30 4 12 152 140 39 16 5 18 72 132 91 33 35 6 65 260 350 270 91 gemiddelde 29 158 212 138 43 P ns ns ns ns ns uin de statistische analyse zijn de patiënten 3,4,5 en 6 niet betrokken.

8104018 -15- 22184/Vk/mb

In tabel J is een samenvatting gegeven van de gegevens die zijn vermeld in de tabellen E, F en G, waarbij het verband is aangegeven tussen het percentage van de tolerantie van de ter vergelijking dienende experimenten in afhankelijkheid van de tijd tijdens een glucose-opwekking 5 voor elke onderzochte groep. In fig. 2 is een grafische voorstelling gegeven van de gegevens die zijn samengevat in tabel H. De aanduiding percentage van de vergelijkende tolerantie (vergelijkingspercentage) zoals aangegeven in fig. 2 geeft het gehalte aan van de glucose bij de na-biotine-behandeling op een gegeven tijdstip tijdens de glucose-opwekking, 10 vermenigvuldigd met 100 en gedeeld door het -glucosegehalte bij de pre-biotine-behandeling gedurende dezelfde tijd . van de opwekking. Wanneer bijvoorbeeld op een bepaald tijdstip het glucosegehalte bij de na-biotine-behandeling gelijk was aan het glucosegehalte bij de pre-biotine-behande-ling dan zou het gegeven punt op dat tijdstip gelijk zijn aan 100%.

15 Verder geldt dat wanneer de glucose-tolerantie werd versterkt na de biotine-behandeling dus wanneer het glucosegehalte bij de na-biotine-behandeling lager was dan het glucosegehalte bij de pre-biotine-behandeling op een bepaald tijdstip dan zou het vergelijkinspercentage lager zijn dan 100%. Wanneer hierentegen de glucose-tolerantie jwerd verlaagd op eei bepaald 20 tijdstip na de biotine-behandeling dan zou de procentuele vergelijkings-tolerantie hoger zijn dan 100?. Zoals aangegeven in fig. 2 en in tabel J versterkt de biotine-behandeling significant de glucose-tolerantie bij de niet-Insuline afhankelijke groepen.Verder scheen de verbeterde tolerantie bij de niet-insuline afhankelijke groep te verbeteren in de laatste 25 trappen van het onderzoek. In déze figuur is un" het aantal onderzochte patiënten en wp" is de waarschijnlijkheid dat de punten niet de ware gegevens weergeven.

-TABEL J- 8104818 -16- 22184/Vk/mb

TABEL J

plasma glucose-tólerantie na een biotine-behandeling (,%) van een ter vergelijking dienende tolerantie *15

5 % C

eroen tijd (uren>

Sr06p F 1_2 3_L_ gezonden 102>2 123,2 103,2 100,0 105,0

^ IDDM

n _ 5 106 12*1,5 116,0 108 111,8 ήΤδ 92,7 91,4 81,7 89,1 76,2 P 0,11 9,01 0,001 0,03 0,001 15 *1) gemiddelde (.%$ van de gedane onderzoekingen.

Daarna werd de gemiddelde dagelijkse hyperglycemia en glycosuria in een groep van vijf insuline afhankelijke diabetici gemeten en bij vijf 20 niet-insuline afhankelijke diabetici gedurende zeven dagen van de biotine-therapie. Bij de IDDM-groep werd de normaal vereiste insulinedosering verlaagd te weten 1/2 tot 1/3» Deze resultaten zijn weergegeven in de fig. 3-6. De gegevens die zodoende werden verkregen werden statistisch op twee manieren geanalyseerd: 25 1) door vergelijking van de gemiddelde q-zes uren bloedsuiker- spiegel en de gemiddelde glycosuria in elke periode, en 2) door de lineaire regressielijnen uit te zetten waar dit toepasbaar is.

Fig. 3 is een samenstelling van de respons van drie insuline-30 afhankelijke diabetische patiënten ten aanzien van de biotine-therapie. Deze patiënten werd een placebo toegediend gedurende een periode van zeven dagen en vervolgens werden ze met biotine behandeld in een hoeveelheid van 0,18 rag/0,45 kg lichaamsgewicht per dag gedurende een periode van zeven dagen. In de grafieken is b de helling van het serum glucose 35 ten opzichte van de tijdlijn; "r" is de lineaire regressie-coëfficient, hetgeen de correlatie is van de punten van de gegevens ten aanzien van de tijd, met een waarde van +1 of -1 hetgeen een perfecte correlatie is en 110’! hetgeen de afwezigheid van de correlatie betekent, "p" is de waar- 8104818 -17- 22184/Vk/mb schijnlijkheid dat de lijn niet in overeenstemming is met de punten van de gegevens; "y " is de ordinaat-interceptie; "b” is de helling van de urine-glucose ten opzichte van de tijdlijn en "U" is de gemiddelde urine-glucosewaarde. De analyse van de lineaire regressie geeft een signifi-5 cante correlatie weer tussen het verschijnen van biotine in serum en het omgekeerde van de positief hellende lineaire regressielijn bij de ter vergelijking dienende placebo-groepen. De gegeven punten die de urine-glucose weergeven werden zelf niet verbeterd op een lineaire regressieanalyse tijdens de biotineperiode zodat een gemiddelde waarde is weer-10 gegeven. Deze gemiddelde waarde is echter aanzienlijk minder dan men zou hebben verwacht wanneer de trend werd voortgezet zoals aangegeven tijdens de placebo-periode. Verder wees een statistische analyse onder toepassing van methode no. 1 niet op significante verschillen tussen de biotine en placebo-perioden.

15 Fig. 4 is een samenstelling van de respons van twee insuline- afhankelijke diabetische patiënten ten aanzien van de biotine-therapie.

Deze patiënten werd biotine toegediend in een hoeveelheid van 0,18 mg/ 0,45 kg lichaamsgewicht per dag gedurende een periode van zeven dagen. De statistische aanduidingen b, y^, r en p zijn dezelfde betekenissen als 20 aangegeven met betrekking tot fig. 3. De statistische analyse en de analyse van de lineaire regressielijn wijzen op een positieve correlatie tussen de verschijning van fciotine en de verlaagde plasma en urine-glucosewaarden.

Fig. 5 is een samenstelling van de respons van drie niet-insuline-afhankelijke diabetici ten aanzien van de biotine-therapie. Deze patiënten 25 kregen een placebo-toediening voor een periode van zeven dagen en vervolgens werden ze behandeld met biotine in de hoeveelheid van 0,18 mg/0,45 kg lichaamsgewicht per dag gedurende een tijd van zevën dagen. Door g en U worden gemiddelde serumglucose- en urineglucosewaarden voorgesteld.

Verder geeft wn,f het aantal aflezingen aan die zijn uitgevoerd om de 30 gemiddelden te kunnen berekenen. Deze resultaten geven een significante daling aan van de plasma- en urineglucose tijdens de biotine-periode in vergelijking met de placebo-periode. Bovendien was de verbetering die werd bewerkstelligd na een serum biotinegehalte van ongeveer 10 ng/ml bereikt.

35 Fig. 6A is een samenstelling van de respons van twee niet- insuline afhankelijke patiënten ten aanzien van de biotine-therapie.

Deze patiënten kregen biotine toegediend in een hoeveelheid van 0,18 mg/0,45 kg lichaamsgewicht per dag gedurende een periode van zeven 8104318 » -18- 22184/Vk/mb dagen en werden daarna behandeld met een placebo gedurende zeven dagen. Deze resultaten geven opnieuw een sterke correlatie weer tussen het verschijnen van biotine en de verlaagde plasma en urine-glucosewaarden. Verder had er een verbetering plaats wanneer de serum biotine-concentratie 5 een waarde bereikte van ongeveer 50-75 ng/ml. Fig. 6A kan worden vergeleken met fig. 6B waarin de samengestelde respons is weergegeven van alle diabetische patiënten die een placebo'krggen toegediend gedurende zeven dagen gevolgd door de biotine-therapie gedurende zeven dagen. In beide gevallen was er een significante verlaging van het serum en urine-glucose-10 gehalte nadat de serum biotine-concentratie een waarde had bereikt van ongeveer 50 ng/ml,

De gunstige werking van biotine kan verder worden aangetoond door de experimenten die zijn uitgevoerd met een insuline-afhankelijke diabitici,waarvan de resultaten zijn weergegeven in de fig. 9 en 10.

15 Deze patient was eerst dagelijks behandeld met grote hoeveelheden insuline. Voordat deze experimenten werden yitgevoerd werd de insulinedosering verlaagd tot 24 eenheden per dag ten einde hyperglycemia en glucosuria te bewerkstelligen. Vervolgens werd deze patient gedurende zeven dagen een placebo toegediend, gevolgd door ongeveer 20 mg/dag biotine gedurende 20 zeven dagen. Zoals aangegeven in fig. 9 was er een daling met betrekking tot de serum en urine-glucose nadat de serum biotinegehaltes een waarde hadden bereikt van ongeveer 40 ng/ml. Het is van belang dat tijdens de placebo-periode de helling van de lineaire regressielijn, uitgezet tussen het serum glucose ten opzichte van de tijd werd berekend en bleek 25 6,6 mg?/dagte zijn.Tijdens.de biotine-periode behandelde de helling tot -9,6 mgi/dag.

Vervolgens werden dezelfde experimenten uitgevoerd met deze patiént maar met een verhoging van de insuline van 24 eenheden per dag tot 31 eenheden per dag. Deze resultaten zijn weergegeven in fig. 10.

30 Opnieuw was er een opmerkelijke daling in het serum glucosegehalte nadat de serum biotine-concentratie een waarde had bereikt van ongeveer 100 ng/ml. De helling van de serum glucose ten opzichte van de tijdlijn was echter berekend en bleek 7,6 mg/dag te zijn tijdens de placebo-periode en -19 mgi/dag tijdens de biotine-periode. Wanneer vergeleken 35 met de resultaten in fig. 9 is het duidelijk dat de verhoogde dosering aan insuline het serum glucose-gehalte van de patient sneller deed stijgen tijdens de placebo-periode en sneller deed dalen met nagenoeg in factor 2 tijdens de biotine-periode. Dit geeft aan dat de effectivi- 8104818 -19- 22184/Vk/mb teit van de insuline-behandeling aanzienlijk kan worden verhoogd door het toedienen van biotine zelfs wanneer aan de insuline-afhankelijke patiënten geschikte doseringen aan insuline worden gegeven.

Uit de volgende specifieke voorbeelden blijkt de gunstige be-5 handeling van de diabetes mellitus-ziekte, in overeenstemming met de richtlijnen volgens de uitvinding. Ook zal het echter duidelijk zijn dat de voorbeelden slechts ter toelichting zijn bedoeld en niet als beperkend moeten worden opgevat.

Voorbeeld I

10 De zeer goede respons van een niet-insuline afhankelijke diabeticus ten aanzien van de biotine-therapie werd gemeten en is aangegeven in fig. 1. Eerst werd de patient behandeld met 30 eenheden insuline per dag. Juist voor deze experimenten werd de insuline-dosering verlaagd tot 24 eenheden per dag om een verhoogd plasma en urine-glucose-15 gehalte te bewerkstelligen. Deze patient kreeg dan een placebo toegediend gedurende een periode van zeven dagen en werd vervolgens behandeld met 0,18 mg/0,45 kg lichaamsgewicht per dag biotine. Na het begin van de biotine-behandeling en nadat de serum biotine-concentratie een waarde » had bereikt van ongeveer 10 ng/ml daalden zowel de serum als de urine-20 glucosegehaltes significant zoals blijkt uit f-ig. 7. Het plasma-glucose-gehalte werd elke zes uren gemeten en de urine-glucose-excretie werd gemeten over een periode van 24 uren. Een statistische analyse geeft aan dat er een significante daling was van de urine-glucose tijdens de biotine-toediening. De fig. 3» 4, 5 en 7 geven aan dat bij diabetici 25 het gemiddelde plasma-glucosegehalte wordt verhoogd tot ongeveer 150-200 mg/100 ml.

Voorbeeld II

De zeer goede respons van een insuline-afhankelijke diabetische patient ten aanzien van de biotine-therapie werd gemeten en is weerge-30 geven in fig. 8. Tijdens de behandeling kreeg de patient 28 eenheden insuline per dag toegediend. Deze patient werd behandeld met 0,18 mg/ 0,45 kg lichaamsgewicht per dag biotine gedurende een periode van zeven dagen en daarna kreeg hij een placebo toegediend gedurende zeven dagen. Zoals aangegeven in fig. 8 was er een significante daling in het serum 35 glucose en urine-glucosegehalte overeenkomend met de verhoogde serum-biotineconcentratie. Wanneer het serum biotinegehate daalde op het einde van de placebo-periode begon het verlaagde glucosegehalte opnieuw te stijgen. Dit toont een sterk direct verband aan tussen de toediening 8104310 r -20- 22184/Vk/mb van biotine en het verlagen van de serum en urine-glucosegehalte.

Hierbij is het van belang dat de resultaten van de hierboven vermelde experimenten duidelijk aangeven dat bij diabetici het serum biotinegehalte bij voorkeur moet liggen bij 10-100 ng/ml voor een 5 geschikte biologische activiteit. Deze waarden zijn 20-200 keer het normale gehalte. Er schijnt een optimalemvloed voor de behandeling van diabetici te zijn wanneer het serum biotinegehalte ongeveer 75 ng/n»l is, hoewel de exacte kwantitatieve waarde van het biotinegehalte voor de beste behandeling kan variëren van patient tot patient, afhankelijk van 10 de persoonlijke fysiologische respons van de patient.

Een aanbevolen behandeling van NIDDM-patienten volgens de uitvinding zou echter zijn dat biotine wordt toegediend in een voldoende hoeveelheid om het serum biotinegehalte van de patient zodanig te verhogen dat de verhouding van insuline uitgedrukt in |UE tot biotine uitgedruk't in 15 ng is 7 + 3 en bij voorkeur is de optimale verhouding voor de behandeling van een bepaalde patient bijvoorbeeld 8/1 of een andere geschikte waarde.

Dit kan worden bewerkstelligd door het toedienen van een benaderde dagelijkse dosering van d-biotine van 5 tot 20 mg per 68 kg lichaamsgewicht vande patient. De dosering kan echter ook lager of hoger zijn binnen 20 het bovenvermelde traject van doseringen in afhankelijkheid van de persoonlijke respons van een bepaaldev patient. Bovendien kan binnen het kader van de uitvinding een dosering aan d-biotine plaatshebben die niet is gèlegen binnen 5 tot 20 rag per 68 kg lichaamsgewicht wanneer blijkt dat de bovenvermelde verhouding voor een bepaalde patiënt kan worden aangepast 25 aan het gebruikelijke gebied van 7+3 tijdens de behandeling onder toepassing van hogere of lagere doseringen aan biotine, al of niet met insuline, dan het bovenvermelde gebied.

Ook is een aanbevolen behandeling voor IDDM-patienten volgens de uitvinding het toedienen van biotine als een vervangingsmiddel voor 30 een 1/3 tot 1/2 vermindering van de insuline-toediening zódat de verhouding van de vermindering van insuline in eenheden per dag tot de toediening van biotine uitgedrukt in mg per dag gelegen is bij 4+2. Het zal opnieuw duidelijk zjljn dat het voordelen zal hebben om een optimale verhouding voor een bepaalde patient te kiezen.

35 Op basis van de resultaten zoals aangegeven in de voorbeelden zal het duidelijk zijn dat volgens de werkwijze van de uitvinding een nieuwe en zeer effectieve behandeling kan worden bewerkstelligd voor het behandelen van diabetes mellitus.

8104318 -21- 22184/Vk/mb

Hoewel de exacte theorie met betrekking tot de toepassing van chemisch d-biotine in het lichaam van de patient om de symptomen van diabetes mellitus te bestrijden niet bekend zijn en hoewel andere fysiologische en chemische overwegingen in feite het goede resultaat van de 5 behandeling volgens de uitvinding kunnen aangeven wordt aangenomen dat insuline en biotine een gezamenlijk metabolisme hebben en dat bij diabetici er een bindende stof aanwezig is die het serum biotine inactief maakt, waarbij de activiteit van serum insuline wordt verlaagd. Het toedienen van vrij (actief) biotine aan de patient kan werken om de activi- 10 teit van endogeen geproduceerd insuline te verhogen bij de patient, waarbij de symptomen van de ziekte wordt behandeld.

Dit concept kan mathematisch als volgt'worden weergegeven: K1

X —......}-^ X

P S

15 K1 .

B + P„t....... — . BP„ (actief)

N „ N

K2 20 K3

Pjf + V-VD (inactief) Kü K5 25 BPN + PDr— -BPNPd (inactief)' K7 BP„ + I —..... ^ 'Actieve stof" N s 30 waarbij Ip is pancreatische insuline, I is serum insuline, B is vrij biotine, BP^ is normaal gebonden biotine, P^ is normaal bindend proteïne en P^ is abnormaal bindende stof. Zodoende kan worden aangetoond dat: * dBt 3 -TT— = -K_ (BP„) (I ) waarbij B. = het totale serum biotine, dt 7 N s t en dat: 8104318 -22- 22184/Vk/mb t r A Γ ίβ ^ _κ

dt dt “ J

Daarom geldt - Ig = (BTq - Ig()) -

Zodoende geeft een grafiek waarbij BT - 1 wordt uitgezet X s 5 ten opzichte van de tijd een reshte lijn op afstand - Igo en helling Kj (vrijmaking pancreatisch insuline).

Deze hypothese werd getest bij normale patiënten en NIDDM-patienten onder toepassing van de gegevens verkregen in fig. 1 en deze resultaten zijn samengevat in fig. 11. De statistische referentie "r" 10 geven de lineaire regressie-coëfficient aan en "p" de waarschijnlijkheid dat de lijn niet voldoet aan de gevonden gegevens. Het zal duidelijk zijn uit fig. 11 dat de gevonden punten in overeenstemming zijn met de voorspelde mathematische vergelijkingen rekening houdend met de correlatie. Het is verder duidelijk dat de hierbij beschreven verhoudingen fysiolo-15 gisch belangrijk zijn.

Zodoende is aangetoond dat volgens de uitvinding een nieuw farmaceutisch produkt wordt verkregen en een nieuwe werkwijze voor het toedienen van het preparaat en een behandeling van de ziekte diabetes mellitus, waarbij deze produkten en de toegepaste werkwijze voordelen 20 hebben en kenmerken zoals boven beschreven. Binnen het kader van de uitvinding zal het mogelijk zijn om wijzigingen of variaties aan te brengen die echter moeten worden begrepen binnen het kader van de uitvinding.

-CONCLUSIES- 8104818

Claims (14)

1. Geneesmiddel voor het behandelen van diabetes mellitus, met het kenmerk, dat dit d-biotine bevat in een hoeveelheid die voldoende 5 is om de concentratie van het serum biotine van de patient te verhogen binnen een kwantitatief gebied waarin hyperglycemia en glycosuria worden verminderd.

2. Werkwijze voor de toediening van een preparaat ter bestrijding van diabetes mellitus, met het kenmerk, dat d-biotine wordt toege- 10 diend aan de patient in een hoeveelheid die voldoende is om de serum biotine-concentratie van de patient te verhogen binnen een kwantitatief gebied waarbij hyperglycemia en glycosuria van de patient worden verminderd of verlicht.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het 15 kwantitatieve gebied van de serum biotine-concentratie wordt gehouden op ongeveer 10-100 ng/ral.

4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de concentratie aan serum biotine kan worden gehandhaafd door het aan de patient toedienen van biotine. in een hoeveelheid van ongeveer 5 tot 20 ml per 20 68 kg lichaamsgewicht van de patient.

5. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de aan de patient toegediende hoeveelheid biotine zoals vermeld dagelijks wordt toegediend.

6. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de hoe- 25 veelheid biotine oraal aan de patient wordt toegediend.

7. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk , dat de hoeveelheid biotine samen met insuline wordt toegediend.

8. Werkwijze voor het toedienen van een geneesmiddel ter bestrijding van diabetes mellitus bij menselijke patiënten door het toe- 30 dienen van d-biotine aan de patient in een hoeveelheid van ongeveer 5 tot 20 mg per 68 kg lichaamsgewicht.

9· Werkwijze voor de toediening van een geneesmiddel ter bestrijding van diabetes mellitus, met het kenmerk, dat de volgende stappen worden bewerkstelligd: 35 a) het meten van het serum biotine en insulinegehalte tijdens een glucose-tolerantietest, b) het bepalen of de patient al of niet insuline-afhankelijk is door het meten van de endogene produktie van insuline en de hiermee samen- 8104818 -24- 22184/Vk/rab t ' Is* * v Λ v hangende biotine-respons tijdens de glucose-tolerantietest, c) het behandelen van de niet-insuline afhankelijke patient met d-biotine in een hoeveelheid die voldoende is ter verkrijging van een bepaalde kwantitatieve verhouding van het serum insulinegehalte tot het 5 serum biotinegehalte waarbij hyperglycemia en glycosuria van de patient worden verlicht na een geschikte*behandelingsperiode, en d) het behandelen van de insuline afhankelijke patient met d-biotine en verlaagde doseringen van parenteraal toegediende insuline op een voldoende wijze ter verkrijging van een kwantitatieve verhouding 10 van toegediende biotine tot verlaagde insulinedosering waarbij de hyperglycemia en glycosuria van de patient worden verlicht na een geschikte behandelingsperiode.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de kwantitatieve verhouding van serum insulineconcentraties tot serum 15 biotineconcentraties in een niet-insuline afhankelijke patient worden gehouden in een traject van 4 tot 10 gedurende een geschikte behandelingsperiode.

11. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de voorbehandelingsdosering van insuline voor een insuline afhankelijke 20 patient kwantitatief wordt verlaagd met 1/3 tot 1/2 en d-biotine wordt toegediend in een hoeveelheid van 2 tot 6 mg per dag voor elke eenheid per dag van de kwantitatief verlaagde insuline.

12. Werkwijze volgens conclusies 9 en 10, met het kenmerk, dat de kwantitatieve verhouding kan worden gehandhaafd door het toedienen 25 van biotine aan de patient in een hoeveelheid van ongeveer 5 tot 20 mg/ 68 kg lichaamsgewicht.

13. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat het serum biotine kwantitatief wordt gemeten in ng per milliliter en het insuline kwantitatief wordt gemeten in micro-eenheden per milliliter tijdens de 30 glucose-tolerantietest.

14. Farmaceutisch produkt voor het behandelen van diabetes mellitus bij menselijke patiënten, met het kenmerk, dat dit d-biotine bevat in een hoeveelheid die voldoende is om hyperglycemia en glucosuria van de patient te behandelen, en insuline. λ Eindhoven, oktober 1g81 8104818