NL8102155A

NL8102155A - Werkwijze voor de bereiding van l-asparaginezuur door vastgelegde microoerganismen en daarbij te gebruiken schuim.

Info

Publication number: NL8102155A
Application number: NL8102155A
Authority: NL
Original assignee: Grace W R & Co
Priority date: 1980-09-17
Filing date: 1981-05-01
Publication date: 1982-04-16
Also published as: FR2490241B1; CA1173387A; DE3134893A1; FR2490241A1; IT8121235A0; AU7357681A; AU549140B2; IT1136579B; JPS5774091A; SE8104944L; CH650798A5

Description

i V - 1 -

Werkwijze voor de bereiding van L-asparaginezuur door vastgelegde microorganismen en daarbij te gebruiken schuim.

Het is bekend dat aspartase het vermogen heeft ammoniumfumaraat in L-asparaginezuur om te zetten. Diverse methoden voor de bereiding van L-asparaginezuur door enzymatische reactie van ammoniumfumaraat onder invloed van aspatase 5 zijn bekend. Bijvoorbeeld kan men L-asparaginezuur bereiden door een aspartase-vormend microörganisme te kweken in een voedings-medium dat fumaarzuur of fumaraat bevat. Zie bijvoorbeeld de Amerikaanse octrooischriften 2.927.059, 2.971.890, 3.198.712, 3.214.345, 3.310.774, 3.999.586, 4.013.508 en 4.048.018, het 10 Britse octrooischrift 880.234 en het Canadese octrooischrift 697.310. Volgens het Amerikaanse octrooischrift 3.214.345 gebruikt men cellen van E. coli om asparaginezuur uit ammoniumfumaraat te bereiden. Anderzins kan L-asparaginezuur bereid worden hetzij door resterende hele cellen met aspartase-activiteit op 15 ammoniumfumaraat te laten inwerken hetzij door het enzym te extraheren en dat dan samen met ammoniumfumaraat te brengen. Maar deze werkwijzen hebben het nadeel dat het ontstane produkt hetzij met enzym hetzij met de microbencellen en de voedingsbronnen, enz. verontreinigd zijn. Om L-asparaginezuur met hoge zuiverheid 20 te winnen zijn aanvullende bewerkingen nodig voor het verwijderen van het enzym en de andere bijmengselen. Vaak worden met deze bewerkingen het enzym en/of de microorganismen vernietigd zodat zij slechts ëën keer gebruikt kunnen worden.

Om deze nadelen te overwinnen is voorge-25 steld aspartase vast te leggen door het te binden aan een anionen-uitwisselend polysaccharide; zie de Japanse octrooipublikatie 6870/1970. Ook is het bekend microorganismen in polymere dragers in te kapselen; zie de Japanse octrooipublikatie no. 17.587/1970, volgens welke men als polymere dragers polyacrylaten gebruikt. In 30 dit verband zijn ook de Amerikaanse octrooischriften 3.649.457, 3.791.926 en 3-898.128 van belang. Het gebruik van carrageenan 8102155 ψ \ - 2 - - \ als drager is door Sato beschreven in Biochemica et Biophysica Acta 570 (1979), 179-186» De Russische octrooipublikaties SU 423.976 en SU 451.483 beschrijven het vastleggen van E. coli-cellen in polyacrylamide en de bereiding van L-asparaginezuur uit ammonium-5 fumaraat.

Het inkapselen van microorganismen in hydrofiele polyurethaan-schuimen is ook al eens voorgesteld, zie het Amerikaanse octrooischrift 3.905.923. Het binden van enzymen aan polyurethanen is ook beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 10 3.672.955, zie kolom 5, regel 27-35. In het Amerikaanse octrooi schrift 4.000.040 vindt men de bereiding van L-asparaginezuur uit andere substraten dan fumaarzuur, te weten azijnzuur, ethanol en koolhydraten. Hydrofiele polymeren zijn ook alsdragers voor chemicaliën toegepast, waaronder bacteriostaten en fungiciden; zie 15 het Amerikaanse octrooischrift 3.975.350. Ook is het bekend bac-terie-cellen in hydrofobe polyurethanen vast te leggen, zie voorbeeld 4 van het Britse octrooischrift 953.414.

Een andere terzake doende verwijzing is naar het artikel van Sonomoto et al in Agric. Biol. Chem. 44 (1980) 20 1119-1126, volgens welke omzettingen van steroïden bereikt worden met bacteriecellen die ingesloten liggen in uit voorpolymeren bereide polyurethanen. Fukui et al beschrijven in Biochimie h2 (1980) 381-386 het gebruik van enzymen die vastgelegd zijn in door belichting verknoopbare voorpolymeren en in urethaan-vöorpolyme-25 ren, voor het bereiden van L-aminozuren. Het vastleggen van bacteriecellen met behulp van urethaan-voorpolymeren is ook beschreven. In een recente Gordon Research Conference van 11-15 augustus 1980 werd het vastleggen, van gehele cellen (met name van genetisch gemanipuleerde E. coli die zeer veel penicilline-amidase maakte) 30 in urethaan-voorpolymeren besproken; biologische systemen voor het bereiden van L-serine en L-tryptofan waren toen ook "nog onder beoordeling".

Volgens de uit-vinding gebruikt men een hydrofiel polyether-polyurethaan-schuim waarin tenminste 5Q mol.% 35 der alkyleenoxyde-eenheden van het polyurethaan ethyleenoxyde is, met in dat schuim een onbeweeglijk gemaakt aspartase-vormend 8102155 - 3 - « V é microorganisme. De uitvinding betreft ook een werkwijze voor het bereiden van het schuim en de toepassing daarvan voor het bereiden van asparaginezuur.

Bij voorkeur bestaan de polyether-segmenten 5 van het polyurethaan voor tenminste 90 mol.% uit ethyleenoxyde-eenheden. Afhankelijk van de gebruikte hoeveelheid verknoper kan het schuim zowel stijf als soepel zijn. De gewichtsverhouding tussen polyurethaan en microorganisme (betrokken op droog gewicht) moet tussen 1:10 en 10:1 liggen, bij voorkeur tussen 2:1 10 en 4:1. Voor het mengen van de cultuur met het voorpolymeer kan het droge gewicht aan microörganismen van de kweek bepaald worden door een monster bij een geschikte temperatuur (bijv. 50°C) droog te dampen. Daarna kan 50 tot 90 % der microörganismen in het schuim vastgelegd worden. Met "vastgelegd" wordt hier bedoeld 15 dat de microorganismen bij contact met water of een waterige oplossing in het schuim blijven zitten en er niet uit weggewassen kunnen worden. Geloofd wordt dat dit vastleggen bereikt wordt doordat de microorganismen in het schuim ingekapseld raken. Ook is het waarschijnlijk dat tijdens de schuimvorming binding op-20 treedt door reactie van de isocyanaat-groepen van het polymeer met bepaalde groepen (bijv. aminogroepen) op het oppervlak der microörganismen.

De schuimen worden bereid door een culture van het aspartase-vormende microorganisme direct te vermengen met 25 een urethaan-voorpolymeer in aanwezigheid van genoeg water om het schuimen te bevorderen. In het algemeen komt het water met de microben-kweek mee, d.w.z. deze kweken bevatten gewoonlijk 10 tot 90 gew.% water (hetgeen gemakkelijk bepaald kan worden door een monster daarvan droog te dampen). Door de aanwezigheid 30 van het water zal het voorpolymeer gaan schuimen en tegelijkertijd worden de microörganismen er in vastgelegd. Om dit zo goed mogelijk te doen moet de pH van de kweek tussen 4 en 11 liggen, bij voorkeur in de buurt van 7. Tijdens het vastleggen ligt de gewichtsverhouding voorpolymeer/water in het algemeen tussen 35 2:1 en 1:2, bij voorkeur tussen 3:2 en 2:3, welk water door de kweek verschaft wordt of door een combinatie van de kweek met 8102155 * \ - 4 - voor of tijdens het mengen toegevoegd water» Tijdens het mengen moet de kweek voldoende homogeen in de combinatie van voorpoly-meer en water gedispergeerd zijn, zodat men geen brokken kan waarnemen. Een dergelijk mengen wordt gemakkelijk gerealiseerd als 5 men de hierboven genoemde omstandigheden in acht neemt» Na het mengen is de schuimvorming in het algemeen in 5-10 minuten voltooid en hardt het schuim in nog eens 5-10 minuten tot zijn eindtoestand uit. Maar met grote hoeveelheden schuim is het denkbaar dat men wat meer tijd nodig heeft.

10 Bij de werkwijze volgens de uitvinding ge bruikt men microörganismen die aspartaat vormen. Voorbeelden van aspartaat-vormende microörganismen omvatten geschikte stammen van de volgende soorten, waarvan het aspartaat—vormend vermogen gemakkelijk vastgesteld kan worden door een katalogus van 15 een officiële stammenverzame1ing (bijv. de ATCC) te raadplegen: Pseudomonas fluorescens Serratia marcescens Bacterium succineum Bacillus megaterium 20 Bacillus subtilis

Aerobacter aerógenes Bacillus natto Micrococcus sp.

Escherichia coli.

25 Al deze microörganismen zijn bij de genoemde officiële stammenverzamelingen publiek verkrijgbaar. Maar opgemerkt moet worden dat onderhavige uitvinding niet tot het gebruik van de met name genoemde soorten beperkt is maar de toepassing van alle aspartaat-vormende microörganismen omvat.

30 L-asparaginezuur kan bereid worden door dat schuim in contact te brengen met ammoniumfumaraat of een mengsel van fumaarzuur of zout daarvan met een anorganisch ammonium-zout. Geschikte voorbeelden van fumaraten zijn de alkalimetaal-zouten zoals natrium- en kaliumfumaraat. Ammoniumchloride, 35 ammoniumsulfaat en ammoniumfosfaat genieten als anorganische ammonium-zouten de voorkeur. Indien een mengsel van fumaarzuur 8102155 % - 5 - of zout ervan met een anorganisch ammonium-zout bij de enzymatische reactie gebruikt wordt ligt de molverhouding ammonium/fumaar-zuur bij voorkeur tussen 1:1 en 2:1. Een tweewaardig metaalion kan aan de reactie-oplossing toegevoegd worden om de enzymatische 5 activiteit te verhogen en de stabiliteit van het vastgelegde microorganisme te verbeteren, hoewel vastgesteld is dat een dergelijke verhoging van de werkzaamheid bij korte reactietijden meestal overbodig is. Geschikte voorbeelden van tweewaardige metaalionen die hierbij gebruikt kunnen worden zijn calcium, mag-10 nesium, mangaan en strontium. Indien ze gebruikt worden moeten de concentraties aan tweewaardig metaalion in de reactie-oplossing tussen 10 ^ en 10 ^ M liggen.

De toegepaste concentratie aan substraat is niet belangrijk, ammoniumfumaraat of een mengsel van fumaarzuur 15 of zout daarvan met anorganisch ammonium-zout wordt tot elke concentratie in water opgelost. Daarna wordt de pH tussen 8 en 10 ingesteld. Het schuim met ingekapselde microörganismen wordt met in de substraat-oplossing contact gebracht en het geheel wordt onder roeren op een temperatuur tussen 15° en 60°C gehouden totdat de 20 reactie volledig is. Dan wordt het schuim afgescheiden en kan men het voor volgend gebruik in de ijskast bewaren. Uit de oplossing kan het L-asparaginezuur op gebruikelijke wijze afgescheiden worden.

Anderszins kan de enzymatische reactie con-25 tinu gebeuren, met behulp van een kolom. Bijvoorbeeld wordt het schuim opgestapeld tot een kolom met een zodanige dichtheid dat het water er doorheen kan blijven stromen. De substraat-oplossing met een pH tussen 8 en 10 wordt, met een geschikt debiet bij een temperatuur tussen 15° en 50°C door de kolom geleid. Men ver-30 krijgt een waterige oplossing van L-asparaginezuur als effluent. Deze oplossing kan desgewenst gerecirculeerd worden. L-aspargine-zuur kan uit een geconcentreerde oplossing gewonnen worden door daarin de pH tussen 2,8 en 3,0 in te stellen, waarna het L-asparaginezuur uitkristalliseert. De zuiverheid van het produkt kan 35 desgewenst verbeterd worden door het met ethanol uit te wassen.

Voor de bereiding van het polyurethaan-schuim 8102 155 V -* - 6 - geschikte voorpolymeren worden verkregen door een polyoxyalkyleen-polyol te laten reageren met een overmaat polyisocyanaat zoals tolueendiïsocyanaat. Dat polyol moet een molecuulgewicht tussen 200 en 20.000 hebben, bij voorkeur tussen 600 en 6000, en per 5 molecuul 2 tot 8 hydroxy-groepen. Als men schuimen maakt uit voorpolymeren met een functionaliteit van ongeveer 2 zijn de eindprodukten in wezen onvertakt en hebben ze minder treksterkte dan indien ze verknoopt zouden zijn. Het verdient dan ook de voorkeur uit te gaan van een polyol met meer dan twee functionele groepen 10 per molecuul; die kan men verkrijgen door uit te gaan van mengsels van diolen met triolen of polyolen met nog hogere functionaliteit.

Voorbeelden van geschikte polyolen zijn (A) in wezen onvertakte polyolen die ontstaan door reactie van 15 ethyleenoxyde met een initiator zoals glycol. Mengsels van ethyleenoxyde met andere alkyleenoxyden kunnen ook gebruikt worden zo lang ethyleenoxyde daarvan tenminste 50 mol.% is. Indien de onvertakte polyethers mengsels van ethyleenoxyde met bijvoorbeeld propyleenoxyde zijn kan de volgorde binnen de polymeerketens zo-20 wel willekeurig als bloksgewijs zijn en de eindgroepen kunnen zowel hydroxyethoxy als hydroxypropoxy zijn. Een tweede klasse van polyolen (B) zijn die met drie of meer hydroxygroepen per molecuul; deze worden gewoonlijk gevormd door reactie van alkyleenoxyden met een meerwaardige initiator zoals trimethylolpropaan, 25 pentaerythritol, enz. Bij het vormen van een polyol B kan het gebruikte alkyleenoxyde ethyleenoxyde of een mengsel daarvan met andere alkyleenoxyden zijn. Nog andere geschikte polyolen zijn (C) vertakte of onvertakte polyolen zoals opgesomd bij A en B tezamen met een initiator of verknoper; een voorbeeld hiervan is 30 een mengsel van polyethyleenglycol (MG ca 1000) met trimethylolpropaan, trimethylolethaan of glycerol. Dit mengsel kan men laten reageren met overmaat polyisocyanaat zodat men een voor de uitvinding bruikbaar voorpolymeer krijgt, maar ook kan men de vertakte of onvertakte polyolen afzonderlijk met overmaat polyiso-35 cyanaat laten reageren. De initiator, bijvoorbeeld trimethylolpropaan, kan ook afzonderlijk met het polyisocyanaat tot reactie 8102155 * - 7 - gebracht worden. Tenslotte worden de afzonderlijk bereide produkten met elkaar tot het voorpolymeer gecombineerd.

Geschikte polyisocyanaten en initiatoren zijn beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 3.903.232. De 5 initiatoren zijn in het algemeen in water oplosbare of dispergeer-bare verknopers die in dat octrooischrift beschreven zijn. Voorpolymeer A wordt bereid door twee equivalenten polyethyleen-glycol met een molecuulgewicht van ca 1000 te combineren met 0,6 equivalent trimethylolpropaan. Voor het verwijderen van water 10 wordt het mengsel bij een druk van 5-15 torr op 100-110°C gedroogd. Dit droge mengsel wordt dan langzaam over een uur onder roeren toegevoegd aan een vat dat 5,52 mol tolueendiïsocyanaat bevat. Daarna wordt nog 3 uur geroerd, waarbij de temperatuur op 60°C gehouden wordt. Tenslotte wordt over een uur onder roeren 15 nog 0,78 mol tolueendiïsocyanaat toegevoegd bij een temperatuur „ van 60°C. Men gebruikt uiteindelijk een overmaat van 5 % isocya-naat en alle eindgroepen zijn nu isocyanaat, geen hydroxyl; ook zijn de ketens nu wat langer geworden.

Voorbeeld I

20 Een suspensie van E. coli-cellen (ATCC

11.303) in 0,1 M fosfaat-buffer van pH = 8,0 werd 30 minuten bij 5000 rpm afgecentrifugeerd. De celmassa liet men overnacht in een ijskast nog verder uitlekken. Deze cellen (11 g) werden gemengd met 11 g voorpolymeer A. Door het water in de celmassa ont-25 stond een soepel hydrofiel polyurethaan-schuim dat in ongeveer 15 minuten uithardde. De cellen lagen ingekapseld binnen of gebonden aan het polyurethaan-matrix. Na afkoelen in de ijskast werd dit schuim voor later gebruik tot kubusjes van ongeveer 6 mm lengte versneden.

30 Voorbeeld II #

Een medium werd aangemaakt door in gedeïoni-seerd water 11,6 g fumaarzuur en 10,3 mg MgC^-öI^O op te lossen en de pH met 25 % ammonia op 8,5 in te stellen. Deze oplossing werd op 37°C gebracht en nu werd ongeveer 1,4 g (droge stof aan) 35 schuim in de vloeistof geplaatst. Na 30 minuten liet analyse door dunlaagchromatografie zien dat een aanzienlijke hoeveelheid 81 02 155 ' - 8 -

. V

> L-asparaginezuur gevormd was. Bij verdere analyse bleek 95 % van het fumaarzuur benut te zijn.

Voorbeeld III

Van het bij voorbeeld I verkregen deeltjes-5 vormige schuim werd ongeveer 75 ml tot een kolom opgestapeld binnen een buis met watermantel. De temperatuur werd op 37°G ingesteld en substraat werd met verschillende debieten door de kolom geleid. De substraat was een oplossing van 400 ml ammonia, 232 g fumaarzuur en 406 mg MgCl^.ö^O in gedeïoniseerd water, dat daar-10 na met datzelfde water tot 2 liter aangevuld werd (pH = 9,0).

De vloeistof ruimte in de kolom (niet door schuim bezet dus) was 31,25 ml.

Ongeveer 3500 ml van deze oplossing met pH is 9,0 en een temperatuur van 37°C werd met een constant debiet 15 van 0,6 ml /min. door de kolom geleid. Zo nu en dan werden monsters genomen en door hoge druk vloeistof-ehromatografie op fumaarzuur geanalyseerd. Het verloop van de omzettingsgraad van fumaarzuur in asparaginezuur met de tijd was als volgt:

Tijd (urén) % Omzetting 20 5 71 46 69 150 61 218 61

Voorbeeld IV

25 Nadat de kolom van voorbeeld III 54 uur in werking was geweest werd het debiet op 0,28 ml/min. ingesteld en werd in 16 uur en 50 minuten 288 ml effluent opgevangen. Uit 250 ml hiervan werd het L-asparaginezuur geïsoleerd, en uit gas-chromatografie van een drooggedampt monster bleek dat de omzetting 30 van fumaarzuur in asparaginezuur ongeveer 85 % bedroeg.

Voorbeeld V

Door de kolom van voorbeeld III liet men dezelfde substraat-oplossing met een debiet van 0,60 ml/min. stromen; ongeveer 3500 ml werd opgevangen. Dit monster werd tot 90°C 35 verwarmd en de pH werd nu op 2,8 ingesteld door 200 ml 60 % zwavelzuur toe te voegen. Het aangezuurde mengsel werd tot 15°C afgekoeld en er kristalliseerde L-asparaginezuur uit» dat afgefiltreerd, 81 02 1 55 % - 9 - » gedroogd en met 95 Z ethanol van 30°G uitgewassen werd. Niet omgezet fumaarzuur lostte in het ethanol op en werd aldus verwijderd. Het onoplosbare L-asparaginezuur werd onder vacuum gedroogd. Bij analyse bleek het voor 97 % L-asparaginezuur te zijn; opbrengst 5 89 Z van de theoretische.

Voorbeeld VI

Overeenkomstig voorbeeld I werd schuim aangemaakt en een monster van 1 g werd in een kolf geplaatst en gemengd met 100 ml oplossing met daarin 126 mg/ml fumaarzuur en 10 met een pH van 9. Na 15 minuten op 37°G werd de vloeistof af geschonken en werd verse oplossing toegevoegd; dit gebeurde in totaal driemaal. In het eerste afschenksel bleek de omzetting van fumaarzuur in asparaginezuur ongeveer 57 % te bedragen, en in de drie volgende porties ongeveer 35 %. Het verschil tussen 15 het eerste resultaat en de latere wordt toegeschreven aan het verwijderen van niet goed ingesloten cellen.

Voorbeeld VII

Overeenkomstig voorbeeld III werd een kolom aangemaakt en benut (een oplossing met 116 mg/ml fumaarzuur, 20 pH = 9,04), maar nu bij een temperatuur van 20°C. De oplossing werd continu door de kolom gerecirculeerd. Na ongeveer 120 uur bleek de omzetting in L-asparaginezuur volledig te zijn. Na 30 uur en 50 uur bedroeg de omzetting respectievelijk 33 % en £&-% bedroeg de omzetting respectievelijk- 33--% eit 50 Z @it laat-25 ste gevonden door extrapolatie), 8102 155

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van L-aspa-raginezuur waarbij een fumaraat-oplossing in contact, gebracht wordt met een in water onoplosbare bron van aspartase, met het 5 kenmerk, dat deze bron van aspartase een hydrofiel polyester-polyurethaan-schuim is waarin tenminste 50 mol.# der alkyleenoxyde-eenheden ethyleenoxyde is, en waarin cellen van een aspartase vormend microörganisme ingekapseld zijn.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het 10 kenmerk, dat de fumaraat-oplossing een pH tussen 8 en 10 heeft.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat de reactie gebeurt bij een temperatuur tussen 15° en 60°C. i+. Werkwijze volgens een der voorafgaande 15 conclusies, met het kenmerk, dat de substraat-oplossing ammonium-fumaraat bevat.

5· Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat de substraat-oplossing magnesium bevat.

6. Werkwijze volgens een der voorafgaande conclusies, met het kenmerk, dat de reactie continu uitgevoerd wordt.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 5, met het kenmerk, dat de reactie in portie gebeurt.

8. Een hydrofiel polyether-polyethaan- schuim waarin tenminste 50 mol.# der alkyleenoxyde-eenheden ethyleenoxyde is, met het kenmerk, dat dit schuim ingekapselde cellen van een aspartase-vormend microörganisme bevat.

9. Schuim volgens conclusie 8, met het ken-30* merk, dat tenminste 90 mol.# van de alkyleenoxyde-eenheden ethyleenoxyde is.

10. Schuim volgens conclusie 8 of 9, bereid door reactie van een hydrofiel polyether-urethaan-voorpolymeer met een waterige suspensie van microbencellen. 35 11, Schuim volgens conclusie 10, met het G kenmerk, dat het voorpolymeer bereid was door reactie van een V 8102155 ·; - 11 - Λ-* - 'J_ ^ polyisocyanaat met een mengsel van polyoxyethyleenglycol met een meerwaardige alkohol van laag molecuulgewicht.

12. Schuim volgens een der conclusies 8 t/m 11, met het kenmerk, dat het stijf is.

13. Schuim volgens een der conclusies 8 t/m I1, met het kenmerk, dat het soepel is.

14. Schuim volgens een der conclusies 8 t/m 13, met het kenmerk, dat de gewichtsverhouding polyurethaan/micro-organismen (betrokken op droge stof) daarin tussen 1:10 en 10:1 10 ligt.

15. Werkwijze voor het bereiden van een hydrofiel polyether-polyurethaan-schuim waarbij een kweek van een as-partase-vormend microörganisme gemengd wordt met een hydrofiel polyether-urethaan-voorpolymeer waarin tenminste 50 mol.% der 15 alkyleenoxyde-eenheden ethyleenoxyde is, en waarbij genoeg water in het mengsel aanwezig is om het voorpolymeer te doen schuimen, zodat de microbencellen van de kweek in het ontstane schuim in-gekapseld worden.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het 20 kenmerk, dat het water-gehalte van de kweek tussen 10 en 90 gew.% ligt.

17. Werkwijze volgens conclusie 15, of 16, met het kenmerk, dat de pH van het mengsel boven 7 ligt.

18. Werkwijze volgens conclusie 15, 16 of 25 17, met het kenmerk, dat de gewichtsverhouding voorpolymeer/micro- bencellen (betrokken op- droge stof) tussen 1:10 en 10:1 ligt.

19. Werkwijze in hoofdzaak volgens beschrijving en/of voorbeelden. 30 O I 8102155