NL8003596A - 6-amino-spiro- (penam 2,4'-piperidine)-3-carbonzuur- derivaten de bereiding daarvan, alsmede farmaceutische preparaten die deze verbindingen als actieve component bevatten. - Google Patents

Description

N * * ) * vo 0608 6-Amino-spiro[penam-2,k'-piperidine]-3-carbonzuurderivaten, de bereiding daarvan, alsmede farmaceutische preparaten die deze verbindingen als actieve component bevatten.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe derivaten van 6-amino-spiro[penam-2,k'-piperidine]-3-carbonzuur die voldoen aan de algemene formule 1 van het formuleblad, waarin R een methyl-, fenyl- of benzylgroep voorstelt, 5 1^ waterstof voorstelt en Zg een groep is gekozen uit de in de chemie van penicillinen bekende groepen, bij voorkeur uit 2-fenyl-acetyl-, 2-amino-2-fenylacetyl-, 5-methyl-3-fenyl-**-isoxazoolcarbonyl- en 2,6-dimethoxybenzoylgroepen, of wel en Zg tezamen een bivalente Z^ groep vormen, bij voorkeur de (hexahydro-1ïï-azepin-1-yl)methyleengroep, even-10 als de niet-giftige farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan.

De uitvinding heeft tevens betrekking op werkwijzen ter bereiding en toepassing van deze nieuwe derivaten.

Algemeen beschouwd vormen de penicillinen een groep verbindingen die beantwoordt aan formule 1A van het formuleblad, waarin X 15 een reeks van substituenten voorstelt, waarvan de meest gebruikelijke worden genoemd in üllmann's Enzyklopaedie der Technischen Chemie, Ue druk, volume 7, (197*0, blz. 651 - 652.

Het tot dusver uitgevoerde onderzoek is grotendeels gericht geweest op nieuwe X-substituenten, waarbij de basiskem van 20 het molecuul onveranderd bleef, niettemin zijn enkele pogingen ondernomen om de invloed van bepaalde variaties in· het molecuul op de activiteit van de aldus verkregen verbindingen te bestuderen. Aldus heeft men nieuwe samenstellingen, analogen van penicillinen, voorgesteld, waarin de gem-dimethylgroep op de 2-plaats werd vervangen door andere 25 groepen. Men heeft een groep volgens formule 13 van het formuleblad (Belgisch octrooischrift 738.131) en een groep volgens formule 1¼ van het formuleblad, (D.H.R. Barton & Coll. Chem. Commun. 13, (1970), blz. 1683 - 168U) voorgesteld.

Men heeft na afsluiting van deze verschillende onder-30 zoekingen geconcludeerd, dat de aard van de substituenten aan het kool-stofatoom op de 2-plaats niet essentieel was voor de anti-bacteriële activiteit van de penicillinen of analoge samenstellingen (zie b.v. over dit onderwerp R.J. Stoodley in "progress in Organic Chemistry" (8, 800 35 96 2 1973, “biz. 106). Onlangs zijn de groepen volgens formules 15 en 16 van het formuleblad voorgesteld (P.J. Claes & Coll., Eur. J. Med. Chem. -Chimica Therapeutica, _10.> 0 975) s blz. 573 - 577)·

De conclusie wat betreft de antibacteriële activiteit 5 was identiek.

Verder onderzoek in dit gebied heeft echter aangetoond dat wanneer men op geschikte wijze het koolstofatoom op de 2-plaats substitueert, het mogelijk is verbindingen te verkrijgen die niet alleen een betere antibacteriële activiteit bezitten dan van de overeenkom-10 stige penicillinen, maar die onder andere in het bijzonder interessant zijn voor de behandeling van infecties die worden veroorzaakt door bacteriën, die tegen penicillinen resistent zijn, door de produktie van (3-laetamazen, d.w.z. enzymen die de activiteit van het antibioticum door hydrolyse van de lactamring daarvan onderdrukken. Deze nieuwe 15 verbindingen, alsmede werkwijzen ter bereiding en toepassing daarvan vormen het onderwerp van de uitvinding.

In de beschrijving is de gebruikte nomenclatuur die voorgesteld door H.J. Stoodley, loc. cit. 102-103. In het bijzonder duidt men met penam de kern volgens formule 17 van het formuleblad aan.

20 * De nieuwe verbindingen van de uitvinding zijn 6-amino- spiro [penam-2, ' -piperidine ] -3-carbonzuren waarin de aminogroep op de 6-plaats is gesubstitueerd door een in de chemie van de penicillinen bekende substituent. Dit betreffen aan penicillinen analoge samenstellingen, waarin het koolstofatoom op de 2-plaats van de penamkera is 25 gesubstitueerd door een bivalente 3-aza-pentamethyleenketen, die met dit koolstofatoom een heterocyclische ring vormt. Deze nieuwe verbindingen omvatten aldus een spiraanvormige heterocyclische ring samengesteld uit de penamkera en de verzadigde monocyclische heterocyclische ring die een stikstofatoom bevat.

30 Onder de in de chemie van de penicillinen bekende sub- stituenten waarvan hierboven melding is gemaakt, kan men in het bijzonder die substituenten noemen die zijn beschreven in Ullmann1s Enzy-klopaedie der Technischen Chemie, zie boven.

Bij wijze van voorbeeld zijn wanneer H is en de 35 substituent Zg de 2-fenylacetylgroep is, de verbindingen van de uitvinding analoog aan benzylpenicilline (penicilline G); wanneer-Z^ H is en Z2 de 2-amino-2-fenylacetylgroep is, zijn de verbindingen van de 800 35 96 « t 3 uitvinding analoog van ampicilline; vanneer H en Z2 de 5-methyl.-3-fenyl-h-isoxazoolcarbonylgroep is, zijn de verbindingen van de uitvinding analoog aan oxacilline en vanneer Z^ H en de groep Z^ de groep 2,6-dimethoxybenzyl is, zijn de verbindingen van de uitvinding analoog 5 aan methicilline.

Wanneer en Z^ tezamen de groep (hexahydro-1H-azepi-ne-1-yl)methyleen voorstellen, zijn de verbindingen van de uitvinding analoog aan penicillinen die het onderwerp vormen van het Britse oc-trooischrift 1.293.590. Men heeft in dit geval zijketens die gebonden 10 zijn aa.n de penamkern door een groep , H-C=N- die men aanduidt met t

H

’’amidino-penicillinen”. Dit type zijketen is onlangs in de chemie van de oenicillinen geïntroduceerd en dit heeft geleid tot verbindingen vaarvan de activiteit ter plaatse van de bacteriële celvand verloopt volgens een ander mechanisme dan dat van de penicillinen, die de tra-15 ditionele zijketens dragen, zoals eerder is gedefinieerd. Het verschil in het verkingsmeehanisme ten opzichte van de bacteriën geeft aan de amidinopenicillinen een oorspronkelijk anti-bacterieel spectrum.

Wat betreft de stereo-chemie zou het bestaan van drie asymmetrische centra bij C^, en Cg moeten leiden tot de vorming van 20 8 isomeren die zich in k diastereoisomere racematen kunnen groeperen.

De kinetica van de reacties leidt in feite tot de vorming van alleen de a, 3 en ff isomeren. Bij voorkeur isoleert men uit dit mengsel het racemische a, -waarvan een van de optische antipoden de configuratie die overeenkomt met die van penicilline bezit; het is een mengsel van 25 isomeren (dl), d.v.z. de configuraties (3S, 5R, 6r) + (3R, 5S, 6s).

De verbindingen volgens formule 1 volgens de uitvinding, waarin Z^ een waterstofatoom voorstelt en Z^ een groep die wordt gekozen uit in de chemie van de penicilline bekende groepen, bij voorkeur uit de 2-fenylacetyl, 2-amino-2-fenylacetyl, 5-methyl-3-fenyl~k-isoxa-30 zoolcarbonyl en 2,6-dimethoxybenzoylgroepen, worden verkregen door een ester, bij voorkeur de benzylester, van een 6-amino-spiro[penam-2,l+'-piperidine]-3-carbonsuur volgens formule 2 van het formuleblad, waarin R de voornoemde betekenissen heeft, te laten reageren met een verbinding volgens de formule Z^Y (3), waarin Z^ de voornoemde betekenissen 35 heeft en waarin Y een halogeenatoom of een hydroxylgroep voorstelt, 8003596

If waarbij de aldus verkregen ester door hydrogenolyse wordt omgezet in bet overeenkomstige zuur. De verbindingen volgens formule 2, toegepast als uitgangsprodukten voor de bereiding van verbindingen volgens formule 1 volgens de uitvinding, worden bij voorkeur toegepast in de vorm 5 van hun zouten met p-tolueensulfonzuur.

De verbindingen volgens formule 3, die dienen als acy-leringsmiddelen voor de aminogroep op de 6-plaats, kunnen zuurhaloge-niden (Y = halogeen) of een vrij zuur (l = OH) zijn; in het laatste geval wordt de acyleringsbehandeling uitgevoerd in aanwezigheid van 10 een koppelingsmiddel, b.v. een carbodixmide, zoals dixsopropylcarbo-dixmide. Wanneer de verbindingen volgens formule 3 een aminogroep bevatten, kan deze laatste op op zichzelf bekende wijze worden beschermd, b.v. door een benzyloxycarbonylgroep, welke vervolgens gedurende de hy-drogenolysebehandeling wordt verwijderd.

15 De ö-amino-spiroCpenam^,^’-piperidine}-3-carbonzuren volgens formule 2 en in het bijzonder de benzylesters daarvan die als uitgangsprodukten worden toegepast, evenals de werkwijzen ter bereiding daarvan,. vormen het onderwerp van een gelijktijdig ingediende octrooiaanvrage van aanvraagster, waarin een meer gedetailleerde be-20 schrijving is gegeven.

De verbindingen volgens formule 2 worden op de volgende wijze bereid: (1) Men laat 2-formyl-2-ftaalimido-tertiair butylace-taat volgens formule k reageren met een a-amino-U-mercapto-1-R-l-pi- 25 peridine-azxjnzuur volgens formule 5 ter verkrijging van het Z-isomeer van een if-carboxy-a-ftaalimido-8-R-1-thia-3,8-diazaspiro[U.5]decaan-2-tertiair butylacetaat volgens formule 6, volgens reactieschema A van het formuleblad.

(2) Men epimeriseert het gamma-isomeer volgens formule 30 6 in het a-xsomeer volgens formule 7, door verhitting met pyridine of dimethyl amine volgens de vergelijking: pyridine gamma-isomeer -> a-isomeer (ζj di ëthylamine (γ) (3) Men bereidt het if-benzyloxycarbonyl-a-ftaalimido-8-E-1-thia-3,8-diazaspiro[5]decaan-2-tertiair butylacetaat volgens for- 35 mule 8 door reactie van het α-isomeer met formule 7 met diazofenylmethaan 800 3 5 96 4 -* 5 of een benzylhalogenide volgens het reactieschema B van het formuleblad.

(4) Men verricht vervolgens de deftalimidering van de verbinding volgens formule 8 door hydrazinolyse, hetgeen leidt tot het 5 a-amino-4-benzyloxycarbonyl-8-R-1-thia-3,8-diazaspiro[4.5]decaan-2- tertiaire butylacetaat volgens formule 9, volgens reactieschema C van het formuleblad. ' (5) Men dealkyleert selectief de tertiaire butylester-groep van de verbinding volgens formule 9 door behandeling daarvan in 10 oplossing in een nitromethaan met gasvormige waterstofchloride, hetgeen leidt tot het diehloorhydraat van het a-amino-4-benzyloxycarbo-nyl-8-R-1-thia-3,8-diazaspiro[4.5]decaan-2-azijnzuur volgens formule 10 volgens reactieschema D van het formuleblad.

(6) Men blokkeert de a-amino groep van de verbinding 15 met formule 10 door middel van tritylchloride, waarbij men aldus het 4-benzyloxycarbonyl-8-R-a-tritylamino-1-thia-3,8-diazaspiro[4.5]de-caan-2-azijnzuur met formule 11 verkrijgt, volgens reactieschema D van het formuleblad.

(7) Men cycliseert vervolgens de verbinding met for- 20 mule 11, bij voorkeur in hete toestand, door reactie met een carbodilmi-de (afgekort Cl) ter verkrijging van het 1'-R-6-tritylamino-spiro[penam-2,4'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat volgens formule 12, volgens reactieschema F van het formuleblad.

(8) Men behandelt tenslotte de verbinding volgens for-25 mule 12 met p-tolueensulfonzuur (p-TS) ter verkrijging van het 6-amino- 1'-R-spiro[penam-2,4'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat met formule 2 in de vorm van het di-p-tolueensulfonaat volgens reactieschema G van het formuleblad, in welke formules R een methyl, fenyl of benzylgroep voorstelt.

30 De bereiding van het 2-formyl-2-ftalimido-tert ..butyl acetaat met formule (4) wordt beschreven in de literatuur (J. Sheehan et al., J. Am. Chem. Soc. 78, (1954), 158 - 160).

De bereiding van het a-amino-4-mercapto-1-K-4-piperi-dine-azijnzuur volgens formule 5 kan op gelijke wijze in de volgende 35 trappen verlopen: (a) Reactie van 2-ethylisocyaanacetaat met een 1-R-4-pi-peridon in aanwezigheid van een suspensie van natriumhydride in tetra- 8003596 6

* A ^ (X

hydrofuran ter verkrijging van q-formamldo-1-R-piperidine-A * -ethylacetaat volgens reactieschema H van het formuleblad.

(b) Verhitting onder terugloop van het α-formamido-1- k q R-piperidine-Λ 5 -ethylacetaat met fosforpentasulfaat in oplossing in 5 acetonitril ter verkrijging van 8-R-1 -thia-3,8-diazaspiro [ U. 5 ] -2-de-ceen-4-ethylcarboxylaat volgens reactieschema J van het formuleblad.

(c) Decyclisering van 8-R-1-thia-3,8-diazaspiro[k.5]-2-deceen-ethylcarboxylaat door verhitting met waterig waterstofchloride, hetgeen leidt tot het gewenste α-amino-i-mercapto-1-R-^-piperidine- 10 azijnzuur met formule 5, in de vorm van dichloorhydraat, volgens reactieschema K van het formuleblad, waarbij in al deze formules R een methyl-, fenyl- of benzylgroep is. Men kan zonodig de twee enantiomere vormen van de verbindingen volgens formule 5 splitsen, waardoor men direct het optisch zuivere diastereoisomeer volgens formule 6 kan ver-15 krijgen.

In het kader van de uitvinding verstaat men onder niet-giftige farmaceutisch aanvaardbare zouten in het bijzonder de metaal-zouten, zoals van natrium, kalium, calcium en aluminium, de ammonium-zouten en aminezouten, zoals van trialkylaminen, in het bijzonder tri- 20 ethylamine, procaine, dibenzylamine, U-benzyl-6-fenetylamine, efenamine, ΒΓ,Η' -dibenzylethyleendiamine, dehydroabiëthylamino, N,II' -bis-dehydro-abiëthyl-ethyleendiamine, de N-(lagere alkyl)piperidinen, zoals N-ethylpiperidine en op algemene wijze de voor penicillinen G en V reeds bekende zouten (zie Ullmann's Enzyklopaedie, loc- cit* blz. 653).

25 Deze zouten kunnen uit de overeenkomstige zuren volgens op zich zelf bekende methoden worden bereid.

In het bijzondere geval dat de 2-amino-2-fenylace-tylgroep voorstelt, kunnen de produkten van de uitvinding worden omgezet in hun zuuradditiezouten, b.v. met niet-giftige farmaceutisch aan-30 vaardbare zuren, zoals azijnzuur, citroenzuur, barnsteenzuur, ascor-binezuur, chloorwaterstofzuur, broomwaterstofzuur, zwavelzuur of fos-forzuur.

De verbindingen volgens formule 1, waarin en Zg tezamen een bivalente Z^ groep voorstellen, bij voorkeur de (hexahydro-35 7H-azepine-1-yl]ethyleengroep, worden bereid door een 6-amino-spirofpe-nam-2,4'-piperidine]-3-carbonzuur volgens formule 2 of een van de es- 800 3 5 96 7 ters daarvan te laten reageren met een actief derivaat van een ver-binding met de formule Z^O, "bij .voorkeur een actief derivaat van hexahydro- 1H-azepine-1-c arboxaldehyde.

Het geactiveerde derivaat van de verbinding Z^ = 0 is 5 bij voorbeeld, Hetgeen tevens de voorkeur verdient, het chloride van het overeenkomstig verkregen amide door de inwerking van oxalylchlo-ride of ook het complex verkregen door de inwerking van dimethylsul-faat. Bij voorkeur maakt men gebruik van de volgende verbindingen, die geactiveerde derivaten van het hexahydro-1H-azepine-1-carboxaldehyde 10 zijn resp. de verbindingen met formules 18 en 19 van het formuleblad, nl. 1 - (chloormethyleen) -hexahydro-1 H-azepiniumchloride en 1 -(methoxymethy-leen)-hexahydro-azepinium-methylsulfaat.

De uitvinding beoogt tevens de toepassing van de verbindingen volgens formule 1, evenals de niet-giffcige farmaceutisch 15 aanvaardbare zouten daarvan, als anti-bacteriile middelen, als dieet-supplementen voor diervoer en als therapeutische middelen voor dieren, en voor de mens ter behandeling van infectieziekten die worden veroorzaakt door gram-positieve of gram-negatieve bacteriën.

De verbindingen volgens de uitvinding bezitten in feite 20 een zeer breed anti-bacterieel activiteitsspectrum, zowel tegen de gram-positieve als gram-negatieve bacteriën, waarbij zij in het bijzonder doeltreffend zijn ter bestrijding van resistente β-lactamasen-produce-rende bacteriestammen.

De nu volgende voorbeelden illustreren de uitvinding.

25 Voorbeeld I

Bereiding van 6-(2-fenylaceetamido)-s?iro[penam-2,Ut-piperidine]-3-car-bonzuren 1.1 Bereiding van het 1 ,-methyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[-penam.-2,Uf-piperidine]-3-carbonzuur 30 a) 1 *-Methvl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,k1-piperidine1-3-benzylc arboxylaat

Het di-p-tolueensulfonaat van 6-amino-1’-methyl-spiro-[penam-2,¾1-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (8,5 g = 0,012 mol) (bereid volgens de methode beschreven in voorbeeld 1.8. 1 van de gelijktij-35 dig ingediende octrooiaanvrage van aanvraagster) wordt omgezet in de vrije base door oplossing in 200 ml dichloormethaan en toevoeging van 2,M g (0,002^ mol) triëthylamine; men koelt de oplossing af tot -10°C

onn u Qfi 8 en behandelt deze gelijktijdig met een oplossing van 1,86 g (0,012 mol) fenylacetylchloride in 40 ml dichloormethaan en met een oplossing van 1,24 g (0,012 mol) triëthylamine in 4 ml dichloormethaan; de duur van de toevoeging is ongeveer een uur.

5 Het roeren wordt gedurende 2 uur voortgezet, waarbij men de temperatuur laat terugkomen op 0°C, waarna men de oplossing achtereenvolgens wast met water, een met natriumbicarbonaat verzadigde oplossing en opnieuw met water. Ha droogdamping verkrijgt men 4,1 g van het methyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,4'-pipericLine]-3- 4 10 benzylcarboxylaat.

Rendement: 16,2%. P.F.: 124 - 5°C (smeltpunt).

Infraroodspectrum (KBr): 3318 cm 1 (NH); 1800 cm 1 (S- lactam); 1740 cm 1 (ester); 1670 cm 1 (amide); 690, 740 cm’"' 15 (fenyl monogesubstitueerd) UMR-spectrum (CDCl^-TMS): Hy singulet bij 4,52 dpm H^: doublet bij 5,47 dpm Hg: doublet bij 5,65 dpm H^ en Hg zijn gekoppeld, J = 20 4,1 Hz.

Massaspectrum: M+* m/e = 479.

b) 1'-Methyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,41-prneridine]-3-carbonzuur o

Bij een waterstofdruk van 3,2 kg/cm in aanwezigheid 25 van 4,4 g palladiumkool (10% Pd) hydrogenolyseert men in een PARE inrichting gedurende een uur een oplossing van 4,4 g (0,091 mol) 1*-me-thyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,4’-piperidine]-3-benzylcar-boxylaat (bereid onder 1.1.a) in 800 ml ethanol. Daarna filtreert men en laat men het neerslag rijpen in. 1,5 liter van een methanol-water 30 9/l mengsel gedurende een uur. Droogdamping van het filtraat levert 1,6 g van het 1’-methyl-6-(2-fenylacetamido)-spiro[penam-2,4'-piperidine]- 3-carbonzuur.

Rendement: 44,8%. Smeltpunt 189 - 190°C (ontleding).

Infraroodspectrum (KBr): 1770 cm”1 (6-lactam).

35 Massaspectrum: M - 44 (COg): m/e = 345·

Analyse voor C^H^^O^S (mol.gew. 389,433):

Berekend (%): C 58,59, H 5,95, N 10,78, 5 8,23.

800 3 5 96 9

Gevonden {%): C 56,7, H 6,1, N 10,20, S 7,20.

1.2 Bereiding van het 1 1-benzyl-6-( 2-f enylaceetami do)-spiro [penam-2, *1'-pineridine I -3-carbonzuur a) 1 * -Benzyl-6- (2-f enylaceetamido) -spiro [penam-2, k* -piperidine ] -3- 5 benzylcarboxylaat

Het di-p-tolueensulfonaat van 6-amino-1 *-benzyl-spiro-[penam-2,k'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (7,82 g = 0,01 mol) (bereid volgens de werkwijze beschreven in voorbeeld 1.8.2 van de gelijktijdig ingediende aanvrage van aanvraagster) wordt omgezet in een vrije base 10 door oplossing in 120 ml dichloormethaan en toevoeging van 2,023 g (0,02 mol) triëthylamine; men koelt de oplossing af tot -10°C en behandelt deze langzaam gelijktijdig met een oplossing van 1,55 g (0,01 mol) fenylacetylchloride in kO ml dichloormethaan en met een oplossing van 1,01 g (0,01 mol) triëthylamine in kO ml dichloormethaan. Men 15 roert gedurende 2 uur en laat de temperatuur terugkomen op 0°C, waarna men de oplossing achtereenvolgens wast met water, een verzadigde na-triumbicarbonaatoplossing en opnieuw met water. Na droogdamping en kristallisatie van het residu in cyclohe:caan verkrijgt men het benzyl- 6-(2-fenyl-aceetamido)-spiro[penam-2,1 *-piperidine]-3-benzylcarboxylaat, 20 dat men als zodanig onderwerpt aan trap I.2,b).

Rendement: 71$· Smeltpunt: 130 - 1°C.

Infraroodspectrum (KBr): 1 792 cm” (3-lactam); 1750 cm”1 (ester); 701-7*10 cm (fenyl monogesubstitueerd).

Mass aspect rum: M+* m/e = 555 25 M - 33 (SH): m/e = 522 M - 91 (C7Ηγ): m/e = h6k

Groep volgens formule 20 van het formuleblad, m/e = 381 Analyse voor c 32^33^3°^ (mol.gew. 555,706)

Berekend:(%): C 69,16, H 5,99, N 7,56 30 Gevonden {%}: C 71,72, H 5,87, N 8,01 b) 1?-Benzyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,k1-piperidine]-3-car-bonzuur 2

Onder een waterstofdruk van 3,2 kg/cm in aanwezigheid van k g palladiumkool (10$ Pd) hydrogenolyseert men in een Parr in-35 richting gedurende 1 1/2 uur een oplossing van het benzyl-6-(2-fenylaceetamido )-spiro[penam-2,h-'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (bereid ρ η n x ς ö 6 10 onder I.2.a) in 800 ml ethanol. Daarna filtreert men, dampt onder vacuum het filtraat droog en vrijft het residu aan in isopropylalcohol.

Men verkrijgt aldus het benzyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,Ur-piperidine]-3-carbonzuur met een rendement van 71%· 5 Smeltpunt: 170 - 1°C (ontleding).

HMR-spectrum (DMSO-TMS): singulet hij b,2 dpm ^ÏT-CHg-fenyl: singulet hij 3,87 dpm fenyl-CHgCOM- : singulet hij 5,81 dpm

Massaspectrum: geen M+’

10 M - 18 (HgO): m/e = bkT

Μ - IA (00g): m/e = U21 Analyse voor (mol.gev. ké5,581)

Berekend (%): C 6k,k9, H 5,8U, E 9,02 Gevonden (%): C 62,19, H 6,03, H 8,57- 15 1.3 Bereiding van het 1 ,-fenyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[-penam-2,Ut- pineridine1-3-carhonzuur a) 11-Fenyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,U’-piperidine]-3- henzylcarhoxylaat

Aan een suspensie van 1,53 g (0,002 mol) van het di-p-20 tolueensulfonaat van 6-amino-1'-fenyl-spiro [penam-2^·'-piperidine]-3-henzylcarhoxylaat (hereid volgens de methode beschreven in voorbeeld 1.8.3 van de gelijktijdig ingediende octrooiaanvrage van aanvraagster) in 100 ml droog dichloormethaan voegt men in êén keer i*0k mg (0,00^ mol) triëthylamine in 10 ml dichloormethaan toe. Men koelt de oplossing af 25 tot tussen 0 en -5°C en voegt druppelsgewijze gelijktijdig een oplossing van 3^0 mg (0,022 mol) fenylacetylchloride in 30 ml dichloormethaan en een oplossing van 220 mg (0,022 mol) triëthylamine in 330 ml dichloormethaan toe. De duur van de toevoeging is ongeveer een uur.

Men blijft gedurende 3 uur hij 15°C roeren. Daarna wast men de oplos-30 sing achtereenvolgens met water, met een met natriumbicarbonaat verzadigde oplossing en opnieuw met water.

Ha droogdamping en rekristallisatie van het residu in een mengsel van ethylacetaat-hexaan (1 : 3), verkrijgt men 950 mg van het 1-fenyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,¾’-piperidine]-3-ben-35 zylcarboxylaat.

Rendement: 88%. Smeltpunt: 120 - 121°C.

Ihfraroodspectrum (KBr): 3300 cm 1 (ïöï); 175^, 1728, 1635 cm 1 (CO).

800 3 5 96 11 MR-spectrum (CDClg-lMS): 3 fenylen : multiplet bij 7,55 dpm

Hg : doublet bij 5,78 dpm H,_ : doublet bij 5 ,k5 dpm -COOCHg-fenyl: singulet bij 5,18 dpm 5 Hg : singulet bij b,5J dpm fenyl-CHgCOHH- : singulet bij 3,6k dpm Analyse voor Cg^^HgO^S (mol.gew. 5^1,65)

Berekend (%): C 68,7^, H 5,77, 3ST 7,7β Gevonden (%): C 68,80, H 5,59, IT 7,50.

TO b) 1 *-Fenyl-6-(2-fenylaceetamido )-spiro[penam-2,b1-piperidine]-3- carbonzuur

Men hydrogenolyseert een oplossing van 470 mg (0,000869 mol) 1'-fenyl-6-(2-fenylaceet amido)-spiro[penam-2,H’-piperidine]-3- benzylcarboxylaat (bereid onder I.3.a), in 200 ml absolute ethanol, in 15 een Parr-inrichting gedurende 2 uur in aanwezigheid van 500 mg palla- diumkool (10% Pd), bij omgevingstemperatuur onder een waterstofdruk van 2 3,5 kg/cm . Daarna filtreert men, dampt het filtraat droog en neemt het residu op in ether. Het neerslag wordt gefiltreerd en gewassen met ether.

20 Men verkrijgt aldus 310 mg van het 1'-fenyl-6-(2-fenyl- aceetatnido )-spiro [penam-2, U * -pyridine] -3-carbonzuur.

Rendement: 79%. Smeltpunt: 153 - 15^°C (ontleding).

Infraroodspectrum (KBr): 1770 cm (CO β-lactam); 16U^ cm (CO amide) HMR-spectrum (DMSO-TMS): HH : multiplet bij 8,95 - 8j0 dpm 25 2 fenylen : multiplet bij 7,5 - 6,6 dpm en Hg : multiplet bij 5,6 - 5,3 dpm H^ : singulet bij htb6 dpm fenyl-CH2C0HH- : singulet bij 3,57 dpm. Analyse voor C^H^HgO^S (mol.gew. U51,53) 30 Berekend (%}: C 63,8^, H 5,58, U 9,31 Gevonden (%): C 6ΐ,6θ, H 5,36, U 8,52.

Voorbeeld II

Bereiding van 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-spiro[penam-2,V-piperidine]-3-carbonzuur 35 II.1 Bereiding; van het 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-1*-methyl-spiro-[penam-2,b1-piperidine]-3-carbonzuur 800 3 5 96 12 a) 6-(2,6-Pimethoxybenzamido)-1' -methyl-spiro [penam-2 1 -piperidine 1 -3-benzylcarboxylaat

Het di-p-tolueensulfonaat van 6-amino-l'-methyl-spiro[penam-2, it·' -piperidine] -3-benzylcarboxylaat (^,9^ g s 0,007 mol) (bereid 5 als aangegeven in voorbeeld I.1.a) wordt omgezet in de vrije base door oplossen in 80 ml dichloormethaan onder toevoeging van 1,^2 g (0,01U mol) triëthylamine; men koelt af tot -10°C en voegt druppelsgewijze gelijktijdig met een oplossing van 1,U0 g (0,007 mol) 2,6-dimethoxybenzo-ylchloride in 20 ml dichloormethaan een oplossing van 0,71 g (0,007 10 mol) triëthylamine in 20 ml dichloormethaan toe; de duur van de toevoeging is ongeveer een uur.

Men gaat voort gedurende 2 uur te roeren waarbij men de temperatuur laat terugkomen op 0°C, en wast de oplossing achtereenvolgens met water, een natriumbicarbonaatoplossing en opnieuw met wa-15 ter. Ha droogdamping en kristallisatie van het residu in diëthylace- taat verkrijgt men 2,5 g 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-1'-methyl-spiro[pe-nam-2 '-piperidine]-3-benzylcarboxylaat.

Rendement: 65%.

Smeltpunt: 97°C (ontleding).

20 Infraroodspectrum (KBr): 1792 cm-^ (β-lactam) HMR-speetrum (CDCl^-EMS): : singulet bij k,61 dpm : doublet bij 5,25 dpm

Hg : 2 doubletten bij 5,96 dpm Nïï : doublet bij 6,60 dpm 25 H^ en Hg zijn gekoppeld, J = ^,1 Hz H van amine en H^ zijn gekoppeld, J = 8 Hz.

Massaspectrum: M m/e = 525

Analyse voor C^H^N^OgS (mol.gew. 525,635).

Berekend (#): C 61,70, H 5,9^·, N 7,99 30 Gevonden (#): C 60,85, H 6,29, H 7,38.

b) 6-(2,6-Pimethoxybenzamido)-11-methyl-spiro[penam-2,k’-piperidine]-3-carbonzuur

Onder een waterstofdruk van 3,2 kg/cm in aanwezigheid van 1,5 g palladiumkool (10# Pd) hydrogenolyseert men in een Farr-in-35 richting gedurende een uur een oplossing van 2 g (0,0038 mol) 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-11-methyl-spiro[penam-2,4'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (bereid onder II.1.a) in 700 ml ethanol. Daarna filtreert men, dampt het filtraat droog en spoelt men het residu met een weinig etha- ft o n 3 * ο fi 13 nol. Men verkrijgt aldus 1,2 g van liet 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-1 '-methyl-spiro[penam-2,U’-piperidine]-3-carbonzuur.

Rendement: 60sh%.

Smeltpunt: 193 - ^°C (ontleding).

5 Iiufraroodspectrum (KBr): 1TT9 cm (3-lactam) ïïMR-spectrum (DMSO-TMS): H3 : singulet bij 3,96 dpm ITH : doublet bij 8,92 dpm H van amine en Hg zijn gekoppeld, J = 7,3 Hz

Analyse voor ^20^25^3^6^ ^35,510) 10 Berekend (*): C 55,16, H 5,18, N 9,6*1 Gevonden {%)'. C 51,Οβ, H 6,51, H 8,92.

II. 2 Bereiding van het 1'-benzyl-6-(2,6-dimethoxybenzamido)-spiro- \ -penam-2 Λ1 -piperidine 1 -3-carbonzuur

Men bereidt op dezelfde wijze als in II.1 de volgende 15 verbindingen: a) 1 *-Benzyl-6-(2,6-dimethoxybenzamido)-spiro[penam-2,U'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat; b) 1'-Benzyl'-6-(2,6-dimethoxybenzamido)-spire[penam-2,¼’-piperidine]-3-carbonzuur.

20 Voorbeeld III

Bereiding van 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-spiro[penam-2, *i1 -piperidine]-3-carbonzuren III. 1 Bereiding van het 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)1-1'-me thyl- spiro[penam-2,b1-piperidine]-3-carbonzuur 25 a) 6-[D(-)-2-Benzyloxycarbonylamino-2-fenylaceetamido)1-1'-me- tbyl-spiro[penam-2,k'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat

Het di-p-tolueensulfonaat.van 6-amino-1'-methyl-spiro [penam-2, *i'-piperidine ]-3-benzylcarbonaat (9 g a 0,0127 mol) (bereid als aangegeven in voorbeeld I.1.a) wordt omgezet in de vrije base door 30 oplossing in 120 ml dichloormethaan en toevoeging van 2,57 g (0,025 mol) triëtbylamine, waarna men aan de aldus verkregen oplossing 3,71 g (0,013 mol) N-(benzyloxycarbonyl)-D~(-]-(2-fenylglycine en k g dilso-propylcarbodiïmide toevoegt. Ha 2b uur filtreert men en verdampt men onder vacuum de overmaat oplosmiddel en reactiecomponent. Men laat het 35 residu uit de verdamping passeren door een kiezelgelkolom 60 Merck onder elutie eerst met chloroform en daarna met aceton. Vervolgens dampt 8003596

1U

men de aldus verkregen acetonoplossing droog, neemt het residu op in chloroform, filtreert de verkregen oplossing en dampt opnieuw droog.

Na kristallisatie van het residu in acetonitril verkrijgt men 0,9 g 6-[D(-)-(2-benzyloxycarbonylamino-2-fenylaceetamido)]-1'-methyl-spiro-5 [penam-2,1* ’-piperidine]-3-benzylcarboxylaat verontreinigd net een wei nig 1,3-diIsopropylureum.

Smeltpunt: 1^1 - 1^1,5°C.

— 1 —i

Infraroodspectrum (KBr); 3325 cm (NH); 1790 cm (β-lactam); 695» 7^5 0111 ^ (fenyl monogesubstitueerd) 10 NMR-spectrum (CDCl^-TMS): ^N-CH^ : singulet bij 2,21 dpm -COOCI^-fenyl : singulet bij 5,08 dpm -C00CH2-fenyl : singulet bij 5,15 dpm H^ : singulet bij ^,5¼ dpm H^ : doublet bij 5,2 dpm 15 Hg : doublet bij 5,7 dpm b) 6- [ D (-) - (2-amino-2-f enylaceet amido) ] -11 -methyl-spiro [ -penam-2, U ’ - piperidine 1-3-carbonzuur 2

Onder een waterstofdruk van 3,2 kg/cm in aanwezigheid van 1,2 g palladiumkool (10 % Pd) hydrogenolyseert men in een Parr-20 inrichting gedurende 3 uur een oplossing van 1,15 g (0,0018 mol) 6-(1(-)-(2-benzyloxyc arbonylamino-2-fenylaceetamido)]-11-methyl-spiro[penam-2,V-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (bereid onder III.1.a) in 600 ml ethanol. Na droogdamping en kristallisatie van het residu in isopropyl-alcohol verkrijgt men 0,5 g van het 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-25 1'-methyl-spiro[penam-2,U’-piperidine]-3-carbonzuur.

Rendement: 67,9#·

Smeltpunt: 185°C (ontleding).

1 —1

Infraroodspectrum (KBr): 3^12 cm” (NHg); 1780 cm (β-lactam); 1680 cm ^ (amide); 1615 cm 1 (C00_).

30 NMR-spectrum (DMS0-TMS): 2H2,, 2Η^,, 2H^f en 2Hg, : multiplet bij 1,5 - 3,8 dpm : singulet bij 3,96 dpm + Hg : multiplet bij 5,1 - 5,7 dpm 5H v.f. fenylgroep : multiplet bij 7,35 dpm 35 NH : breed bij 9,05 dpm III.2 Bereiding van het 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1*-ben-zyl-spiro[penam-2,U'-piperidine]-3-carbonzuur 8003596 15 a) 11-Benzyl-6-[P(-)-(2-benzyloxycarbonylamino-2-fenylaceetamido)]- spiro[penam-2,41-piperidine1-3-benzylcarboxylaat

Het di-p-tolueensulfonaat van 6-aini.no-1 * -benzyl-spi-ro[penam-2,4'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (9»93 g = 0,0127 mol) 5 (bereid als aangegeven in voorbeeld I.2.a) wordt omgezet in de vrije base door oplossing in 200 ml dichloormethaan en toevoeging van 2,57 g (0,0254 mol) triëthylamine, waarna men aan de aldus verkregen oplossing 3,70 g (0,013 mol) N-(benzyloxycarbonyl)-D(-)-2-fenylglycine en 7 g diïsopropylcarbodilmide toevoegt. Ia 24 uur filtreert men en dampt 10 bet filtraat onder vacuum in. Men laat het residu door een kolom van kiezelgel 60 Merck passeren onder toepassing van chloroform als eluent. Na twee passages levert droogconcentratie van de eluent 1,2 g benzyl-6-[D(—}—(2-benzyloxycarbonylamino-2-fenylaceetamido)]-spiro[penam-2, 4' -piperidine]-3-benzylcarboxylaat.

15 Smeltpunt 72 - 73°C.

—1 —ί

Infraroodspectrum (KBr): 1793 cm (β-lactam); 1737» 1749 cm (ester); —1 “1 1685 cm (amide); 698, 742 cm (fenyl mono- gesubstitueerd).

NMR-spectrum (CDCl^-TMS): ^N-C^-fenyl : singulet bij 3,41 dpm 20 : singulet bij 4,46 dpm -COOCHg-fenyl : singulet bij 5,05 dpm -COOCHg-fenyl : singulet bij 5,15 dpm fenyl-Cïï-CO- : singulet bij 5,43 dpm + f

Massaspectrum:. M m/e = 704.

25 Groep volgens formule 21 : m/e = 381

Groep volgens formule 22 : m/e = 380 idem - 33 (SH) : : m/e = 347

Analyse voor (mol.gew. 704,858)

Berekend (%)i C 68,27, H 5,72, N 7,94 30 Gevonden (%)i C 68,17, H 5,60, If 8,26.

b) 6-fD(^)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1 *-benzyl-suiro[uenam-2,41-pi peridine 1-3-carbonzuur 2

Onder een waterstofdruk van 3 kg/cm in aanwezigheid van 1 g palladiumkool (10$ Pd) hydrogenolyseert men in een Parr-inrichting 35 gedurende 3 uur een oplossing van 1,2 g (0,0017 mol) benzyl-6-[D(-)-(2-benzyloxycarbonyl amino-2-fenylaceetamido)]-spiro[penam-2,4'-piperidino]-

O

3-benzylcarboxylaat (bereid onder III.2.a) in 250 cm ethanol. Daarna ft η n 11 o fi 16 filtreert men, dampt het filtraat droog waarbij men 0,3 g verkrijgt van het 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1'-benzyl-spiro[penam-2,U'-piperidine]-3-earbonzuur.

Smeltpunt: }195°C (ontleding).

—1 -*1 5 Xnfraroodspectrum (KBr): 3M5 cm (NI^); 1785 cm (β-lactam); 1680 cm 1 (amide); 1615 cm~^ (COO""); 700, 750 cm 1 (fenyl monogesubstitueerd)

Massaspectrum van methylester (na verestering met diazomethaan): M+*: m/e

= U9U

10 -[M + H]+* : m/e = 1+95 [M - H]+* : m/e = 1+93 M - 33 (SH): m/e = 1+61 M - 59 (C00CÏÏ3): m/e = 1+35 Groep volgens formule 23 : m/e = 361 15 Groep volgens formule 2k : m/e = 362

Groep volgens formule 25 : m/e = 305

Analyse voor (raol.gew. 1+80,597)

Berekend (%)· C 62,1+7, H 5,87, JT 11,66 Gevonden (%): C 56,76, H 5,90, U 9,1+0.

20 III.3 Bereiding van het 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1^fe-nyl-spiro Γpenam-2,1+ *-piperidine]-3-carbonzuur a) 6— Γΐ>( —) -(2-Benzyloxyearbonylamino-2-f enylaceetamido) 1 -11 -f e- nyl-spiro[penam-2,1+ *-piperidine]-3-benzylcarboxylaat

Aan een suspensie van 1,53 g (0,002 mol) van het di-p-25 tolueensulfonaat van 6-amino-1'-fenyl-spiro[penam-2,1+'-piperidine]-3-benzylcarboxylaat (bereid als aangegeven in voorbeeld I.3.a) in 50 car dichloormethaan voegt men bij omgevingstemperatuur 0,UoU g (0,001+ mol) triëthylamine in 5 ral dichloormethaan toe. Men koelt de oplossing tussen 0 en -5°C en voegt achtereenvolgens 0,630 g (0,002 mol) N-(benzyloxy-30 carbonyl)-B(-)-(2-fenylglycine in 10 ml dichloormethaan toe, daarna een oplossing van 0,1+60 g dicyclohexylcarbodiïmide in 30 ml dichloormethaan. Men roert bij 5°C gedurende een uur, daarna gedurende een nacht bij de omgevingstemperatuur. Men filtreert het neerslag en wast het filtraat achtereenvolgens met water, met een verzadigde natriumbi-35 carbonaatoplossing en daarna opnieuw met water. Men droogt en dampt droog. Het residu na rekristallisatie in een ethylacetaat-hexaanmengsel 800 3 5 96 17 (1:3) levert 1,36 g 6-[D(-)-(2-benzyloxycarbonylamino-2-fenylaceet-amido)]-1'-fenyl-spiro[penam-2,1*1-piperidine]-3-benzylcarboxylaat. Rendement: 99#, smeltpunt: 167 - 168°C.

Infraroodspectrum (KBr): 3320 em 1 (NH); 1765, 1730, 166k cm 1 (CO) 5 NMR-spectrum (CDCl^-TMS): k fenylenen : multiplet bij 7,55 - 6,55 dpm

Hj, Hg en 2 -COGCHg-fenyl : multiplet bij 5,55 - 5,00 dpm : singulet bij k,5o dpm Analyse voor (mol.gew. 690,79) 10 Berekend (#): C 67,80, H 5,5**, N 8,11 Gevonden (%): C 67,36, H 5,93', H 8,23.

b) 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)1-11-fenyl-spiro[penam-2,b'-pi peridine ]-3-carbonzuur

Men hydrogenolyseert bij omgevingstemperatuur gedurende 2 15 U uur in een Parr-inriehting onder een waterstofdruk van 3,5 kg/em en in aanwezigheid van 1 g palladiumkool (10# Pd) een oplossing van 690 mg 6-[D(-)-(2-benzyloxycarbonylamino-2-fenylaceetamido)]-11-fenyl-spiro-[penam^jU’-piperidinej-S-benzylcarboxylaat (bereid onder III.3»a) in 200 ml absolute ethanol. Daarna filtreert men, wast het filtraat met 20 ethanol en dampt droog. Het resid'd wordt opgenomen in ether. Ha filtratie isoleert men 120 mg van het 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1*-fenyl-spiro[penam-2,k1-piperidine]-3-carbonzuur.

Rendement: 26#. Smeltpunt 187 - 1S9°C (ontleding).

Infraroodspectrum (KBr): 1765 cm (CO 0-lactam), 16T5 cm ”* (amide).

25 Analyse voor C^H^I^O^S (mol.gew. 1*66,55).

Berekend (#): C 61,78, H 5,62, II 12,01 Gevonden (#): C 57,90, H 5,31, H- 10,07.

Farmacologische eigenschappen

Er werden verschillende vergelijkende proeven uitgevoerd 30 met betrekking tot de intrinsieke biologische activiteit van de verbindingen volgens formule 1 ten opzichte van verschillende bacteriestammen van het gram-positieve of gram-negatieve type. De referentiepro-dukten zijn resp. penicilline G, ampicilline en methicilline. Hierbij volgen eerst enige toelichtingen betreffende de oorsprong en de eigen-35 schappen van de gebruikte bacteriestammen.

A. Gram-positieve bacteriestammen - Staphylococcus aureus 6538 οπη 7 κ Ofi 18

Dit betreft een gram-positieve kok die bijzonder gevoelig is voor penicillinen en die een gering weerstandsmechanisme bezit. Deze Staphylococcenstam is aldus representatief voor een maximale gevoeligheid van de soort.

5 - Staphylococcus aureus 5211*9

Dit betreft een gram-positieve kok waarvan de intrinsieke gevoeligheid van de ontvanger equivalent is aan die van de voorafgaande stam, maar die een 8-lactamase produceert dat typerend is voor de soort die haar resistent maakt tegen alle voor hydrolyse 10 gevoelige penicillinen.

B. Gram-negatieve bacteriestammen

- Escherichia coli B

Dit betreft een klassieke stam van de Escherichia coli collectie, die zeer weinig b-lactamase van het type I) produceert 15 en die derhalve zeer gevoelig is voor penicillinen.

Wat betreft de klassificatie van de U-lactamasen wordt gebruik gemaakt van die voorgesteld door M.H. Richmond en R.B. Sykes in Advances in Microbiol. Physiology, 9, (1973), biz. U3 en ¾5.

- Escherichia coli B-AMPI R

20 Dit betreft een mutant van de voorafgaande stam die door aanvraagster is gemaakt. Deze stam is juist een hyperproducent van β-lactamase van het type I, dat reeds wordt geproduceerd door de moederstam E. coli B. Deze vertoont aldus een verhoogde resistentie tegen penicillinen, die naar blijkt direct is gekoppeld met de pro-25 düktie van 0-lactamase.

- Escherichia coli K 12

Dit betreft een klassieke stam uit de collectie, die zeer weinig 8-lactamase van het type I produceert en derhalve zeer gevoelig is voor penicillinen.

30 - Escherichia coli K 12-M-S

Dit betreft een pleiotrope mutant van E. coli K 12-¾¾ (die op zijn beurt een mutant van E. coli K 12 is). Deze mutant produceert geen fj-lactaraase en is zeer gevoelig voor penicillinen door hyper-permeabiliteit.

35 - Escherichia coli K-12-M-S-TEM

Deze stam wordt verkregen uit een stam van E. coli K 12-kk-S, waarin men het episoom TEM heeft overgebracht, dat in het bij- 800 35 96 19 zonder verantwoordelijk is voor de produktie van een @-lactamase van het type III.

- Escherichia eoli K.-12-kk S-RP^

Deze stam wordt verkregen uitgaande van een stam van . s 5 E. coli K-12-W—S waarin men het episoom BP^ heeft overgebracht, dat verantwoordelijk is voor een resistentiefactor ten opzichte van penicillinen door impermeabiliteit van de bacteriewand.

C. Resultaten van vergelijkende activiteitsproeven

Volgens de hierna beschreven procedure werd voor een 10 aantal verbindingen volgens formule 1 de minimale remmende concentratie (afgekort MRC) ten opzichte van de bacteriegroei bepaald.

De te beproeven produkten worden in toenemende concentraties geïntroduceerd in een agarcultuurkweek in petrischalen.

Een veelvoudige inoculateur wordt toegepast om op een oppervlak van 15 het milieu gelijktijdig druppels van het inoculatum (in totaal 10 microliter) (suspensie ongeveer 10^ bacterie per ml) te deponeren.

Ha incubatie bij 3T°C gedurende 2k uur wordt de groei van de bacteriën geobserveerd. Per definitie wordt, de MRC uitgedrukt als de minimale concentratie (uitgedrukt in micromol per ml) die de 20 vermenigvuldiging van de bacteriën remt. In de nu volgende resultaten is steeds de MRC gelijkgesteld aan 1 voor de referentieprodukten waarbij de voor de. beproefde verbindingen volgens formule 1 aangegeven activi-teitscijfers aldus relatieve waarden zijn. Deze presentatie van de resultaten is correcter en beter reproduceerbaar, omdat men voor eenzelfde 25 bacteriestam, verschillende MRC waarden kan waarnemen wanneer zij op verschillende momenten worden gemeten. Dit hangt samen met ,,seizoen"-varia-ties van de stammen en hun voedingsmilieu.

De volgende verbindingen zijn beproefd:

Verbinding A: 1,-methyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-21-piperidi-30 ne]-3-carbonzuur,

Verbinding B: 1,-benzyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,it'-piperidi-ne]-3-carbonsuur,

Verbinding C: 1 '-fenyl-é-fë-fenylaceetamidoJ-spirotpenam^jil·'-piperidine ]-3-c arbonzuur, 35 Verbinding D; 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-1'-methyl-spiro[penam-2 tk'- piperidine]-3-carbonzuur, 8003596 20

Verbinding E: 6-[ü(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1'-methyl-spiro[penam-2, It '-piperidine ] -3-carbonzuur,

Verbinding F: 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1'-benzyl-spiro[penam-23k’-piperidine]-3-carbonzuur, 5 Verbinding G; 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1'-fenyl-spiro[penam-2tk’-piperidine]-3-carbonzuur.

a) Vergelijkende proeven met penicilline G

Bacteriestam Penicilline G Verbinding A Verbinding B Verb.C

S. aureus 6538 1 0,5 0,3 0,2 10 S. aureus 521^9 1 2 0,5 0,5 E. coli B-AMPI E 1 1 2 0,3 E. coli K 12-UU-S-TEM 1 2 2 0,3 E. coli K 12-Wt-S-BP^ 1 1 1 0,5 b) Vergelijkende proeven met methicilline 15 Bacteriestam Methicilline Verbinding D S. aureus 6538 1 0,1 E. aureus 521^9 1 0,1 E. coli K 12-H-S-TEM 1 0,5 c) Vergelijkende proeven met ampicilline

20 Bacteriestam Ampicilline Verbinding E Verbinding F Verb. G

S. aureus 6538 1 211 S. aureus 521^9 1 0,5 1 2 E. coli B-AMPI R 1 2 - 0,3 E. coli K 12-1^-S- t 0,5 0,5 0,12

TEM

25 E. coli K 12-4U-S- 1 0,25 0,25 0,25 RP^

Uit deze resultaten blijkt dat de verbindingen volgens formule 1 volgens de uitvinding een betere activiteit hebben dan die van de overeenkomstige traditionele penicillinen, zowel tegen de gram-positieve als gram-negatieve bacteriën. Bovendien is deze betere werking 30 zeer scherp ten opzichte van penicilline-resistente bacterie-stammen (S. aureus 521^9, E. coli B-AMPI R, E. coli K 12-W-S-TEM en E. coli K

12-U-S-RP^}.

D.. Activiteit in vivo

Deze wordt gedemonstreerd door een klassieke proef van 800 3 5 96 21 "bij muizen door Diplococcus pneumoniae veroorzaakte bloedvergiftiging. Men brengt een experimentele infectie bij muizen teweeg, door intra-peritoneale injectie van een verdunde kweek van een stam van Diplococcus pneumoniae (53 1^5 van het Pasteur Instituut te Parijs). Het aantal ge-5 injecteerde bacteriën komt overeen met ongeveer 100 LD^. Men lost het te beproeven produkt op in een fysiologische pekeloplossing en men dient dit via subcutane weg toe aan muizen, de eerste keer op het moment van de infectie en de tweede keer 5 uur later.

De volgende tabel geeft de resultaten verkregen met de 10 verbinding A volgens de uitvinding en met het overeenkomstige penicilline G. De dosis wordt uitgedrukt in micromol/kg en de verhouding geeft voor de aangegeven dosis het aantal overlevende dieren ten opzichte van het totale aantal beproefde dieren aan:

Dosis Penicilline G Verbinding A

15 0,50 0/10 8/10 1,00 0/10 9/10 2,00 9/10 10/10

Uit deze tabel volgt dat bij een dosis van 0,50 micromol/kg van verbinding A van de 10 geïnfecteerde muizen 8 de infectie 20 overleefden, terwijl geen enkele muis, waaraan men dezelfde dosis penicilline G had toegediend, in leven bleef. Om een gelijk aantal overlevenden te verkrijgen dient men de dosis van penicilline G te verviervoudigen. In deze proef blijkt aldus verbinding A vier keer zo krachtig te zijn als penicilline G.

25 E. Dosering en gebruik

De toediening van de verbindingen volgens formule 1 vindt, zoals voor de penicillinen, plaats via orale of parenterale weg.

In het algemeen dient men tussen 0,2 en 8 g produkt per dag toe, welke doses uiteraard worden aangepast aan de toestand van de zieke, de te 30 behandelen ziekte en de toedieningsvorm.

800 35 96

Claims (5)

1. 6-Amino-spiro [penam-2, · -piperidine ] -3-carbonzuur-deri- vaten die voldoen aan de algemene formule 1, waarin R een methyl-, fenyl- of een benzylgroep voorstelt, Z^ waterstof voorstelt en Z2 een groep is gekozen uit de in de chemie van penicillinen "bekende groepen, 5 bij voorkeur gekozen uit 2-fenylacetyl, 2-amino-2-fenylacetyl, 5-me-thyl-3-fenyl-^-isoxazoolcarbonyl en 2,6-dimethoxybenzoyl, ofwel en Z2 tezamen een bivalente groep Z^ vormen, bij voorkeur de (hexahydro-1H-azepin-1-yl)methyleengroep, evenals de niet-giftige farmaceutisch aanvaardbare zouten daarvan.

2. Verbindingen volgens conclusie 1, bestaande uit: - 1'-methyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,U'-piperidine]-3-car-bonzuur, - 1'-benzyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,¼'-piperidine]-3-carbon-zuur, 15 - 1 ’-fenyl-6-(2-fenylaceetamido)-spiro[penam-2,k'-piperidine]-3-car- bonzuur, - 6-(2,6-dimethoxybenzamido)-1 *-methyl-spiro[penam-2,U1-piperidine]-3-carbonzuur, - 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-11-methyl-spiro[penam-2,k'-pipe-20 ridine]-3-carbonzuur, - 6-[D(-)-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1'-benzyl-spiro[penam-2,4'-piperidine ]-3-carbonzuur, - 6-[D(-]-(2-amino-2-fenylaceetamido)]-1’-fenyl-spiro[penam-2,U1-piperidine ]-3-e arbonzuur.

3. Werkwijze ter bereiding van verbindingen die voldoen aan de algemene formule 1, waarin een waterstofatoom en Zg een groep is gekozen uit de in de chemie van penicillinen bekende groepen, met het kenmerk, dat men een ester van een 6-amino-spiro[penam-2,U’-piperidine] -3-carbonzuur met formule 2, waarin R een methyl-, fenyl- of 30 benzylgroep voorstelt, laat reageren met een verbinding volgens formule Z2Y, waarin Z2 de eerder genoemde betekenissen heeft, en Y een halo-geenatoom of een hydroxylgroep voorstelt, en dat men de verkregen ester door hydrogenolyse omzet in het overeenkomstige zuur. U. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de 800 35 96 ester van het 6-amino-spiro[penam-29k'-piperidine]-3-carbonzuur een benzylester is.

5. Toepassing van verbindingen volgens een van de conclusies 1 of 2, als antibacteriële middelen, als dieetsupplementen voor 5 diervoer en als therapeutische middelen voor dieren en voor de mens ter behandeling van infectieziekten veroorzaakt door gram-positieve en gram-negatieve bacteriën.

6. Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit een voor therapeutische doeleinden doeltreffende hoeveelheid van een verbin- 10 ding volgens een van de conclusies 1 en 2, in combinatie met een farmaceutisch aanvaardbare drager of aanvaardbaar verdunningsmiddel, bevat. 800 35 96