NL7908936A

NL7908936A - Werkwijze voor het bereiden van vaccins.

Info

Publication number: NL7908936A
Application number: NL7908936A
Authority: NL
Original assignee: Sandoz Ag
Priority date: 1978-12-15
Filing date: 1979-12-12
Publication date: 1980-06-17
Also published as: AU5379079A; BE880620A; IL58947A; SE7910089L; CA1153309A; FR2443839B1; JPS5589231A; IL58947A0; IT7951051A0; FR2443839A1; DE2949031A1; GB2037165A; ZA796820B; PH15412A

Description

·*

Werkwijze voor het bereiden van vaccins.

De uitvinding is gericht op het toepassen van immunocanplexen als vaccins, of als bestanddelen daarvan, tegen virusaandoeningen, in het bijzonder die veroorzaakt door Herpes-, Myxo- of Paramyxo-virussen.

5 Immunocomplexen (of antilichaam-antigeen complex en zoals ze vaak worden aangeduid) ontstaan door combinatie van een antilichaam met zijn overeenkomstige antigeen. Afhankelijk van de hoeveelheid toegepaste bestanddelen, kunnen oplosbare of onoplosbare immunocanplexen met hoog molecuulgewicht worden verkregen. Voor de 10 vorming van deze immunocomplexen past men bij voorkeur een overmaat antigeen toe, in het bijzonder een hoeveelheid die een beetje boven het equivalentiegebied van de precipitatiekromme ligt.

Het is bekend dat immunisatie met immunocomplexen tot de vorming van antilichamen tegen het antigeen in het immuno-15 complex leidt. Voor dit doel wordt hierbij een antiserum toegepast dat afstamt van dezelfde species die met het complex geïmmuniseerd moet worden. Deze methode kan eveneens met virus antigenen voor het verkrijgen van mono-specifieke antilichamen worden toegepast.

De uitvinding is gebaseerd op de vondst dat 20 vaccinatie met immunocanplexen een doeltreffende bescherming tegen het virus waarvan het immunocomplex is afgeleid en daardoor tegen ziekten die door dit virus worden veroorzaakt kan geven.

De uitvinding is dus gericht op een werkwijze voor het bereiden van een vaccin tegen ziekten die door een virus 25 worden veroorzaakt door een immunocomplex van een antilichaam/oplosbaar antigeen afgeleid van een dergelijk virus in een voor een dergelijke toepassing geschikte toedieningsvorm te brengen.

De immunocanplexen die in de vaccins volgens de uitvinding kunnen worden toegepast kunnen worden verkregen door 7908936 ♦ . 2 materiaal dat de opgeloste virusantigenen bevat te combineren met de overeenkomstige antilichamen. De benodigde antilichamen worden verkregen uit de sera van de species waarin het vaccin moet worden toegepast, verkregen na natuurlijke infectie met het virus, of na immu- 5 nisatie. In het geval van menselijke vaccins kan bijvoorbeeld in de handel verkrijgbaar menselijk γ-globuline (bijvoorbeeld Sandoglobu-lin ) worden toegepast. Het is ook mogelijk donors met hoge anti-lichaamtiters tegen de betreffende virus te zoeken en hun sera te verzamelen. In het geval van dierlijke vaccins (bijvoorbeeld tegen 10 pseudorabies in biggen), kunnen de benodigde sera uit de betreffende dierspeciës, die, speciaal voor dit doel, met het betreffende virus zijn geënt of herhaalde malen met een geïnactiveerd virus of met een immunocomplex vaccin volgens de uitvinding zijn geënt, worden verkregen.

15 De uitvinding verschaft in het bijzonder een vaccin tegen ziekten veroorzaakt door een virus in een species dat een immuno-complex bestaande uit êén of een aantal oplosbare antigenen van een dergelijk virus gecombineerd met antilichamen van het virus in een dergelijke species bevat.

20 De immunocanplexen die in de vaccins volgens de uitvin ding worden toegepast kunnen, zoals hiervoor aangegeven, op een bekende wijze door combinatie van antilichamen, bijvoorbeeld in de vorm van anti-serum of γ-globuline, met het oplosbare, antigeen bevattende virusmateriaal worden verkregen. Voorbeelden van dit ma- 25 teriaal zijn antigenen die zelf oplosbaar zijn of oplosbaar zijn gemaakt, zoals a) oplosbare virusantigenen die in het cultuurmedium worden afgescheiden, b) een oplosbaar gemaakt, geheel of ten dele gezuiverd 30 virus, c) oplosbaar gemaakte oppervlakantigenen van een geheel of ten dele gezuiverd virus, d) een oplosbaar gemaakt membraan van geïnfecteerde cellen of 35 e) oplosbaar gemaakte geïnfecteerde cellen.

7908936 * 3

Werkwijzen voor het bereiden van deze genoemde materialen zijn bekend, bijvoorbeeld de volgende in het geval van Herpes simplexvirus voor elk type van a) tot e): a) Geïnfecteerde cellen maken een reeks virus proteïnen 5 in het cultuurmedium vrij. Na centrifugeren met hcge snelheid van het cultuurmedium, teneinde virusdeeltjes en alle brokstukken te verwijderen, kunnen de vrijgemaakte, virus-specifieke, proteïnen volgens bekende biochemische methoden worden geconcentreerd en uit de bovenstaande vloeistof worden afgescheiden, 10 b), c) Ruwe virussuspensies kunnen worden verkregen uit geïnfecteerde cellen of uit hun cultuurmedium. Het virus kan uit de geïnfecteerde cellen na een korte tijd weken in een hypotonische buffer en vervolgens homogeniseren van de cellen in de Dounce homo-genisator worden vrijgemaakt en door centrifugeren met een lage snel-15 heid van de overgebleven deeltjesvormige, bestanddelen van de cellen worden afgescheiden. Het is ook mogelijk het virus tot een suspensie te verdichten door het cultuurmedium met hoge snelheid te centrifugeren. De aldus verkregen virussuspensie kan door centrifugeren in een sucrose- of dextran-dichtheidsgradiënt worden gezuiverd. Ter 20 verkrijging van materiaal b) kunnen de gezuiverde virusdeeltjes door behandeling met een oppervlakteaetief middel, bijvoorbeeld natrium-dodecylsulfaat of natriumdesoxycholaat, of met een mengsel van dergelijke middelen, oplosbaar worden gemaakt. Ter verkrijging van materiaal c) kunnen de oppervlakantigenen, in het bijzonder de gly-25 coproteïnen, door behandeling met een oppervlakteaetief middel oplosbaar worden gemaakt en door centrifugeren met een hoge snelheid van de overblijvende virusdeeltjes worden afgescheiden.

d) Membranen van geïnfecteerde cellen kunnen volgens bekende methoden worden verkregen; zo kan men bijvoorbeeld geinfec- -3 30 teerde cellen wassen met een 10 M calciumacetaatbuffer m een fysiologische natriumchloride-oplossing en vervolgens suspenderen in een 0,02 M tris.HCL buffer (pH = 7,0) met 0,01 M EDTA. De cellen worden gebroken in een Dounce homogenerator en de kernen worden door centrifugeren met een lage snelheid verwijderd. Men mengt sucrose 35 met de bovenstaande vloeistof tot een eindeoncentratie van

79 0 8 9 3 S

i u (gew./gew.) en brengt daarna deze oplossing als onderste laag in een discontinue sucrosegradiënt en verzamelt de celmembraan vesicae in deze gradiënt na 20 uren centrifugeren bij 26.000 g. Men verzamelt daarna de membraan-vesicae bevattende banden, verdunt vier 5 malen met Tris-buffer en verkrijgt een vast product door centrifugeren onder hoge snelheid. Tenslotte kan het gezuiverde celmembraan met geschikte oppervlakte-actieve middelen of chactropische ionen, (bijvoorbeeld 5% Triton X-100 of 2,5 M guanidine HCL) oplosbaar worden gemaakt.

10 e) Men neemt geënte cellen op in ongeveer hetzelfde volume van een Tris-glycine buffer (pH =8,^) die 5% Triton of 2,5 M guanidine . hydrochloride bevat, en maakt ze oplosbaar door 10-30 min. te incuberen bij 37°C en daarna ultrasonisch te behandelen.

Het oplosbaar gemaakte materiaal kan van het onoplosbare residu 15 worden afgescheiden door eerst met lage en vervolgens hoge snelheid (60 min. bij 100.000 g) te centrifugeren.

Het oplosbaar gemaakte, antigeen bevattende materiaal kan op een gebruikelijke wijze met antilichamen worden gecombineerd, bijvoorbeeld door incuberen met bijvoorbeeld een γ-globuline prepa-20 raat, gevolgd door centrifugeren van het verkregen immunocomplex.

Het is ook mogelijk de immunocomplexen te verkrijgen door gekruiste immuno-elektroforese in een agarose cel. De te gebruiken hoeveelheid van de antilichaam bron, bijvoorbeeld anti-sera en antigeen bevattend materiaal, zal afhangen van de gewenste eigenschappen van het te 25 bereiden immunocomplex. In het algemeen worden onoplosbare immuno-complexen in de vaccins volgens de uitvinding aanbevolen en eveneens in het algemeen zijn de immunocomplexen die de voorkeur hebben equivalent of bevatten een overmaat antigeen. Het verdient vooral aanbeveling een hoeveelheid antigeen te gebruiken die een weinig boven het 30 equivalentietrajeet van de precipitatiekranme ligt.

Men kan de verkregen immunocomplexen op een gebruikelijke wijze, bijvoorbeeld door centrifugeren, van ongewenst restmateriaal scheiden.

Het op deze wijze bereiden van immunocomplexen maakt het 35 mogelijk de gewenste virusantigenen selectief van gasteel materialen' 790805? 5 en virus DNA en ΕΝΑ af te scheiden.

Het gebruik van immunocomplexen is een nieuwe methode voor het bereiden van vaccins die slechts die antigenen die essentieel voor de bescherming zijn bevatten. Dergelijke vaccins bevatten 5 vrijwel geen gastcelmateriaal. dat tot nevenreacties en ongewenste sensibilisatie kan leiden. Ze bevatten vrijwel evenmin virusnucle-inezuren en zijn daardoor eveneens geïndiceerd voor mogelijke oncogene virus typen.

De vaccins volgens de uitvinding kunnen op een gebruike-10 lijke wijze worden bereid en kunnen bijvoorbeeld gebruikelijke immunologische toevoegsels, zoals aluminiumhydroxyde, bevatten. De dosering van het vaccin of, in het bijzonder, immunocomplex, dat moet worden toegediend zal van vele bekende factoren, zoals de virus waartegen moet worden beschermd, de te beschermen species en de mate 15 van de gewenste immunorespons, afhangen. In het algemeen kan echter de geschikte dosering voor een speciaal vaccin op een gebruikelijke wijze worden bepaald. Hierbij kunnen de standaard-doses van gebruikelijke vaccins voor hetzelfde virus, voorzover deze bekend zijn, als basis voor het bepalen van de geschikte, overeenkomstige dosis 20 van de vaccins volgens de uitvinding worden beschouwd. Het is echter zo dat de vaccins volgens de uitvinding een hogere immuniteit dan enkele gebruikelijke vaccins kunnen geven, zodat ter verkrijging van hetzelfde effect doeltreffend lagere doses kunnen worden aangewend.

25 De vaccins volgens de uitvinding worden geschikt subcu- taan toegediend.

Zoals hiervoor reeds vermeld, zijn de vaccins volgens de uitvinding in het bijzonder geïndiceerd voor toepassing ter bescherming tegen aandoeningen of ziekten veroorzaakt door Herpes-, Myxo-, 30 of Paramyxo-virussen, in het bijzonder Herpes-virussen, en de overeenkomstige, aanbevolen vaccins bevatten dus immunocomplexen afgeleid van deze virussen.

De Herpes-vaccins verdienen vooral aanbeveling cmdat het zuiveren van een Herpes-virus uitermate bewerkelijk en moeilijk is.

35 Het gebruik van Herpes-immunocomplexen laat een betrekkelijk eenvou-

790893S

t 6 J, dige zuivering en afscheiding van de essentiële antigenen van ongewenste bestanddelen toe.

Een bijzonder vaccin volgens de uitvinding is een vaccin tegen Herpes simplex virus met de volgende samenstelling: 5 1. Een onoplosbaar immunocomplex dat: 100 yg HSV-specifieke proteïnen (die in het geval van HSV 2 voornamelijk 3 groepen glycoproteïnen in de resp. mol.gewichts-trajecten van 120.000-130.000, 80.000-90.000 en 55.000-65.000 en in het geval van HSV 1 voornamelijk 2 groepen glycoproteïnen in de resp. 10 molgewichtstrajecten van 120.000-130.000 en 55*000-65.000) en ongeveer 300 yg menselijk γ-globuline bevat.

2. Triton X-100: maximaal 1 yg.

3. Een fysiologische natriumchloride-oplossing: 1 ml.

h. A1(0H)3 0,1$ (desgewenst).

15 Voorbeeld I

Met behulp van deze proef wordt de doeltreffendheid van het vaccineren met Herpes-geënte, oplosbaar- gemaakte cellen vergeleken met het vaccineren met een immunocomplex vaccin verkregen uit dergelijke cellen.

20 a) Het winnen van γ-globuline uit anti-sera van guinese biggetjes tegen Herpes simplex virus.

Men entte witte, gefokte, guinese biggetjes met 10 plaque-vormende eenheden (pfu) van Herpes simplex virus Type 2 g (HSV 2) in beide achterpoten. 6 Weken later ontvingen de dieren 10 25 pfu in de hals. 10 Dagen na de tweede immunisatie onttrok men aan de dieren het bloed via hartpunetie en scheidde het serum door eentfi-fugeren met lage snelheid van de vaste bloedbestanddelen af. Daarna inactiveerde men het serum door het 60 min. bij 56°C te incuberen en sloeg het γ-globuline uit het serum neer door toevoegen van een 30 verzadigde oplossing van ammoniumsulfaat (20 ml serum + 10 ml van een verzadigde (NHj^SO^ oplossing). Na centrifugeren nam men het verkregen neerslag op in 10 ml van een verzadigde oplossing van natrium-chloride (0,9$ NaCl) en verwijderde het resterende (NH^JgSO^ door H8 uren de dialyseren tegen een oplossing van natriumchloride.

35 b) Bereiding van het vaccin.

7908936 7

Men entte embryonale fibroplasten van een guinees biggetje (GPF) met HSV2 in een hoeveelheid van 0,(A pfu per cel. Daarna incubeerde men de culturen h8 uren bij 36°C. Vervolgens scheidde men de cellen van het cultuurmedium door centrifugeren met lage snelheid.

7 5 Vervolgens suspendeerde men ongeveer 7.10 cellen xn 35 ml van een 0,02 M Tris-glycine buffer (pH = 8,U), die 5$ Triton X-100 bevatte en maakte ze door 10 min. incuberen bij 37°C gevolgd door ultrasoon behandelen (3 x 15 sec.) oplosbaar. Men scheidde de niet-opgeloste celbestanddelen (voornamelijk de kernen) door centrifugeren bij 9.000 10 g van de bovenstaande oplossing af. Het aldus verkregen materiaal wordt hierna aangeduid als "LYSATE”.

Men mengde 10 ml van dit LYSATE met 20 ml van het γ-glo-buline preparaat, verkregen volgens a), uit anti-HSV serum van guinese biggetjes. Daarna incubeerde men dit mengsel eerst 2 uren 15 bij 37°C en daarna h8 uren bij h°C. Vervolgens centrifugeerde men de verkregen immunoccmplexen af door 30 min. te centrifugeren bij 50.000 g en suspendeerde het aldus verkregen neerslag in 10 ml van een fysiologische oplossing van natriumchloride. Het aldus verkregen materiaal wordt hierna aangeduid als "IC".

20 c) Proeven op dieren.

Men mengde LYSATE en IC elk met hetzelfde volume van onvolledig Freund's adjuvans. Men diende 0,2 ml van elk mengsel per dosis toe. Men vaccineerde 20 guinese biggetjes per groep twee maal suhcutaan met een tussenpoze van 3 weken. 1 Week na de booster-25 injectie nam men van de dieren een bloedmonster ter bepaling van de antilichaam concentratie. Vervolgens werden de dieren intravaginaal k ingeënt met 10 pfu HSV2, waarbij tevens ter controle 20 niet geïmmuniseerde dieren werden ingeënt. De klinische waarneming van de dieren geschiedde gedurende 62 dagen p.i.

30 Beide vaccins, LYSATE en IC, wekten overeenkomstige titers van neutraliserende antilichamen en een overeenkomstige bescherming tegen de genitale challenge infectie op, hetgeen wil zeggen dat de primaire ziekte werd verminderd, evenals de zich herhalende infecties.

35 Voorbeeld II

79 0 3 9 3 S

8

Bij deze proef werd het beschermende effect van immuno-ccmplexen die 1-3 gedefinieerde HSV2-antigenen bevatten onderzocht. Men bereidde een lysaat uit met HSV2 geënt GPF en γ-globuline uit anti-RSV-serum van guinese biggetjes op de wijze als beschreven in 5 voorbeeld I.

Het immunoccmplex werd op de volgende wijze door gekruiste immuno-elektroforese in een agarose cel verkregen:

Men bekleedde 10 x 10 cm glazen platen bij 1:8°C met 15 ml van een agarose-oplossing. Deze oplossing bevatte 1,5% Indubiose 10 A37 (L'Industrie Biologique Fran^aise, Clichy), elektroforese buffer en 0,5 ml anti-HSV-y-globuline. De elektroforese buffer (pH * 8yk) bevatte per 100 ml: 0,221* g diethylbarbituurzuur Ο,Μ: g Tris 15 0,01 g calciumlactaat 0,02 g NaN3 1,0 ml Triton X-100.

Na het vast worden van de agarose perste men in de onderste, rechter hoek van de platen, 1 cm van de rand, gaten en vulde 20 ze met 15 ml van het lysaat. De antigenen werden elektroforetisch in twee dimensies gescheiden en neergeslagen, (1e dimensie 200 V, 2 uren; 2e dimensie 100 V, 12 uren).

Men sneed vier verschillende neerslagen uit de platen en combineerde de overeenkomstige neerslagen van 16 platen. Vervolgens 25 verpoederde men de gel in bevroren toestand en nam elk monster op in 2 ml van een met fosfaat gebufferde oplossing van natriumchloride.

Bij een overeenkomstige proef voerde men radioactief gemerkt lysaat als antigeen in, loste de verkregen immunoneerslagen op en analyseerde met SDS-polyacrylamidegel elektroforese (methode 30 van Norrild en Vestergaard, J. Virol. 1977, 22, 113).

Bij deze analyse bevatten de immunocomplexen gesneden uit de platen de volgende HSV-2 proteïnen:

Monster 1: glycoproteïne met een molecuulgewicht van 80.000-85.000 35 monster 2: glycoproteïne met een molecuulgewicht van 7908930 9 78.000-80.000 monster 3: nietgeglycosileerd proteïne met een molecuul-gewicht van 131.000 menster h: glycoproteïnen met molecuulgewichten van 5 57.000, 115.000-126.000.

Men mengde de immunocomplex gelsuspensies elk met dezelfde hoeveelheid onvolledig Freund's adjuvans en diende 0,2 ml van elk mengsel twee malen, met een tussenpoze van 3 weken, subcu-taan toe aan guinese biggetjes (10 dieren per groep). 1 Week na de 10 boosterinjectie entte men de guinese biggetjes in de zool van de h linker voet in men 10 pfu HSV2 s.c. en volgde de klinische symptomen gedurende 100 dagen p.i.

De met monsters 2 of k gevaccineerde dieren vertonen een bescherming tegen het optreden van zich herhalende Herpetische aan- 15 doeningen.

Voorbeeld III

Volgens deze proef absorbeerde men de antilichamen eerst aan Al(QE)^ en combineerde daarna de virusantigenen met de geabsorbeerde antilichamen.

20 γ-globuline uit anti-HSV-serum van guinese biggetjes werd op de wijze verkregen als beschreven in voorbeeld I.

Antigeen.

Men entte Verocellen met HSV2 in een hoeveelheid van 0,01 pfu/cel en incubeerde 96 uren bij 3^°C. Daarna scheidde men de 25 cellen door centrifugeren met lage snelheid van het cultuurmedium en verkreeg een lysaat op de wijze als beschreven in voorbeeld I.

Daarna mengde men 9 al anti-HSV-y-globuline met 1 ml Alu Gel S (Serva) en absorbeerde 18 uren bij ^°C. Vervolgens verwijderde men niet-geabsorbeerd proteïne door 6 malen uitwassen met PBS. Ver- 30 volgens suspendeerde men de gel in 10 ml PBS en mengde met 10 ml lysaat. Het mengsel werd nog 18 uren geïncubeerd bij U°C en al het niet gebonden materiaal werd door 6 malen wassen in PBS verwijderd. Tenslotte werd de gel in 10 ml PBS gesuspendeerd, welke suspensie men met "Ag-Ab-Alu-vaccin" aanduidt.

35 Een aan Alu-gel geabsorbeerd lysaat, aangeduid met "Ag- 7908936 10

Alu-vaccin", diende ter controle. Dit werd verkregen door 1 ml Alu Gel S te verdunnen met 9 ml PBS en te mengen met 10 ml lysaat. Na 18 uren incuberen bij U°C verwijderde men niet gebonden materiaal door 6 malen wassen in PBS en de gel te suspenderen in 10 ml PBS.

5 Men entte 5 guinese biggetjes twee malen, met een tussen poos van 3 weken, in met 0,5 ml van de respectievelijke vaccins.

5 Guinese biggetjes dienden ter controle en ontvingen 0,2$ Alu gel in PBS. 1 Week na de tweede immunisatie nam men bloedmonsters voor de bepaling van antilichamen concentratie. Tenslotte werden de 10 dieren in de huid in de flank ingeënt met HSY2.

Beide vaccins induceerden hoge titers van neutraliserende antilichamen en boden een goede bescherming tegen cutane Herpetische-aandoeningen. Bovendien induceerde het Ag-Alu-vaccin een hoge titer aan antilichamen tegen gastcellen, die als complement afhankelijke 15 cytotoxische antilichamen evenals door passieve cutane anafylaxie konden worden aangetoond. Aan de andere kant induceerde het Ag-Ab-Alu-vaccin geen antilichamen tegen gasteel materiaal.

79 0 8 9 3 *5

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van een vaccin tegen ziekten veroorzaakt door een virus, met het kenmerk, dat men een immunocomplex van een antilichaam/oplosbaar antigeen afgeleid van een dergelijke virus in een voor een dergelijke toepassing geschikte 5 toedieningsvorm brengt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1 voor het bereiden van een vaccin tegen ziekten veroorzaakt door een virus in een speciale species, met het kenmerk, dat men een immunoeanplex van êên of een aantal oplosbare specifieke antigenen van een dergelijke virus 10 gecombineerd met antilichamen voor het virus uit een dergelijke species toepast.

3. Werkwijze volgens êên der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men alle essentiële specifieke antigenen van een dergelijke virus, vrijwel in afwezigheid van niet-essentiële bestand- 15 delen ervan, welke antigenen in de vorm van immunocamplex(en) van oplosbare specifieke antigeen(en) met antilichamen voor het virus uit een dergelijke species toepast. U. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies voor het bereiden van een vaccin tegen ziekten veroorzaakt door een

20 Herpes-virus, met het kenmerk«, dat men een antilichaam/oplosbaar antigeen immunoeanplex van een dergelijke virus toepast.

5. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies voor het bereiden van een vaccin tegen ziekten veroorzaakt door een myxo- of paramyxo-virus, met het kenmerk, dat men een antilichaam/ 25 oplosbaar antigeen immunocomplex van een dergelijke virus toepast.

6. Werkwijze volgens ëén der voorgaande conclusies voor het bereiden van een vaccin tegen ziekten veroorzaakt door Herpes simplex virus (HSV), met het kenmerk. dat men een HSV antilichaam/ oplosbaar antigeen immunocomplex dat oplosbare HSV-specifieke anti- 30 genen tot een complex gevormd met menselijk anti-HSV-^-globuline, waarvan de HSV-specifieke antigenen in het geval van HSV2 tenminste 3 groepen glycoproteïnen met molecuulgewichten respectievelijk variërende van 120.000-130.000; 80.000-90.000 en 55-000-65.000 en in het geval van HSV1 ten minste 2 groepen glycoproteïnen met molge- 7903535 +

7. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men een immunocomplex toepast dat onoplosbaar is.

8. Werkwijze volgens één der voorgaande conclu- 5 sies, met het kenmerk, dat de bestanddelen in het immunocomplex equivalent zijn of dat er een overmaat van het antigeen in aanwezig is.

9. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men in het geneesmiddel tevens een immuno- 10 logisch adjuvans opneemt.

10. Werkwijze voor het beschermen van een species tegen virus-ziekten, met het kenmerk, dat men aan dit species een doeltreffende hoeveelheid van een vaccin bereid volgens conclusies 1-9 toedient.

11. Werkwijzen als beschreven in de beschrijving en/of voorbeelden.

12. Immunocomplexen van een antilichaam/oplosbaar antigeen volgens conclusies 1-11. ^ 7 9 0 8 9 3 § -/3 - V Sr Verbetering van errata in de beschrijving behorende bij de octrooiaanvrage no. 79-08936 Ned. voorgesteld door Aanvrager dd. 1 4 JAN. 1380 Toevoegen aan de laatste regel van bladzijde 11: "wichten tussen respectievelijk 120.000 - 130.000, 80.000 - 90.000 en 55.000 - 60.000". Schut/RR 790 89 36