NL1022689C2 - Bioconditioner. - Google Patents

Description

5

Titel: Bioconditioner

De uitvinding heeft betrekking op een waterbed conditioner waarmee de waterkwaliteit van water aanwezig in een waterbedmatras verhoogd kan worden. De uitvinding heeft in het bijzonder betrekking op een biologische conditioner, ofwel bioconditioner, waarmee de hoeveelheid 10 gas* en stankvormende bacteriën in een waterbed gereduceerd kan worden.

De waterbed-industrie vormt een industriële tak van aanzienlijke omvang. Tot op heden zijn er alleen al binnen Nederland zo'n 1 miljoen waterbedden verkocht en het waterbed wint nog steeds aan populariteit.

In de praktijk is echter gebleken dat na verloop van tijd een 15 aanzienlijk aantal waterbedden problemen gaat vertonen. Een veelvoorkomend probleem heeft betrekking op een vermindering van de kwaliteit van het water waarmee een waterbedmatras, of watermatras, gevuld is. De meeste, zoniet alle, problemen met de waterkwaliteit van waterbedden kunnen worden teruggevoerd op microbiële activiteit. Het 20 vrijwel stilstaande, verwarmde water in een watermatras biedt gunstige omstandigheden voor de groei van micro-organismen zoals bacteriën. Uit onderzoek is gebleken dat in zogenaamde 'probleemwaterbedden', die veelal worden gekenmerkt door gas- en/ of stankvorming, hogere concentraties micro-organismen, zoals bacteriën, voorkomen dan in zogenaamde 25 'probleemloze' waterbedden. Sommige van die bacteriën produceren het gas waterstofsulfide (H2S). H2S stinkt naar rotte eieren en kan door het vinyl matras dringen zodat er een nare lucht in de slaapkamer, en in veel gevallen in het gehele huis, komt te hangen. Andere micro-organismen produceren het gas koolstofdioxide (CO2) bij de verbranding van glucose in 30 een aërobe omgeving. Watermatrassen met een relatief hoog gehalte aan fermenterende micro-organismen moeten doorgaans vaak ontlucht worden om de gasbellen uit het matras te verwijderen. Het volume van een H waterbed bevat in het algemeen voldoende zuurstof om een micro-organisme met een fermenterend metabolisme voor een langere periode, zoals gedurende enkele jaren, in stand te houden.

Een aantal jaren geleden werd een nieuw type watermatras 5 geïntroduceerd dat was uitgerust met een stabilisatiesysteem ten einde de deining te verminderen tijdens het in-of uitstappen of tijdens het omdraaien in bed. De stabilisatie wordt veelal bereikt door een of meerder lagen van dempend schuim, vezels of vinnen. Hoewel de ontwikkeling van een gestabiliseerd watermatras (ook wel bekend onder de naam 'motionless' 10 of 'waveless' matras) de verkoop van waterbedden enorm heeft gestimuleerd, heeft het ook een aanzienlijk probleem gecreëerd. Het inwendige stabilisatiesysteem biedt namelijk de mogelijkheid voor bepaalde bacteriestammen om zich aan het oppervlak van het systeem te hechten om aldaar kolonies te vormen.

15 Behalve fermenterende micro-organismen kan een watermatras ook niet-fermenterende micro-organismen bevatten. Niet-fermenterende micro-organismen zijn in hoofdzaak onafhankelijk van een oxidatief metabolisme aangezien ook zij ook andere moleculen dan kool(water)stoffen als brandstof kunnen gebruiken. Niet-fermenterende bacteriën kunnen 20 bijvoorbeeld stikstof en/ of fosfaat-houdende moleculen metaboliseren om I aan energie te komen. In tegenstelling tot een waterbed met een hoofdzakelijk fermenterende micro-flora of flora, hoeft een waterbed met een I hoofdzakelijk niet-fermenterende flora zelden ontlucht te worden en veroorzaakt een dergelijk waterbed aanzienlijk minder stankproblemen.

I 25 Een klassieke benadering van problemen die geassocieerd zijn met een slechte waterkwaliteit betreft dan ook het bestrijden van de micro-flora, microbiële flora of flora die verantwoordelijk wordt geacht voor stank- en /of I gas-vorming. Een veelgebruikte methode om groei van dergelijke micro- organismen tegen te gaan bestaat uit het periodiek toevoegen van een 30 chemisch product met anti-microbiële werking, een zogenaamde 3 'desinfectant'. Er zijn verschillende dergelijke biocidische producten, ook wel 'waterbed conditioners' genoemd, op de markt. Vrijwel alle bestaande chemische conditioners bevatten de quaternaire ammoniumverbinding alkylbenzyldimethylammonium chloride (QUAT) als actieve stof. Deze 5 chemische verbinding heeft een remmend effect op de groei van. Daarnaast wordt in de praktijk vaak een parfum aan het water toegevoegd om eventuele storende luchtjes verder te verdoezelen.

Er kleven echter een aantal bezwaren aan het gebruik van chemische waterbed conditioners. Ten eerste, de werking van een biocide is doorgaans 10 aspecifiek waardoor zowel de schadelijke, fermenterende micro-flora als de gunstige, niet-fermenterende micro-organismen worden gedood. Ten tweede is de concentratie van een chemische conditioner, ofwel biocide, in een watermatras veelal te laag om het aantal bacteriën in een waterbed significant te verlagen. Ten derde doden sommige biocides geen schadelijke 15 micro-organismen maar remmen ze slechts hun groei. Tenslotte blijkt de gevoeligheid van een fermenterende flora voor biocides vaak lager te zijn dan die van een niet-fermenterende flora, met als gevolg dat bestaande biocides de groei van 'slechte' flora bevoordelen ten koste van een 'goede' flora. Hierdoor wordt het gas- en stank probleem dikwijls alleen maar 20 verergerd. Behalve voornoemde nadelen met betrekking tot het werkingsmechanisme van chemische conditioners, bestaat het risico dat er van het met biocide behandelde water, of zelfs van een fles bevattende het geconcentreerde biocide, wordt gedronken met alle schadelijke gevolgen van dien. Met name de meer agressieve chemicaliën die worden gebruikt om de 25 meest schadelijke bacteriestammen te doden, zoals bacteriën die met name in de populaire, gestabiliseerde watermatrassen voorkomen, kunnen bij inname een bedreiging voor de gezondheid vormen. Een ander nadeel van het gebruik van bestaande biocidische waterbed conditioners is het feit dat de chemische bestanddelen in het afvalwater terecht komen telkens

102?RQQ

Η Η wanneer het water in het waterbed ververst wordt. Daarmee wordt het immer groeiend probleem van watervervuiling vergroot.

Uit het bovenstaande is duidelijk dat het effectief bestrijden van een gas- en stankvormende micro-flora in een watermatras, terwijl in 5 hoofdzaak aan de hedendaagse normen met betrekking tot veiligheid en milieuvervuiling voldaan wordt, moeilijk te verwezenlijken is met de tot op heden bekende methoden en producten.

De uitvinding verschaft het inzicht dat een 'goede' flora aan een 10 waterbed toegevoegd kan worden teneinde de concentratie 'slechte' flora, aanwezig in een watermatras, te doen afnemen. Door concurrentie om nutriënten en ruimte krijgt een overmaat aan 'goede' flora meer kans krijgen om te groeien, wat ten koste gaat van de groei en ontwikkeling van een 'slechte' flora. De uitvinding verschaft een werkwijze voor het 15 selecteren van ten minste een eerste micro-organisme welke, indien toe gevoegd aan een waterbed bevattend ten minste een tweede micro- organisme, in staat is om de hoeveelheid van ten minste het tweede micro- organisme aanwezig in het waterbed te beïnvloeden, de werkwijze omvattende de stappen van : a) het verkrijgen van ten minste een eerste 20 micro-organisme; b) het verkrijgen van een monster bevattend ten minste I een tweede micro-organisme; c) het bepalen van de hoeveelheid en de I identiteit van het tweede micro-organisme in het monster; d) het toevoegen van het eerste micro-organisme aan het monster; e) incubatie van het monster onder condities waarbij het eerste micro-organisme groeit; f) het 25 bepalen van de hoeveelheid en de identiteit van ten minste het tweede micro-organisme in het monster na toevoeging van het ten minste eerste organisme; g) het bepalen van het verschil in de hoeveelheid tweede micro-organisme in het monster blootgesteld aan het eerste micro-organisme met de hoeveelheid tweede micro-organisme in het monster voor blootstelling 30 aan het eerste micro-organisme, en h) het selecteren van ten minste een ii η n * ) λ λ 5 eerste micro-organisme dat in staat is om de hoeveelheid van ten minste het tweede micro-organisme in het monster te beïnvloeden.

Het is bekend dat de groei van één micro-organisme de groei van een ander micro-organisme kan remmen of juist stimuleren. Men spreekt hij 5 dergelijke microbiële interacties van antagonisme, respectievelijk synergisme. Er is sprake van antagonisme tussen micro-organismen wanneer één soort of groep van micro-organismen een verandering in de groeivoorwaarden aanbrengt welke ongunstig is voor de ontwikkeling van een andere soort of groep. Een micro-organisme kan dus de ontwikkeling 10 van een andere micro-organisme remmen door het milieu minder gunstig te maken, bij voorbeeld door de verwijdering van noodzakelijke voedingsbestanddelen, door een verandering van de pH of de redoxpotentiaal of door de produktie van groei-inhiberende bestanddelen. Symbiotische relaties tussen micro-organismen komen ook voor. De 15 mechanismen van deze interacties zijn in essentie gelijk aan die van symbiose. Het belang van microbieel antagonisme mag niet onderschat worden. De relatief lage incidentie van voedselvergiftigingen door onder andere S. aureus, C. perfringens, en C. botulinum is wellicht gedeeltelijk te verklaren door de gevoeligheid van deze micro-organismen aan competitie 20 en inhibitie door bv. Pseudomonas soorten, Enterobacteriaceae, Bacillus soorten, melkzuurbacteriën, niet pathogene Stafylococcus en Micrococcus soorten.

Een ten minste eerste micro-organisme kan op verschillende manieren worden verkregen, bijvoorbeeld bij een commerciële 25 cultuurcollectie zoals bij de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany (DSMZ; zie www.dsmz.de) of bij de American Type Culture Collection (ATCC; zie www.atcc.org). Een ten minste tweede micro-organisme kan van dezelfde bron betrokken worden. De hoeveelheid van het tweede micro-organisme in een monster kan 30 gemakkelijk worden bepaald door het bepalen van het kiemgetal.

n · ✓'; λ λ H Het aantal micro-organismen per milliliter wordt doorgaans uitgedrukt door het aantal kolonievormende eenheden per milliliter (KVE/ml), het zogenaamde kiemgetal. Het kiemgetal van een monster kan door de vakman of een ieder met enige microbiologische kennis en ervaring 5 gemakkelijk bepaald worden. Bijvoorbeeld, het monster of een bekende verdunning daarvan wordt in een petrischaal gebracht. In de schalen wordt een handwarme agarhoudende voedingsbodem gegoten en het monster (verdunning) wordt goed gemengd met deze voedingsbodem.Vervolgens koelt de voedingsbodem af en wordt de bodem stijf door de aanwezigheid 10 van de agar die "stolt”. Na incubatie, doorgaans bestaande uit het wegzetten van de petrischaal in een verwarmde stoof, wordt het aantal kolonies geteld.

Via de aangelegde verdunningen kan men eenvoudig terugrekenen hoeveel micro-organismen per milliliter aanwezig zijn. Na toevoeging van een I eerste micro-organisme volgens de uitvinding aan een monster bevattende I 15 ten minste een tweede micro-organisme, wordt het monster gehouden, ofwel H geïncubeerd, onder condities welke vergelijkbaar zijn met de condities in een I waterbed. In een voorkeursuitvoering worden een aantal verschillende micro-organismen, en / of verschillende verdunningen daarvan, in parallel getest op hun capaciteit om een ten minste tweede micro-organisme te 20 beïnvloeden. Een aantal niet-fermenterende bacteriestammen in een vloeibare suspensieculture worden bijvoorbeeld in een serie verschillende verhouding, zoals 1:10,1:100 en 1:200, toegevoegd aan een monster, bij voorkeur een kweek- of cultuurhuis bevattende ten minste een tweede, fermenterende, bacteriestam in een vloeibaar medium. Dit is bij voorkeur 25 een arm, waterig medium teneinde de omstandigheden in een waterbed zo goed mogelijk na te bootsen.

In een werkwijze volgens de uitvinding kan een micro-organisme worden geïdentificeerd aan de hand van een determinatie-overzicht zoals getoond in Figuur 5, waarbij gebruik wordt gemaakt van standaard 30 microbiologische determinatiemethoden zoals Gramkleuring, selectieve A A *·\ Λ 7 voedingsbodems, oxidase-test, nitraatreductie-test, en andere determinatiemethoden. Een vakman is goed in staat om te beoordelen welke methoden of tests met voordeel gebruikt kunnen worden en op welke wijze deze moeten worden uitgevoerd. Een eerste en een ten minste tweede micro-5 organismen is bij voorkeur te kweken in een laboratorium. Hierbij kan onderscheid gemaakt worden tussen kweken in een vloeistof, ook wel medium of bouillon genaamd, of op een vaste ondergrond. In beide gevallen wordt doorgaans gebruik gemaakt van medium, al dan niet gestold, dat alle, voor de groei essentiële, voedingsstoffen bevat. Net als hogere organismen 10 hebben micro-organismen energie nodig om te overleven en te groeien.

Daarom wordt er een substraat, vaak bepaalde suikers, toegevoegd aan het medium. Verder worden er veelal vitaminen door het medium gemengd. Elk micro-organisme, zoals een bacterie, heeft zo z'n specifieke voorkeuren wat de voeding en de omgevingscondities betreft. Zo kan gelet worden op de 15 temperatuur, de pH en de zoutconcentratie. In een werkwijze volgens de uitvinding wordt, na toevoeging van een eerste micro-organisme aan een monster, het monster geïncubeerd onder condities welke gunstig zijn voor de groei of vermenigvuldiging van het eerste micro-organisme. Geschikte groeicondities stellen het eerste micro-organisme immers in staat om het 20 ten minste tweede micro-organisme te beïnvloeden, bij voorbeeld door te concurreren om nutriënten of ruimte, of door het uitscheiden van een substantie welke een effect heeft op het tweede organisme. Wanneer met vloeibaar medium gewerkt wordt, kan groei eenvoudigweg geconstateerd worden doordat de vloeistof troebel wordt of doordat een soort neerslag 25 ontstaat. Op vast medium (platen) worden doorgaans kolonies gevormd. Dat zijn kleine spots van bacteriën die veelal met het oog zijn waar te nemen. Kolonies kunnen spectaculaire kleuren hebben, afhankelijk van de soort, het medium waarop ze groeien en of er bepaalde kleurreacties zijn uitgevoerd. Deze kleurreacties kunnen met voordeel gebruikt worden om de 30 aanwezigheid van een bepaald micro-organisme aan te tonen.

1 Π Ί Ί R Q Ω H Na een bepaalde incubatieperiode wordt opnieuw de hoeveelheid van het ten minste tweede micro-organisme in het monster bepaald om het effect van de toevoeging van het ten minste eerste organisme op het ten minste tweede micro-organisme vast te stellen. De periode van incubatie is 5 afhankelijk van zowel het type eerste micro-organisme als van het ten minste tweede micro-organisme en van het gekozen medium. Een snelgroeiend eerste micro-organisme kan bij voorbeeld al na een relatief korte incubatietijd een tweede micro-organisme beïnvloeden. Echter, in het geval een eerste· micro-organisme een relatief lange lag-tijd heeft dan is een I 10 langere incubatietijd nodig om te kunnen beoordelen of het eerste organisme I een ten minste tweede organisme te beïnvloeden. De lag-tijd is de tijd die I het micro-organismen nodig heeft om zich aan te passen aan de omgeving I om te groeien, ofwel de periode die verloopt voordat de vermeerdering van een micro-organisme begint. In het algemeen is de incubatietijd ook 15 afhankelijk van de relatieve hoeveelheden van het eerste en het ten minste tweede micro-organisme; hoe meer van het eerste micro-organisme aan een I monster wordt toegevoegd, hoe sneller een effect kan worden verwacht op I een ten minste tweede micro-organisme. Als laatste stap in een werkwijze I volgens de uitvinding wordt het verschil bepaald tussen de hoeveelheid van I 20 een tweede micro-organisme in een monster welke is blootgesteld aan een I eerste micro-organisme en de hoeveelheid tweede micro-organisme in het I monster voor blootstelling aan het eerste micro-organisme. Indien er sprake I is van een verschil, hetzij positief hetzij negatief, kan worden geconcludeerd dat een eerste micro-organisme in staat is om de hoeveelheid van ten minste 25 het tweede micro-organisme in het monster te beïnvloeden.

I De uitvinding verschaft een werkwijze voor het selecteren of identificeren van ten minste een eerste micro-organisme dat in staat is om de hoeveelheid van ten minste het tweede micro-organisme in een waterbed te verlagen.

De uitvinding voorziet in het bijzonder in een werkwijze voor het 30 selecteren van een eerste micro-organisme die de ontwikkeling en/of groei 9 van een fermenterend organisme welke problemen veroorzaakt in een waterbedmatras, kan remmen. Een eerste organisme selecteerbaar volgens de uitvinding is bij voorkeur een micro-organisme met een niet-fermenterend metabolisme, ofwel een niet-fermenterend micro-organisme.

5 Zoals beschreven in de gedetailleerde omschrijving, verschaft de uitvinding een niet-fermenterend organisme welke ten minste één fermenterend micro-organisme, zoals een micro-organisme die CO2, H2S of ammoniak kan produceren, kan overgroeien. Een niet-fermenterend eerste organisme volgens de uitvinding is bijvoorbeeld een bacterie behorend tot het genus 10 waartoe Pseudomonas spp. of Chryseomonas spp. behoren. Een eerste micro-organisme heeft bij voorkeur geen negatief effect op de waterkwaliteit van een watermatras en heeft geen invloed op de bestanddelen van het watermatras, zoals het waterbedvinyl en het waterbedschuim. De invloed van een eerste micro-organisme op waterbedvinyl kan op meerdere wijzen 15 worden bepaald. Bij voorbeeld, zoals beschreven in de gedetailleerde omschrijving, kan bepaald worden of het vinyl na blootstelling aan een micro-organisme een verminderde uitrekking en terugkrimping krijgt. Bij het schuim kan getest worden of deze een verminderde terugvering krijgt.

In een voorkeursuitvoering van de uitvinding is een ten minste 20 tweede organisme een fermenterend organisme dat problemen kan veroorzaken in een waterbed, zoals een bacterie behorend tot het genus waartoe Staphylococcus spp., Escherichia spp., Stenotrofomonas spp., Pasteurella spp. of Enterobacter spp. behoren. Om te bepalen of een eerste micro-organisme volgens de uitvinding de hoeveelheid van een ten minste 25 tweede fermenterend micro-organisme in een monster kan beïnvloeden, kan worden getest op gasvorming in het monster. Bijvoorbeeld, de vorming van H2S en /of ammoniak kan worden onderzocht op relatief eenvoudige wijze. H2S-vormende bacteriestammen beschikken over het enzym cysteine-desulfhydrase. Hierdoor zijn ze in staat om zwavel vrij te maken uit 30 zwavelbronnen zoals pepton, cysteine, cystine en thiosulfaat. Daarna 1 0 2 2 R « q Η Η verbindt het vrijgekomen zwavel zich met waterstof tot H2S. H2S kan H worden aangetoond door zware metalen aan het monster tot te voegen, H zodat er een onoplosbare, zwarte metaalsulfideverbinding kan ontstaan.

In een andere test kan de aanwezigheid van een of meerdere ammoniak- 5 vormende bacteriestammen worden bepaald door de enzymactiviteit van bacterieel urease in een monster te bepalen. Ureum is een substraat dat H door urease snel gehydrolyseerd wordt tot twee moleculen ammoniak. Dit veroorzaakt een toename in de pH, welke zeer eenvoudig gedetekteerd kan worden met behulp van een pH indicator, zoals bijvoorbeeld fenolrood. Een 10 kleuromslag van geel naar rood tot rood-paars is positief en duidt op de aanwezigheid van ten minste een urease-bevattend tweede micro- organisme.

Een werkwijze volgens de uitvinding voor het selecteren van een eerste H micro-organisme of 'goede flora' welke een tweede, H2S-of ammoniak 15 vormend micro-organisme kan overgroeien omvat bijvoorbeeld een bovengenoemde test op gasvorming om een verandering in de gasvormende, 'slechte' micro-flora aan te tonen.

Bij een normaal gebruik van een eerste micro-organisme volgens de uitvinding als bioconditioner is het onwaarschijnlijk dat de consument in 20 ruime mate aan het micro-organisme, zoals een niet-fermenterende H bacteriestam, wordt blootgesteld. Het spreekt echter voor zich dat voor het I gebruik van een eerste micro-organisme als bioconditioner voor een waterbed, een eerste organisme volgens de uitvinding bij voorkeur een niet- pathogeen micro-organisme is welke in hoofdzaak onschadelijk is voor de I 25 mens. Van de meeste, zo niet alle, reeds bekende micro-organismen is I bekend in welke mate ze een gevaar kunnen vormen voor de gezondheid.

I Bijvoorbeeld, Pseudomonas spp., in het bijzonder P. aeruginosa, kunnen I infecties veroorzaken bij personen met een verlaagde weerstand.

I Een waterbed conditioner volgens de uitvinding bevat bij voorkeur I 30 tenminste een micro-organisme te verkrijgen volgens de uitvinding welke

I 1 022 RP Q

11 snel, goedkoop en gemakkelijk op industriële schaal gekweekt kan worden. De groei-eigenschappen van een micro-organisme kunnen door een vakman worden getest, bijvoorbeeld door het opschalen van kweekprocedures die onder laboratorium condities worden gebruikt. Bij voorkeur kan een eerste 5 micro-organisme volgens de uitvinding uitgroeien tot een hoge dichtheid.

Dit biedt als voordeel dat de goede flora in de vorm van een geconcentreerde culture, ofwel microconcentraat, aan een waterbed kan worden toegevoegd. Hoe hoger het kiemgetal van een bioconditioner volgens de uitvinding, hoe groter de kans dat het ten minste eerste micro-organisme in een waterbed 10 zal "aanslaan" ofwel zal gaan groeien. Een microconcentraat volgens de uitvinding bevat bij voorkeur ten minste 106KVE/ml, beter ten minste 107 KVE/ml, zoals 108 tot 1010 KVE/ml.

Na toediening van een eerste micro-organisme volgens de uitvinding aan een waterbed, is het organisme bij voorkeur in staat om zich 15 snel in het waterbed te vermenigvuldigen. Immers, hoe hoger de groeisnelheid van het eerste micro-organisme, hoe beter de groei een ten minste tweede micro-organisme geremd kan worden. Uit de praktijk blijkt dat een toename in het relatieve kiemgetal van een eerste organismen in een waterbed van ten minste 5% in enkele maanden, zoals 2-4 maanden, 20 voldoende remmend effect heeft op een slechte of probleemveroorzakende flora in een waterbed. De bepaling van het relatieve kiemgetal is elders in de uitvinding beschreven. De relatieve toename is echter bij voorkeur hoger, zoals ten minste 10%, of beter ten minste 15% of zelfs ten minste 30%, en wordt bij voorkeur sneller bereikt zodat de slechte flora geen kans krijgt.

25 Zoals elders beschreven verschaft de uitvinding een micro-concentraat met C.luteola waarmee een relatieve toename van ongeveer 15-25% kan worden bereikt in een in periode van 1 tot 3 maanden. Daarnaast zijn in alle behandelde waterbedden welke voorheen als probleemwaterbedden werden bestempeld de problemen van gas- en/of stankvorming afgenomen. De 30 uitvinding verschaft hiermee een werkwijze voor het verkrijgen van een 1 n ? ? « q o H waterbed conditioner, ten minste omvattende het selecteren van een eerste micro-organisme volgens de uitvinding.

Bij voorkeur is een eerste micro-organisme verkrijgbaar volgens een werkwijze hierin beschreven in staat om na toediening aan een 5 waterbed het totale kiemgetal te doen afnemen. Zoals blijkt uit Tabel 6, is het totale kiemgetal van een waterbedmonster in vrijwel alle geteste waterbedden afgenomen na toediening van een C. luteola microconcentraat.

Daarnaast verdient het de voorkeur dat een eerste micro- organisme een lange houdbaarheid heeft en niet in werkzaamheid verliest 10 in het traject tussen het moment van productie en het moment van gebruik als waterbedconditioner door de consument. De uitvinding verschaft een waterbed conditioner ten minste omvattende eerste micro-organisme verkrijgbaar volgens een werkwijze volgens de uitvinding, welke voor een redelijke periode, zoals enkele weken, of beter enkele maanden of zelfs 15 enkele jaren stabiel blijft. De uitvinding voorziet bijvoorbeeld in een C.

luteola microconcentraat waarvan de beginconcentratie (uitgedrukt in H aantal kolonievormende eenheden per milliliter) niet achteruit gaat na plaatsing of opslag van het concentraat bij 4 graden Celsius of bij I kamertemperatuur gedurende een periode van ten minste vier maanden.

I 20 De uitvinding voorziet tevens in een samenstelling van een container met ten minste een eerste micro-organisme verkrijgbaar volgens een werkwijze volgens de uitvinding, en een gebruiksaanwijzing. Een gebruiksaanwijzing kan een etiket zijn welke op de container is aangebracht of het kan een bijsluiter zijn die los aan de container wordt toegevoegd. De I 25 gebruiksaanwijzing geeft bij voorbeeld aan op welke wijze de consument het eerste micro-organisme, zoals een niet-fermenterende bacteriestam, als I waterbed conditioner kan gebruiken. Het vermeldt bijvoorbeeld in welke I hoeveelheid en met welke frequentie het microconcentraat, bevattend ten I minste een eerste micro-organisme volgens de uitvinding, aan een 30 watermatras kan worden toegevoegd teneinde de waterkwaliteit te 13 verbeteren of te stabiliseren. Een container is een reservoir welke geschikt is voor het opslaan en/of vervoeren van het ten minste een eerste organisme, bij voorbeeld in een vloeibare vorm zoals een bacteriële suspensie. Een container is bij voorkeur goed af te sluiten zodat het micro-organisme 5 tijdens de opslag en/of het vervoer niet buiten de container komt.

Voorbeelden van geschikte containers zijn een fles, een kolf, een flacon, een pot of een buis. In een voorkeursuitvoering van de uitvinding is een container hersluitbaar, bijvoorbeeld met een dop voorzien van schroefdraad. Een hersluitbare container biedt als voordeel dat een consument niet ineens 10 de totale inhoud van de container hoeft te gebruiken maar ook een gedeelte van de totale hoeveelheid micro-organisme kan gebruiken. In een andere uitvoeringsvorm bevat een container echter een afgepaste hoeveelheid van een eerste organisme in suspensie, bij voorbeeld 50 milliliter, welke voldoende is voor een enkele behandeling van een waterbed. Ook verschaft 15 de uitvinding een container met het opschrift 'waterbed conditioner' of een ander opschrift of mededeling waaruit kan worden opgemaakt dat de inhoud van de container gebruikt kan worden als waterbed conditioner.

Daarnaast verschaft de uitvinding een samenstelling van waterbed en ten minste een eerste micro-organisme verkrijgbaar volgens een 20 werkwijze volgens de uitvinding.

102?Ran H Figuur 1: De invloed van de pH op de vorming van CO2, HCO3' en I co32-

Figuur 2 : De krimpwaarden (A) en rekwaarden (B) van teststroken zonder seal-laag na blootstelling gedurende een bepaalde tijd aan H 5 kraanwater zonder (Blanco) of met lysozym (Enzym).

Figuur 3 : De krimpwaarden (A) en rekwaarden (B) van teststroken met seal-laag na blootstelling gedurende een bepaalde tijd aan kraanwater zonder (Blanco) of met lysozym (Enzym).

Figuur 4 : De hoogte van een blok waterbedschuim met (A) en 10 zonder (B) gewicht van 4.5 kilogram na blootstelling van het schuim aan kraanwater zonder (Blanco) of met lysozym (Enzym).

Figuur 5: Determinatieoverzicht bacteriestammen.

Tabel 1: MIC waarden desinfectantia voor de geteste micro- organismen.

H 15 Tabel 2 : MBC waarden desinfectantia voor de geteste micro- organismen.

Tabel 3 : Het effect van lysozym op de slechte flora in verschillende waterbedden.

Tabel 4 : Het effect van lysozym op de uitrekking en krimping van I 20 teststroken zonder seal-laag.

H Tabel 5 : Het effect van lysozym op de uitrekking en krimping van I teststroken met seal-laag .

Tabel 6: Het effect van een niet-fermenterend micro-concentraat op de waterkwaliteit van geteste waterbedden.

I 25

Om tot een beter begrip te komen van de waterkwaliteit in waterbedden is I de microbiologische samenstelling van het water in een waterbed onderzocht. Hierbij zijn monsters gebruikt van probleemwaterbedden en 30 probleemloze waterbedden. De meest voorkomende problemen zijn gas en r'\ » λ ^ 15 stank vorming. Uit onderzoek is gebleken dat in probleemwaterbedden hogere concentraties micro-organismen voorkomen namelijk 1* 107 - 1* 109/ml, in probleemloze waterbedden ligt de concentratie rond de 1* 105-1* 106. Deze micro-organismen zijn onderzocht of zij in staat zijn gas en/of 5 stank te vormen. In een normaal waterbed en een probleemwaterbed zijn de meest voorkomende micro-organismen welke in staat zijn gas en stank te vormen S. aureus, S. epidermidis en Steno. Maltophilia. Tevens Pasteurella spp. en Pseudomonas aeroginosa, deze zijn echter alleen in staat stank te vormen.

10 Om de waterkwaliteit van waterbedden te verhogen zijn er op de markt verschillende conditioners aanwezig. Al deze conditioners hebben hetzelfde actieve bestanddeel, namelijk alkylbenzyldimethylammoniumchloride (QUAT). Ondanks het gebruik van deze conditioners doen zich nog in verschillende regio’s problemen voor. De werking van deze conditioners is 15 onderzocht op de verschillende micro-organismen die uit het onderzoek zijn aangewezen als de veroorzakers van de gas en stank problemen. Uit onderzoek is gebleken dat de conditioners niet de probleem micro-organismen doden of remmen, en dus niet de gas en stank problemen verminderen. In de hieronder beschreven voorbeelden zijn verschillende 20 desinfectantia getest op de mogelijkheid om de “slechte” flora te remmen/doden.

Voorbeeld 1: Testen werkzaamheid alternatieve conditioners

De mate van remming of inhibitie van de groei van een micro-organisme 25 door een anti-microbieel middel, zoals een desinfectant, kan worden uitgedrukt als Minimal Inhibition Concentration (MIC). De concentratie van een anti-microbieel middel waarbij een micro-organisme gedood wordt, wordt doorgaans uitgedrukt als Minimal Bactericidal Concentration (MBC). Met behulp van het onderzoek MIC en MBC is de gevoeligheid van micro-30 organismen voor verschillende desinfectantia welke als alternatieve H conditioner zouden kunnen fungeren getest. De micro-organismen kunnen H worden onderverdeeld in drie groepen: Η 1. De “goede" flora, bijvoorbeeld Stafylococcus aureus en Stafylococcus epidermis.

5 2. De "slechte" gasvormende flora, bijvoorbeeld Pseudomonas aeroginosa en H Pasteurella spp.

3. De "slechte" stankvormende flora, bijvoorbeeld Enterobacter cloacae.

De conditioners zijn getest op de goede flora en de gasvormende flora. MIC

10 staat voor Minimal Inhibition Concentration, de laagste concentratie waarbij de flora geremd wordt in haar groei. MBC staat voor Minimal

Bactericidal Concentration, de laagste concentratie waarbij de flora wordt I gedood. De volgende desinfectantia zijn getest: · Alkylbenzyldimethylammoniumchloride (QUAT) 15 · Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) · Chloroform · Waterstofperoxide · Sodium dodecyl sulfaat (SDS) · Perazijnzuur 20 · Glutaaraldehyde · Lysozym I QUAT is het actieve bestanddeel van de conditioner die momenteel op de markt aanwezig is. Er is uitgegaan van 250 ml desinfectant in een 600 liter waterbed, zodat de concentratie desinfectant 0.04 % bedraagt.

I 25 I Resultaten: I De gevonden MIC waarden van de verschillende desinfectantia per micro- I organisme, zijn samengevat in Tabel 1. De gevonden MBC waarden van de I verschillende desinfectantia per micro-organisme, zijn samengevat in Tabel I 30 2.

Claims (20)

10 Hoe lager de pH hoe groter de C02 vorming. De pH van waterbedwater kan verhoogd worden door gebruik te maken van loog (pH ± 9). Gas problemen kunnen zowel een biologische als een chemische oorzaak hebben. Door toevoeging van perazijnzuur aan het waterbed wordt de pH 15 verlaagt waardoor meer opgelost C02 overgaat in de gasvorm en zo I ontsnapt. De pH van een waterbed kan worden verhoogd door toevoeging van loog aan het water waardoor er weinig tot geen C02 wordt gevormd. B Voorbeeld 3: Selectie Lysozym B 20 Lysozym is een enzym dat de celwand van Gram-negatieve micro- B organismen aantast waardoor deze niet meer kunnen groeien. De gas· en stankproblemen in waterbedden worden in vele gevallen veroorzaakt door Gram-negatieve micro-organismen. Er is getest of door het toevoegen van lysozym in een waterbed de concentratie “slechte” flora te vermindert 25 waardoor de “goede” flora de kans krijgt om te groeien. Aan verschillende waterbedden met een bekend aantal kolonievormende eenheden per ml (KVE/ml) wordt per 100 liter water 0.001 gram lysozym toegevoegd. Eenmaal per maand wordt een watermonster van de waterbedden genomen en het KVE/ml bepaalt. Als maat is genomen dat de £ s* /<*. /·-* afname van de “slechte” flora minstens een factor 100 moet zijn voordat de werking positief mag worden genoemd. Resultaten: In de afzonderlijke waterbedden is het effect van lysozym op het verloop van 5 het KVE/ml bepaald. De resultaten zijn samengevat in Tabel 3. Het lysozym, in deze concentratie, is te onbetrouwbaar. In slechts 13 % van de gevallen is een duidelijke afname van het aantal KVE/ml te constateren. In die gevallen waarbij een afname wordt geconstateerd bereikt de afname 10 een piek na circa een maand, na circa 2 maanden is de werking van het lysozym echter weer tenietgedaan en vindt er weer een toename van het aantal KVE/ml plaats. Voorbeeld 4: Effect van lysozym op waterbed materiaal 15 Om de invloed van het lysozym op het waterbedvinyl en het waterbedschuim te meten, zijn drie verschillende testen ingezet, te weten een trekbanktest, een rek- en krimptest en een schuimtest. In de trekbanktest en de rek- en krimptest wordt bij het waterbedvinyl gekeken of deze na blootstelling aan het lysozym een verminderde uitrekking en 20 terugkrimping krijgt. In de schuimtest wordt bepaald of het schuim een verminderde terugvering krijgt. Trekbank test In de trekbanktest wordt bepaald of de rekbaarheid van waterbedvinyl, met en/of zonder seal-laag door de inwerking van lysozym wordt aangetast.

25 Hiertoe worden van het te testen waterbedvinyl ingekorte genormaliseerde teststroken geknipt. Deze worden geplaatst in kraanwater (blanco) en in kraanwater met een concentratie van 50 international Units lysozym per ml. De gestandaardiseerde teststroken worden in het donker bij kamertemperatuur geplaatst. Met behulp van een trekbank worden de 30 teststroken op een bepaalde tijd beproefd. Hierbij wordt vastgelegd hoe tö2?o n H groot de teststrook was op het moment dat deze brak (de verlenging) en H tevens de kracht (F max) die hiervoor nodig is. De gemiddelde verlenging H en F max worden bepaald en vergeleken met de referentie waarde. De referentiewaarde is bepaald met behulp van teststroken welke geen H 5 inwerking hebben gehad van blanco of enzym. Resultaten: Tabel 4 geeft de testresultaten van de teststroken zonder seal-laag. Tabel 5 geeft de testresultaten van de teststroken met seal-laag.

10 Uit de resultaten van de trekproeven is af te leiden dat het lysozym geen meetbare invloed heeft op de rekbaarheid van het waterbedvinyl. Zowel bij waterbedvinyl met als zonder seal-laag wijken de meetwaarden van de gemiddelden niet significant af van de referentiewaarden.

15 Rek- en krimptest In de rek- en krimptest wordt de invloed van lysozym bepaald op de rekbaarheid en terugkrimping van gestandaardiseerde waterbedvinyl teststroken. I Van het te testen waterbedvinyl worden gestandaardiseerde teststroken 20 geknipt. Deze teststroken worden voor onbepaalde tijd geplaatst in I kraanwater(blanco) en in kraanwater die van het enzym een concentratie I van 50 international Units lysozym per ml bevat (enzym). Dit wordt in triplo I gedaan voor teststroken met en zonder seal. De teststroken worden in het donker bewaard bij kamertemperatuur. Tevens worden er referentiestroken I 25 getest welke geen kraanwater of enzymbehandeling hebben gehad. De I metingen van de referentiestroken zijn in week 1 uitgevoerd. Voor het I aanvangen van de test moeten de gestandaardiseerde teststroken uit de I oplossing worden gehaald en goed worden gedroogd met behulp van een doek. Op de teststrook moet aan beide weerskanten een lijn op 4 cm worden 30 gezet, tot hier wordt de teststrook geklemd. Het gebied tussen de beide 4 cm strepen is het meetgebied. Vervolgens wordt de teststrook in de opstelling geklemd waarna het gewicht (ongeveer 5 kg) eraan wordt gehangen. Op de volgende tijdstippen wordt de grootte van het meetgebied gemeten: 0.25, 0.5, 1, 2, 5,10, 30, 60 minuten. Deze gegevens zeggen iets over de rekking. Na 5 een uur wordt de teststrook uit de opstelling gehaald. Op de volgende tijdstippen: 0.25, 0.5,1, 2, 5,10, 30, 60 minuten wordt de grootte van het meetgebied gemeten. Deze gegevens zeggen iets over de krimping. Resultaten: De rek- en krimpwaarden van teststroken met en zonder seal-laag zijn 10 bepaald na 60 minuten meting. De waarden van de blanco en de enzymbehandeling zijn weergegeven in Figuren 2 (zonder seal-laag) en 3 (met seal-laag). De stippellijn in de grafieken geeft de referentiewaarde, gemeten in week 1, aan.

15 Lysozym heeft geen meetbaar effect op de rekbaarheid en terugkrimping van het waterbedseal. De enzym en blanco behandeling hebben hetzelfde effect op het waterbedseal. De krimp- en rekwaarden fluctueren beiden rond de referentielijn.

20 Schuimtest Met behulp van de schuimtest wordt getest of door de inwerking van lysozym het waterbedschuim meer indrukt en minder terugveert. Hiertoe worden blokken waterbedschuim van 22 cm lang, 29 cm breed en 13.5 cm hoog in bakken met alleen kraanwater geplaatst (blanco) of in kraanwater 25 dat van het lysozym een concentratie van 50 international Units per ml bevat (enzym). Deze test wordt in duplo en in het donker bij kamertemperatuur uitgevoerd. Op het waterbedschuim wordt een gewicht geplaatst van 4.5 kilo. Om de week wordt de hoogte van het waterbedschuim met gewicht en zonder gewicht gemeten. De meting zonder «0 Λ Λ H gewicht wordt verricht een uur nadat het gewicht van het waterbedschuim verwijderd is. Resultaten: Figuur 4 toont de hoogte van het schuim met gewicht (panel A) en zonder 5 gewicht (panel B). Lysozym heeft geen meetbare invloed op de inkrimping (Fig. 4A) en terugvering (Fig. 4B) van het waterbedschuim. De invloed van water zonder H en met lysozym is nagenoeg hetzelfde. Voorbeeld 5: Microconcentraat Door het toevoegen van een hoge concentratie “goede” flora moet deze in staat zijn de “slechte” flora te overgroeien. Door concurrentie om nutriënten 15 en ruimte zal door de overmaat “goede” flora deze meer kans krijgen om te groeien waardoor de concentratie “slechte” flora zal afhemen. H Chryseomonas luteola is gebruikt voor het micro-concentraat. Chryseomonas luteola heeft geen negatieve eigenschappen met betrekking H tot de waterbedomstandigheden en behoort dus tot de “goede” flora. I 20 Onder optimale omstandigheden kan dit micro-organisme uitgroeien tot een I concentratie van 1* 1010. Deze concentratie is gebruikt voor het microconcentraat. I Houdbaarheidstest I 25 Microconcentraat met een concentratie van 1 * 1010 is gedurende vier I maanden geplaatst bij kamertemperatuur en 4 graden Celsius. Elke week is I er van het microconcentraat een monster genomen en het KVE/ml bepaald. I Na vier maanden is de beginconcentratie van het microconcentraat nog I steeds constant. Microconcentraat is dus minstens vier maanden houdbaar I 30 zowel bij kamertemperatuur als bij 4 graden Celsius. Veldtesten Veldtesten zijn uitgevoerd met een microconcentraat gemaakt met Chryseomonas luteola. Dit niet-fermenterende micro-organisme is een Gram 5 negatieve staaf welke onder optimale omstandigheden uit kan groeien tot 1 * 1011 - 1 * 10“ KVE/ml. Aan een serie waterbedden werd 50 ml microconcentraat bevattende 1 * 1010 Chryseomonas luteola toegevoegd aan zowel waterbedden die kort daar voor waren gevuld met vers kraanwater gevuld, als aan waterbedden waarin zich 10 reeds een micro-flora had ontwikkeld. De microbiologische status van alle waterbedden werd op verschillende tijdstippen voor en na toediening van het micro-concentraat nauwkeurig bepaald met behulp van standaard microbiologische technieken, zoals reinkweek, selectieve kweek en bepaling van het kiemgetal met behulp van verdunningsplaat methode. De pH en de 15 hardheid van de watermonsters werden bepaald met behulp van geijkte, digitale meetinstrumenten. Resultaten: Tabel 6 toont de gegevens van de negen waterbedden (ID 39, 47, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61) waaraan 50 ml microconcentraat bevattende 1 * 1010 niet-fermenterend micro-organisme was toegevoegd.

20 In alle bedden,welke een volume hebben variërend van 100 tot 600 liter, slaat het micro-organisme aan en is er enige tijd na toediening een duidelijke relatieve toename te zien in het C. luteola kiemgetal. Deze relatieve toename varieert van ongeveer 2% tot ongeveer 20% in een periode van circa 1 tot 3 maanden. Tevens neemt na toediening van het micro-25 concentraat in de meeste gevallen het totale kiemgetal af. Een 50 ml preparaat, ofwel microconcentraat, van 1 * 1010 Chryseomonas luteola is in staat om een waterbed met een volume van 100 tot 600 liter te 30 koloniseren wanneer het waterbed vlak daarvoor is voorzien van vers 1. o o « ... H kraanwater. Het microconcentraat kan fermenterende bacteria die H aanwezig zijn in een ververst waterbed overgroeien. Daarnaast blijkt dat het micro-concentraat ook bestaande waterbedden kan koloniseren en dat het de reeds gekoloniseerde fermenterende bacteria kan overgroeien.

5 Tenslotte vertonen de waterbedden die voorzien zijn van het C. luteola micro-concentraat als waterbedconditioner aanzienlijk minder problemen, zoals stank- en gasvorming, die geassocieerd worden met fermenterende bacteria. Samenvattend is gebleken dat de gas- en stankproblemen bij 10 waterbedden veroorzaakt worden door micro-organismen. De “slechte” gasvormende flora zijn Gram-negatieve staven die voornamelijk in de darmflora voorkomen. Gebleken is dat de conditioner (actieve bestanddeel QIJAT) die momenteel verkrijgbaar is op de markt deze micro-organismen niet doodt of remt en dat het de “goede” flora remt. Alternatieve conditioners 15 zijn getest op de mogelijkheid om de “slechte” flora te remmen/doden en de I “goede” flora ongemoeid te laten. Uit deze test zijn perazijnzuur, lysozym als H mogelijke opties gevonden. Perazijnzuur heeft een aggresief karakter en uit het onderzoek is gebleken dat na toevoeging aan waterbedden de I gasproblemen verergeren. De oorzaak hiervan is dat de pH verlaagd wordt I 20 waardoor er meer opgelost CO2 overgaat in de gasvorm en zo ontsnapt. Tevens veroorzaakt het perazijnzuur een penetrante lucht. Verder onderzoek met perazijnzuur is om deze redenen gestaakt. Uit de veldtesten met lysozym is gebleken dat deze sporadisch werkt. De Lysozym is, in de I concentratie (0.04%) waarin deze getest is, niet betrouwbaar. De invloed van I 25 lysozym op het waterbedschuim en waterbedvinyl is getest. Uit dit I onderzoek is gekomen dat lysozym geen meetbare invloed hierop heeft. Deze I uitvinding verschaft het inzicht dat door het toevoegen van een hoge I concentratie “goede” flora (microconcentraat) aan een waterbed, deze in I staat is de “slechte” flora te overgroeien zodat de concentratie hiervan 30 afneemt en dus ook de gas en stankproblemen. Als "goede" flora is in eerste 1 ü ] / J «Λ r\ instantie gekozen voor Chryseomonas luteola. Een microconcentraat met Chryseomonas luteola blijkt is opmerkelijk goed in staat te zijn om zich in een nieuw dan wel bestaand waterbedmilieu te handhaven en dus de “slechte” flora te overgroeien. Het vermindert de gas- en stankvorming en is 5 derhalve zeer geschikt als waterbed conditioner. REFERENTIES

10 Biemans et al. Fundamentele biologie, tweede druk, Bohn Stafleu Van Loghum, Houten, 1987. Madigan et al. Biology of microorganisms, achtste druk,Prentice Hall, USA, 1997. Knecht en Doornbos, Bacteriologie voor laboratorium en kliniek 1, 15 derde druk, Bohn Stafleu Van Loghum, Houten, 1995. Brooks et al. Medical Microbiology, twintigste druk, Appleton & Lange, 1995. Cappuccino and Sherman, Microbiology a laboratory manual, zesde druk, Benjamin Cunnings, 2001. 20 http://www2.austin.cc.tx.us/microbugz/labindex.html 1 022689 I CONCLUSIES Η 1. Werkwijze voor het selecteren van ten minste een eerste micro- organisme welke, indien toegevoegd aan een waterbed bevattend ten minste een tweede micro-organisme, in staat is om de hoeveelheid van ten minste het tweede micro-organisme aanwezig in het waterbed te beïnvloeden, 5 de werkwijze omvattende : - verkrijgen van ten minste een eerste micro-organisme, - verkrijgen van een monster bevattend ten minste een tweede micro- organisme, - bepalen van de hoeveelheid en de identiteit van het tweede micro- H 10 organisme in het monster - toevoegen van het eerste micro-organisme aan het monster, - incubatie van het monster onder condities waarbij het eerste micro- organisme groeit, - bepalen van de hoeveelheid en de identiteit van ten minste het tweede 15 micro-organisme in het monster na toevoeging van het ten minste eerste I organisme, - bepalen van het verschil in de hoeveelheid tweede micro-organisme in het I monster blootgesteld aan het eerste micro-organisme met de hoeveelheid I tweede micro-organisme in het monster voor blootstelling aan het eerste 20 micro-organisme, en - selecteren van ten minste een eerste micro-organisme welke in staat is om I de hoeveelheid van ten minste het tweede micro-organisme in het monster te beïnvloeden. I 25 2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij het eerste micro-organisme I een niet-fermenterend micro-organisme is. I m??Roo

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij het tweede micro-organisme een fermenterend micro-organisme is.

4. Werkwijze volgens een der conclusies 1-3, waarbij het eerste 5 micro-organisme in staat is om de hoeveelheid van ten minste het tweede micro-organisme in het monster te verlagen.

5. Werkwijze volgens een der conclusies 1-4, waarbij het tweede micro-organisme CO2, H2S of ammoniak kan produceren. 10

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1-5, waarbij het tweede micro-organisme een bacterie is behorend tot het genus waartoe Stafylococcus spp., Escherichia spp., Stenotrofomonas spp, Pasteurella spp. of Enterobacter spp. behoren. 15

7. Werkwijze volgens conclusies 1-6, waarbij het eerste micro-organisme een bacterie is behorend tot het genus waartoe Pseudomonas spp. of Chryseomonas spp. behoren.

8. Werkwijze voor het reguleren van de kwaliteit van water in een waterbed, ten minste omvattende het toevoegen van een eerste micro-organisme verkrijgbaar volgens een der conclusies 1-7 aan het waterbed.

9. Werkwijze voor het verkrijgen van een waterbed conditioner, ten 25 minste omvattende het selecteren van een eerste micro-organisme volgens een der conclusies 1-7.

10. Gebruik van ten minste een eerste micro-organisme verkrijgbaar volgens een werkwijze volgens een der conclusies 1-7 voor het reguleren van 30 de kwaliteit van water in een waterbed. 1 Π99 o ηΛ Η 11. Gebruik van een eerste micro-organisme volgens conclusie 10, waarbij het eerste micro*organisme in hoofdzaak onschadelijk is voor de mens.

12. Samenstelling van een container en ten minste een eerste micro- organisme verkrijgbaar volgens een werkwijze volgens een der conclusies 1- 7, en een gebruiksaanwijzing.

13. Samenstelling van een waterbed en ten minste een eerste micro- organisme verkrijgbaar volgens een werkwijze volgens een der conclusies 1-

14. Een container met ten minste een eerste micro-organisme I 15 verkrijgbaar volgens een werkwijze volgens een der conclusies 1-7, waarbij de container is voorzien van een opschrift waaruit blijkt dat de inhoud van de container als 'waterbed conditioner' gebruikt kan worden. 20 25 1. o o * λ λ