NL1020885C2

NL1020885C2 - Glutaminase, glutaminasegen, nieuw recombinant DNA en werkwijze voor de bereiding van glutaminase.

Info

Publication number: NL1020885C2
Application number: NL1020885A
Authority: NL
Inventors: Kenichiro Matsushima; Kotaro Ito; Yasuji Koyama
Original assignee: Kikkoman Corp
Priority date: 2001-06-21
Filing date: 2002-06-17
Publication date: 2004-10-05
Also published as: US20030040098A1; JP2003033183A; NL1020885A1; CN100408680C; US6919195B2; JP3904185B2; CN1394953A

Description

- 1 -

Registratienummer: 166713 EdH/KD/NdB 5

GLUTAMINASE. GLUTAMINASEGEN. NIEUW RECOMBINANT DNA EN WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN GLUTAMINASE

ACHTERGROND VAN DE UITVINDING 10 1. Gebied van de uitvinding

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een glutaminase, een glutaminasegen, een nieuw recombinant DNA en een werkwijze voor de bereiding van een glutaminase.

15 2. Beschrijving van de relevante techniek

Glutaminase is een enzym dat L-glutamine hydroly-seert tot ammoniak en L-glutaminezuur, een umamismaak-versterkende component (zoetstof). Glutaminase speelt een belangrijke rol in de voedselbewerkingsindustrie. Het is bij-20 voorbeeld bruikbaar bij de bereiding van sojasaus of die specerijen die worden geproduceerd door het enzymatisch hy-drolyseren van eiwitten. Glutaminase is geïsoleerd uit diverse soorten, en zijn enzymologische eigenschappen en genen zijn gerapporteerd (bijvoorbeeld in Japanse octrooi-25 publicatie (Kokoku) nr. 6-38748).

Bij de bereiding van sojasaus en de bereiding van specerijen met behulp van kojimout is het om glutaminase te verbeteren door middel van genetische modificatietechnieken en het enzym in grote hoeveelheid te produceren, van belang 30 het enzym uit de kojimout te verkrijgen.

Op deze wijze kan de kwaliteit van hydrloyse-producten van eiwitten (zoals sojasaus) gemakkelijk worden verbeterd en kunnen ze tegen lage prijzen worden geleverd.

35 SAMENVATTING VAN DE UITVINDING

Het doel van de onderhavige uitvinding is daarom te voorzien in een uit kojimout afkomstig glutaminase, een 1020885 - 2 - glutaminasegen, een nieuw recombinant DNA en een werkwijze voor de bereiding van glutaminase.

Na uitvoerig onderzoek en analyse zijn de onderhavige uitvinders erin geslaagd een uit Aspergillus sojae af-5 komstig glutaminasegen te isoleren en de structuur daarvan te bepalen, waarmee de onderhavige uitvinding was bereikt.

Volgens een eerste aspect wordt voorzien in een glutaminase volgens (a) of (b): (a) een eiwit omvattende een aminozuursequentie 10 getoond in SEQ ID NO: 2; (b) een eiwit dat een aminozuursequentie omvat met de deletie, substitutie of additie van één of meer aminozuren in vergelijking tot de aminozuursequentie van (a) , en dat glutaminaseactiviteit heeft.

15 Volgens een tweede aspect wordt voorzien in een glutaminasegen dat codeert voor een eiwit volgens (a) of (b) : (a) een eiwit omvattende een aminozuursequentie getoond in SEQ ID NO: 2; 20 (b) een eiwit dat een aminozuursequentie omvat met de deletie, substitutie of additie van één of meer aminozuren in vergelijking tot de aminozuursequentie van (a), en dat glutaminaseactiviteit heeft.

Volgens een derde aspect wordt voorzien in een 25 glutaminasegen omvattende een DNA volgens (a) of (b): (a) een DNA omvattende een basensequentie getoond in SEQ ID NO: 1; (b) een DNA dat onder stringente omstandigheden hybridiseert met het DNA dat de basensequentie van (a) om- 30 vat, en dat codeert voor een eiwit met glutaminaseactiviteit.

Volgens een vierde aspect wordt voorzien in een nieuw recombinant DNA, met het kenmerk dat het bovengenoemde glutaminasegen is ingebracht in vector-DNA.

35 Volgens een vijfde aspect wordt voorzien in een transformant of transductant die het bovengenoemde recombi-nante DNA bevat.

ΙΠολλ.

- 3 -

Volgens een zesde aspect wordt voorzien in een werkwijze voor de bereiding van een glutaminase, omvattende het kweken van de bovengenoemde transformant of transduc-tant op een kweekmedium, en het verzamelen van glutaminase 5 uit het kweekproduct.

BESCHRIJVING VAN UITVOERINGSVORMEN

De onderhavige uitvinding zal hierna in detail' worden beschreven.

10 1. Een glutaminase en een aen dat daarvoor codeert

Het glutaminase volgens de onderhavige uitvinding is een glutaminase volgens (a) of (b): (a) een eiwit omvattende een aminozuursequentie 15 getoond in SEQ ID NO: 2; (b) een eiwit dat een aminozuursequentie omvat met de deletie, substitutie of additie van één of meer aminozuren in vergelijking tot de aminozuursequentie van (a), en dat glutaminaseactiviteit heeft.

20 Het eiwit (a) kan worden verkregen door klonering van een natuurlijk voorkomend glutaminasegen dat afkomstig is uit een chromosomaal DNA of cDNA van een filamenteuze schimmel van het geslacht Aspergillus, gevolgd door inbren-ging van de kloon in een geschikt vector-gastheersysteem 25 voor expressie.

Zoals aangegeven in (b) kan dit eiwit een aminozuursequentie omvatten met de deletie, substitutie of additie van één of meer aminozuren in vergelijking tot de aminozuursequentie van (a), zolang de aminozuursequentie 30 maar glutaminaseactiviteit heeft. In de onderhavige uitvinding betekent "meer" gewoonlijk 2 tot 300, bij voorkeur 2 tot 170, liever 2 tot 50, en liefst 2 tot 10, afhankelijk van de positie van de aminozuurresten in de driedimensionale structuur van het glutaminase-eiwit, of van de soort 3 5 aminozuren.

Een dergelijk gemuteerd glutaminase, dat wil zeggen het eiwit (b), kan worden verkregen door een gemuteerd

1 Π 9 Π A A R

- 4 - I glutaminasegen te produceren door in de basensequentie van een natuurlijk voorkomend glutaminasegen een mutatie aan te I brengen zoals substitutie, deletie, insertie, additie of I inversie, en het voor expressie in te brengen in een ge- 5 schikt vector-gastheersysteem.

De werkwijzen voor het aanbrengen van de mutatie I in het gen omvatten bijvoorbeeld een plaatsspecifieke muta- genese, een werkwijze voor het induceren van willekeurige I mutatie met behulp van PCR, en een werkwijze waarmee het I 10 gen selectief wordt geknipt en vervolgens weer aan elkaar wordt gevoegd na verwijdering of toevoeging van gekozen nu- I cleotiden.

I Het glutaminasegen volgens de onderhavige uitvin- I ding is een gen dat een DNA bevat dat codeert voor het I 15 eiwit (a) of (b). Het glutaminasegen volgens de onderhavige I uitvinding kan een gen zijn dat onder stringente omstandig- I heden hybridiseert met een DNA dat codeert voor het eiwit I (a) of (b), en dat codeert voor een eiwit met glutaminase- activiteit. In de onderhavige uitvinding betekent "strin- I 20 gente omstandigheden" zodanige omstandigheden dat de na- I triumconcentratie 50 tot 300 mM en bij voorkeur 150 mM is, I en de temperatuur 42 tot 68°C en bij voorkeur 65°C is.

I Een voorbeeld van het gen dat het DNA bevat dat

codeert voor het eiwit (a) , is een DNA dat de met SEQ ID

I 25 NO: 1 aangegeven basensequentie bevat. Dit DNA is een na- I tuurlijk voorkomend glutaminasegen.

I Het natuurlijk voorkomende glutaminasegen kan wor- I den verkregen door klonering van een natuurlijk voorkomend gen afkomstig uit chromosomaal DNA of cDNA van een filamen- I 30 teuze schimmel van het geslacht Aspergillus. Werkwijzen I voor genklonering omvatten bijvoorbeeld een werkwijze waar- I bij na zuivering van glutaminase en bepaling van de gedeel- I telijke aminozuursequentie een ^geschikt probe-DNA wordt I gesynthetiseerd waarna chromosomaal cDNA van Aspergillus I 35 sojae wordt onderzocht met het probe-DNA. Een andere werk- I wijze behelst de productie van een geschikt primer-DNA op I basis van een gedeeltelijke aminozuursequentie, gevolgd - 5 - door amplificatie van een DNA dat fragmenten van het bovengenoemde gen bevat met een geschikte polymerase-ketting-reactie (PCR) zoals de 5'-RACE-werkwijze of 3'-RACE-werk-wijze, zodat de fragmenten aan elkaar worden gevoegd ter 5 verkrijging van een DNA dat het gen van volledige lengte bevat.

Specifiek kan het natuurlijk voorkomende glutami-nasegen als volgt worden verkregen. Eerst wordt Aspergillus sojae FERM BP-6820 gekweekt en wordt de verkregen bactβίο riële massa ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens fysisch gemalen met behulp van een mortier of iets dergelijks, waarmee fragmenten van de bacteriële massa in de vorm van een fijn poeder worden verkregen, waaruit op gebruikelijke wijze een uit compleet RNA bestaande fractie 15 wordt geëxtraheerd. Bij de extractieprocedure kan gebruik worden gemaakt van commercieel verkrijgbare RNA-extractie-kits.

Als alternatief kan uit het verkregen vloeibare RNA-extract een RNA worden verzameld met ethanolprecipita-20 tie, waarna op gebruikelijke wijze een RNA met een poly-A-keten kan worden gefractioneerd. Bij deze fractionerings-procedure kan gebruik worden gemaakt van een commercieel verkrijgbare oligo-dT-kolom.

Primers voor gebruik bij PCR worden gesyntheti-25 seerd aan de hand van de DNA-sequentie in SEQ ID NO: 1. Met dit primer-DNA en het op de boven beschreven wijze verkregen RNA wordt een DNA dat fragmenten van het gen bevat, ge-amplificeerd met een geschikte RT-PCR-reactie zoals de 5'-RACE-werkwijze en de 3'-RACE-werkwijze, en wordt door 30 het aan elkaar koppelen van deze fragmenten een DNA verkregen dat het gen van volledige lengte bevat. In de procedure voor synthese van gedeeltelijk cDNA met de 57-RACE-werkwijze en 3'-RACE-werkwijze kan gebruik worden gemaakt van commercieel verkrijgbare kits.

35 Onder gebruik van het bovenstaande cDNA als tem plate wordt PCR uitgevoerd met de aan de 5' -eindstandige sequentie en de 3'-eindstandige sequentie complementaire 1 Πο η Ω α H gesynthetiseerde primers, waarmee het DNA wordt geamplifi- ceerd. Het geamplificeerde DNA kan worden gekloneerd vol- I gens gebruikelijke werkwijzen.

Het geamplificeerde DNA wordt in een geschikte I 5 vector gebracht ter verkrijging van een recombinant DNA.

I Voor klonering kan een commercieel verkrijgbare kit zoals I TA Cloning Kit (Invitrogen Corporation), kunnen commercieel verkrijgbare plasmidevector-DNA's zoals pUC119 (Takara Shu- I zo Co., Ltd.), pBR322 (Takara Shuzo Co., Ltd.) en pBlue- I 10 script SK+ (Stratagene) en kan een commercieel verkrijgbaar bacteriofaagvector-DNA zoals λ EMBL3 (Stratagene) of iets I dergelijks worden gebruikt.

I Door gebruik van het zo verkregen recombinante I DNA wordt een transformant of een transductant verkregen I 15 door transformatie of transductie van Escherichia coli I K-12, bij voorkeur bijvoorbeeld Escherichia coli JM109 (Ta- I kara Shuzo Co., Ltd.), of XL-Blue (Stratagene). De trans- formatie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met de werkwij- I ze van D.M. Morrison (Methods in Enzymology,_68, 326-331, 20 1979) . Anderzijds kan de transductie bijvoorbeeld worden uitgevoerd met de werkwijze van B. Hohn (Methods in Enzymo- I logy, 68, 299-309, 1979). Als gastheercel kunnen behalve I Escherichia coli andere micro-organismen zoals bacteriën, I gisten, filamenteuze schimmels en actinomyceten en dierlij- I 25 ke cellen worden gebruikt.

I De gehele basensequentie (zie SEQ ID NO: 1) van I het aldus geamplificeerde DNA kan bijvoorbeeld worden ge- I analyseerd met een Li-COR MODEL 4200L Sequencer (betrokken I van ALOKA CO., LTD.), 370DNA Sequence System (PerkinElmer I 30 Inc.), of CEQ2000XL DNA Analysis System (Beekman Coulter).

I Door vergelijking van de basensequentie met informatie over I de gedeeltelijke aminozuursequentie kan worden vastgesteld I of het natuurlijk voorkomende glutaminasegen is verkregen of niet.

I 35 Door analyse van het natuurlijk voorkomende gluta- I minasegen kan de aminozuursequentie van het getranslateerde I polypeptide, dat wil zeggen het eiwit (a), worden bepaald.

- 7 - 2. Werkwijze voor de bereiding van glutaminase

Bij de bereiding van het glutaminase volgens de onderhavige uitvinding wordt eerst een recombinant DNA geproduceerd dat het glutaminasegen bevat. Een transformant 5 of transductant die dat recombinante DNA bevat, wordt vervolgens geproduceerd en gekweekt en uit het kweekproduct kan glutaminase worden verzameld.

Om het eiwit met glutaminaseactiviteit te bereiden door gebruik van het glutaminasegen volgens de onderhavige 10 uitvinding, is het noodzakelijk een geschikt vector-gast-heersysteem te kiezen. Als een dergelijk systeem kan bijvoorbeeld worden genoemd een systeem van pST14 (ünkles et al., 1989, Mol. Gen. Genet., 218, 99-104) en een filamen-teuze schimmel (Aspergillus sojae, Aspergillus oryzae, As-15 pergillus nidulans, Aspergillus niger, Penicillium chryso-genum, etc.) , een systeem van een gistexpressievector pYES2 (Invitrogen) en de gist Saccharomyces cerevisiae, en een systeem van een Escherichia coli-expressievector pTE (Stra-tagene) en Escherichia coli. Het heeft de voorkeur een sys-20 teem van een filamenteuze schimmel of gist te gebruiken waarin suikerketens aan het eiwit worden toegevoegd.

Het recombinante DNA kan worden verkregen door insertie van het glutaminasegen in een geschikte vector. Als de vector kunnen commercieel verkrijgbare producten 25 worden gebruikt, zoals bijvoorbeeld gistexpressievectoren pYES2, pYDl (Invitrogen), pUR123 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pYEX-BX , pYEX-Sl, pYEX-4T (CLONTECH) , Escherichia coli-ex-pressievector pSET (Invitrogen) en pTE (Stratagene).

Daarna wordt het recombinante DNA getransformeerd 30 of getransduceerd in een gastheercel. De transductie in gist kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd met de werkwijze van Becker DM et al. (Methods in Enzymology, 194, 182-187, 1991). Als gastheercel kunnen behalve Escherichia coli en gist micro-organismen zoals andere bacteriën, filamenteuze 35 schimmels en actinomyceten of dierlijke cellen worden gebruikt .

1 fi o n q o c I - 8 - H Zo wordt een transformant of transductant met het vermogen tot glutaminaseproductie verkregen. Hoewel de transformant of transductant kan worden gekweekt met de ge- bruikelijke werkwijzen met vast kweekmedium, heeft het de 5 voorkeur zo veel mogelijk gebruik te maken van vloeibare kweek.

I Wanneer een gist als gastheer wordt gebruikt, kun- nen algemene eutrofe media zoals YPD-media en YM-media wor- den gebruikt. Wanneer een selectief medium wordt gebruikt 10 met het oog op de genetische eigenschappen van de gastheer, I kan een SD-medium worden gebruikt, wat een minimaal medium I is. Wanneer het selectieve medium wordt gebruikt, worden, omdat de selectiedruk verschilt afhankelijk van het ge- bruikte gastheer-vectorsysteem, bijvoorbeeld aminozuren of I 15 nucleïnezuren anders dan de selectiedruk aan het minimale I medium toegevoegd, naar behoefte in overeenstemming met de I genetische eisen van de gastheer.

I Daarnaast kunnen naar behoefte anorganische zou- I ten, saccharidematerialen, vitaminen etc. aan het medium I 20 worden toêgevoegd. De aanvankelijke pH van het medium wordt I op geschikte wijze bijgesteld tot 6 tot 9. Afhankelijk van I de gebruikte vector kan de expressie van het eiwit worden I gereguleerd. Bij gebruik van een dergelijke vector kan I glutaminase worden geïnduceerd door toevoeging van een voor I 25 de vector geschikte inductor, zoals galactose of koperio- nen.

I Voor het kweken van de gist moeten bij voorkeur I werkwijzen gebruikt worden zoals een ondergedompelde kweek I met beluchting-roeren, schudkweek, statische kweek etc. bij I 30 temperaturen van 25 tot 35°C, bij voorkeur bij ongeveer I 30°C, gedurende 24 tot 48 uur.

I Het tot expressie gebrachte glutaminase kan worden I gezuiverd met een gedeeltelijk gemodificeerde versie van de I werkwijze beschreven in Japanse terinzagelegging (Kokai) I 35 11-332553.

I In het geval van gist wordt nadat de getransfor- I meerde gist is gekweekt met de bovengenoemde geschikte - 9 - werkwijze, de kweekoplossing gecentrifugeerd ter verkrijging van een gistmassa. Nadat de celwand in voldoende mate is gelyseerd door toevoeging van een celwand-lyserend enzym aan de gistmassa, wordt door middel van centrifugati'e een 5 bovenstaande vloeistof verkregen. Vervolgens wordt ammo-niumsulfaat aan de bovenstaande vloeistof toegevoegd voor uitzouten, waarna de vloeistof nogmaals wordt gecentrifugeerd ter verwijdering van onoplosbare eiwitten, waarmee een ruwe enzymoplossing wordt verkregen die glutaminase 10 bevat.

Uit de ruwe enzymoplossing wordt een fractie met glutaminaseactiviteit gezuiverd met behulp van een fenyl-Sepharosekolom, DEAE-Sepharosekolom, een gelfiltratiekolom en HPLC, waarmee een gezuiverd glutaminase wordt verkregen. 15 De genetische modificatiewerkwijze volgens de on derhavige uitvinding kan worden uitgevoerd volgens de beschrijvingen in bijvoorbeeld "Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2e editie" (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-8769-309-6 en "Current Protocols in 20 Molecular Biology" (1989), John Wiley & Sons, Inc., ISBN 0-471-50338-X.

VOORBEELDEN

De onderhavige uitvinding zal hierna meer in de-25 tail worden beschreven aan de hand van voorbeelden.

VOORBEELD 1: VERKRIJGING VAN EEN GLUTAMINASE-cDNA

(1) Zoeken van een homoloog qlutaminaseqen in een bacterie van het geslacht Aspergillus 30 Na het doorzoeken van de kojischimmel-EST-biblio- theek van het International Patent Organism Depositary bij het National Institute of Advanced Science and Technology op een gen dat in hoge mate homoloog is met een bekend glu-taminasegen afkomstig uit Cryptococcus (Japanse octrooi-35 aanvrage 2000-270371) werd een EST-kloon Contig Mix0010110003775_l van 711 basen verkregen. Verondersteld 1020885 - 10 - werd dat de kloon een fragment van het glutaminasegen was en een cDNA van het gen werd gekloneerd.

Extractie van het complete RNA uit Aspergillus soiae 5 Sporen van Aspergillus sojae FERM BP-6820 werden geïnoculeerd in 50 ml van een sojapoedermedium (3% soja-poeder, 1% KH2P04> pH 6,0) tot een dichtheid van 3xl05/ml en de sporen werden 48 uur bij 30°C gekweekt in een Erlen-meyer-kolf van 150 ml onder schudden met 150 rpm.

10 De zo verkregen kweekoplossing werd gefiltreerd door Miracloth (Calbiochem) om zo een bacteriemassa te verzamelen. Na wassen van de verzamelde bacteriën met gesteriliseerd water werd de bacteriemassa ingevroren in vloeibare stikstof en vervolgens fysisch gemalen in een mortier, 15 waarmee fijn verpoederde bacteriële fragmenten werden verkregen. Uit de bacteriële fragmenten werd een compleet RNA geëxtraheerd met behulp van ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd.). De gehele procedure werd uitgevoerd volgens het bijgevoegde protocol.

20 (2) Verkrijging van een crlutaminase-cDNA met de RACE-werk-wii ze

Uit ongeveer 200 μg van het aldus verkregen complete RNA werd 4 μg mRNA verkregen onder gebruik van de 25 Oligotex-dT30<Super> mRNA Purification Kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). Van het mRNA werd 1 μg onderworpen aan 5'-RACE en 37-RACE uitgevoerd door gebruik van de Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech) en Advantage cDNA PCR kit (Clon-tech). Als primers voor de RACE-werkwijze werden oligo-30 DNA's gesynthetiseerd, respectievelijk weergegeven als SEQ ID NO: 3-6, te weten antisense primers (SEQ ID NO: 3 en 4) voor de EST-kloon CONTIG MIX0010110003775JL voor de 5'-RACE, en sense primers (SEQ ID NO: 5 en 6) voor het uitvoe-ren van de 3'-RACE. De gehele procedure werd uitgevoerd 35 volgens het bijgevoegde protocol. Als PCR-inrichting werd het GeneAmp5700 DNA-detectiesysteem (PerkinElmer) gebruikt. Als resultaat werd amplificatie van ongeveer 1,7 kb van een - 11 - DNA-fragment overeenkomend met het 5'-gebied van glutamina-se-cDNA en ongeveer 0,8 kb van een DNA-fragment overeenkomend met het 3'-gebied bevestigd.

De geamplificeerde DNA-fragmenten werden geschei-5 den op een 0,7% agarosegel en geëxtraheerd met behulp van de QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN) . De procedure was in overeenstemming met het bijgevoegde protocol. Het geëxtraheerde DNA-fragment werd ingebouwd in een pCR2.1-TOPO-vector door gebruik van de TOPO TA Cloning Kit (Invi-10 trogen). Het verkregen recombinante plasmide werd onderworpen aan een sequencing-reactie door gebruik van de Thermo Sequence Cycle Sequencing Kit (Amersham Pharmacia Biotech) en de basensequentie werd bepaald met de LI-COR MODEL4200L sequencer (betrokken van Aloka) . Als resultaat werd de 15 DNA-sequentie bepaald van een open leeskader (ORF) van ongeveer 1,9 kb aangegeven met SEQ ID NO: 1, en het werd duidelijk dat de EST-kloon CONTIG MIX0010110003775_1 een deelfragment daarvan was.

Dit DNA codeerde voor een eiwit van 643 amino-20 zuren. Deze aminozuursequentie is beschreven in SEQ ID NO: 2. Verder werd met betrekking tot deze aminozuursequentie een homologieonderzoek uitgevoerd op een bekende aminozuur-sequentie-database. Voor het homologieonderzoek werd NCBI BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) gebruikt. Het 25 resultaat was dat er geen bekend eiwit was dat overeenkwam met het bovengenoemde ORF.

Wanneer echter een homologieonderzoek werd uit-gevoerd met betrekking tot een glutaminase afkomstig uit Cryptococcus albidus en Cryptococcus nodaensis, werd homo-30 logie vastgesteld in een gebied dat naar verwachting een actief centrum is, hetgeen suggereerde dat het glutaminase werd gecodeerd door het ORF.

PCR werd uitgevoerd door als template gebruik te maken van het cDNA dat was geproduceerd tijdens een 35 5'-RACE, waardoor het cDNA van volledige lengte van gluta minase werd gekloneerd. Als primer werd gebruik gemaakt van oligo-DNA, aangegeven met SEQ ID NO: 7 en 8. Het verkregen

1nonftKS

I - 12 - I geamplificeerde DNA-fragment van ongeveer 2,1 kb werd ge- extraheerd met de bovengenoemde werkwijze en ingebouwd in I de pCR2.1-TOPO-vector onder gebruik van de TOPO TA Cloning I Kit (Invitrogen), waarmee een recombinant plasmide pASgln I 5 werd verkregen dat het cDNA van volledige lengte van gluta- I minase bevatte.

De basensequentie van het recombinante plasmide I pASgln werd opnieuw geanalyseerd ter bepaling van de basen- I sequentie van het glutaminase-cDNA (SEQ ID NO: 1).

I 10 Het glutaminase-cDNA van volledige lengte, dat wil I zeggen het plasmide pASgln met daarin de basensequentie I aangegeven met de basenummers 1 tot 1932 van SEQ ID NO: 1, is bij de International Patent Organism Depositary bij het .

I National Institute of Advanced Science and Technology I 15 gedeponeerd als FERM BP-7634.

I VOORBEELD 2: EXPRESSIE VAN GLUTAMINASE-cDNA

Het bovengenoemde plasmide pASgln werd onderworpen I aan een enzymbehandeling met de restrictie-enzymen BamHI en I 20 Sphl (beide van Takara Shuzo Co., Ltd.). Vervolgens werd I het onderworpen aan elektroforese op een 0,7% agarosegel.

I Daarna werden DNA-fragmenten van een gewenste grootte (on- geveer 2,0 kb) uitgesneden en gezuiverd.

I Deze DNA-fragmenten werden ingebouwd in een gist- I 25 expressievector pYES2 (Invitrogen) die was onderworpen aan I een enzymbehandeling met het bovengenoemde restrictie-en- I zym, om zo een recombinant plasmide pYES-ASgln te produce- I ren. Dit recombinante plasmide is in staat tot inductie van I de expressie van glutaminase als doeleiwit. Als gastheer I 30 werd de bijgevoegde INVScl (Genotype: MATa, his3Al, leu2, I trpl-289, ura3-52/MATa, his3Al, leu2, trpl-289, ura3-52) gebruikt en de gastheergist werd getransformeerd met het bovengenoemde plasmide pYES-ASgln met de lithiumacetaat- I werkwijze. Als selectief medium werd gebruik gemaakt van I 35 0,67% Yeast Nitrogenbase zonder aminozuren (Difco), 2% raf- I finose (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd) en 0,192% I Yeast Synthetic Dropout Medium Supplement zonder uracil - 13 - (SIGMA). De lithiumacetaatwerkwijze werd uitgevoerd volgens de beschrijving in "Tanpakushitsu Jikken Purotokoru-Kino

Kaiseki-hen—" ("Protein Experiment Protocol — Function Analysis—") (Supplement bij het tijdschrift Saibo Kogaku 5 (Cell Technology; Shujun-sha).

Daarna werd de verkregen transformant gebruikt om een eiwit tot expressie te brengen volgens het bij de pYES2-vector (Invitrogen) gevoegde protocol. De transformant werd uit een kolonie overgezet in 20 ml van het selec-10 tieve medium onder gebruik van een Erlenmeyerkolf van 200 ml met oneffenheden, en ongeveer 14 uur bij 30°C gekweekt onder schudden met 140 rpm, waarmee een entkweek werd verkregen.

De troebelheid (OD600) van de entkweek werd ver-15 volgens gemeten, en de entkweek werd geinoculeerd in een eiwitexpressie-inducerend medium, zodanig dat de aanvankelijke troebelheid OD600 0,4 was. Voor het kweken in het eiwitexpressie-inducerende medium werd een Sakaguchi-kolf van 500 ml gebruikt, en er werd een schudkweek uitgevoerd 20 in 50 ml van het medium bij 30°C, 140 rpm. Als eiwitexpressie-inducerend medium werd gebruik gemaakt van 1% gistex-tract (Difco), 2% Poly Pepton (Nippon Seiyaku K.K.), 1% raffinose en 2% galactose (beide SIGMA). De gecentrifugeerde en verzamelde gistmassa werd gesuspendeerd in gedestil-25 leerd water en geleverd als enzymoplossing.

Glutaminaseactiviteit werd gemeten met een gedeeltelijk gemodificeerde versie van de werkwijze beschreven in Japanse terinzagelegging (Kokai) 11-332553. Specifiek werd 500 μΐ 0,2 M fosforzuurbufferoplossing (pH 6,5) en 500 μΐ 30 van de enzymoplossing toegevoegd aan 250 μΐ 2% (W/V) L-glu-tamineoplossing en men liet dit 30 minuten bij 37°C reageren. De reactie werd gestopt door toevoeging van 250 μΐ 0,75 N perchloorzuuroplossing, en de reactieoplossing werd geneutraliseerd door toevoeging van 125 μΐ 1,5 N natriumhy-35 droxideoplossing. Deze reactieoplossing werd gecentrifugeerd (10.000 rpm, 10 minuten) en aan 100 μΐ van de bovenstaande vloeistof werd 1,0 ml 0,1 M hydroxylamine-hydro- inon ft R5 - 14 - chloridebufferoplossing (pH 8,0), 1,0 ml 20 tnM NAD+-oplos-sing (Oriental Yeast Co., Ltd.) en 50 μΐ 500 eenheden/ml L-glutaminezuurdehydrogenaseoplossing (SIGMA) toegevoegd. Men liet de supernatantoplossing 30 minuten bij 37°C reage-5 ren en de absorptie bij 340 nm werd gemeten met een spec-trofotometer. Onder deze omstandigheden werd één eenheid (U) glutaminaseactiviteit gedefinieerd als de hoeveelheid enzym die 1 μχαοί glutaminezuur per minuut genereert.

Het resultaat van de meting van glutaminaseactivi-10 teit van de transformant wordt getoond in tabel 1. De waarden in de tabel geven de glutaminaseactiviteit aan per 1 ml van de kweekvloeistof (mü/ml) 24 uur na de start van de kweek (OD600=15) . De aanduiding "pYES2" geeft de transformant met het plasmide pYES2 aan, en de aanduiding 15 "pYES-ASgln" geeft de transformant met plasmide pYES-ASgln aan. De symbolen en " + " wijzen respectievelijk op in ductie door een niet-eiwitexpressie-inducerend medium zonder galactose en door een eiwitexpressie-inducerend medium met galactose.

20

Tabel 1

Plasmide/galactose - + pYES2 0,33 2,50 pYES-ASgln 4,64 32,87 25

Bij kweken op het eiwitexpressie-inducerende medium met galactose had de transformant met het plasmide pYES-ASgln een hogere glutaminaseactiviteit dan de transformant met het plasmide pYES2. Anderzijds vertoonde bij 30 kweken in het niet-eiwitexpressie-inducerende medium zonder galactose de transformant met het plasmide pYES-ASgln geen verhoging van glutaminaseactiviteit. Dit wees erop dat de glutaminaseactiviteit van de transformant met het plasmide pYES-ASgln afkomstig was van het ingebrachte glutaminasegen 35 (tabel 1) . Ook wanneer de INVScl werd gebruikt als de gastheer voor expressie van glutaminase, werd de glutaminase- - 15 - activiteit tot expressie gebracht op het oppervlak van de gistmassa, zoals in het geval van de bacterie van het geslacht Aspergillus.

Volgens de onderhavige uitvinding kan glutaminase 5 dus efficiënt worden bereid. De onderhavige uitvinding heeft daarom een grote industriële toepasbaarheid.

Claims

1. Glutaminase volgens (a) of (b): I 10 (a) een eiwit omvattende een aminozuursequentie getoond in SEQ ID NO: 2; I (b) een eiwit dat een aminozuursequentie omvat met I de deletie, substitutie of additie van één of meer amino- I zuren in vergelijking tot de aminozuursequentie van (a), en 15 dat glutaminaseactiviteit heeft.

2. Glutaminasegen dat codeert voor een eiwit I volgens (a) of (b): I (a) een eiwit omvattende een aminozuursequentie I getoond in SEQ ID NO: 2; I 20 (b) een eiwit dat een aminozuursequentie omvat met I de deletie, substitutie of additie van één of meer amino- I zuren in vergelijking tot de aminozuursequentie van (a), en dat glutaminaseactiviteit heeft.

3. Glutaminasegen omvattende een DNA volgens (a) I 25 of (b) : (a) een DNA omvattende een basensequentie getoond I in SEQ ID NO: 1; (b) een DNA dat onder stringente omstandigheden hybridiseert met het DNA omvattende de basensequentie van I 30 (a) , en dat codeert voor een eiwit met glutaminaseactivi- teit.

4. Nieuw recombinant DNA met het kenmerk, dat het glutaminasegen volgens conclusie 2 of 3 is ingebracht in H vector-DNA.

5. Transformant of transductant die het recombi- nante DNA volgens conclusie 4 bevat. -17-

6. Werkwijze voor de bereiding van glutaminase, omvattende: het kweken van de transformant of transductant volgens conclusie 5 op een kweekmedium, en 5 het verzamelen van glutaminase uit het kweek- product. ***** 1 n ? n a η s