NL1019317C2 - Detectie van een geladen deeltje. - Google Patents

Description

Titel: Detectie van een geladen deeltje

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze, een sensor-oppervlak, en een instrument voor de detectie van een geladen deeltje in een vloeistof met behulp van brekingsindexverandering te weeg gebracht door het genoemde deeltje.

5 Brekingsindexdetectie is een veel toegepaste techniek. Hierbij laat men in het algemeen een vloeistof waarin te detecteren deeltjes zijn opgelost door een detector stromen, waarbij de brekingsindexverandering ten gevolge van het deeltje in de oplossing gemeten wordt. Een dergelijke techniek is in hoge mate universeel toepasbaar voor uiteenlopende soorten deeltjes, 10 hetgeen enerzijds een voordeel is, maar anderzijds leidt tot een beperkt onderscheidend vermogen tussen verschillende soorten deeltjes. Bovendien laat de detectielimiet van brekingsindexdetectie soms te wensen over.

Een sensoroppervlak voor de specifieke detectie van bepaalde biomoleculen middels brekingsindexdetectie is bekend uit het Amerikaanse 15 octrooischrift 5,242,828. Dit oppervlak omvat liganden (zoals antilichamen) die via een organische monolaag en een polymeermatrix aan een metaaloppervlak gebonden zijn. De polymeermatrix waaraan de liganden gebonden worden, bevat reactieve groepen zoals hydrazide- en carboxy-methylgroepen. De carboxymethylgroepen kunnen in een vloeistof met een 20 lage ionsterkte als een zwakke ionenwisselaar een ionogene binding aangaan met bepaalde opgeloste liganden, zoals eiwitten en peptiden, waarna deze liganden via de hydrazidegroep covalent gebonden kunnen worden aan de polymeermatrix. Dergelijke liganden binden specifiek bepaalde te detecteren eiwitten of andere biomoleculen, zonder interactie te 25 vertonen met andere moleculen. De brekingsindexverandering die optreedt bij binding van zo’n molecuul kan vervolgens worden gemeten met behulp van oppervlakte plasmon resonantie (SPR), welke techniek bekend is uit H. Raether (1977), Physics of Thin Films, Ed Hass G, Francombe M and Hoffman R, Academie Press New York, pp 145-261, en uit V. Silin and A.

2

Plant, Biotechnical applications of surface plasmon resonance, Elsevier Science Ltd., 15, 353-359 (1997).

Er is nu gevonden dat geladen deeltjes gedetecteerd kunnen worden door ze tijdelijk te immobiliseren met behulp van een 5 ionenwisselaar die gebonden is aan een sensoroppervlak, waarbij de aan het sensoroppervlak gemeten brekingsindexverandering gebruikt kan worden voor de detectie van het deeltje.

De onderhavige uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het detecteren van een deeltje door het meten van de 10 brekingsindex aan een sensoroppervlak, op welk sensoroppervlak een ionenwisselaar is aangebracht voor binding van het deeltje, waarbij het sensoroppervlak deel uitmaakt van een detectiecel, welke detectiecel is voorzien van middelen om de brekingsindexverandering ten gevolge van de aanwezigheid van het deeltje te bepalen, welke werkwijze de volgende 15 stappen omvat: • het laten stromen van een monster, dat al dan niet te detecteren deeltjes bevat, langs het sensoroppervlak onder condities waarbij een of meer te detecteren deeltjes geïmmobiliseerd worden op de ionenwisselaar, • het veranderen van de condities zodat tenminste een aantal van de 20 deeltjes -indien aanwezig - gemobiliseerd worden, • het verwijderen van de gemobiliseerde deeltjes van het sensoroppervlak, en • het meten en registreren van de veranderingen in de brekingsindex.

25 De onderhavige uitvinding heeft voorts betrekking op een sensoroppervlak voor gebruik in een werkwijze volgens de uitvinding voor de detectie van een geladen deeltje in een vloeistof, welke vloeistof kan stromen langs een zijde van het sensoroppervlak waarop een ionenwisselaar is aangebracht voor reversibele binding van het deeltje.

3

Met een reversibele binding van een deeltje aan een ionenwisselaar wordt hierin een binding bedoeld die verbroken kan worden onder invloed van de juiste condities, bijvoorbeeld door de ionenwisselaar waaraan het deeltje is gebonden in contact te brengen met een vloeistof waarvoor het 5 deeltje een grotere affiniteit heeft dan voor de ionenwisselaar. Hierop zal hierna verder worden ingegaan.

De uitvinding blijkt uitermate geschikt te zijn voor de detectie van allerlei verschillende deeltjes in één monster, zoals verschillende zuren of diverse polymeren met een verschillend molecuulgewicht. Behalve de meer 10 universele toepasbaarheid is het ionenwisselende materiaal in een sensoroppervlak of werkwijze volgens de uitvinding veel goedkoper dan antilichamen en andere eiwitten die als receptoren voor de binding van een biomolecuul kunnen dienen in bekende SPR technieken. Bovendien is gevonden dat middels de uitvinding scheiding en detectie van verschillende 15 deeltjes gecombineerd kunnen worden, waardoor de uitvinding zowel een in hoge mate universele detectie van geladen deeltjes als detectie met een groot onderscheidend vermogen biedt, hetgeen onder andere zeer grote economische voordelen biedt.

Voorts biedt de uitvinding de mogelijkheid om ‘on-line’ de te 20 detecteren deeltjes te concentreren en/of te scheiden van de monstermatrix. Hierdoor kan monstervoorbereiding in veel gevallen vereenvoudigd worden, bijvoorbeeld omdat er geen aparte extractiestap, voorafgaand aan de analyse, nodig is. In tegenstelling tot een normale brekingsindexdetector biedt de uitvinding de mogelijkheid componenten in een monster (analyten) 25 selectief aan te tonen.

Zeer geschikte wijzen om de brekingsindex te bepalen zijn detectie-wijzen die gebaseerd zijn op het principe van evanescent veld metingen en in het bijzonder oppervlakte plasmon resonantie (SPR) en Mach Zehnder Interferometrie.

4

De uitvinding blijkt bijzonder geschikt voor de detectie van allerlei synthetische en/of in de natuur voorkomende geladen deeltjes, zoals organische zuren, basen, aminozuren, monomeren met een of meer geladen groepen, oligomeren met een of meer geladen groepen en polymeren met een 5 of meer geladen groepen. Voorbeelden van dergelijke geladen groepen zijn carboxy-, amino-, fosfaat- en sulfaatgroepen. De uitvinding is onder andere zeer geschikt bevonden voor het detecteren van geladen deeltjes met een relatief laag molecuulgewicht vanaf ongeveer 100 g/mol of hoger zoals hexaandiamine, capronzuur, aminocapronzuur en dergelijke maar ook voor 10 het detecteren van polymeren, bijvoorbeeld van polyester met carboxylgroepen, in het bijzonder een polyester met carboxyleindgroepen. Hierna zullen molecuulgewichten van polymeren met het aantalsgewichtsgemiddelde worden aangeduid.

Een detectiecel volgens de uitvinding is niet alleen geschikt voor de 15 detectie van deeltjes met een hoge lading/massa-verhouding maar ook voor deeltje met een relatief lage lading/massa-verhouding. De uitvinding kan bijvoorbeeld worden toegepast voor het detecteren van een of meer deeltjes met een lading/massa verhouding in het bereik van ongeveer 1 lading per 100 g/mol tot ongeveer 1 lading per 500 kg/mol of van ongeveer 1 lading per 20 500 g/mol tot ongeveer 1 lading per 250 kg/mol. Zeer goede resultaten zijn ook bereikt voor het detecteren van verschillende deeltjes met een lading/massa verhouding in het bereik van ongeveer 1 lading per 1 kg/mol tot ongeveer 1 lading per 10 kg/mol.

De grootte van het sensoroppervlak is niet bijzonder kritisch.

25 Afhankelijk van de hoeveelheid monster, de doorstroomsnelheid en dergelijke kan deze worden aangepast. In een voorkeursuitvoeringsvorm omvat de detectiecel een sensoroppervlak van ongeveer 0,3-3 mm2 bij grote voorkeur ongeveer 1-2 mm2, bijvoorbeeld ongeveer 1,5 mm2 Het oppervlak is bij voorkeur in hoofdzaak vlak.

5

Het detectiecelvolume ten opzichte van het detectieceloppervlak is bij voorkeur relatief klein, bijvoorbeeld 0.1 tot 0.3 mm3/mm2, hetgeen in een detectiecel waarbij het monster in een vlakke laag langs het sensoroppervlak stroomt overeenkomt met een laagdikte van de over het 5 sensoroppervlak stromende vloeistof van 100 tot 300 pm. In een dergelijke uitvoeringsvorm is gevonden dat de interactie tussen ionenwisselaar en het geladen deeltjes zeer gunstig is.

Als detectiecel voor gebruik in een werkwijze volgens de uitvinding kan bijvoorbeeld een commercieel verkrijgbare detectiecel worden gebruikt. 10 Zoals een SPR chip van Biacore (Biacore AB, Zweden) of een Spreeta chip (Texas Instruments). Gedetailleerde tekeningen van een systeem met een SPREETA cell zijn weergegeven in figuur 2a-2e.

Het sensoroppervlak kan al voorzien zijn van een geschikt ionen-wisselingsmateriaal, zoals de Biacore CM 5, of het ionenwisselingsmateriaal 15 kan hierop worden aangebracht, bijvoorbeeld zoals hierna is beschreven.

De ionenwisselaar kan worden gekozen uit bekende soorten ionenwisselaars. De keuze van de ionenwisselaar hangt mede af van de aard van de te detecteren deeltjes. Zeer geschikt is een ionenwisselaar op basis van een cellulose, dextraan of een ander polysaccharide dat gederivatiseerd is 20 tot een polymeer met functionele groepen, die reversibel anionen of kationen kunnen binden. Bereidingswijzen voor dergelijke ionenwisselaars zijn bijvoorbeeld bekend uit E.A. Peterson, cellulosic ion exchangers, Chapter 1,2,3,4, pages 228-286, North-Holland, Amsterdam-London, 1970; uit Ayers, US patent 4,175,183, Hydroxylated cross-linked regenerated cellulose and 25 method of preparation thereof (1979) en uit Porath J. Arkiv Kemi, Some cellulose ion exchangers of low substitution and their chromatographic application, Arkiv Kemi, 11 (1957) 97-106.

Het type functionele groep kan worden gekozen uit de bekende functionele groepen met anionen- dan wel kationenwisselende capaciteit. Bij 30 voorkeur omvat de detectiecel een ionenwisselaar waarvan de functionele 6 groepen, verkregen kunnen worden door middel van nucleofiele substitutie. Zeer geschikt voor de detectie van een negatief geladen deeltje is een ionenwisselaar welke aminogroepen en/of ammonium groepen omvat, zoals een sterk basische anionenwisselaar waarvan een of meer actieve groepen 5 weergegeven kunnen worden met een van de volgende formules: -R4-N+RiR2R3 (Ia) of -N+RiR2Rs (Ib) waarin R4 (in formule Ia), respectievelijk N (in formule Ib) 10 verbonden is met de stationaire fase, waarin R] ,R2, R3 gebonden zijn aan het stikstof en onafhankelijk gekozen zijn uit de groep gevormd door waterstof, alkylgroepen, alkylamines en hydroxyalkylgroepen, waarbij de alkylgroepen, alkylamines en/of hydroxyalkylgroepen bij voorkeur 1-8 koolstof atomen, bij grotere 15 voorkeur 1-4 koolstofatomen bevatten. Bij bijzondere voorkeur worden Ri ,R2, R3 gekozen uit de groep gevormd door -CH3, -CH2-CH3, en -CH3-C2H4OH.

waarin R4 in formule la bij voorkeur een alkylgroep is, bij grotere voorkeur een alkylgroep met 1-6 koolstofatomen en bij bijzondere voorkeur 20 een alkylgroep met 1 of 2 koolstofatomen.

Een bijzondere voorkeur heeft een ionenwisselaar die tertiaire aminegroepen en/of quaternaire ammoniumgroepen volgens formule Ia of Ib omvat.

Zeer goede resultaten zijn voorts behaald met een ionenwisselaar 25 waarbij R] ,R2 en R3 identieke groepen zijn.

Voor de detectie van een positief geladen deeltje is gevonden dat een ionenwisselaar die fosfaatgroepen, carboxylgroepen, bijvoorbeeld carboxymethylgroepen, SO3' en/of sulfalkylgroepen of een combinatie daarvan omvat, zeer geschikt is. De alkylgroep van de sulfalkylgroepen 30 omvat bij voorkeur 1-6 koolstof atomen. Sulfethylgroepen hebben een 7 bijzondere voorkeur. Bereidingswijzen voor dergelijke ionenwisselaars zijn bijvoorbeeld bekend uit E.A. Peterson, cellulosic ion exchangers, Chapter 1,2,3,4, pages 228-286, North-Holland, Amsterdam-London, 1970; uit Ayers, US patent 4,175,183, Hydroxylated cross-linked regenerated cellulose and 5 method of preparation thereof (1979) en uit Porath J. Arkiv Kemi, Some cellulose ion exchangers of low substitution and their chromatographic application, Arkiv Kemi, 11 (1957) 97-106.

Een gederivatiseerd polysaccharide of een synthetisch polymeer met een gemiddelde molecuulgewicht in het bereik van de conventioneel 10 toegepaste verknoopte polysacchariden of synthetische polymeren in ionenwisselaars (bijvoorbeeld circa 500 kg/mol), zoals een op cellulose gebaseerde ionenwisselaar, kan worden toegepast. Het gebruik van een polysaccharide heeft een voorkeur met het oog op de resistentie ervan tegen veel organische oplosmiddelen.

15 In een voorkeursuitvoering heeft het polymeer, bijvoorbeeld een polysaccharidederivaat, een aantalsgemiddeld molecuulgewicht in het bereik van 1 tot 500 kg/mol, bij grotere voorkeur 10-300 kg/mol en bij bijzondere voorkeur in het bereik van ongeveer 20 tot ongeveer 100 kg/mol. Met een dergelijke ionenwisselaar is gevonden dat de gevoeligheid zeer hoog 20 en/of detectielimiet bijzonder goed is. Ook is gevonden dat een dergelijke ionenwisselaar bijzonder gunstige regenererende eigenschappen heeft.

De gewenste ionenwisselaarssterkte kan binnen een breed bereik gekozen worden, afhankelijk van de specifieke toepassing. Voor een toepassing waarvoor een hoge gevoeligheid vereist is, kan gekozen worden 25 voor een zeer sterke ionenwisselaar, voor een hoog regeneratievermogen een minder sterke ionenwisselaar.

De ionenwisselaar is geïmmobiliseerd op het sensoroppervlak, bij voorkeur door middel van een covalente binding. Geschikte immobilisatie-werkwijzen zijn afhankelijk van het gekozen sensoroppervlak en de gekozen 30 ionenwisselaar(s). Geschikte immobilisatiewerkwijzen zijn bekend uit de 8 literatuur, zoals bijvoorbeeld "S.S. Wong, Chemisty of protein conjugation and cross-linking, CRC Press Inc, 1991, ISBN 0-8493-5886-8 en "G.T. Hermanson, A. Krishna Mallia and P.K. Smith, Immobilized affinity ligand techniques, Academic Press, Inc, 1992, ISBN 0-12-342330-9.

5 Zeer geschikt is immobilisatie met behulp van een heterogene of homogene bifunctionele cross-linker. De laagdikte van het ionenwisselende materiaal kan binnen een breed bereik gekozen worden. In een voorkeursuitvoeringsvorm is laagdikte circa 1 pm of lager, bij grote voorkeur circa 300 nm of lager, bij bijzondere voorkeur circa 0,5-100 nm.

10 Zeer goede resultaten zijn bereikt met een laagdikte van tenminste 10 nm.

Als sensoroppervlak zijn allerlei materialen geschikt. Zeer goede resultaten zijn behaald met een detectiecel waarbij het sensoroppervlak een of meer metalen omvat. Zeer geschikte metalen zijn edelmetalen, zoals zilver, goud, platina en andere metalen zoals koper, aluminium. Ook 15 combinaties van verschillende metalen zijn geschikt. Het metaallaagje is gewoonlijk aangebracht op een transparant dragermateriaal (bijvoorbeeld glas of kwarts). Geschikte sensoroppervlakten staan onder andere beschreven in S. Lofas et al, Sens-Actuators, -B, Aug-Dec 1991; B5 (1-4): 79-84; in S. Lofas et al Biosensors-bioelectron (1995) 10, 9-10, 813-822 en in M. 20 Malmqvist, Nature (1993), 361, 6408, 186-187. Zeer goede resultaten zijn behaald met een detectiecel die vervaardigd is met een BIACORE SA-kit van Biacore en de SPREETA sensor van Texas instrument als basis.

Voor de immobilisatie van een ionenwisselaar, bijvoorbeeld een polysaccharide, op een metaal wordt het metaal bij voorkeur eerst 25 schoongemaakt. Hiervoor is plasmaoxidatie, in het bijzonder zuurstof plasmaoxidatie, zeer geschikt. Vervolgens wordt een linker aangebracht, waarna de ionenwisselaar via de linker covalent met het metaal verbonden wordt.

9

In een andere voorkeursuitvoeringsvorm omvat het sensor-oppervlak een silicamateriaal, zoals bijvoorbeeld glas, glasvezel of gemodificeerde silica.

Geschikte immobilisatietechnieken voor de immobilisatie van 5 ionenwisselaar op metaal zijn bijvoorbeeld beschreven in NL1015303 en NL1014816 (Werkwijze voor het bepalen van binding met natuurlijke receptoren).

Verder is een sensoroppervlak dat een optisch polymeer omvat, zeer geschikt. Hiervoor is een zogenaamd stroom-injectie-analyse systeem 10 ("Flow Injection Analysis system"; FIA-systeem) zeer geschikt.

De uitvinding heeft voorts betrekking op een instrument voor de detectie van een of meer geladen deeltjes, welk instrument een detectiecel volgens de uitvinding omvat.

In een uitvoeringsvorm bevat zo'n instrument een lichtbron 15 waarvan de uit de lichtbron tredende lichtstraal onder een hoek gericht is op het sensoroppervlak en een meetinrichting die geschikt is voor het bepalen van een brekingsindexverandering aan het sensoroppervlak. Een dergelijke meetinrichting is bijvoorbeeld een inrichting waarmee de hoek van de van het sensoroppervlak kerende lichtstraal bepaald kan worden.

20 Een instrument met een dergelijke meetinrichting is zeer geschikt voor het meten van de brekingsindexverandering van het evanescente veld.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van een instrument volgens de uitvinding is weergegeven in Figuur 1 De detectiecel omvat een doorstroomkanaal (1) een sensoroppervlak (2) dat onderverdeeld is in dun 25 laagje (2a) (bijvoorbeeld goud of zilver) aan de doorstroomzijde. Het laagje (2a) is opgebracht op een transparante dragerlaag (2b). Aan de doorstroomzijde bevinden zich voorts de ionenwisselaar (3). Verder omvat het instrument een lichtbron (4), bijvoorbeeld een licht emitterende diode (LED), een LASER of een conventionele lamp waarvan de uit de lichtbron 30 tredende lichtstraal (5) onder een hoek gericht is op het sensoroppervlak (2).

10

In een voorkeursuitvoeringsvorm is de uit de lichtbron tredende straal (5) convergerend. De lichtstraal wordt in deze uitvoeringvorm via prisma (6) op de meetzijde van het sensoroppervlak gericht Onder invloed van aan de ionenwisselaar (3) gebonden deeltjes verandert de breking van de 5 weerkaatste lichtstraal (7) welke wordt geregistreerd middels een meetinrichting voor het bepalen van de hoek van de van het sensoroppervlak kerende lichtstraal. Een zeer geschikte meetinrichting is een diode array detector, bijvoorbeeld met tenminste 128 diodes, bijvoorbeeld met 256 diodes, 512 diodes of met 1024 diodes. Hiermee kan 10 niet alleen een hoekverandering van de lichtbundel bepaald worden maar ook een lichtintensiteitsverandering.

Geschikte systeemcondities zijn voorts beschreven in de wetenschappelijke literatuur, bijvoorbeeld in Stenberg, E., et al (1991), Colloid and Interface Science,Volume: 143, Pages: 513-526; Jönsson, U. et 15 al(1993), Ann. Biol. Clin. Paris, Volume: 51, Pages: 19-26; Jönsson, U. et al (1991), BioTechniques, Volume: 11, Pages: 620-627; Liedberg, B. et al (1993), Sensors and Actuators, Volume: 11, Pages: 63-72; Löfas, S. et al (1991), Sensors and Actuators B, Volume: 5, Pages: 79-84.

Een bijzondere voorkeur heeft voorts een inrichting welke een 20 detectiecel volgens de uitvinding omvat en waarbij de detectiecel koppelbaar is aan een vloeistofdoseringssysteem voor het laten stromen van vloeistof over het sensoroppervlak, met welke inrichting tenminste één te analyseren monster geselecteerd kan worden en verder een of meer loopvloeistoffen om door het doorstroomkanaal geleid te worden. Als vloeistofdoseringssysteem 25 zijn uit de hoge druk vloeistofchromatografie (HPLC) en capillaire elektro-forese (CE) bekende systemen zeer geschikt. Een dergelijk vloeistof-doserings-systeem omvat bijvoorbeeld een of meer pompen en eventueel een of meer injectiesystemen en/of monsterwisselaars. De in figuur 1 weergegeven detectiecel kan bijvoorbeeld gekoppeld worden via de instroom- 11 opening (9). Een schema van een dergelijke inrichting is weergegeven in figuur 3.

Een dergelijke inrichting die is gekoppeld aan een vloeistof-doseringssysteem, is uitermate geschikt voor de analyse van monsters met 5 een of meer verschillende deeltjes. Zo kan met het doseringssysteem een al dan niet nauwkeurig bepaalde hoeveelheid monster in de detectiecel worden gebracht waar te detecteren deeltjes binden aan het sensoroppervlak. Als vervolgens de condities veranderd worden zodat een of meer te detecteren deeltjes weer gemobiliseerd worden en van het sensoroppervlak verwijderd 10 worden, kunnen door het meten van de brekingsindexveranderingen kwalititatieve en/of kwantitatieve gegevens over een of meer gedetecteerde deeltjes verkregen worden.

De uitvinding is geschikt voor tal van werkwijzen voor de detectie van uiteenlopende deeltjes, met behulp van brekingsindexbepaling, 15 bijvoorbeeld met behulp van SPR. Afhankelijk van de toepassing zal niet alleen de ionenwisselaar gekozen worden, maar kunnen ook de loopvloeistof condities aangepast worden. Tot de geschikte loopvloeistoffen behoren polaire vloeistoffen, apolaire vloeistoffen en oplossingen op basis van dergelijke vloeistoffen. Zeer geschikt zijn water, alcoholen (bijvoorbeeld 20 methanol, ethanol, isopropanol), acetonitril, tetrahydrofuraan (THF), dichloormethaan, tetrachloormethaan en andere vloeistoffen en oplossingen die gebruikt kunnen worden als eluens in vloeistofchromatografie. Een loopvloeistof kan eventueel een of meer additieven bevatten zoals een of meer zouten, buffers, zuren, basen, surfactanten, chelatoren en dergelijke.

25 Vooral in waterige loopvloeistoffen zijn een of meer dergelijke additieven bij voorkeur aanwezig.

Het is tevens mogelijk een scheiding te weeg te brengen tussen verschillende deeltjes met een verschillende affiniteit voor de ionenwisselaar, door deze deeltjes eerst te immobiliseren en vervolgens deze 30 deeltjes te scheiden door condities om mobilisatie te weeg te brengen 12 geleidelijk of stapsgewijs te veranderen, zodat de deeltjes op verschillende momenten gemobiliseerd worden. Een groot voordeel van een dergelijke werkwijze is dat de detectiecel hierin zowel een detectie-eenheid als een scheidingseenheid is. Dit biedt grote economische voordelen voor de analyse 5 van oplossingen met meer dan één component ten opzichte van conventionele brekingsindexdetectie, waarbij voorafgaand aan de detectie in een brekingsindexdetector een scheiding dient te worden uitgevoerd in bijvoorbeeld een chromatograaf. Er kan immers volstaan worden met minder apparatuur, hetgeen goedkoper is in aanschaf en waardoor er 10 minder labruimte nodig is. Ook kan de analyse binnen kortere tijd worden uitgevoerd.

De immobilisatie van een te detecteren deeltje geschiedt in het algemeen doordat het monster dat het deeltje bevat in contact te brengen met de ionenwisselaar door het monster langs het oppervlak te laten 15 stromen. De actieve groepen van de ionenwisselaar zullen het te detecteren deeltje binden en immobiliseren indien de affiniteit van het deeltje voor de ionenwisselaar voldoende groot is ten opzichte van het monster. Bij voorkeur zal na het in contact brengen van het monster met de ionenwisselaar, een vloeistof langs het sensoroppervlak geleid worden, 20 bijvoorbeeld een bufferoplossing, water of een organisch oplosmiddel waarvoor de te detecteren deeltjes een lage affiniteit hebben, waardoor niet gebonden deeltjes en de bulkvloeistof van het monster worden weggevoerd van het sensoroppervlak. De te detecteren deeltjes blijven dan geïmmobiliseerd achter op het sensoroppervlak.

25 De te detecteren deeltjes worden vervolgens gemobiliseerd. De mobilisatiestap kan op verschillende manieren worden bewerkstelligd. Zeer geschikt is een mobilisatiestap waarbij een of meer deeltjes weer worden gemobiliseerd door middel van een verandering in de loopvloeistof die door de detectiecel stroomt of door het aanbrengen van een elektrisch veld of een 30 verandering daarin. Een bijzondere voorkeur heeft een mobilisatie met 13 behulp van een verandering in de loopvloeistofsamenstelling. De loopvloeistof waarmee een geladen deeltje weer wordt gemobiliseerd wordt ook wel regeneratievloeistof genoemd.

Aan de hand van de affiniteit van een deeltje voor de 5 ionenwisselaar en de regeneratievloeistof, zal de vakman een geschikte regeneratievloeistof kunnen selecteren. Zeer geschikte regeneratie-vloeistoffen voor uiteenlopende toepassingen zijn onder andere fosforzuuroplossing, hydroxideoplossing, bijvoorbeeld een NaOH, LiOH of KOH oplossing, een GuCl oplossing (een oplossing van guanidine en HC1, bij 10 voorkeur met een pH in het bereik van 1-6), alcohol, bijvoorbeeld ethanol en/of methanol, een nitril, bijvoorbeeld acetonitril, een chlorideoplossing, bijvoorbeeld een KC1 of NaCl of HCl-oplossing, of een combinatie van twee of meer van deze oplossingen. Een bijzondere voorkeur heeft een fosforzuuroplossing in een concentratie van 25-200 mM. Ook zijn goede 15 resultaten verkregen met respectievelijk 25-100 mM HC1, 25-100 mM NaOH, 0,5-2,5 M NaCl en GuCl met 5-7 M guanidine.

Door over het sensoroppervlak een vloeistof, zoals de regeneratie vloeistof, te laten stromen waarin de te detecteren deeltjes worden meegevoerd, worden deze weer van het sensoroppervlak verwijderd. De 20 verandering in de brekingsindex wordt gemeten in de tijd. Aan de hand hiervan kunnen kwantitatieve en/of kwalitatieve gegevens worden verkregen over de aard van het monster.

Eventueel kunnen te detecteren deeltjes ook op een andere wijze van het sensoroppervlak worden verwijderd, bijvoorbeeld door het 25 aanleggen of veranderen van een elektrisch veld.

Een werkwijze voor de detectie van een of meer deeltjes volgens de uitvinding is uitermate geschikt voor toepassing in bijvoorbeeld de procestechnologie en kan zowel off-line als in een continu proces worden ingezet, bijvoorbeeld om bij te dragen aan de procesbeheersing en 30 procesanalyse. Zo kan de werkwijze bijvoorbeeld toegepast worden bij 14 waterzuivering, de controle op watervervuiling, het meten van gezondheidsparameters, chemische, biochemische en/of biotechnologische productieprocessen.

De uitvinding zal nu verder worden toegelicht aan de hand van 5 enkele voorbeelden.

Voorbeeld 1 De bereidins van ionenwisselaars op basis van dextranen 10 Voorbeeld IA: DEAE dextraan plus tertiair aminozout 1 g DEAE dextraan (Pharmacia LKB, 500 kg/mol) werd overgebracht naar een 50 ml fles met een refluxcondensator. 10 ml 2 M NaOH en 1 g 2-diethylaminoethylchloride hydrochloride werd toegevoegd en 15 het reactiemengsel werd 2 uur bij 100 °C gekookt. Gedurende deze periode vond de volgende reactie plaats H3C^ h3c^ N , JVk Het

Dex-CK ^ + Cr η -- CH, CH3 20 aldus verkregen

H C

3 '"'i product was

Dex_0//^N\--/^N'^VCH3 + Cl klaar voor μ ς/ J immobilisatie

3 H3C

25 op een chip.

Voorbeeld 1B DEAE dextraan plus quaternair ammonium 15 1 g DEAE dextraan (Pharmacia LKB, 500 kg/mol) werd zoals onder Voorbeeld IA gereageerd maar nu met 1 g 3-bromopropyltrimethyl-ammonium bromide, zodat de volgende reactie plaatsvond: H3C\ 9H3 1 + -- CH3

Dex-CK 3 CH3 H3C\ ^ CH3 I. u , D - h3c 5

Voorbeeld 1C TEAE Dextraan (triaminethyldextraan) 8 g DEAE dextraan (Pharmacia LKB, 500 kg/mol) werd in een 100 10 ml fles met refluxcondensator gemixt met 35 ml 10 % ethylbromide in ethanol (v/v) en gedurende 4 uur gekookt, gedurende welke periode de volgende reactie plaatsvond: h3cn h3c\ h2 1+^~ch3 N , H3C"'C"Br-- Dex-0/~'V'-/NS + Br

Dex- + ch3

Het resulterende TEAE dextraan werd gedroogd en voorafgaand 15 aan immobilisatie werd 200 mg TEAE-dextraan opgelost in natriumboraat buffer (50 mM pH 9).

16

Voorbeeld ID Bereiding van een coating voor Spreeta chips

Een reactiemengsel van ethyleenbromide (bij voorkeur 2 ml), 300 mg DEAE-dextraan (Pharmacia LKB, 500 kg/mol) (bij voorkeur 300 mg), 2-5 ethylaminoethylchloride hydrochloride (bij voorkeur 300 mg) en NaQH (bij voorkeur 1 ml, 2 M) werd gedurende een uur verhit op 100°C in een gesloten flesje met een magnetische roervlo.

Met een op dergelijke wijze gemodificeerd dextraan konden zeer goede detectie-eigenschappen verkregen worden, in het bijzonder in een 10 Spreeta opstelling.

Voorbeeld 2 zuurstof plasmapolymerisatieprocedure en immobilisatie van dextraan.

15 Voorbeeld 2A Zuurstof plasmaoxidatie en -polymerisatie

Een schone chip (bijvoorbeeld een Biacore chip zonder polymeerlaag) werd behandeld door middel van zuurstof plasmaoxidatie onder een argon/zuurstof atmosfeer gedurende 1 minuut en 50% energie 20 met een microgolf ondersteunde plasma ester Model 11011-AX van SPI

supplies, West Chester, USA. (100 % energie = ongeveer 800 W). Vervolgens werd op het sensoroppervlak van de chip diamino-ethaan gepolymeriseerd gedurende 30 sec, onder doorstrooming van een diamino-ethaanatmosfeer (doorstroming van 15 ml/min) en 8% energie.

25

Voorbeeld 2B Immobilisatie van ionenwisselaar

De chip werd gedurende een uur geactiveerd met 50 ul 10% 1,6-diisocyanhexaan in zonnebloemolie (onder uitsluiting van licht). Daarna 30 werd de chip gewassen met ethanol. Vervolgens werd een van de in 17

Voorbeeld 1 beschreven gemodificeerde dextranen gedurende een uur bij kamertemperatuur geïmmobiliseerd op het behandelde chipoppervlak door de betreffende dextraansamenstelling in contact te brengen met het sensoroppervlak.

5 De chip werd vervolgens gewassen met heet water, waarna de chip geschikt is als sensoroppervlak in een detectiecel of werkwijze volgens de uitvinding.

De beschreven procedure is ook geschikt voor een Spreeta chip (Texas Instruments). Deze werd eerst gewassen met ethanol een onder 10 stikstof gedroogd, de plastic zijden van de chip werden in vier lagen parafïlm gepakt ter bescherming. Verder werd de chip behandeld zoals hierboven beschreven.

Voorbeeld 3A 15 DEAE dextraan (500 kg/mol) werd aangebracht op een goudchip zoals beschreven in voorbeeld 2, waarbij de immobilisatie gedurende een uur plaatsvond middels een 30 % DEAE-dextran mengsel in 10 % NAOH oplossing. De chip werd geplaatst in een Biacore detectiecel.

20 In een doorstroomexperiment met 50 mM HEPES (pH 7,01) als buffer) werd de mate van binding en de regeneratie getest voor een aantal geladen deeltjes (in een concentratie van 10 pg/ml) geteste Substantie(c=10pg/ml) : binding: regeneratie ___(NaOH.GuCI): _1,10-diaminodecaan__-___ _1,8-diamino-octaan__- _ 1,3-diamino-2-hydroxypropaan__--____ _melkzuur__-__ _Aminocapronzuur__-__ _Poly-l-lysine____ _Carboxymethylcellulose 5__+++__++_ _Inuline 98%gecarboxyleerd__+++__++_ 18 _Inuline 50% gecarboxyleerd__+++__++ .

Inuline + _

Onder de testcondities is DEAE dextraan geschikt voor de detectie van sterke anionen (anionen met veel carboxylgroepen).

Als regeneratie vloeistof werd een NaOH oplossing gebruikt en/of 6 5 M guanidine dat op een gewenste pH in het bereik van 1-6 was gebracht met HC1

Voorbeeld 3B

10 De gemodificeerde dextraan van voorbeeld 1B werd geïmmobiliseerd op een BIAcore SPR chip zoals in voorbeeld 2 is beschreven. Deze chip werd geplaatst in een Biacoredetector. Vervolgens werd de binding en regeneratie getest met aminodecaanzuur, diamino-decaan, amino n-hexaanzuur en diaminohexaan (elk 10 ug/ml) in een 15 doorstroomexperiment met 50 mM HEPES (pH 7,01) (5 ul monsterinjectie; stroomsnelheid 5 ul/min . Diaminohexaan bond niet de overige verbindingen wel. Sterkste binding was voor amino n-hexaanzuur (2500 units), gevolgd door aminodecaanzuur (ca. 750 units) en diaminohexaan (<500 units). Regeneratie was incompleet met 100 mM NaOH maar compleet met 100 20 mM fosforzuur.

De detectielimiet voor aminododecaanzuur was onder deze condities 1 ug/ml.

Voorbeeld 3C

25

Het DEAE dextraan met quaternaire amonium coating van voorbeeld 1B werd geïmmobiliseerd op een SPREETA chip (Texas Instruments, Dallas USA) zoals beschreven in Voorbeeld 2. De chip werd 19 geplaatst in een Mach Zehnder Interferometer (leverbaar door Mierij Meteo, De Bilt, NL)

Een monster met de volgende polymeren werd geïnjecteerd nadat ze waren opgelost in 100% acetonitril, dat ook diende als 5 immobilisatievloeistof.

Polymeer_aantal zure groepen Mw (g/mol)_

Polystyreen geen 591;1256;2570;4 __916_

Epikote 1007 (experimenteel 0-2 per molecuul 4783 polyester)____

Epikote 1004 (bisphenol A- geen 9114 epichlorhydrine epoxy hars van

Shell)_j___

Polyester UA5 (polyester van 0-2 per molecuul approx. 3000 adipinezuur, iso-terephtaalzuur en een diol)___

Een resultaat is weergegeven in figuur 3.

10 Voobeeld 3D Sensoroppervlak van primaire aminogroepen op goud

Een chip werd behandeld door middel van zuurstof plasmaoxidatie en geplasmapolymeriseerd zoals beschreven in voorbeeld 2A, zodat een sensoroppervlak ontstond met primaire aminogroepen, die direct gebonden 15 waren aan de goudlaag.

10 ug/ml 1,10-diaminodecaan, 1,8 diamino-octaan en aminocapronzuur werden over het sensoroppervlak nadat dit geplaatst was in een BIAcore detectiecel. Deze verbinding bleken redelijk goed te binden aan het oppervlak maar het sensoroppervlak was niet te regenereren met 20 ethanol.

20

Voorbeeld 4: Sensoroppervlak met polylysinecoating als ionenwisselaar.

Een chip met een goudlaag werd behandeld door middel van 5 zuurstof plasmaoxidatie onder een argon atmosfeer, 30 sec met 50% energier en vervolgens geplasmapolymeriseerd onder ethaandiamine atmosfeer gedurende 30 sec en 8% energie. Een mengsel van 1 mg/ml poly-1-lysinehydrochloride (Sigma; Cat. nr. P9404 of P2658; CAS nummer 2614-78-7, Mw>70 kD) 50 μΐ N-3-dimethylamnopropyl-N’-ethylcarbodiiminde 10 hydrochloride (EDC) en 50 ul N-hydroxysuccinimide (NHS) in MES buffer (10 mM, pH 6,1) werd 15 minuten geactiveerd (geïncubeerd), zodat carboxylgroepen chemisch veranderd werden opdat nucleofielen (zoals aminogroepen) kunnen binden aan de gemodificeerde carboxyl groep.

Direct na de plasmapolymerisatie van de chip werd de geactiveerde 15 polyly sine oplossing 30 min geïncubeerd op de chip, waarna deze zorgvuldig gewassen werd met water en geïnstalleerd in een Biacore detectiecel.

Het sensoroppervlak van de geïnstalleerde chip (de zijde waarop polylysine is aangebracht) werd enkele malen gewassen met achtereenvolgens 100 mM fosforzuur en 50 mM HEPES (pH 7,01). Een 20 dergelijke voorbehandeling diende om het oppervlak te laten wennen aan de juiste omstandigheden. Hierna werd de binding van een aantal componenten bepaald aan het sensoroppervlak.

_geteste verbinding (C=10pg/ml):__binding : _glucoseoxidase pH 7,01__++ CM5-dextraan (Fulka), Mw = 500 kD ++ (substitutie: circa 10 % van de suikereenheden _bevat een carboxylgroep)__ _6-amino-n-hexaan zuur__- 21

Voorbeeld 5: Poly-l-lysineplus "S-layer protein” als ionenwisselaar.

Een poly-l-lysine chip volgens voorbeeld 4 werd 3 uur geïncubeerd met 100 ug/ml "S-layer" proteïne (van Lactobacillus acidophilus). Het S-layer 5 proteïne is bijvoorbeeld verkrijbaar zoals beschreven in U.B. Sleyter, M. Sara, Bacterial and archaeal S-layer proteins: structure-function relationships and their biotechnological applications, Tibtech 15, 20-26 (1997) en is U.B. Sleyter, M. Sara, Biotechnology and Biomimetric with crystalline bacterial cell surface layers (S-layers), Micron 27, 2, 141-156 10 (1996)

De binding van een aantal componenten werd bepaald met 50 mM HEPES (pH 7,01) als buffer.

_geteste component (C=10Mg/ml):__Binding : _1,10-diaminodecaan__++ _1,8-diaminooctaan__++ _1,3-diamino-2-hydroxypropaan__++

Aminocapronzuur ++ 15 Voorbeeld 6 CM-5 dextraan chip

Een BIAcore CM-5 dextraan chip werd gebruikt om de componenten met aminogroepen (in plaats van negatief geladen groepen) te detecteren in een buffer van 50 mM HEPES (pH 7,01). De resultaten waren 20 als volgt.

22

geteste verbinding (C=10pg/ml): binding : regeneratie (100 mM

___NaOH):_ _1,10-diaminodecaan__++ _++_ _1,8-diaminooctaan__+__++ _Aminocapron zuur__::__ 1,3-diamino-2-hydroxypropaan__+__++ _melkzuur__~___

Voorbeeld 7: dextraan plus quaternair ammoniumzout 1 ml 30 % dextraan (T500, Fulka) plus 2 ml 600 mg/ml 5 Br· (CH2)3 — N+(C2H5)3Br in 2M NaOH werd gemengd en overnacht bewaard. Het mengsel werd geïncubeerd op een goudchip die geplasmaoxideerd en geplasmapolymeriseerd was zoals beschreven in Voorbeeld 2. Vervolgens werden de binding en de regeneratie bepaald van een aantal stoffen. Tijdens de binding werd 50 mM HEPES (pH 7,01) 10 gebruikt en voor de regeneratie ethanol.

geteste substantie (C=10pg/ml) : Binding: regeneratie(EtQH): _1,10-diaminodecaan__--__ _1,8-diamino-octaan__--__ 1,3-diamino-2-hydroxypropaan__-»_ ~ _melkzuur__--__ _Aminocapronzuur__--__ _Poly-l-lysine__++__++_

Inuline 98% gecarboxyleerd__+__+_

Inuline 50% gecarboxyleerd__+__+_ _Inulin__+__

Voorbeeld 8: DEAE dextraan plus Br-(CH2)2-NH2 15 Een goudchip werd geplasmaoxideerd en geplasmapolymeriseerd zoals beschreven in Voorbeeld 2.

Een mengsel van 300 mg broommethylamine, 300 mg DEAE dextraan en 2 ml NaOH (2M) werd geroerd en gedurende 1 uur op 100 °C verhit. Vervolgens werd het mengsel 1 uur geïncubeerd op de chip.

23

Een aantal stoffen werd opgelost in 50 mM HEPES (pH 7,01) en over het sensoroppervlak van de chip geleid (de zijde met het gemodificeerde dextraan). Vervolgens werden de stoffen geregenereerd met 1 M of 2 M NaCl in water. De resultaten waren als volgt.

5 geteste substanties (C=10pg/ml): Binding : regeneratie ___(NaCl): _1,10-diaminodecaan_ --__ _1,8-diaminooctaan__--__ _1,3-diamino-2-hydroxypropaan__--__ _melkzuur__--__ _ Poly-Hysine__+__+_ _Inuline 98%gecarboxyleerd__+___+_ _Inuline 50%gecarboxyleerd__+__+_ _Inulin__--__ _citroenzuur__--__ _wijnsteenzuur__+__+_ _fenylazijnzuur__--__ _6-Amino-n-hexaanzuur__+__+_ _dextraan CM5__++__++ _Hydroxyisobutaanzuur_ --__ 24

Fig. 2 B1 = behuizing (body) B2 = doorstroomcel B3 = connector voor computer B4 = sensorhouder B5 = schroef B6 = veer

Fig. 3 3.1 = Buffers 3.2 = Kraan 3.3 = Pomp 3.4 = Monsterwisselaar

3.5 = HPLC

3.6 = Kraan 3.7 = Detector 3.8 = Collector

Claims (21)

1. Werkwijze voor het detecteren van een deeltje door het meten van de brekingsindex aan een sensoroppervlak, op welk sensoroppervlak een ionenwisselaar is aangebracht voor binding van het deeltje, waarbij het sensoroppervlak deel uitmaakt van een detectiecel, welke detectiecel is 5 voorzien van middelen om de brekingsindexverandering ten gevolge van de aanwezigheid van het deeltje te bepalen, welke werkwijze de volgende stappen omvat: • het laten stromen van een monster, dat al dan niet te detecteren deeltjes bevat, langs het sensoroppervlak onder condities waarbij een of 10 meer te detecteren deeltjes geïmmobiliseerd worden op de ionenwisselaar, • het veranderen van de condities zodat tenminste een aantal van de deeltjes -indien aanwezig - gemobiliseerd worden, • het verwijderen van de gemobiliseerde deeltjes van het sensoroppervlak, en 15. het meten en registreren van de veranderingen in de brekingsindex.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij deeltjes met een verschillende affiniteit voor de ionenwisselaar van elkaar gescheiden worden door condities om mobilisatie te weeg te brengen geleidelijk of 20 stapsgewijs te veranderen, zodat deeltjes op een verschillende momenten gemobiliseerd worden.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij een of meer deeltjes worden gemobiliseerd door middel van een loopvloeistof of een elektrisch veld.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij de loopvloeistof een fosforzuuroplossing, een hydroxideoplossing, een waterige oplossing van guanidine en HC1, of een chlorideoplossing is.

5. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de brekingsindexverandering van het evanescente veld gemeten wordt.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, waarbij de brekingsindexverandering met behulp van oppervlakte plasma resonantie 5 (SPR) of Mach Zehnder Interferometrie gemeten wordt.

7. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de ionenwisselaar een derivaat van cellulose, een derivaat van dextraan of een derivaat van een ander polysaccharide omvat.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, waarbij de ionenwisselaar een 10 polysaccharidederivaat omvat met een aantal gemiddelde molecuulgewicht in het bereik van 1 tot 500 kg/mol.

9. Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de ionenwisselaar tertiaire aminegroepen, quaternaire ammoniumgroepen, fosfaatgroepen, -SO3·, sulfalkylgroepen, carboxylgroepen of een combinatie 15 daarvan omvat.

10. Sensoroppervlak voor gebruik in een werkwijze volgens een van de conclusies 1-9 voor de detectie van een geladen deeltje in een vloeistof, welke vloeistof kan stromen langs een zijde van het sensoroppervlak waarop een ionenwisselaar is aangebracht voor reversibele binding van het geladen 20 deeltje, welke ionenwisselaar een derivaat van cellulose, een derivaat van dextraan of een derivaat van een ander polysaccharide omvat, met een aantalsgemiddeld molecuulgewicht in het bereik van 1 tot 500 kg/mol.

11. Sensoroppervlak volgens conclusie 10, waarbij het aantalsgemiddeld molecuulgewicht in het bereik van 10 tot 300 kg/mol ligt

12. Sensoroppervlak volgens conclusie 11, waarbij aantalsgemiddeld molecuulgewicht in het bereik van 20 tot 100 kg/mol ligt.

13. Sensoroppervlak volgens een van de conclusies 10-12, waarbij de ionenwisselaar tertiaire aminegroepen, quaternaire ammoniumgroepen, fosfaatgroepen, -SO3', sulfalkylgroepen of een combinatie daarvan omvat.

14. Sensoroppervlak volgens een van de conclusies 10*13, waarbij het sensoroppervlak een of meer metalen gekozen uit de groep van koper, zilver, goud, platina, aluminium, omvat.

15. Sensoroppervlak volgens een van de conclusies 10-14, waarbij het 5 sensoroppervlak een of meer silicamaterialen gekozen uit de groep van glas, glasvezels en gemodificeerde silica oppervlakken omvat.

16. Sensoroppervlak volgens een van de conclusies 10-15, waarbij het sensoroppervlak een optisch polymeer omvat.

17. Detectiecel, omvattende een sensoroppervlak volgens een van de 10 conclusies 10-16.

18. Het gebruik van een sensoroppervlak volgens een van de conclusies 10-16 of een detectiecel volgens conclusie 17, voor de detectie van een geladen, synthetisch of natuurlijk monomeer, oligomeer of polymeer.

19. Inrichting omvattende een detectiecel volgens conclusie 17, een 15 lichtbron waarvan de uit de lichtbron tredende lichtstraal onder een hoek gericht is op het sensoroppervlak en een meetinrichting die geschikt is voor het bepalen van een brekingsindexverandering.

20. Inrichting volgens conclusie 19, waarbij de meetinrichting geschikt is voor het bepalen van de hoek van de van het sensoroppervlak kerende 20 lichtstraal.

21. Inrichting volgens conclusie 19 of 20, waarbij de detectiecel koppelbaar is aan een vloeistofdoseringssysteem voor het laten stromen van vloeistof over het sensoroppervlak, met welk vloeistofdoseringssysteem tenminste één te analyseren monster en een of meer loopvloeistoffen om 25 over het sensoroppervlak geleid te worden geselecteerd kunnen worden.