NL1011687C2

NL1011687C2 - Werkwijze voor het bereiden van een reactieproduct door enzymatische katalyse.

Info

Publication number: NL1011687C2
Application number: NL1011687A
Authority: NL
Inventors: Joseph Johannes Heijnen; Michael Johannes Jacob Litjens; Adrianus Johannes Jo Straathof; Jacob Arie Jongejan
Original assignee: Univ Delft Tech
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 1999-03-29
Publication date: 2000-10-03
Also published as: CN1350588A; EP1165822A1; DE60014606D1; CN1226415C; WO2000058490A1; EP1165822B1; AU3844000A; ATE278797T1

Description

Werkwijze voor het bereiden van een reactieproduct door enzymatische katalyse

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een reactieproduct door enzymatisch gekatalyseerde reactie van een eerste reactant A en een tweede reactant B in een oplosmiddel, waarbij de 5 eerste reactant A en de tweede reactant B elk in het oplosmiddel oplosbaar zijn en de eerste reactant A en de tweede reactant B in het oplosmiddel een zout AB kunnen vormen dat in het oplosmiddel neerslaat.

Een dergelijke werkwijze wordt gehinderd door het 10 feit dat de neergeslagen substraten A en B voor het enzym, dat de reactie tussen A en B katalyseert, niet beschikbaar zijn. Het in de organische chemie gebruikelijke verhogen van de oplosmiddeltemperatuur teneinde de oplosbaarheid van de reactanten A, B te verhogen is, in verband met de thermische 15 instabiliteit van het enzym, vaak slechts in beperkte mate mogelijk.

De onderhavige uitvinding beoogt een werkwijze van de in de aanhef genoemde soort te verschaffen, waarbij de omzetting van A en B wordt versneld.

20 Hiertoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat de concentraties van de eerste reactant A en de tweede reactant B zodanig worden gekozen dat zij beantwoorden aan de formule (I) 25 [A]T = [B]T + (F-1) · /lp* waarbij [A] T de concentratie van de eerste reactant A voor-30 stelt betrokken op het totale volume dat door de reactanten A, B en het oplosmiddel in beslag wordt genomen; [B] T de concentratie van de tweede reactant B voorstelt betrokken op het totale volume dat door de reactanten A, B en het oplosmiddel in beslag wordt genomen; 35 K het oplosbaarheidsproduct is voor het tussen het eerste reactant A en het tweede reactant B gevormde zout AB, en F een factor is gelegen tussen 1/10 en 10.

1 o 11; :i ? 2

In de chemie worden reactanten in principe in stoi-chiometrische hoeveelheden bij elkaar gebracht. Er kunnen redenen zijn om daar van af te wijken. Hierbij kan worden gedacht aan het onderdrukken van nevenreacties. Ook kunnen 5 voor reacties waarbij de opbrengst niet ca. 100% is kostenoverwegingen ertoe leiden dat de goedkoopste reactant in overmaat wordt toegevoegd. Wanneer wel wordt uitgegaan van stoichiometrische hoeveelheden is er in de praktijk echter altijd sprake van een afwijking van de optimale stoichiome-10 trische verhouding. Aanvraagster heeft verrassenderwijze gevonden dat kleine afwijkingen in de verhouding tussen de reactanten A en B grote gevolgen hebben voor de snelheid waarmee de reactanten A en B door het enzym worden omgezet. Door de concentraties voor A en B zodanig te kiezen dat deze 15 binnen het volgens de uitvinding door de factor F gedefinieerde bereik liggen, blijken sneller goede opbrengsten te kunnen worden verkregen.

Wanneer in de onderhavige aanvrage over concentratie wordt gesproken, wordt daarmee de concentratie in molair 20 bedoeld. Verder geldt dat reactanten alleen in de formule worden meegerekend wanneer zij voor precipitatie tot zout AB beschikbaar zijn of aanwezig zijn als zout AB. De uitvinding is in het bijzonder van toepassing op die reacties waarbij het zout AB een oplosbaarheidsproduct heeft van bijvoorbeeld 25 minder dan 10‘3 M2, zoals minder dan 3*10'4 M2 en in het bijzonder minder dan 10‘4 M2 of 3*10‘s M2.

Als uitweg voor het probleem dat reactanten als zout neerslaan, wordt in de stand van de techniek de bereiding van primaire amiden onder gebruikmaking van een enzymatisch 30 gekatalyseerde reactie het carbonzuur eerst veresterd alvorens de ester met de ammoniumverbinding in contact wordt gebracht.

De Zoete et al. (ref. 1) stellen dat directe ammo-niolyse van octaanzuur geen octaanamide oplevert door de 35 vorming van zouten. Om deze reden voeren zij een tweestapsre-actie uit via de ethylester van octaanzuur.

Öhrner et al. (ref. 2) zeggen dat octaanzuur met de amine een ongewenst zout zou kunnen vormen, om welke reden ook zij van ethyloctanoaat gebruik maken.

101 1 o 37 3

De vorming van primaire amiden is een belangrijke toepassing van de werkwijze.

Volgens een gunstige uitvoeringsvorm is F gelegen tussen 1/5 en 5, bij voorkeur tussen 1/3 en 3 en met meer 5 voorkeur tussen 1/2 en 2.

Door te kiezen voor dergelijke beperktere bereiken, worden nog hogere omzettingssnelheden bereikt. Hierbij moet wel worden opgemerkt dat reactie-kinetische aspecten aanleiding kunnen zijn binnen de genoemde bereiken af te wijken van 10 de voor wat betreft de concentratie van beide reactanten optimale waarde voor F van 1, zoals voor de terzake kundige duidelijk zal zijn.

Volgens een zeer gunstige uitvoeringsvorm worden de eerste reactant A en de tweede reactant B als zout van elkaar 15 toegevoegd. Op deze wijze wordt op eenvoudige en doelmatige wijze een waarde voor F van 1 bereikt.

Een belangrijke toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding betreft de bereiding van een reactieproduct waarbij de eerste reactant A een zure reactant is en de 20 tweede reactant B een basische reactant. Deze geven in een organisch oplosmiddel gemakkelijk neerslagen. Indien de reactie een condensatiereactie is, is het oplosmiddel bij voorkeur in hoofdzaak vrij van die verbinding die bij de condensatiereactie als eenvoudig molecuul, zoals water, wordt 25 afgesplitst en als oplosmiddel (of het oplossen bevorderend middel) zou kunnen fungeren.

Volgens een voorkeursuitvoering is de eerste zure reactant A een carbonzuur en de tweede basische reactant B een verbinding gekozen uit de groep bestaande uit i) ammoni-30 ak; en ii) een primaire amine.

Volgens een interessante uitvoeringsvorm wordt ammoniak toegevoegd als ammoniumbicarbonaat, ammoniumcarba-maat, ureum of met ammonium beladen ionenwisselingshars.

Hierdoor kan ammoniak meer geleidelijk voor reactie 35 ter beschikking komen. Een interessant aspect van het gebruik van ureum als bron voor ammoniak, bijvoorbeeld door enzymatische hydrolyse, is dat bij de condensatie-reactie vrijgekomen water wordt weggenomen, hetgeen de vorming van het amide bevordert. Er komen twee moleculen ammoniak vrij per weggeno- 10 1 1687 4 men molecuul water, hetgeen in enige mate een gereguleerde vrijgave van de afgifte van ammoniak betekent. Desgewenst kan bij deze, of andere in de onderhavige aanvrage beschreven, uitvoeringsvorm gebruik worden gemaakt van een ammoniak 5 sensor of een chromatografische techniek voor het meten van de concentratie vrij ammoniak.

Als enzym wordt een enzym gebruikt gekozen uit lipasen, esterasen en peptidasen, zoals bij voorkeur het lipase Candida antarctica lipase B is.

10 Aldus kan op doelmatige wijze een primair amide worden gevormd.

De uitvinding zal thans worden toegelicht aan de hand van het volgende uitvoeringsvoorbeeld.

VOORBEELD 1 15 Een oplossing van over 3 Angstrom moleculaire zeven gedroogd 73 mg boterzuur in 10 ml over 3 Angstrom moleculaire zeven gedroogde methylisobutylketon wordt bij 35°C geroerd met 80 mg ammoniumcarbamaat (als ammoniakbron) en 15 mg Candida antarctica lipase B (Novozym 435, activiteit 11000 20 PLU/g, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denemarken). De oplossing bevat tevens 10 μΐ dodecaan per ml oplossing als interne standaard voor analyse. Monsters worden met uiteenlopende tussenpozen genomen en na centrifugeren (14.300 tpm gedurende 1 min.) meteen geanalyseerd met behulp van gaschromatografie. 25 Na 3 dagen is de initiële boterzuurconcentratie van 83 mmol/1 verlaagd tot 7 mM, en is 75 mM butyramide gevormd.

VOORBEELD 2 4 ml van een oplossing van 395 mg boterzuur en 120 μΐ dodecaan (als interne standaard) in over 3 Angstrom mole-30 culaire zeven gedroogde methylisobutylketon wordt gemengd met een in de onderstaande tabel aangegeven hoeveelheid gedroogde en met ammoniak verzadigde (230 mM) methylisobutylketon en met gedroogde methylisobutylketon aangevuld tot 30 ml. Deze oplossing bevat derhalve 150 mM boterzuur, en een in de tabel 35 weergegeven concentratie ammoniak. De suspensie wordt bij 25°C geroerd met 45 mg Candida antarctica lipase B (Novozym 435, activiteit 11000 PLU/g, Novo Nordisk, Bagsvaerd, Denemarken) . Onder deze omstandigheden is K = 1,3 · ΙΟ'4 M2.

1011687 5

Experiment aan NH3 verz. MIBK') MIBK') [NH3] F

_(ml)__(ml)__(mM)___ _1__20__6__153__0,8 _2__22__4__169__0,2 5 3__24__2__184__0,09 _4___26__0__199__0,05 ‘) gedroogde methylisobutylketon

De experimenten 3 en 4 zijn vergelijkingsexperimen-10 ten. In de figuur is de concentratie product (butyramide) uitgezet tegen de tijd (in uur). Duidelijk is te zien dat een afwijking van de stoichiometrische verhouding sterk doorwerkt in de snelheid waarmee het product wordt gevormd. Bij experiment 3 is de concentratie boterzuur 150 mM en de concentratie 15 NH3 184 mM. Ofschoon de concentratie ammoniak slechts 21% hoger is, is de omzettingssnelheid meer dan een factor 2 lager dan bij experiment 1 (F respectievelijk 0,09 en 0,8).

101 1687

Claims

1. Werkwijze voor het bereiden van een reactiepro-duct door enzymatisch gekatalyseerde reactie van een eerste reactant A en een tweede reactant B in een oplosmiddel, waarbij de eerste reactant A en de tweede reactant B elk in 5 het oplosmiddel oplosbaar zijn en de eerste reactant A en de tweede reactant B in het oplosmiddel een zout AB kunnen vormen dat in het oplosmiddel neerslaat, met het kenmerk, dat de concentraties van de eerste reactant A en de tweede reactant B zodanig worden gekozen dat zij beantwoorden aan de 10 formule (I) [A]r = [B]T + (F-l) · / | 15 waarbij [A] x de concentratie van de eerste reactant A voorstelt betrokken op het totale volume dat door de reactanten A, B en het oplosmiddel in beslag wordt genomen; [B] T de concentratie van de tweede reactant B voor- 20 stelt betrokken op het totale volume dat door de reactanten A, B en het oplosmiddel in beslag wordt genomen; K het oplosbaarheidsproduct is voor het tussen het eerste reactant A en het tweede reactant B gevormde zout AB, en F een factor is gelegen tussen 1/10 en 10.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat F gelegen is tussen 1/5 en 5, bij voorkeur tussen 1/3 en 3 en met meer voorkeur tussen 1/2 en 2.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de eerste reactant A en de tweede reactant B als zout AB 30 worden toegevoegd.

4. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de eerste reactant A een zure reactant is en de tweede reactant B een basische reactant is en het oplosmiddel een organisch oplosmiddel is.

5. Werkwijze volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat de eerste zure reactant A een carbonzuur is en de tweede basische reactant B een verbinding is gekozen uit de groep bestaande uit i) ammoniak; en ii) een primaire amine. 1011687

6. Werkwijze volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat ammoniak wordt toegevoegd als ammoniumbicarbo-naat, ammoniumcarbamaat, ureum, of met ammonium beladen ionenwisselingshars.

7. Werkwijze volgens een van de conclusies 4 tot 6, met het kenmerk, dat als enzym voor de enzymatisch gekatalyseerde reactie een enzym wordt gebruikt gekozen uit lipasen, esterasen en peptidasen.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, 10 dat het lipase Candida antarctica lipase B is. 1011887