NL1004948C2 - Werkwijze en inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma. - Google Patents

Description

Titel: Werkwijze en inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, van de in de aanhef van de hoofdconclusie beschreven soort. Een dergelijke werkwijze is bekend uit de parktijk en wordt 5 bijvoorbeeld toegepast voor het voor bewaring geschikt maken van sperma voor gebruik bij kunstmatige inseminatie en dergelijke.

Voor het kunstmatig insemineren van bijvoorbeeld runderen, varkens en mensen, wordt op daartoe geeigende 10 plaatsen sperma ingevroren voor later gebruik. Daartoe wordt steeds een groot aantal, elk een monster bevattende houders sterk afgekoeld in een invriestraject, zodanig dat de levende cellen snel worden ingevroren. Als gevolg daarvan kan ten minste een deel van de ingevroren cellen op een 15 later tijdstip weer worden ontdooid en in levende toestand worden gebruikt voor bevruchting. Op vergelijkbare wijze kunnen levende cellen voor andere doeleinden zoals bijvoorbeeld onderzoek worden opgeslagen. Daarbij is het steeds van het grootste belang dat een zo groot mogelijk 20 percentage van de levende cellen de voornoemde behandeling levend en in tact zal doorstaan. Zo is het voor het toepassen van kunstmatige inseminatie het groot belang dat een zo groot mogelijk percentage van de ingevroren spermacellen het invriezen en ontdooien overleeft en intact 25 blijft, omdat daardoor de kans op een succesvolle bevruchting wordt vergroot.

Het is bekend voor het invriezen van sperma gebruik te maken van invriesapparatuur waarbij een relatief grote hoeveelheid houders met daarin een spermamonster, 30 tegelijkertijd sterk wordt afgekoeld. Daarbij wordt in een vat waarin de houders zijn opgesteld vloeibare stikstof gevoerd, zodanig dat warmte aan de houders en het daarin opgenomen monster wordt onttrokken. De temperatuur in het vat wordt daaroij zo veel mogelijk constant gehouden. Eik 1004948 2 monster wordt vanaf een temperatuur boven 0°C snel afgekoeld tot een temperatuur van bijvoorbeeld -120°C en vervolgens opgeslagen in een opslaginrichting, voor later gebruik.

Deze bekende werkwijze heeft als nadeel dat het 5 temperatuurverloop in de houders en daarmee in elk monster sterk afhankelijk is van bijvoorbeeld het aantal houders dat in het vat wordt geplaatst, de begintemperatuur van de houders en de afkoelsnelheid. Met name deze laatste factor kan van grote invloed zijn op het temperatuurverloop in elk 10 monster. En juist dit temperatuurverloop binnen deze substantie blijkt van grote invloed op het aantal spermacellen dat de behandeling van invriezen en ontdooien intact overleeft.

Teneinde dit percentage te verhogen is voorgesteld 15 de temperatuur van het vat over het gehele invriestraject in hoge mate constant te houden, door het periodiek in werking stellen van het koelmechanisme van de invriesapparatuur; steeds wanneer de temperatuur in het vat meer dan een toegestane marge afwijkt van de gewenste temperatuur wordt 20 het koelmechanisme in werking gesteld. Bij deze bekende werkwijze wordt uitgegaan van een doorgaande temperatuurdaling van elk monster in de houders. Daarbij is de temperatuurgradiënt tijdens het invriestraject niet constant en in de houders onderling verschillend. Daardoor 25 wordt toch nog een relatief ongestuurde en daarmee ongecontroleerde afkoeling verkregen van monsters. De resultaten van een dergelijke bekende werkwijze zijn dan ook voor verbetering vatbaar.

De uitvinding beoogt een werkwijze van de beschreven 30 soort, waarbij de genoemde nadelen zijn vermeden, met behoud van de voordelen daarvan. Daartoe wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens de hoofdconclusie.

In deze aanvrage dient het begrip temperatuur-35 gradiënt ten minste te worden geacht te omvatten een verandering van de temperatuur in de tijd (°C/min). Deze kan bijvoorbeeld worden verkregen door verandering van de 1004948 3 temperatuur bij een stilstaande houder, verplaatsing van een houder langs een traject met afnemende temperatuur of een combinatie daarvan. Ook op andere wijzen kan een temperatuurgradiënt worden verkregen.

5 De uitvinding berust op het verrassende inzicht dat sturing van de temperatuurgradiënt tijdens ten minste het optreden van kristallisatie in een levende cellen bevattend monster van grote invloed is op de resultaten daarvan. Uit onderzoek van aanvraagster is gebleken dat wanneer tijdens 10 de kristallisatie in een monster temperatuurstijging in het monster slechts in relatief geringe mate, bij voorkeur niet wordt tegengegaan een betere overlevingskans geboden wordt voor de in te vriezen en later te ontdooien levende cellen, welke cellen dan bovendien een grotere levendigheid 15 vertonen.

Met name voor sperma is het toestaan van een slechts geringe temperatuurstijging tijdens het optreden van kristallisatie van bijzonder belang omdat daardoor tijdens gebruik voor inseminatie een betere kans op bevruchting 20 wordt verkregen. Doordat een hoger percentage van de spermacellen intact overleeft kan met een kleiner aantal zaadcellen per houder worden volstaan, zodat een groter aantal houders uit één ejaculaat kan worden verkregen.

Bovendien is voor de gebruikers van de inhoud van 25 een houder de kans dat een succesvolle bevruchting wordt verkregen groter, zodat de kans dat de procedure dient te worden herhaald kleiner is, hetgeen betekent dat uit kostenoverweging een werkwijze volgens de uitvinding voor zowel de gebruiker als de aanbieder van het sperma voordelig 30 kan zijn. Met name voor sperma van individueel als bijzonder geschikt geachte donoren, zoals bijvoorbeeld een specifieke partner is dit van groot belang dat de kans op een succesvolle bevruchting maximaal is.

Anders dan bij de bekende werkwijzen wordt bij een 35 werkwijze volgens de uitvinding derhalve gebruik gemaakt van het verrassende inzicht dat een zogenaamde kristallisatie-pauze tijdens het invriestraject, waarbij derhalve niet 1004948 4 wordt uitgegaan van een voortdurend dalend temperatuur-verloop over het gehele invriestraject, een aanmerkelijke verbetering van het resultaat oplevert.

Zodra kristallisatie start zal de temperatuur in de 5 betreffende cellen of delen van het monster naar het voor de betreffende oplossing geldende vriespunt verschuiven. Zolang de kristallisatie niet althans grotendeels volledig is kan de temperatuur in de houder niet, althans nagenoeg niet van buiten af worden beïnvloed, anders dan door het op gang 10 houden van de kristallisatie. Bij de bekende werkwijzen en inrichtingen wordt steeds ook tijdens het optreden van de kristallisatie de omgevingstemperatuur verder verlaagd, wordt doorgekoeld. Verrassenderwijs is gebleken dat deze omgevingstemperatuur tijdens het kristalliseren juist niet 15 of slechts minimaal moet dalen, teneinde te grote temperatuurverschillen tussen de inhoud van de houder en de omgeving te verhinderen. Als dit verschil te groot wordt kunnen grote spatiële verschillen optreden in de voortgang van de kristallisatie, bijvoorbeeld tussen een zone nabij de 20 buitenwand van de houder en een zone in het hart van de houder. Dergelijke ongewenste verschillen zullen tevens ongewenste verschillen in afkoelsnelheid veroorzaken. Bovendien heeft een tijdens de kristallisatie doorgezette afkoeling van de omgeving tot gevolg dat wanneer de 25 kristallisatie volledig is het temperatuurverschil tussen de houder en de omgeving onaanvaardbaar groot is, met als gevolg dat de daarop volgende afkoeling te snel verloopt.

Tijdens het afkoelen dient met name nabij het vriespunt c.q. -traject van de oplossing ijsvorming binnen 30 de cellen (intracellulaire ijsvorming) te worden verhinderd daar dit dodelijk is voor de betreffende cellen. De oorzaak dat dit wordt voorkomen is een efflux van water uit de cel, dat wil zeggen door het celmembraan wegstromen naar de omgeving. Daardoor daalt de waterconcentratie in de cel, dat 35 wil zeggen het aandeel water in het celvolume wordt minder, waardoor het vriespunt daalt.

1004948 5

Bij te hoge afkoelsnelheden zal de efflux van water zeer snel plaatsvinden, hetgeen op zichzelf reeds ongunstig lijkt voor de cellen. Bovendien bestaat een grote kans dat de water-efflux, relatief ten opzichte van de 5 afkoelsnelheid, daarbij niet snel genoeg plaatsvindt, dat wil zeggen dat de daling van het vriespunt daarbij minder snel verloopt dan de daling van de temperatuur. De temperatuur komt daardoor ver onder het vriespunt waardoor toch intracellulair ijs ontstaat.

10 Bij te lage afkoelsnelheden treedt juist het omgekeerde effect op. De ijskristallisatie buiten de cellen (intercellulair) en de efflux van water uit de cellen kunnen rustig verlopen, zodat deze processen nabij het thermodynamisch evenwicht zullen geraken. Dit evenwicht ligt 15 bij een zeer lage waterconcentratie in de cellen. Zowel intercellulair als intracellulair zal de dehydratie derhalve zeer snel optreden. De dehydratie en zout- en metaboliet-concentraties in de cellen worden daarbij zodanig hoog dat de cellen daardoor worden beschadigd. Bovendien raken de 20 cellen vervormd door afname van het volume, en beschadigd door de snel groeiende intercellulaire ijskristallen. Verder verblijven de cellen bij een te lage invriessnelheid te lang in de instabiele toestand. Pas bij zeer lage temperaturen, bijvoorbeeld onder -80°C zullen geen (bio)chemische reacties 25 of fysische transities meer plaatsvinden.

Door een geschikte keuze van het temperatuurprofiel tijdens het afkoeltraject, kan steeds een zodanige momentane afkoelsnelheid worden gerealiseerd dat de bovengenoemde nadelen worden vermeden. Een dergelijke sturing van het 30 temperatuurverloop is bijzonder goed mogelijk door gebruik van een inrichting volgens de uitvinding.

In een nadere uitwerking wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 3.

35 Door in het eerste en derde koeltraject relatief snel te koelen, terwijl in het tweede traject de temperatuur op de kristallisatie wordt afgestemd en nagenoeg constant 1004948 6 wordt gehouden, worden condities verkregen voor het invriezen van een een hoeveelheid levende cellen bevattend monster, of althans delen daarvan, die een nog betere kans op het intact overleven van de werkwijze bieden en derhalve 5 bijvoorbeeld een nog betere kans bieden op een succesvolle bevruchting via kunstmatige inseminatie.

In een voorkeursuitvoeringsvorm wordt een werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 5.

10 Het optreden van kristallisatie, in het bijzonder de aanvang daarvan in de houders is een proces dat in hoofdzaak afhankelijk is van toeval, bijvoorbeeld van toevallig in de substantie aanwezige kristallisatiekernen. Door het plaatselijk gedurende relatief korte tijd sterk onderkoelen 15 van een gedeelte van het monster wordt kristallisatie actief op gang gebracht aan het begin van het tweede koeltraject.

Feitelijk wordt daarmee het begin van het tweede koeltraject bepaald waardoor het voordeel wordt bereikt dat sturing van de temperatuur in de houders en in elk monster daarmee beter 20 kan worden geregeld, waardoor een verdere verbetering van de resultaten van de werkwijze wordt verkregen. Juist doordat het begin van het tweede koeltraject, dat de kristallisatiepauze omvat, in tegenstelling tot bij de bekende werkwijzen is vastgelegd kan de omgevingstemperatuur 25 tijdens de gehele kristallisatiepauze goed gestuurd, in het bijzonder nagenoeg constant worden gehouden.

In een bijzonder voordelige uitvoeringsvorm wordt een werkwijze volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 8.

30 Bij een dergelijke werkwijze kunnen de monsters met name tijdens het derde koeltraject relatief snel worden afgekoeld doordat de kristallisatie relatief rustig verloopt. Dit maakt dat de afkoelsnelheid in met name het derde koeltraject minder kritisch is en eventueel hoger kan 35 liggen dan bij de bekende werkwijze.

Een werkwijze volgens de uitvinding is met name geschikt voor het invriezen van rundersperma, in het 1004948 7 bijzonder onder toepassing van de maatregelen volgens conclusie 9, voor invriezen van berensperma (boar sperm), in het bijzonder onder toepassing van de maatregelen volgens conclusie 10 en voor het invriezen van menselijk sperma, in 5 het bijzonder onder toepassing van de maatregelen volgens conclusie 11.

In een verdere voordelige uitvoeringsvorm wordt een werkwijze volgens de uitvinding voorts gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 12.

10 Bij de bekende werkwijze is het gebruikelijk het of elk monster, voorafgaand aan het eigenlijke invriezen, voor te koelen tot een temperatuur van ongeveer 5°C of minder. Algemeen wordt aangenomen dat dit noodzakelijk is om een goed resultaat te verkrijgen en dat bij een hogere 15 begintemperatuur de overlevingskansen en de levendigheid van de cellen in te hoge mate nadelig worden beïnvloed. Uit onderzoek van aanvraagster is verrassenderwijze gebleken dat, met name maar niet uitsluitend voorafgaand aan een invriestraject volgens de uitvinding, een in te vriezen 20 monster minder dient te worden afgekoeld. Een monster wordt derhalve bij een hogere begintemperatuur, bijvoorbeeld tussen 5 en 18°C, meer in het bijzonder tussen 9 en 15°C aan een inrichting voor het doorvoeren van een invriestraject volgens de uitvinding toegevoerd. Het verdient daarbij de 25 voorkeur dat, althans bij invriezen van een spermamonster, deze voorkoeltemperatuur ongeveer 13°C bedraagt. Het zal duidelijk zijn dat deze exacte temperatuur afhankelijk van de soort in te vriezen cellen kan worden geoptimaliseerd. Deze optima zijn daarbij uiteraard mede, in belangrijke 30 mate, afhankelijk van de samenstelling van de oplossing, vloeistof of suspensie waarin het monster, althans de cellen zijn opgenomen.

De uitvinding heeft voorts betrekking op de toepassing van een kristallisatiepauze tijdens het invriezen 35 van een aantal levende cellen bevattende monsters, gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 13, en op de toepassing van een voorkoeling van ten minste één levende 1004948 8 cellen bevattend monster, voorafgaand aan een invrieswerkwijze voor het of elk monster, zoals gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 14.

De uitvinding heeft bovendien betrekking op een 5 inrichting voor het invriezen van levende cellen bevattende monsters, in het bijzonder spermamonsters, welke inrichting in het bijzonder geschikt is voor gebruik bij een werkwijze volgens de uitvinding en wordt gekenmerkt door de maatregelen volgens conclusie 15.

10 Een dergelijke inrichting maakt het op bijzonder eenvoudige en nauwkeurige wijze mogelijk de tenmperatuur van de houders en daarin opgenomen monsters te sturen tijdens het verblijf daarvan in de inrichting. Daardoor kunnen bij elk soort monsters optimale resultaten worden bereikt door 15 afstemming van een afkoelprotocol op onder meer de soort cellen, de overige inhoud van de houders, de begintemperatuur en de gewenste eindtemperatuur van de houders en de monsters en het aantal tegelijkertijd in de inrichting aanwezige monsters.

20 Alternatieve uitvoeringsvormen van werkwijzen en inrichtingen volgens de uitvinding zijn beschreven in de overige conclusies en de beschrijving.

Ter verduidelijking van de uitvinding zal een uitvoeringsvoorbeeld van een inrichting, te zamen met 25 voorbeelden van werkwijzen, onder verwijzing naar de tekening, worden beschreven, daarin toont: fig. 1 een inrichting volgens de uitvinding, schematisch, in doorgesnede zij-aanzicht; fig. 2 een alternatieve inrichting volgens de 30 uitvinding, schematisch, in doorgesneden zij-aanzicht en vooraanzicht; fig. 3 een tijd-temperatuurprotocol voor het invriezen van rundersperma, zoals beschreven in voorbeeld I; fig. 4 een tijd-temperatuurprotocol voor het 35 invriezen van berensperma (boar sperm), zoals beschreven in voorbeeld II; 1004948 9 fig. 5 een tijd-temperatuurprotocol voor het invriezen van menselijk sperma, zoals beschreven in voorbeeld III.

Een inrichting volgens fig. 1 omvat een blok 2, 5 vervaardigd uit warmtegeleidend materiaal zoals metaal, bijvoorbeeld aluminum, koper of legeringen daarvan, waarin een aantal koelleidingen 5 is opgenomen. De koelleidingen 5 zijn via een aantal regelkleppen 7 aangesloten op een aanvoerleiding 6 voor een koelmiddel, bijvoorbeeld vloeibaar 10 stikstof. In het oppervlak 3 van het blok 2 zijn temperatuurmeetmiddelen 8 opgenomen, aangesloten op een centrale regeleenheid 10. Met behulp van de centrale regeleenheid 10 kunnen de regelkleppen 7 worden aangestuurd voor het door de koelleidingen 5 voeren van een hoeveelheid 15 koel-medium afgestemd op de op dat moment gewenste temperatuur van het oppervlak 3, afhankelijk van de gemeten temperatuur. Daarmee kan een in de centrale regeleenheid 10 ingevoerd koelprotocol KP, afgestemd op de te koelen levende cellen, worden overgebracht op het blok 2 en daarmee op 20 daarop geplaatste houders 16.

Over het bovenvlak 3 van het blok 2 is een dunne, flexibele en thermisch isolerende film 17 aangebracht, bijvoorbeeld HDPE- of PTFE-film. Deze film 17 isoleert de houders 16 van de omgeving en vormt te zamen met het blok 2 25 voor een gesloten behuizing 18. Het verdient daarbij de voorkeur dat het verdampende medium in de richting van de invoerzijde 119, dat wil zeggen het warmste einde van de inrichting stroomt, zodat de houders daardoor niet onbedoeld weer worden opgewarmd. Bovendien zal eventuele lucht binnen 30 de inrichting de neiging vertonen in de bewegingsrichting van de houders 16 mee te stromen. Het is daarom voordelig de stikstof in hoofdzaak in tegengestelde richting te doen stromen voor het verdringen van die lucht. Door een relatief klein deel van de stikstof echter met de houders 116 mee te 35 laten bewegen wordt ook de lucht nabij het koude einde van de inrichting verdreven.

1004948 10

Tijdens gebruik ligt een aantal houders 16 op het oppervlak 3, zodanig dat de houders 16 met een deel van het buitenoppervlak daartegen aanliggen, zoals duidelijk blijkt uit fig. 1. In het getoonde uitvoeringsvoorbeeld worden de 5 houders 16 gevormd door kunststof foliezakjes, waarin een monster is opgenomen. Elk monster omvat een aantal levende, in te vriezen cellen, in het bijzonder sperma, in een hoeveelheid oplosvloeistof.

De houders 16 liggen in rijen en kolommen in de vorm 10 van een matrix op het blok 2, stationair ten opzichte van de inrichting en van elkaar. De houders kunnen eventueel tegen elkaar zijn gelegen doch de voorkeur verdient dat de houders met enige onderlinge afstand van elkaar zijn geplaatst, zodat zij elkaar tijdens het afkoelen niet beïnvloeden.

15 Figuur 2 toont een alternatieve uitvoeringsvorm van een inrichting 101 volgens de uitvinding. Gelijke delen hebben daarbij corresponderende verwijzingscijfers.

Een inrichting 101 volgens fig. 2 omvat een blok 102, vervaardigd uit warmtegeleidend materiaal, bijvoorbeeld 20 aluminium of een aluminiumlegering. Het blok 102 heeft een ten opzichte van zijn breedte B een grote lengte L, terwijl de dikte D relatief klein is. De bovenzijde 103 van het blok 102 is voorzien van een reeks evenwijdige, zich in de lengterichting uitstrekkende groeven 104, waarvan het doel 25 en de uitvoeringsvorm nog nader zullen worfden toegelicht.

Door het blok 102 strekt zich onder het bovenvlak 3 een aantal koelleidingen 105 uit, in hoofdzaak dwars op de lengterichting van het blok 102, over de volle breedte B daarvan. Een aantal naast elkaar gelegen koelleidingen 105 30 is steeds gezamenlijk verbonden met een aanvoerleiding 106 voor een koelmedium, bijvoorbeeld vloeibare stikstof. In elke aanvoerleiding is een regelklep 107 opgenomen voor het doseren van de hoeveelheid koelmedium die door de betreffende koelleidingen 105 wordt geleid. De regelklep 107 35 wordt gestuurd door een in het oppervlak 103 ter hoogte van de betreffende koelleidingen 105 aangebrachte thermostaat of andersoortige temperatuurmeetmiddelen 108. De koelleidingen 1004948 11 105 die te zamen door één aanvoerleiding 106 en één regelklep worden gevoed vormen te zamen één koelstation 109, waarin de temperatuur wordt geregeld op basis van signalen van de bijbehorende temperatuurmeetmiddelen 108. In de 5 getoonde uitvoeringsvorm is een negental van dergelijke koelstations 109A-109I in de lengterichting van het blok 102 gezien achter elkaar aangebracht.

De temperatuurmeetmiddelen 108 zijn gezamenlijk instelbaar met behulp van een centrale regeleenheid 110, met 10 behulp waarvan de gewenste temperatuur in elk koelstation 109 kan worden ingesteld, zodanig dat een gewenst temperatuurprofiel over het blok 102 kan worden verkregen. Dit gewenste temperatuurprofiel zal nog nader worden toegelicht.

15 De inrichting is voorzien van een aandrijfinrichting 112, omvattende een ketting of band 14 met zich over het bovenvlak 103 van het blok 102, over de groeven 4 uitstrekkende duwstangen 115.

Ook de inrichting 101 volgens fig. 2 is afgedekt 20 door een isolerende afdekfilm 117. Deze inrichting 101 is met name geschikt voor gebruik in samenwerking met monsters welke zijn opgenomen in langwerpige rietjes, vervaardigd uit kunststof. De koelkanalen 105 monden aan bijvoorbeeld de van de aanvoerleiding 106 afgekeerde zijde of door kleine 25 doorgangen naar het oppervlak 103 uit onder de film 117, binnen de genoemde behuizing 118. Bij het verlaten van de koelleidingen 105 verdampt de vloeibare stikstof en verdringt alle lucht uit de behuizing 18 of althans tussen de film 117 en het oppervlak 103 van het blok 102. Daardoor 30 wordt verhinderd dat condensatie optreedt binnen de behuizing 118, welke condensatie thermisch ongunstig zou zijn. Het verdient daarbij de voorkeur dat het verdampende medium in de richting van de invoerzijde 119, dat wil zeggen het warmste einde van de inrichting stroomt, zodat de 35 houders daardoor niet onbedoeld weer worden opgewarmd. Bovendien zal eventuele lucht binnen de inrichting de neiging vertonen in de bewegingsrichting van de houders 16 1004948 12 mee te stromen. Het is daarom voordelig de stikstof in hoofdzaak in tegengestelde richting te doen stromen voor het verdringen van die lucht. Door een relatief klein deel van de stikstof echter met de houders 116 mee te laten bewegen 5 wordt ook de lucht nabij het koude einde van de inrichting verdreven.

Inrichtingen volgens fig. 1 en 2 zijn nader beschreven in de door aanvraagster mee ingediende (co-pending) Nederlandse octrooiaanvrage getiteld 10 "Invriesinrichting". Deze aanvrage wordt geacht hierin door verwijzing te zijn opgenomen.

Tijdens gebruik ligt een aantal houders 16 in de groeven 4, zodanig dat de houders 16 met een deel van het buitenoppervlak aanliggen tegen het binnenoppervlak van de 15 groeven 4, zoals duidelijk blijkt uit fig. 2. In het getoonde uitvoeringsvoorbeeld worden de houders 16 gevormd door dunwandige rietjes, waarin een monster is opgenomen.

Elk monster omvat een aantal levende, in te vriezen cellen, in het bijzonder sperma, in een hoeveelheid oplosvloeistof. 20 De rietjes liggen in de lengterichting naast elkaar, waarbij steeds een duwstang 15 aanligt tegen het in bewegingsrichting achterliggende einde van de houders 16. Tijdens het aandrijven van de aandrijfinrichting 12 worden de houders derhalve in de lengterichting door de groeven 4 bewogen 25 tussen de beide einden van het blok 2, daarbij innig contact makend met het oppervlak 3 van het blok 2, in het bijzonder de binnenzijde van de groeven 4.

Bij deze inrichting wordt een temperatuurprofiel over het oppervlak (of de gezamenlijke oppervlakken) 30 aangelegd, zodanig dat bij transport van de houders over het of elk oppervlak de houders in de richting van het koudste einde worden gevoerd. Het verdient daarbij de voorkeur een constante aandrijfsnelheid in te stellen, waarbij het temperatuurprofiel tezamen met de aandrijving zorgt voor het 35 verkrijgen van het gewenste afkoelprotocol. Met name is daarbij van belang dat het tweede (of althans een tussengelegen) koelstation 109b een zeer kleine spatiële 1004948 13 temperatuurgradiënt heeft, bijvoorbeeld een constante temperatuur over zijn gehele oppervlak. Daardoor wordt automatisch het tweede koeltraject verkregen, meer in het bijzonder de gewenste kristallisatiepauze.

5 Een inrichting volgens de uitvinding omvat ten minste één contactvlak waarvan de temperatuur regelbaar is met behulp van koel- en/of verwarmingsmiddelen. Een contactvlak dient in deze te worden begrepen als een oppervlak dat door direct of althans nagenoeg direct contact de tempera-10 tuur van houders kan beïnvloeden. Daarbij kan de temperatuur van het of elk contactvlak zelf bijvoorbeeld door contact met een koel medium, door convectie of door straling worden geregeld, waarbij de of elke houder kan aan liggen tegen het contactvlak of bijvoorbeeld op zeer geringe afstand daarvan 15 kan liggen, bijvoorbeeld gedragen door een film van koelmedium.

Overigens kan een werkwijze volgens de uitvinding ook met andersoortige inrichtingen worden toegepast, bijvoorbeeld een inrichting omvattende middelen voor het 20 door direct contact tusen vloeibare, althans verdampende stikstof of andere vloeistoffen of gassen koelen van de houders.

Dergelijke inrichtingen maken een exacte sturing van de omgevingstemperaturen echter minder eenvoudig mogelijk.

25 Toepassingen van inrichtingen volgens de uitvinding voor het uitvoeren van werkwijzen volgens de uitvinding zullen in een aantal voorbeelden worden toegelicht, welke voorbeelden geenszins als beperkend dienen te worden uitgelegd.

30

Voorbeeld I

Sperma van vijf ongeselecteerde stieren werd opgevangen in een KI-station van de Faculteit der Diergeneeskunde, 35 Universiteit Utrecht en werd bewaard bij 31°C. Het sperma werd verdund met vier delen standaard invries medium van 31°C. Dit medium bestond uit 200 mM Tris base 1004948 14 (tris(hydroxymethyl)-aminomethaan), 66.7 mM citroenzuur, 55.5 mM fructose, 581 mM glycerol, 0.475 g/1 = 800.000 units/1 sodium penicilline, 0.8 g/1 streptomycin sulfaat en 200 ml eigeel per liter medium. Een buis met het genoemde 5 mengsel werd geplaatst in een bekerglas water van 31°C en werd vervolgens in dit bekerglas weggezet bij een temperatuur van 7°C.

Het verdunde sperma werd in zogenaamde Franse rietjes 10 (French straws, interne diameter 1.6mm; IMV, France) verpakt, welke werden gesloten met een plug van polyvinylalcohol. De helft van de rietjes werd volgens een bekend invriesprotocol ingevroren, de andere helft werd ingevroren volgens een invriesprotocol volgens de 15 uitvinding.

Bij het bekende invriesprotocol werden de rietjes en het sperma relatief langzaam afgekoeld tot 5°C, waarna de rietjes c.q. invrieszakjes in een vrieskabinet werden 20 gebracht bij een initiële temperatuur van -110°C. Steeds wanneer de temperatuur in het kabinet steeg boven de ingestelde temperatuur werd de koeling van het kabinet in werking gesteld. Bij het bereiken van een temperatuur van ongeveer -110°C werden de rietjes c.q. invrieszakjes in een 25 vat vloeibare stikstof gebracht. Vervolgens werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen bepaald.

30 Bij het invriesprotocol volgens de uitvinding werden de rietjes in een eerste koeltraject met een snelheid van 50°C/min afgekoeld vanaf ongeveer 7°C tot onder het vriespunt, tot ongeveer -10°C. Bij onderkoeling werd bij het optreden van ijsnucleatie een lichte stijging van de 35 temperatuur in de rietjes c.q. zakjes gemeten, tot nabij het vriespunt. Het sperma werd in een tweede koeltraject gedurende ongeveer 1 minuut op deze temperatuur gehouden, 1004948 15 waarbij de ijsvorming in de rietjes werd voltooid onder constante afvoer van de gegenereerde warmte. Aansluitend werden de rietjes in een derde afkoeltraject verder afgekoeld tot -100°C, met een afkoelsnelheid van 120°C/min.

5 Aansluitend werden de rietjes overgebracht in vloeibare stikstof van -196°C. Vervolgens werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen bepaald.

10 De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het bekende protocol ingevroren rietjes was na ontdooien gemiddeld ongeveer 48% (minimaal 40%, maximaal 63%). De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het protocol volgens de uitvinding ingevroren rietjes was 15 gemiddeld ongeveer 64% (minimaal 58%, maximaal 75%).

Voorbeeld II

"Equex" is een mengsel van verschillende detergentia, 20 hoofdzakelijk natrium- en ethanolamine-laurylsulfaat, en verder verschillende hulpstoffen. Het werd oorspronkelijk vervaardigd en geleverd door Procter and Gamble. Het wordt momenteel geleverd door Nova Chemicals (P.O. Box 144, Scituate, MA 02066 U.S.A.). De overige chemicaliën waren 25 alle van pro analysi kwaliteit. Eieren voor het invriesmedium werden meestal betrokken van een vast adres met vastzittende kippen. De eieren worden vlak voor gebruik gereinigd. De eidooiers worden gescheiden van het eiwit en worden over filtreerpapier droog gerold, waarna het vlies 30 wordt gebroken om het zuivere eigeel te winnen. De gebruikte 0,25 ml rietjes waren van IMV. De invrieszakjes waren zelfgemaakt uit 40|im dik HDPE (Hoge dichtheid polyethyleen) folie. Het sperma werd verkregen van KI station Centraal Nederland te Bunnik. Het sperma werd gevangen voor gewone 35 produktiedoeleinden op de voor het KI station gebruikelijke wijze. De beren werden niet geselecteerd.

1004948 16

De volgende media zijn gebruikt: 1. Beltsville Thawing Solution (BTS): 205 mM glucose, 24 mM natriumcitraat, 3,5 mM natrium-EDTA, 15mM natriumbicarbonaat, 10,3 mM kaliumchloride, 0.6 g/1 5 natrium penicilline en 1 g/1 streptomycinesulfaat.

2. BTS-eigeel (BE): 4 volumedelen BTS plus 1 deel eigeel. Vanwege de lage pH van het eigeel wordt de pH bijgesteld met 1 M NaOH tot pH 7,2.

3. BTS-eigeel-glycerol-Equex (BEGE): Aan 93 ml BE wordt 5,35 10 g glycerol (± 87%) toegevoegd en 2,08 g Equex toegevoegd.

Dit maakt ± 100 ml.

Sperma van ongeselecteerde beren (Boarsperm) werd opgevangen op een KI station te Bunnik en werd direct verdund met 1.5 15 volume BTS, bij 32°C. Het sperma werd vervolgens overgebracht in een wijde beker met een maximum laagdikte van 1 cm en relatief snel afgekoeld, twintig minuten bij kamertemperatuur en vervolgens 30 minuten bij 17°C. Aansluitend werd het verdunde sperma 10 minuten 20 gecentrifugeerd bij 1100 G. Het zaadsediment werd voorzichtig geroerd met een glazen roerstaaf en daarbij geresuspendeerd door druppelsgewijze toevoeging van BE-medium. Hierna werd het sperma in een centrifugebuis 90 minuten weggezet, bij 13°C. Hierna werd aan twee volumedelen 25 sperma in BE medium druppelsgewijs één volumedeel BEGE medium met een temperatuur van 13°C toegevoegd, onder zachtjes roeren met een magneetroerder. De eindconcentraties zijn dan 0.2 M glycerol en 6.9 g/1 Equex. Rietjes werden gevuld met deze suspensie en afgedicht met afdichtpoeder 30 (Polyvinylalcohol). Bovendien werden invrieszakjes gevuld en geseald. De rietjes werden aansluitend ingevroren met een Cryoson programmeerbare invrieskamer, de zakjes werden ingevroren met een zelfgemaakt programmeerbaar invriesapparaat.

De invriesprotocollen voor de rietjes en invrieszakjes waren gelijk. De helft van de rietjes en zakjes werd met het 35 1004948 17 bekende invriesprotocol ingevroren. De andere helft volgens een invriesprotocol volgens de uitvinding.

Bij het bekende invriesprotocol werden de rietjes en het 5 sperma relatief langzaam afgekoeld tot 5°C, waarna de rietjes c.q. invrieszakjes in een vrieskabinet werden gebracht bij een initiële temperatuur van -110°C. Steeds wanneer de temperatuur in het kabinet steeg boven de ingestelde temperatuur werd de koeling van het kabinet in 10 werking gesteld. Bij het bereiken van een temperatuur van ongeveer -110°C werden de rietjes c.q. invrieszakjes in een vat vloeibare stikstof gebracht. Vervolgens werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen 15 bepaald.

Bij het invriesprotocol volgens de uitvinding werden de rietjes c.q. invrieszakjes met een snelheid van 50°C/min afgekoeld vanaf 13°C tot onder het vriespunt. Bij 20 onderkoeling werd bij het optreden van ijsnucleatie een lichte stijging van de temperatuur in de rietjes c.q. zakjes gemeten, tot nabij het vriespunt. Het sperma werd gedurende ongeveer 1 minuut op deze temperatuur gehouden, waarbij de ijsvorming in de rietjes c.q. invrieszakjes werd voltooid 25 onder constante afvoer van de gegenereerde warmte.

Aansluitend werden de rietjes c.q. invrieszakjes verder af gekoeld tot -12 0°C, met een af koelsnelheid van 50°C/min. Aansluitend werden de rietjes c.q. invrieszakjes overgebracht in vloeibare stikstof van -196°C. Vervolgens 30 werden de rietjes c.q. invrieszakjes op de gebruikelijke wijze ontdooid en werd de beweeglijkheid van de spermacellen bepaald.

De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het 35 bekende protocol ingevroren rietjes c.q. invrieszakjes was na ontdooien gemiddeld ongeveer 45%. De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het protocol volgens de 1004948 18 uitvinding ingevroren rietjes was gemiddeld ongeveer 51.5%. De beweeglijkheid van de spermacellen in de volgens het protocol volgens de uitvinding ingevroren invrieszakjes was na ontdooien gemiddeld ongeveer 52%.

5

De uitvinding is geenszins beperkt tot de inrichtingen en werkwijzen zoals als voorbeelden beschreven. Vele variaties daarop zijn mogelijk.

Zo kan, afhankelijk van de soort en hoeveelheid in 10 te vriezen cellen, de gewenste nauwkeurigheid, de gewenste overlevingskans, de samenstelling van de vloeistof of andersoortige omgeving waarin de levende cellen zijn opgenomen en worden ingevroren, de gewenste eindtemperatuur en dergelijke, een ander invriesprotocol worden gekozen. Bovendien 15 kunnen andersoortige contactoppervlakken worden toegepast. Ook kunnen combinaties van oppervlakken worden toegepast. Voorts kan een inrichting zijn opgebouwd uit een combinatie van een inrichting volgens de uitvinding voor het eerste, over het algemeen meest kritische gedeelte van het invries-20 traject, en een inrichting van de bekende soort voor een gedeelte van het invriestraject na de kristallisatiefase, dat wil zeggen dat deel van het invriestraject nadat althans nagenoeg volledige kristallisatie in de houders is opgetreden. Verder kunnen andere koelmiddelen worden 25 toegepast en kunnen andere houders worden gebruikt. Ook kunnen meerdere contactvlakken tegenover elkaar worden geplaats, waarbij de houders tussen de betreffende contactvlakken worden opgenomen of doorgevoerd. Het koelprotocol kan handmatig of (semi)automatisch worden geregeld. In elk 30 afkoeltraject kan de temperatuur constant zijn of volgens een gewenst patroon verlopen c.q. worden gestuurd, waarbij meer dan drie koeltrajecten kunnen worden onderscheiden, elk met afzonderlijke temperatuurgradiënten. Deze en vele vergelijkbare varianten vallen binnen het raam van de 35 uitvinding.

1004948

Claims (17)

1. Werkwijze voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, waarbij de cellen in ten minste één monster tijdens een invriestraject worden afgekoeld tot nabij een bewaartemperatuur, gekenmerkt doordat tijdens een 5 gedeelte van het invriestraject waarin kristallisatie in het of elk monster optreedt gestuurd een temperatuurgradiënt wordt aangelegd die kleiner is dan ten minste de tempertauurgradiënt in een daaraan voorafgaand of daarop volgend deel van het invriestraject.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij tijdens het optreden van kristallisatie in het of elk monster daling van de temperatuur in het of elk monster in hoofdzaak wordt tegengegaan en bij voorkeur tijdens de kristallisatie de temperatuur rond het of elk monster in hoofdzaak constant 15 wordt gehouden.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij het invriestraject een eerste, een tweede en een derde koeltraject omvat, waarbij in elk koeltraject de tenperatuurgradiënt actief wordt gestuurd, waarbij in het 20 eerste en derde koeltraject de temperatuurgradiënt relatief groot wordt gehouden, waarbij tijdens het tussengelegen tweede koeltraject ten minste een zodanige temperatuur wordt ingesteld dat kristallisatie in hoofdzaak daarin optreedt.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, waarbij het tweede 25 koeltraject aanvangt ongeveer bij aanvang van kristalvorming in het of een monster en bij voorkeur wordt beëindigd wanneer in hoofdzaak volledige kristallisatie is opgetreden in het of elk monster.

5. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, waarbij 30 kristallisatie in het of elk monster op gang wordt gebracht door veroorzaken van een plaatselijke onderkoeling gedurende korte tijd in althans een deel van het of elk monster in de 1004948 of elke houder, zodanig dat initialisatie van de kristallisatie optreedt.

6. Werkwijze volgens één der conclusies 3-5, waarbij tijdens het tweede koeltraject een zodanige temperatuur 5 wordt ingesteld dat het overdraagbare vermogen in de tijd voldoende is om de kristallisatiewarmte vanuit de of elke houder weg te voeren, terwijl de kristallisatie zodanig snel wordt uitgevoerd dat zodanige dehydratie wordt verhinderd dat de cellen beschadigen als gevolg van te hoge zout- en/of 10 metabolietconcentratie, en zodanig langzaam wordt uitgevoerd dat de daling van het vriespunt van de oplossing tijdens kristallisatie ten minste even snel en bij voorkeur sneller verloopt dan de daling van de temperatuur.

7* Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij de temperatuur 15 in het tweede koeltraject wordt ingesteld tussen -4°C en -25°C, bij voorkeur tussen -5°C en -15°C, meer in het bijzonder op gemiddeld ongeveer -10°C, waarbij de kristallisatie nagenoeg volledig wordt voltooid binnen een tijd tussen 10 sec. en 60 sec., bij voorkeur tussen 15 sec. 20 en 45 sec., in het bijzonder in ongeveer 20 sec. na aanvang van de kristallisatie.

8. Werkwijze volgens één der conclusies 3-7, waarbij de temperatuurgradiënt in het eerste en derde koeltraject wordt gekozen afhankelijk van ten minste de soort in te vriezen 25 cellen en de samenstelling van het of elk monster.

9. Werkwijze volgens één der conclusies 3-8, waarbij de temperatuurgradiënt in het eerste koeltraject ten minste gelijk is aan en bij voorkeur kleiner is dan in het derde koeltraject.

10. Werkwijze volgens één der conclusies 3 - 9, in het bijzonder voor invriezen van rundersprema, waarbij de temperatuurgradiënt in het eerste koeltraject wordt ingesteld tussen -20°C/min en -100°C/min, meer in het bijzonder tussen -35°C/min en -80°C/min en bij voorkeur 3. ongeveer -50°C/min, waarbij het of elk monster in het eerste koeltraject wordt afgekoeld tot een temperatuur tussen -4°C en -20°C, bij voorkeur ongeveer -10°C, waarbij in het derde 1004948 koeltraject een temperatuurgradiënt wordt ingesteld tussen -50°C/min en -170°C/min, meer in het bijzonder tussen -80°C/min en -150°C/min en bij voorkeur ongeveer -120°C/min.

11. Werkwijze volgens één der conclusies 3-9, in het 5 bijzonder voor invriezen van varkenssperma, waarbij de temperatuurgradiënt in het eerste koeltraject wordt ingesteld tussen -20°C/min en -100°C/min, meer in het bijzonder tussen -35°C/min en -80°C/min en bij voorkeur ongeveer -50°C/min, waarbij het of elk monster in het eerste 10 koeltraject wordt afgekoeld tot een temperatuur tussen -4°C en -2 0°C, bij voorkeur ongeveer -10°C, waarbij in het derde koeltraject een temperatuurgradiënt wordt ingesteld tussen -10°C/min en -100°C/min , meer in het bijzonder tussen -30°C/min en -70°C/min en bij voorkeur ongeveer -50°C/min.

12. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, in het bijzonder voor het invriezen van humaan sperma, waarbij de temperatuurgradiënt in het eerste koeltraject wordt ingesteld tussen -20°C/min en -100°C/min, meer in het bijzonder tussen -35°C/min en -80°C/min en bij voorkeur 20 ongeveer -50°C/min, waarbij het of elk monster in het eerste koeltraject wordt afgekoeld tot een temperatuur tussen -4°C en -20°C, bij voorkeur ongeveer -10°C, waarbij in het derde koeltraject een temperatuurgradiënt wordt ingesteld tussen -10°C/min en -100°C/min , meer in het bijzonder tussen 25 -30°C/min en -70°C/min en bij voorkeur ongeveer -50°C/min. [Noot: is het wellicht verstandig de laatste waarde (optimaal -50°C/min) iets minder te kiezen, bijvoorbeeld -40°C/min. Daarmee wordt in elk geval aangegeven dat het wellicht kritischer is dan voor runderen en varkens.]

13. Werkwijze volgens één der conclusies 3-12, waarbij het eerste koeltraject wordt voorafgegaan door een voorkoeltraject met een ten opzichte van het eerste koeltraject relatief kleine temperatuurgradiënt, waarbij het of elk monster in het voorkoeltraject wordt afgekoeld tot 35 een voorkoel temperatuur van meer dan 5°C, bij voorkeur tussen 5°C en 18°C, in het bijzonder tussen 9°C en 15°C, meer in het bijzonder ongeveer 13 °C. 1004948

14. Toepassing van een kristallisatiepauze tijdens het invriezen van een aantal levende cellen bevattende monsters, waarbij tijdens de kristallisatiepauze kristallisatie in het of elk monster optreedt, waarbij temperatuurdaling tijdens 5 kristallisatie door sturing van de koeling van het of elk monster tijdens de kristallisatiepauze in hoofdzaak wordt verminderd en de temperatuur rond het of elk monster tijdens de kristallisatiepauze bij voorkeur constant wordt gehouden.

15. Toepassing van een voorkoeling van ten minste één 10 levende cellen bevattend monster, voorafgaand aan een invrieswerkwijze voor het of elk monster, waarbij het of elk monster tijdens de voorkoeling relatief langzaam wordt af gekoeld tot een temperatuur van meer dan 5°C, bij voorkeur tussen 6 en 18°C, in het bijzonder tussen 11 en 15°C en meer 15 in het bijzonder tot ongeveer 13°C, vanaf welke temperatuur een invriestraject wordt aangevangen waarin het of elk monster relatief snel wordt afgekoeld.

16. Inrichting voor het invriezen van levende cellen, in het bijzonder sperma, omvattende middelen voor het koelen 20 van in houders opgenomen monsters, welke monsters levende cellen omvatten, waarbij middelen zijn opgenomen voor het regelen van de afkoelsnelheid van elk monster tijdens ten minste een drietal tijdsintervallen, waarbij de regelmiddelen zijn ingericht voor het actief gestuurd: 25 in een eerste tijdsinterval in stand houden van een relatief hoge temperatuurgradiënt; in een daarop volgend tweede tijdsinterval in stand houden van een relatief lage temperatuurgradiënt, bij voorkeur constant houden van de omgevingstemperatuur van elk 30 monster; en in een daarop volgend derde tijdsinterval wederom in stand houden van een relatief hoge temperatuurgradiënt.

17. Inrichting volgens conclusie 16, waarbij ten minste één contactoppervlak en koelmiddelen voor het of elk 35 contactoppervlak zijn voorzien, waarbij de inrichting is ingericht voor het tijdens gebruik in contact brengen van ten minste één contactoppervlak met ten minste een deel van 1004948 ten minste een aantal van de houders, zodanig dat daarbij koeling van de houders of althans een daarin opgenomen monster wordt verkregen, waarbij de koelmiddelen zijn ingericht voor het gestuurd koelen van het of elk 5 contactoppervlak en daarmee van het monster in de of elke houder. 1004948